30 FAGLIGT
En mulig forklaring på, hvordan hornhinden har fået sin anatomiske form I
AF JOHANNA TUKLERHENRIKSSON,B.SC. OPTOM
Læs artiklen og glæd dig til at møde forfatteren Johanna Tukler-Henriksson på kontaktlinsekonferencen i København den 13.-14. november 2010.
mere end halvandet århundrede har det været kendt, at den menneskelige hornhinde er tykkere periferisk og tyndere centralt, det vil sige formet som et timeglas eller en negativ linse. En anatomisk forklaring på dette tykkelsesforhold er dog aldrig blevet givet1. I dag er musen det mest anvendte forsøgsdyr i øjenforskningen2 på grund af, at der findes mange forskellige arter, at den forplanter sig hurtigt og er kosteffektiv at arbejde med. Et af vore tidlige studier konkluderede, at musens hornhinde har en distinkt forskel i tykkelsen mellem den central og perifere hornhinde, og at denne kan være helt op til 60 %. Til forskel fra menneskene er musens hornhinde tykkere centralt og tyndere perifert, altså formet som en positiv linse (Figur 1). På trods af at tykkelsesforskellen i musens hornhinde er modsats menneskets kan den stadig studeres som en model og give os en forklaring på, hvordan en tykkelsesvariation anatomisk er blevet til. Næsten uden undtagelse har tidligere beskrivelser fremhævet, at den menneskelige hornhindes lameller er konstrueret som broer fra limbus til limbus 3,4,5,6 , men en ny rapport indikerer, at det måske ikke er tilfældet med alle lameller7. Derfor er det tænkeligt, at en korneal tykkelsesvariation kan have sin forklaring i antallet af lameller tilstede perifert og centralt. I dette studie undersøges den hypotese, at musen har flere lameller ved korneale apex end ved den limbale kornea. Keratocyter er den hovedsaglige
type af celler, som forekommer i det korneale stroma. Det anslås, at den voksne hornhinde indeholder cirka 1.4 millioner keratocyter.8,9 Disse celler kan studeres både med et lysog et elektron-mikroskop i et vertikalt snit gennem hornhinden10,11,12,13 og genfindes hovedsaglig mellem stromas lameller.14,15 Er det derfor muligt, at antallet af keratocyter, som genfindes fra anterialt til posterialt i et tværsnit kan give et fingerpeg om antallet af lameller, der bidrager til den korneale tykkelse ved et bestemt punkt på kornea? Målet med dette studie, som anvender musens hornhinde som model, var anatomisk at forklare den korneale tykkelsesvariation og etablere, om antallet af keratocyter regnet axialt kan give indblik i antallet af tilstedeværende lameller.
Metoder Alle eksperimenter er udført i henhold til myndighedernes retningslinjer og i henhold til ARVOs regler for anvendelse af forsøgsdyr indenfor oftalmologisk og øjenrelateret forskning. Seks voksne, 6 til 8 uger gamle C57BL/6 mus blev aflivet, og et par dråber fixativ 2% glutaraldehyde i 80mM sodium cacodylate buffer, 330mMOsm/kg16 blev tilføjet direkte på hornhinden. Siden forberedtes og farvedes vævet til elektron-mikroskopi (TEM). Vævet placeredes i kobberskåle (200MP, Cat # G200P, Electron Microscopy Sciences) og undersøgtes i et ett Tecnai G2 Bio Twin Spirit (FEI Company, USA) elektronmikroskop. Overlappende digitale fotos blev taget med 890 gange forstørrelse over den totale tykkelse af hornhinden både centralt og perifert. Fo-
tografierne blev stykket sammen til en montage og afbildedes endeligt i en forstørrelse på cirka 5000 gange (Figur 2). Antallet af lameller blev beregnet, og deres tykkelse målt både centralt og perifert ved hjælp af på forhånd etablerede kriterier17. I henhold til disse kriterier kendetegnes to lameller ved, at de har en distinkt kontrast-skillelinje. Ved tydelige forgreninger af lameller opdaget i et billede, blev alene en af grenene talt med. Forekomst af en keratocyt blev taget som en indikation om, at der fandtes en lamelgrænse, og lameller tyndere end 0.2 μm blev ikke inkluderet 17. For at opnå en konsistent beregning af lamellernes tykkelse defineredes den perifere cornea som præcis anterialt med de limbale blodkar og trabekulum. Den centrale hornhinde defineredes som halvdelen af den corneale diameter ± 14 % fra de perifere [riktmärkena] (Figur 1). Den corneale diameter for C57BL/6 musene er 2.6 mm.18 Antallet af keratocyter kvantifierades også langs en anterialposterial linje både ved hjælp af et lysmikroskop på 1 μm tykke vævssnit farvet med toluidine blå og ved hjælp af et elektronmikroskop, for at fastslå, om det er muligt at antallet af keratocyter i et tværsnit kan give en indikation af, om antallet af eksisterende lameller.
