V17n06o 21 e1 5 by Dental Press International

artigo inédito

Citotoxicidade de alginatos de uso ortodôntico Matheus Melo Pithon1, Rogério Lacerda dos Santos2, Fernanda Otaviano Martins3, Maria Teresa Villela Romanos4

Objetivo: avaliar a citotoxicidade de três diferentes alginatos de uso ortodôntico. Métodos: foram avaliados três diferentes alginatos divididos em três grupos, denominados grupo JCO (Jeltrate Chromatic Ortho), OP (Orthoprint) e CO (Carrex Orthotrace). Três grupos controle também participaram: controle + (C+), constituído pelo detergente celular Tween 80; controle - (C-) PBS; e controle de célula (CC) onde as células não foram expostas a nenhum material. Após manipulação dos materiais, seguindo as orientações do fabricante, foram confeccionados corpos de prova utilizando-se anéis de silicone. Em seguida, esses foram imersos em meio mínimo essencial de Eagle (MEM) por 2min, onde, então, procedeu-se à remoção do sobrenadante e à colocação em contato com fibroblastos L929. Após contato com o meio, as células foram incubadas por mais 24h onde, então, foi adicionado o corante vermelho neutro a 0,01%. Passado esse período, foram fixadas e, então, realizada contagem de células viáveis em espectrofotômetro (BioTek, Vermont, EUA) em um comprimento de onda de 492nm. Resultados: os resultados demonstraram diferenças estatística entre os grupos CC e C- com os demais. O grupo experimental JCO mostrou-se com maior citotoxicidade, seguido pelos grupso OP e CO. Conclusões: pode-se concluir, com a realização desse trabalho, que todos os alginatos testados mostraram caráter citotóxico. Palavras-chave: Citotoxicidade celular anticorpo-dependente. Materiais para moldagem odontológica. Técnicas de cultura de células.

Como citar este artigo: Pithon MM, Santos RL, Martins FO, Romanos MTV. Cytotoxicity of alginate for orthodontic use. Dental Press J Orthod. 2012 Nov-Dec;17(6):21. e1-5.

Professor de Ortodontia, Universidade Estadual do Sudoeste da Bahia.

Professor de Ortodontia, Universidade Federal de Campina Grande.

Enviado em: 05 de janeiro de 2009 - Revisado e aceito: 16 de agosto de 2009

Mestre em Tecnologia de Imunobiológicos, Unidade BioManguinhos, Fundação Oswaldo Cruz – FIOCRUZ.

» Os autores declaram não ter interesses associativos, comerciais, de propriedade ou financeiros, que representem conflito de interesse nos produtos e companhias descritos nesse artigo.

Professora de Virologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Endereço para correspondência: Matheus Melo Pithon Av. Otávio Santos, 395 – Sala 705 – Centro CEP: 45020-750 – Vitória da Conquista/BA E-mail: matheuspithon@gmail.com

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Citotoxicidade de alginatos de uso ortodôntico

artigo inédito

INTRODUÇÃO Durante a elaboração do plano de tratamento ortodôntico, o ortodontista deve contar com uma documentação detalhada e completa a fim de se obter todas as informações necessárias para um correto diagnóstico e subsequente plano de tratamento4,19. Segundo Monti15, a moldagem é a primeira operação a ser realizada ao iniciar o tratamento ortodôntico, sendo um dado complementar ao diagnóstico. Uma moldagem adequada é requisito fundamental para confecção de modelos ortodônticos de estudo, dos quais são extraídos dados que auxiliarão na condução do tratamento4,19,22. O alginato, ou hidrocoloide irreversível, é o material de moldagem mais aceito e utilizado na Ortodontia. Os fabricantes, com o objetivo de manufaturar alginatos com características importantes para o ortodontista, produzem o pó de alginato ortodôntico com modificações em seus componentes. Muitas substâncias, como zinco, bário, cádmio, silicatos de chumbo e fluoretos, são adicionados em algumas marcas comerciais com o objetivo de melhorar suas propriedades físicas, químicas e mecânicas, causando preocupação no que se refere à toxicidade desse material11. Basicamente, a intoxicação com alginato pode dar-se por inalação do pó pelo paciente e profissional, ingestão acidental pelo paciente e absorção pela mucosa bucal em casos de repetidas moldagens2,3,24. Durante uma moldagem, o alginato entra em contato íntimo, por um tempo de cerca de dois minutos, com a mucosa bucal, que é altamente vascularizada e possui grande potencial de absorção. Sendo assim, a repetição de moldagens consecutivas poderia causar certo grau de toxicidade ao paciente, dependendo da composição do material20,2. Baseado nessa premissa, o presente artigo tem o objetivo avaliar a citotoxicidade de três diferentes alginatos de uso ortodôntico em cultura de célula.

