manual de microscopia

Manual de

microscopia bruno p. kremer

Ediciones Omega

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viaje hacia pequeños mundos

1 Viaje hacia pequeños mundos 1.1 Expediciones hacia lo invisible La naturaleza no revela sus secretos de una vez por todas.

Séneca, Naturales quaestiones, Libro 7

Solo mediante el conocimiento de lo pequeño es concebible lo grande. Por este motivo puede ser de ayuda observar primero en una lupa y luego en el microscopio óptico distancias de longitud conocida.

Eucitos

Orgánulos

Microscopio óptico

Órdenes de magnitud en biología celular. Los planos de observación van desde una dimensión molecular hasta la orgánica. La escala está subdividida logarítmicamente.

Bacterias

Macromoléculas

Pequeñas moléculas Átomo del hidrógeno

1000 nm = 1 µm

100 nm

Microscopio electrónico

Virus

10 µm

10 nm

1 nm

0,1 nm

A diferencia de lo que ha sucedido con la astrofísica, con el microscopio el hombre ha desplazado los límites del mundo de su experiencia sólo por el tamaño de fracciones de milímetro. Pero con ello ha conquistado mundos que no se pueden expresar en cantidades. Quien contempla la luna con un telescopio, continúa viendo la luna y además un par de centenares de cráteres de impacto de meteoritos que a ojo desnudo quizás no se pueden reconocer con precisión. Posiblemente este nuevo conocimiento es en gran medida inútil.

La profundización en una célula viva con la ayuda de un microscopio, aunque sea sencillo, resulta por el contrario una experiencia de cualidades totalmente diferentes, pues la célula no es perceptible a simple vista. Lo que vemos es meramente un gran conglomerado de células que forman un continuo y utilizamos otro tipo de conceptuación, orientada al macrocosmos, y hablamos de hojas, tallos, piel o cabellos. Descubrir que de hecho existe una infinidad de seres vivos esencialmente más pequeños que los psocópteros, aquellos puntos gris pardusco que corretean por los libros amarillentos, resulta, para el que entra en contacto por primera vez con la microscopia, una de las aventuras visuales más excitantes.

Desplazamiento de los límites de la experiencia El microscopio óptico con sus desarrollos tecnológicos y todo el ámbito de la microscopia electrónica se saltan muchos escalones en los niveles de la naturaleza para introducirnos en la profundidad del microcosmos, poniendo de manifiesto que las cosas y los seres vivos en la pequeña dimensión están constituidos de un modo totalmente diferente al que comunica la experiencia a escala macroscópica. Al contrario de lo que sucede con la observación de la luna y los paseos por la superficie lunar, la mirada microscópica nos afecta de forma directa, pues los seres humanos, igual que las hojas de una planta, estamos compuestos de células que cooperan entre sí de un modo asombroso. Órdenes de magnitud en biología La resolución natural del ojo humano está –con oscilaciones individuales– entre 0,3 y 0,1 mm aproximadamente.

Resolución significa que objetos de estructura simple como puntos o líneas solo se perciben como imágenes separadas cuando su distancia es mayor que al menos 0,1-0,3 mm. Si se hallan a menor distancia, ya no se pueden reconocer como dos imágenes, pues ópticamente confluyen como si se tratara de un único objeto. Una distancia de 1 mm es en general relativamente fácil de imaginar, ya que se corresponde con una marca en una regla o una escuadra. Con fracciones de milímetro, que constituyen el ámbito de trabajo de la microscopia, ya resulta más difícil, pues no pertenecen al campo habitual de las experiencias reales. Lo que queda fuera de los límites de nuestra percepción es, por lo tanto, al mismo tiempo antiintuitivo. Con este problema debe lidiar todo aquel que mire por primera vez a través

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exploración de la naturaleza inorgánica