Resultat Morfologisk var det corneala stroma hovedsagligt formet af kollagenfibre organiserat i lameller. De flesta af dissa lameller var avgrænsede og arrangerade som flade skiver, der gik parallellt med hornhindens epi-
31 Referencer
Figur 1. Vævudsnit farvet med toluidine blå, som viser tykkelsesforskellen mellem den centrale og perifere del af musens hornhinde (40X).
i antallet af celler mellem den centrala och perifere hornhinde. Dog etablerades ingen forskel mellem antaltet af målte keratocyter i den centrala og perifera hornhinde når keratocyterna måltes ved hjælp af ett elektronmikroskop. Denne forskel mellem metoderne beror tænkeligt på, at vævsudsnittene som blev undersøgt under et lysmikroskop er tykkere, h vilket tillader at flere keratocyter bliver inkluderet i beregningen. Keratocyterna er ikke ensartet nedlagt med en celle direkte overfor en anden, men i stedet spredt ud horisontalt i cornea. Når det handler om at vurdere, om antallet af eksisterende celler kan give en indikation af antallet af lameller udviklet i en corneal region i forhold til en anden, er lysmikroskopet derfor den bedre metode at anvende.
Konlusioner
Figur 2. tel og PLL. Til forskel fra mennesker har musen ikke noget ALL, hvilket vi har berettet i Investigative Ophthalmology Visual Science.18 Keratocyter fandtes regelmæssigt mellem lamellerne. Ifølge dette studie kan hele 50%, alltså den væsentligste del af musens hornhindes tykkelsesforskel, forklares med et færre antal lameller perifert i forhold til centralt. En yderligere faktor, der bidrager til 20% af tykkelsesforskellen, er at lamellerna mindskes i tykkelse perifert. Epitelet bidrager også til den perifere tykkelsesforskel og står for 30% af den totale fortynding. Studiet viste også at når keratocyterna måltes axialt ved hjælp af et lysmikroskop afsløredes en forskel
Montage af central og perifer muse-cornea.
Dette studie viste altså, at musens hornhinde indeholder færre lameller, og at de er tyndere perifert sammenlignet med centralt. Dette er en vigtig observation, da det kraftigt antyder, at alle stromas lameller ikke går fra limbus til limbus, hvilket strider imod stort set al tidigere litteratur. En anden interessant opdagelse var, at når keratocyter taltes axialt med et lysmikroskop kunne antallet af celler give et indtryk af forholdet mellem antallet af eksisterende lameller centralt sammenlignet med perifert. Tykkelsesforskellen i den menneskelige hornhinde, med dens centrum tyndere end periferien, har sandsynligvis en lignende anatomisk forklaring. Øget indsigt i stromaets arkitektur er nødvendig for udvidet forståelse af konreal ødem og sygdomme, som dræber det corneala stromat, for eksempel keratokonus, men også for bedre at kunne forudse det kliniske resultat og komplikationer efter refraktivkirurgi, samt bedre fortolkning af kliniske virkninger efter ortokeratologi.