2,5mg/ml de fungizona (Bristol-Myers-Squibb, EUA), 0,25ml solução de bicarbonato de sódio (Merck, Alemanha), 10mm de HEPES (Sigma, EUA), e 10% de soro fetal bovino (SFB) (Cultilab, Campinas), e mantida a 37ºC em ambiente contendo 5% de CO2. Alginatos avaliados A amostra foi composta de três diferentes alginatos de uso ortodôntico, divididos em três grupos: JCO (Jeltrate Chromatic Ortho, Dentsply, Petrópolis – Lote 955069), OP (Orthoprint, Itália, Lote 72251) e CO (Cavex Orthotrace, Países Baixos, Lote 080910). Composição dos alginatos avaliados (fornecido pelos fabricantes) Diatomita, alginato de potássio, sulfato de cálcio, óxido de magnésio, óxido de ferro, tetrasódio pirofosfato e óleo de hortelã. Confecção dos corpos de prova Para confecção dos corpos de prova, o material foi manipulado por um minuto utilizando-se cubeta de borracha e espátula plástica, seguindo as recomendações do fabricante. Após correta homogeneização, o alginato foi inserido em anéis de silicone nas dimensões de 4mm de diâmetro por 4mm de altura, até sua completa geleificação. Controles Para verificar a resposta celular frente aos extremos, outros três grupos foram inseridos: grupo CC (controle de célula), no qual as células não foram expostas a nenhum material; grupo C+ (controle positivo), constituído de um detergente Tween 80 (Polioxietileno-20-Sorbitan) a 10%; e C- (controle negativo), solução de PBS (tampão fosfato-salino) a 100%. Ensaio de citotoxicidade dos materiais Os materiais foram esterilizados previamente por exposição à luz UV (Labconco, EUA) durante uma hora. Em seguida, três amostras de cada material foram colocadas em placas de 24 poços contendo meio de cultura (Cultilab, Campinas). Após dois minutos de contato com o meio de cultura, os sobrenadantes foram coletados para posterior avaliação quanto à toxicidade para as células L929. Os sobrenadantes foram colocados, em triplicata, em uma placa de 96 poços contendo

MateriaL e Métodos Cultura de células A linhagem celular utilizada foi a L929 (fibroblasto de camundongo), obtida do American Type Culture Collection (ATCC, Rockville), cultivada em meio mínimo essencial de Eagle (MEM) (Cultilab, Campinas), suplementado com 2mm de L-glutamina (Sigma, EUA), 50mg/ml de gentamicina (Schering Plough, EUA),

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Tabela 1 - Média, desvio-padrão, percentagem de células viáveis e análise estatística dos grupos avaliados.

monocamada confluente de L929 e incubados por 24 horas a 37ºC em ambiente contendo 5% de CO2. Terminado o tempo de incubação, o efeito na viabilidade celular foi determinado por meio da técnica dye-uptake, descrita por Neyndorff et al.16 Após 24 horas de incubação, foram adicionados 100ml de vermelho neutro a 0,01% (Sigma, St. Louis, EUA), em meio de cultura, em cada poço das microplacas, e essas foram incubadas a 37ºC por três horas para penetração do corante nas células vivas. Passado esse período, após desprezar o corante, foram adicionados 100ml de solução de formaldeído (Reagen, Rio de Janeiro) a 4% em PBS (NaCl 130mm; KCl 2mm; Na2HPO4 2H2O 6mm; K2HPO4 1mm; pH 7,2) por cinco minutos, para promover a fixação das células às placas. Em seguida, para a extração do corante, foram adicionados 100ml de uma solução de ácido acético (Vetec, Rio de Janeiro) a 1% com metanol (Reagen, Rio de Janeiro) a 50%. Após 20 minutos, a leitura foi realizada em espectrofotômetro (BioTek, EUA) em um comprimento de onda de 492nm.

M. Cel / D.P.

% células viáveis

Est.

JCO

644,25 ± 193,59

50,6

617 ± 173,86

48,46

560,87 ± 23,60

44,05

C+

67 ± 2,20

5,26

C-

1111,5 ± 67,85

87,31

1273,75 ± 125,71

100

M. Cel: valores médios da quantidade de células viáveis; DP: desvio-padrão; Est: Estatística, onde letras iguais representam ausência de diferenças estatísticas.

Citotoxicidade (células viáveis)

1500,000

Análise estatística As análises estatísticas foram realizadas com auxílio do programa SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, EUA). A análise estatística descritiva, incluindo média e desvio-padrão, foram calculadas para os grupos avaliados. Os valores da quantidade de células viáveis foram submetidos à análise de variância (ANOVA) para determinar se haviam diferenças estatísticas entre os grupos, e, posteriormente, ao teste de Tukey.