2 Exploración de la naturaleza inorgánica 2.1 Las preparaciones más sencillas Examinar la regularidad en los dentados de una colección de sellos no requiere grandes ceremonias. Uno coge una simple lupa de lectura y se sumerge en la observación. Pero una investigación microscópica no alcanza tan rápidamente su objetivo, pues antes se requieren unas preparaciones apropiadas. Estas pueden ser preparaciones en seco, húmedas, en fresco o permanentes. Una diferenciación precisa se proporciona en el Apéndice técnico a partir de la pág. 252. A continuación, se describirán unas primeras preparaciones muy sencillas, con las cuales será posible entrenarse en el manejo del microscopio, la comprensión espacial y la prevención de determinados errores.

Los primeros pasos

Rasguño en el portaobjetos: un cañón caótico.

Después de cambiar a un objetivo más potente (40 aumentos) puede suceder que ya no se perciba ningún contorno definido. Entonces se debería comprobar que la mella sobre el portaobjetos está realmente encima, es decir, orientada al objetivo.

Para una primera mirada en los pequeños mundos microscópicos no se requiere un proceso de preparación costoso ni ningún objeto exótico; algunos utensilios típicos del hogar o de la caja de herramientas del microscopista sirven perfectamente para la fase inicial.

Zanjas en el vidrio El canto afilado de un destornillador o un cortavidrios dejan una mella blancuzca en un portaobjetos: ya tenemos listo una preparación en seco asombrosamente rica. Ya con un escaso aumento (lupa de 3,5 aumentos o equivalente), la simple raya aparece como un cañón de forma compleja, en el cual no encontramos líneas ni ángulos rectos: desde las paredes hasta el fondo de zanja irrumpen numerosas depresiones mayoritariamente concoideas. En su disposición caótica e irregular muestran un tesoro de formas que no podemos encontrar en la erosión natural de un valle.

Por consiguiente, este paisaje de un cañón en el cristal parecerá irreal y extraño.

Sin embargo, presenta una sorprendente característica: una plena iluminación no nos deja ver las fracturas más finas de la mella o reconocer sus contornos. Al cerrar el diafragma de abertura en el condensador, se modera la cantidad de rayos irradiados y mejora la percepción de los contornos. A la vez aumenta también la profundidad de campo. Sólo ahora se pueden contemplar todos los finos relieves de la mella.

Al cambiar a la siguiente ampliación (objetivo de 10 aumentos), la sección representada quedará reducida. Ahora incluso una mayor obturación del diafragma no será suficiente para captar en una misma observación todas las alturas y profundidades del cañón; descender al fondo de la zanja conduce solo a focalizar con el mando micrométrico.

Un temblor: el movimiento browniano El botánico escocés Robert Brown (1773-1858), a quien la ciencia debe una buena cantidad de contribuciones fundamentales, se ocupó de la polinización de las plantas y para ello estudió al microscopio, el verano de 1827, unos granos de polen flotando en el agua de la planta ornamental Clarkia pulchella. Para su asombro, constató que

movimiento browniano

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Proyecto Movimiento browniano de las pequeñas partículas Material Harina de trigo Otros posibles Tóner de impresora, colores para acuarela de la caja materiales de pintura, harina de rocas (en un centro de jardinería), tinta, cultivos de bacterias, arcilla para cerámica Método Que el material flote muy dispersado en agua Observación Las partículas flotantes suspendidas se mueven en trayectorias irregulares a través del medio de estudio. todos los granos de polen en la preparación mostraban un llamativo movimiento tembloroso. Se interesó por el fenómeno e investigó también sustancias inorgánicas finas, entre otras el granito pulverizado de una esfinge egipcia del Museo Británico. En todas las muestras pudo constatar el movimiento de temblor. Su interpretación fue que las partículas se mueven por sí mismas activamente.