En stor tak En stork tak til Optikbranchen for det årliga stipendie og for rejsestipendiet, som blev tildelt til rejsen til ARVO.
1. Gerlach J. Handbuch der allgemeinen and speciellen gewebelehre des menschlichen körpers. Mainz, Verlag von Eduard Janitsch, 1854. 2. Smith RS, John SWM, Nishina PM, Sundberg JP. The anterior segment and ocular adnexae, Smith RS. Systematic Evaluation of the Mouse Eye, Anatomy, Pathology and Biomethods, Boca Raton, FL, CRC Press;2002:3-24. 3. Duke-Elder S, Wybar KC. DukeElder S. The eye. In: System of ophthalmology, vol 2. The anatomy of the visual system, St Louis. Henry Kimpton; 1961:92-131. 4. Hogan MJ, Alvarado JA, Weddell JE. Histology of the Human Eye. Philadelphia: WB Saunders; 1971;55-111. 5. Klyce SD, Beuerman RW. Structure and function of the cornea. Kaufmann HE, Barron BA, McDonald MR. The Cornea, Boston. Butterworth-Heinemann, 1998;14. 6. Edelhauser HF, Ubels JL. The cornea. Kaufman PL, Alm A. Adler’s Physiology of the Eye, St. Louis, CV Mosby, 2003;56. 7. Mathew JH, Bergmanson JPG, Doughty MJ. Fine structure of the interface between the anterior limiting lamina and the anterior stromal fibrils of the human cornea. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008;49(9):3914-3918. 8. Möller-Pedersen T, Ledet T, Ehlers N. The keratocytedensity of human donor corneas. Curr Eye Res. 1994;13:163-169. 9. Möller-Pedersen T, Ehlers N.A three-dimensional study of the human corneal keratocyte density. Curr Eye Res. 1995;14:459-464. 10. Goldman JN, Benedek GB, Dohlman CH, Kravitt B. Structural alterations affecting transparency in the swollen human cornea. Invest Ophthalmol. 1968;7:501-519. 11. Hamada R, Giraud J-P, Graf B, Pouliquen Y. Etude analytique et statistique des lamellas, des keratocytes, des fibrilles de collagene de la region centrale de la cornee humaine normale (Microscopique optique et electronique). Arch ophthalmol (Paris). 1972;32:536-570. 12. Kuwabara T. Current concepts in anatomy and histology of the cornea. Contact Intraocular Lens Med J. 1978;4:101-132. 13. Müller LJ, Pels L, Vrensen GFJM. Novel aspects of ultrastructural organization of human corneal keratocytes. Invest Ophthalmol Vis Sci. 1995;36():2557-2567. 14. Doughty MJ, Seabert W, Bergmanson JPG, Blocker Y. A descriptive and quantitative study of the keratocytes of the corneal stroma of albino rabbits using transmission electron microscopy. Tissue Cell. 2001;33(4):408-422. 15. Bergmanson JPG. Clinical ocular anatomy and physiology. 16th edition. Houston, Texas Eye Research and Technology Center; 2009:67-94. 16. Doughty MJ, Bergmanson JPG, Blocker Y. Shrinkage and distortion of the rabbit corneal endothelial cell mosaic caused by a high osmolarity glutaraldehyde-formaldehyde fixative compared to glutaraldehyde. Tissue Cell. 1997;29(5):533-547. 17. Bergmanson JPG, Horne J, Doughty MJ, Garcia M, Gondo M. Assessment of the number of lamellae in the central region of the normal human corneal stroma at the resolution of the transmission electron microscope. Eye Contact Lens. 2005;31(6):281287. 18. Tukler Henriksson J, McDermott AM, Bergmanson JPG. Dimensions and morphology of the cornea in three strains of mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. Accepted February, 2009.