Las observaciones de Robert Brown condujeron a sus contemporáneos al error de pensar que en estas partículas llenas de movimiento habían encontrado las denominadas mónadas, ya imaginadas por Platón y que luego jugaron un papel tan importante como unidades originarias de la materia en la filosofía idealista de Leibniz. Una interpretación inesperada del fenómeno la dio Albert Einstein en su tratado de 1905. Según ella, el incesante temblor se debería a las imperceptibles oscilaciones en la densidad del líquido en observación, afectadas por el efecto Schlieren, pero aún lejos de tener una

explicación satisfactoria. Sin embargo, la explicación que se puede leer habitualmente, muy simplificadora y según la cual un billar a la escala más pequeña, partiendo del continuo movimiento térmico de las moléculas del agua, provocaría el efecto visible en el plano de la microscopia, tampoco es del todo adecuada. Si los continuados golpes dados por las partículas del medio envolvente fuesen la causa del temblor, también un ladrillo fijado con cemento se tendría que mover en alguna dirección determinada si fuese alcanzado por todos lados por miles de bolas de tenis. El sencillo modelo convencional, según el cual los golpes determinados por el calor de partículas en el plano submicroscópico aparecerían como un temblor de las partículas danzantes, es ciertamente intuitivo, pero lamentablemente no correcto.

Los procesos en juego son de una naturaleza bastante más compleja.

Para leer más Rühenbeck (1998)

Movimiento browniano de una partícula en la preparación microscópica. La trayectoria ha sido reconstruida después de una grabación en vídeo.

Izquierda: borde del cubreobjetos; un serie de picos y muescas.

Derecha: cubreobjetos empañado con gotas de agua.

Muchos otros microscopistas comprobaron y corroboraron las observaciones de Brown.

El fenómeno se denomina desde entonces movimiento browniano.

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en el umbral de la vida

3.3 Las cianobacterias

En las montañas sobre la roca desnuda de paredes rocosas se pueden encontrar casi siempre bandas verticales anchas y negras que incluso en la literatura internacional especializada se conocen como trazos de tinta.

La base del reino vegetal

Izquierda: los llamativos trazos de tinta en las verticales paredes rocosas son en su mayoría tapetes microbianos de cianobacterias.

Derecha: en las franjas de esta formación de hierro bandeado de más de 1,5 mil millones años de edad se muestran los anteriores horizontes de oxidación que se remontan a alfombras de cianobacterias.

Los organismos activos desde un punto de vista fotosintético, unicelulares o con estructura filamentosa convencionalmente se llaman algas. También las especies llamadas algas azules, debido a su peculiar color turquesa o verde azulado o incluso rojizo, durante décadas se incluían en el grupo de las demás algas verdes, pardas y rojas y hasta se les había asignado una clase propia: Cyanophyceae. Hace ya décadas que con los mejores microscopios ópticos se vio que algo no encajaba en las algas azules: no se encontró núcleo celular ni plastidios. Solo la investigación posterior detallada y minuciosa aportó más información: las algas azules son procariotas y por tanto bacterias.

Las manchas de color verde negruzco en las partes inferiores de las paredes húmedas o en los cimientos sombreados de edificios son bastante feas pero vale la pena una inspección más detallada: se toma una prueba rascando, de la cual se transfiere una pequeña parte a un portaobjetos y se disuelve el material en una gota de agua con dos agujas de disección. La inspección microscópica muestra una maraña de delgadas estructuras filamentosas en las cuales células singulares esféricas o cúbicas están alineadas en largas cadenas no ramificadas. Es característica la uniforme coloración que presentan las cadenas celulares, un color verde azulado especial, a veces también con matices de color turquesa claro o marrón o colores azul rojizos.

También son útiles las muestras de canales permanentemente húmedos o de guijarros más grandes de un arroyo en cuya superficie se han depositado resbaladizas capas marrones.

Las células cambian el mundo La denominación moderna de cianobacterias hace hincapié en el hecho de que los géneros y especies en cuestión son sin duda procariotas y en la típica e inconfundible tinción de las células que no existe en otras algas unicelulares o filamentosas. Las bacterias verde azuladas contienen clorofila a de color verde claro, que también está presente en todas las algas eucarióticas y plantas superiores, pero además contienen unos carotenoides amarillentos y cantidades mayores de ficobiliproteínas azuladas o rojizas que están químicamente relacionadas con los pigmentos biliares. Estos tintes determinan según las proporciones de su mezcla el aspecto y el color de los organismos. Las formas que crecen bajo luz verde son más propensas a un color más rojizo que aquellas que se desarrollan en agua bajo luz azul. Este fenómeno se llama adaptación cromática. Pero al final este hecho no explica todos los matices de color que se encuentran en las cianobacterias.

El oxígeno de la atmósfera, del que depende toda la biosfera, es exclusivamente el producto de la fotosíntesis oxigénica de las plantas.

En la evolución de la vida, las cianobacterias fueron los primeros representantes de una

plan básico de la célula

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4 La célula y sus componentes 4.1 Plan básico de la célula La menor unidad indivisible estructural y funcional de todos los seres vivos es la célula. Solo ella posee todas las características de un sistema vivo y es capaz de proporcionar todos los servicios necesarios para la autopreservación como por ejemplo operar metabólicamente lejos del equilibrio químico.

Aunque muchas células están altamente especializadas, todas tienen unas bases comunes fundamentales. Según las diferencias características de su organización celular, los seres vivos pueden ser asignados a uno de los tres dominios Archaea, Bacteria y Eucarya. En la imagen microscópica se pueden reconocer claras diferencias entre células animales y células vegetales.

Se pasa un dedo limpio por el interior de la mejilla, se limpia la saliva adherida en un portaobjetos, se añade una pequeña gota de agua y se examina después de una tinción con > azul de metileno.

La mucosa bucal humana es un tejido de revestimiento (= epitelio) que como capa superior tapiza una superficie interior. Consiste en células laminares bastante planas con un contorno poco determinado que se exfolia con facilidad. Por ello en la preparación las células están dispersas o en pequeños grupos. Cada célula individual representa una típica célula animal: está limitada por la membrana plasmática, reconocible como fina línea. Como las células individuales habían sido tratadas algo duramente durante la preparación, en la delicada membrana hay por todas partes arrugas y pliegues.

Pero la forma de la célula ha sido poco afectada.

En el interior es bien visible el núcleo celular con su nucléolo. Una célula con núcleo celular se llama eucito.

En la observación con contraste de fases, los bordes de la célula así como el núcleo destacan por su relieve de los otros corpúsculos de la célula, finos y por ahora no identificables. Las células de rápida extracción de la mucosa bucal se utilizan a menudo como preparaciones de muestra en esta técnica de observación.

Con frecuencia se encuentran en las preparaciones de superficies celulares también restos de células y gran cantidad de bacterias teñidas de un azul profundo con azul de metileno (véase pág. 46 y sig). Así estas sencillas preparaciones ofrecen al mismo tiempo la oportunidad de contemplar la diferencia considerable de tamaño entre un protocito diminuto y un eucito de tamaño medio.

Todos los seres vivos son seres celulares La célula observada en la preparación de la mucosa bucal representa la unidad funcional de los seres vivos. Todas las funciones básicas características de la vida se encuentran ya en su totalidad y sin excepción en la célula. Por debajo del nivel organizativo de una célula, es decir, en la dimensión subcelular de sus componentes y otros niveles de ordenación, las características distintivas de

Tinción con azul de metileno pág. 270

Unidad en la diversidad

Células laminares epiteliales de la mucosa bucal La preparación es ideal para practicar la técnica del dibujo de objetos observados. Para la creación de un dibujo y la técnica de una representación simplificada véase el apartado “Dibujar las preparaciones” (pág. 263 y sig.).

Las células individuales de un organismo multicelular no pierden necesariamente su autonomía, pero la limitan en beneficio del todo y con el aumento de la especialización se vuelven más dependientes unas de otras.

cromosomas

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4.5 Cromosomas y división nuclear La característica más importante en la definición de la célula eucariótica (eucito) es su núcleo. A pesar de su excelente capacidad de tinción con tintes diferentes, en la imagen microscópica no es muy llamativo. Solo durante la división nuclear hay movimiento en esta estructura que se puede observar en el microscopio óptico. Precisamente el estudio más detallado del núcleo celular ha introducido la biología del siglo xx y xxi en una dimensión inesperada.

Varias preparaciones hasta ahora propuestas (véase pág. 60) han mostrado los núcleos celulares como cuerpos esféricos o elípticos, que en la célula vegetal, debido sobre todo al espacio ocupado por la vacuola, se encuentra por lo general cerca de la membrana plasmática, y en la célula animal está más bien en el centro de la célula. Casi siempre se observa una relación de medidas específicas para la especie entre el diámetro de la célula y el tamaño del núcleo, como se puede comprobar fácilmente mediante > mediciones.

En el microscopio óptico, el núcleo celular se muestra generalmente bastante pobre en cuanto a estructuras con excepción de los nucléolos presentes de forma individual o múltiple. La envoltura nuclear que rodea todo el espacio nuclear llamado carioplasma se muestra solo como una línea simple incluso con alta resolución e inmersión en aceite. Sin embargo está formada por una membrana doble que en toda su superficie presenta poros nucleares con un diámetro de 50-70 nm. La mayor parte del núcleo la ocupa la sustancia nuclear básica que, por su buena capacidad de tinción, ya en los inicios de la microscopia óptica recibió el nombre de cromatina. Esta consiste en el ADN del núcleo y algunas proteínas especializadas.

Crecer por división Los organismos uni- y pluricelulares se reproducen por división celular, donde la célula madre se divide en dos células hijas.

A la división celular precede siempre una división nuclear (= mitosis) que proporciona dos núcleos hijos genéticamente idénticos. Para poder realizar el seguimiento de las etapas individuales de la mitosis, en la preparación microscópica se necesita un tejido de proliferación. Para una preparación sencilla en las plantas son de fácil acceso los ápices de las raíces de crecimiento rápido.

Una cebolla se introduce en un vaso de yogur de manera que el disco de raíz apenas entre en contacto con el agua. Adecuadas para este cultivo de raíces son solo las jóvenes cebollas que no hayan sido tratadas con sustancias inhibidoras (como la mayoría de las cebollas del mercado). También se pueden utilizar los bulbos de tulipán o jacinto. Otros objetos son la haba (Vicia faba) o el ayocote (Phaseolus coccineus). En este caso, se fijan las semillas para germinar entre el papel secante húmedo y la pared interior de un tarro de mermelada de vidrio.

Una vez que las raíces tienen una longitud de 1-2 cm, se cortan 3 mm del ápice que se introducen para su fijación en una mezcla fría de > etanol-ácido

El núcleo está en el centro Medir pág. 262 y sig.

Mezcla de fijación Carnoy pág. 257

Como modelo de esta estructura importante se puede usar un hueso de melocotón con sus numerosos surcos.

Los cromosomas de las plantas monocotiledóneas son relativamente grandes. Por tanto se eligen por lo general especies de Allium o Lilium para la observación de la mitosis.

Muchas plantas crecen a un ritmo diario. El mejor momento para fijar los ápices radicales en crecimiento es la madrugada.

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organismos unicelulares y otros protistas

Izquierda: marisma con brillante película de diatomeas de color pardo dorado. Derecha: formas naviculoides se encuentran a menudo en muestras de tierra.

Diatomeas tubulares como Berkeleya ramosissima tienen macroscópicamente el aspecto de algas filamentosas. Muchas células individuales forman un tubo gelatinoso común en el cual se mueven de forma independiente.

Debido a que las diatomeas no desaparecen, se encuentran a veces de nuevo como material de construcción de origen animal, por ejemplo en las conchas de las amebas.

Como explicación de esta secuencia de movimientos se han ofrecido varios mecanismos bastante complejos. Simplificando se pueden resumir en el principio del vehículo oruga. En células que están atrapadas entre pequeños obstáculos dentro de la muestra se puede observar fácilmente como unas partículas pequeñas revolotean sobre las valvas.

Al parecer existen unas bandas de plasma que proporcionan a las células el impulso necesario. Únicamente los representantes con un rafe tienen movilidad propia. Por lo tanto, uno se imagina que en el citoplasma dentro del rafe se encuentra una estructura especial como un cordón a través del cual el plasma pasa como la cortina sobre la barra.

Caparazones de sílice a montones Aunque la imagen de barrido muestra un caparazón de diatomea como una estructura compacta y en apariencia sostenible, los caparazones son en realidad muy frágiles. Pero como las estructuras de silicatos puros no pueden descomponerse químicamente, mantienen su forma durante incluso largas épocas geológicas.

Los caparazones vacíos de diatomeas muertas se acumulan en el fondo de las aguas interiores o en el fondo del mar formando extensos depósitos a menudo estratificados. Acumulaciones de diatomeas de muchos metros de grosor de los últimos millones de años han sido explotadas como tierra de diatomeas para fines técnicos en minas a cielo abierto, por ejemplo en la Baja Sajonia (Lüneburg). Pero en la actualidad no hay depósitos accesibles. La tierra de diatomeas que se utiliza para diferentes propósitos técnicos se encuentra a veces en Bricodepot. También los comercios para el laboratorio ofrecen tierra de diatomeas como absorbente para la cromatografía en capa fina. Algunas veces los caparazones acumulados se pueden compactar en roca sólida: como diatomita por ejemplo aparecen en algunas rocas sedimentarias de los Alpes Centrales.

Para leer más Baumann (1986), Burba (2007), Dietle (1971), Göke (1974, 1978, 1984, 1988, 2003), Kalbe (1980), Krammer (1986), Lee (2009), Linne von Berg y Melkonian (2004), Meller (1985), Round et al. (1996), Schmidt (1937), Schrader (1961), Werner (1977), Wiertz (1990), Vangerow (1981)

mohos

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6.2 Microhongos filamentosos Un hecho muy molesto es el deterioro de los alimentos por hongos, exteriormente visible por la presencia del moho. Antes de eliminarlos con los residuos orgánicos se les puede observar al menos una vez en el microscopio. A pesar de su estructura simple, los mohos son unos organismos muy interesantes y sobre todo prolíficos.

El problema específico de la investigación de cultivos de mohos de la nevera o de colonias > de placas de captura son las conidiosporas. Con un manejo inadecuado se pueden verter al aire millones de esporas que, si se inhalan, pueden desencadenar peligrosas micosis orgánicas. La famosa “venganza de los faraones” fue una aspergilosis, ya que los arqueólogos levantaron nubes de esporas mientras buscaban en las recién descubiertas cámaras funerarias. Por lo tanto, los alimentos masivamente enmohecidos deben eliminarse preferentemente con el recipiente cerrado. Para las siguientes investigaciones se recomiendan solo mohos que no presentan problemas o aquellas colonias de microorganismos que tienen un riesgo de infección muy bajo.

Mohos: hongos en los alimentos En algunos alimentos, los mohos forman parte de su elaboración y no son una infección por accidente. El ejemplo más conocido son las muchas clases de quesos blandos, muy respetados sobre todo en Francia, que son la delicia de los gourmet: en las variedades Brie, Camembert y Roquefort la infección con hongos es un componente básico en el proceso de elaboración y sirve para proporcionar sus característicos sabores.

De la superficie de un Camembert o Brie se quita con una aguja de disección o una pinza puntiaguda una pequeña muestra de la placa bacteriana. Se introduce en una gota de agua o en solución de > azul de metileno o > lactofenol-azul de anilina diluida con agua en la proporción 2:1 y se observa con un aumento medio.

La imagen microscópica muestra, aparte de los glóbulos de grasa y otros componentes del queso (proteínas lácteas cuajadas), los largos hilos de células muchas veces ramificados de las especies de moho presentes.

En el caso del Camembert, se trata por lo general de la especie Penicillium camemberti. Llamamos hifas a los sistemas de hilos unifilares, mientras que su totalidad forma el micelio. Muchos de los mohos pertenecen a los ascomicetos, que reciben su nombre de sus característicos contenedores de esporas (ascos). Pero a menudo no se forman. En su lugar, los mohos se multiplican sobre todo, y a veces exclusivamente, de manera anamorfa: en el extremo de las hifas se desarrollan conidióforos especiales, característicos para cada especie, de los cuales se separan grandes cantidades de pequeñas esporas redondas (conidiosporas o conidios). En la especie Penicillium, los conidióforos ramificados como un moño tienen aspecto de un pincel de pocas cerdas. Por esta razón estas formas reciben también el nombre de moho pincel.

Mohoso y descompuesto

Hifas de moho sobre mermelada.

Mano que sostiene

Agar Micelio en Aguja de crecimiento disección

Para la retirada de material se abre la placa de Petri con cultivos de moho sólo por un lado.

Placas de captura pág. 291 Azul de metileno pág. 270 Lactofenol-azul de anilina pág. 279

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plantas por doquier

Izquierda: calco de película de la epidermis inferior de hiedra (Hedera helix).

Derecha: puerro (Allium porrum): en la epidermis de la hoja, los estomas están ordenados en filas longitudinales.

Corte transversal polar y ecuatorial y corte longitudinal de un estoma. Abajo: dos estados de funcionamiento: abrir y cerrar.

Medir pág. 262

interferencias, así como en la luz polarizada o con la luz lateral. También bajar el condensador al mínimo con el diafragma abierto puede facilitan a la observación.

Superficies en la tercera dimensión Las películas obtenidas por diferentes técnicas de calco reflejan como imagen de relieve todas las estructuras espaciales de la superficie de la epidermis utilizada. Permiten, por lo tanto, determinar el número, la disposición y el estado de funcionamiento de los complejos de estomas. Por lo general, en las películas de calco se puede calcular el número de estomas por unidad de superficie mucho mejor que en los cortes planos, donde restos del mesófilo verde pueden interferir en un recuento exacto. Si los resultados medios de cada campo visual, obtenidos en varios recuentos, se pasan a centímetros cuadrados o incluso a toda la superficie de la hoja (el área del campo visual con un aumento conocido se determina con un > ocular micrométrico y un micrómetro objetivo), se obtienen resultados impresionantes y sorprendentes de una magnitud de 1 x 106 estomas/dm2. Sin embargo, para la eficacia del intercambio de gases entre la hoja y la atmósfera no es solamente importante la cantidad de estomas en un lado de la hoja o en el otro. Una variable de control importante para la transpiración es también el grado de abertura que está regulado a través de un complicado sistema de factores. Películas de calco bien preparadas también dan una información fiable sobre el estado actual de abertura de los estomas en la epidermis de la hoja utilizada.

Sin horario de apertura Desde luego, la apertura y el cierre de los estomas se puede observar únicamente en las preparaciones vivas. Si se examinan células epidérmicas bajo agua, las células oclusivas de los estomas serán turgentes y, por lo tanto, estarán bajo presión y la ranura central se abrirá al máximo. El diámetro de la abertura del estoma, que es específico para cada especie, se determina mejor con el diafragma de abertura muy abierto y luz refractante con el ocular micrométrico.

Para iniciar el proceso de cierre se utiliza un truco osmótico. Después de hacer pasar unas gotas de una solución de sacarosa 1 molar aproximadamente (= 2 terrones de azúcar en 10 ml de agua), las células oclusivas liberan agua a causa del potencial hídrico exterior más alto (véase pág. 74 y sig.); se relajan y cierran la abertura. Naturalmente, este procedimiento es reversible.

Sustituyendo la solución de sacarosa por agua pura, se observa con el ocular micrométrico la lenta abertura de la ranura. Los movimientos realizados por las células oclusivas son, en su conjunto, relativamente menores, pero

sacos polínicos

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dimensión microscópica como un diseño muchas veces utilizado y que nos proporciona varias estructuras complejas.

Embalaje perfecto Si se elige el nivel de corte correcto, los cortes transversales de flores permiten observar también los estambres. En muchas plantas con flores, los cuatro sacos polínicos (microesporangios) de cada antera de un estambre están ordenados entre sí como las alas de una mariposa. En esta figura con forma de mariposa, cada pareja de sacos polínicos (= “pareja de alas” derecha e izquierda) forman las tecas de la antera, que están unidas por el tejido conectivo central (conectivo). La antera a su vez está situada sobre un filamento pediculiforme redondo. El filamento y la antera forman el estambre.

En la imagen de la flor de prímula, en una esquina está el círculo de cinco partes de estambres. En la región central del corte transversal de la antera, se puede detectar un haz vascular de desarrollo relativamente débil, pero que tiene la importante tarea de transportar todos los materiales necesarios para el desarrollo del polen en los departamentos de polen (lóculos), ya que no hay actividad fotosintética en los estambres y son, por lo tanto, regiones que necesitan suministro de sustancias nutritivas. El desarrollo del polen y la meiosis se llevan a cabo mucho antes de que se abra la flor (véase pág. 85).

Particularmente llamativas son las distintas capas que participan en la formación de la pared de los cuatro sacos polínicos y que hacia los flancos exteriores consisten en capas celulares concéntricas. En la parte externa, se inicia la secuencia con una epidermis de delgadas paredes, que en las anteras se denomina exotecio. Hacia el interior sigue con una capa celular subepidérmica, el endotecio, cuyas células de gran volumen interno reciben una configuración particular durante la maduración de las anteras. Durante el crecimiento se forman fibrosas barras de engrosamiento que convergen en la parte basal de la célula cual dedos de una mano y disminuyen un poco hacia fuera. Esta capa de fibra subepidérmica es típica de las angiospermas; en las gimnospermas este reforzamiento fibroso de la pared celular se encuentra en la epidermis. Los materiales para la construcción de la pared almacenados para el fortalecimiento, principalmente microfibras de celulosa, son birrefringentes (anisótropas) y, por lo tanto, brillan en la luz polarizada.

Punto de ruptura preformado Si se sigue la disposición de las células fibrosas con más precisión, se puede observar que el endotelio está formado por dos o tres capas en las áreas de contacto con el conectivo. Cabe destacar que la franja brillante de las células fibrosas no está cerrada. En el punto de unión en el conectivo entre el borde trasero del “ala” anterior con el borde anterior del “ala” trasera, si miramos espacialmente, existe un hendidura longitudinal entre los sacos polínicos y en algunas células falta el reforzamiento fibroso. Esta hendidura se denomina estomio y por ella se abren los sacos polínicos para liberar su carga de polen. Para esto la pared del saco polínico se separa del conectivo como una cremallera y se curva mucho hacia el exterior debido a la tensión en las células fibrosas.

Izquierda: arcos espiraloides en las inflorescencias de ojo de buey (Anthemis tinc­toria).

Derecha: retama negra (Cytisus scoparius); corte transversal de la flor como diagrama floral.

1 2 3 4

Corte transversal de una pared de antera: 1 epidermis, 2 capa fibrosa, 3 capa intermedia, 4 tapete.

Prímula (Primula acaulis): corte transversal de la antera.

En la luz polarizada (abajo), se muestran las barras de refuerzo en la capa fibrosa.