1200,000

900,000

600,000

300,000

0,000 c ati

m hro

C te

tra Jel

tho

e ac otr

rin

th Or

x ve Ca

th Or

C+

C-

Materiais avaliados e controles

Figura 1 - Diagrama em caixas demonstrando os valores de viabilidade celular entre os grupos avaliados.

como zinco, bário, cádmio, silicatos de chumbo e fluoretos são adicionados em algumas marcas comerciais com o objetivo de melhorar suas propriedades físicas, químicas e mecânicas, causando preocupação no que se refere à toxicidade desse material6. De acordo com Syndiskis et al.24, o alginato tem a capacidade de afetar a habilidade das células em se reproduzir; isso é, a substância pode não ser tóxica o suficiente para matar as células, mas é tóxica para inibir o crescimento celular ou, em pequena escala, afetar a função celular normal. O significado clínico disso é que, enquanto um único contato pode não causar sintomas clínicos, contatos repetidos com o material alteram ou afetam a viabilidade das células, podendo resultar em reação tóxica tardia ou alérgica. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a citotoxicidade de três alginatos de uso ortodôntico em cultura de células.

Resultados Os resultados demonstraram diferenças estatísticas entre o grupo C+ com todos os outros e entre os grupos C- e CC com os grupos experimentais JCO, OP e CO (p < 0,05). Ausência de significância estatística foi observada entre os grupo JCO, OP e CO, e entre os grupos C- e CC (p > 0,05) (Tab. 1). Com relação à viabilidade celular, o grupo C+ apresentou a menor viabilidade, seguido pelos grupos experimentais CO, OP e JCO (Fig. 1). Discussão O alginato é o material de moldagem mais aceito e utilizado na Ortodontia. Os fabricantes produzem o pó de alginato ortodôntico contendo vários componentes, com diferentes finalidades. Muitas substâncias,

Grupo

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Citotoxicidade de alginatos de uso ortodôntico

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A utilização de cultura de células vem sendo utilizada como parte de uma série de testes recomendados para avaliar o comportamento biológico dos materiais a serem colocados em contato com tecidos humanos9,14,21. Nesse estudo, testes de citotoxicidade foram realizados para avaliar a citotoxicidade dos alginatos. Utilizou-se linhagem de célula L929 (fibroblastos de camundongos), bastante utilizada em diversos trabalhos onde pretende-se avaliar a citotoxicidade de materiais de uso odontológico1,8,10,13. O método utilizado para avaliação da viabilidade celular foi com a utilização do vermelho neutro. O procedimento de análise do vermelho neutro é um ensaio de sobrevivência/viabilidade celular, baseado na capacidade das células viáveis de incorporar e combinar o vermelho neutro dentro dos lisossomos. Normalmente, é realizado em células aderentes. O vermelho neutro é um corante catiônico fraco, que penetra prontamente na membrana celular e se acumula intracelularmente nos lisossomos (pH lisossômico < pH citoplasmático), onde se combina com a parte aniônica da matriz lisossômica12. Tais alterações ocorridas pela ação de xenobióticos resultam na diminuição da absorção e combinação do vermelho neutro. Assim, é possível distinguir células viáveis, danificadas ou mortas, o que é a base do ensaio. A quantidade de corante incorporado às células é medida por espectometria, e é diretamente proporcional ao número de células com membrana intacta. Esse método foi utilizado, primeiramente, para avaliação de citotoxicidade de materiais de uso ortodôntico por Pithon et al.17, que compararam esse com o método de difusão de ágar, onde ambos os métodos mostraram-se aptos para avaliação citotóxica. Os resultados do presente trabalho demonstraram citotoxicidade das três marca de alginatos estudados, sendo o menos citotóxico o Jeltrate (50,6% de viabilidade celular), seguido do Orthoprint (48,46%) e do Carrex Orthotrace (44,05%). Diferenças estatísticas foram encontradas entre os grupos experimentais com os controles de célula (CC) e o negativo (C-). Não foi observada diferença estatística entre os grupos experimentais avaliados,o que pode ser justificado pela constituição semelhante desses materiais.

O tempo de avaliação foi de dois minutos, tempo baseado no tempo máximo que o alginato fica em contato com a mucosa bucal durante o processo de moldagem recomendado pelo fabricante. Os corpos de prova ficaram em contato com o meio de cultura por esse período, após isso, foi coletado o sobrenadante do meio de cultura que foi, então, colocado em contato com as células. Os corpos de prova não foram colocados diretamente com as células, uma vez que o contato mecânico desses com as células poderiam lesa-las, como sugerido por Costa5. Visando avaliar a resposta celular frente à situações extremas, foi inserido ao trabalho um grupo controle positivo (C+) que teve como função gerar lesões às células. O material utilizado como controle positivo foi o Tween a 10%, que é um surfactante não-iônico, tóxico às membranas biológicas18, constituído por ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitol, que tem como característica estimular a secreção de proteínas em microrganismos23, além de alterar a morfologia e a superfície da parede celular7. Como esperado, o controle positivo apresentou alta toxicidade, sendo estatisticamente diferente de todos outros grupos (p < 0,05). O grupo controle negativo constituiu-se de uma solução de PBS a 100%, reconhecidamente não tóxica às células. Esse controle visou avaliar apenas a ação física sobre as células, sendo que demonstrou baixa citotoxicidade, com ausência estatística com o grupo controle de célula, no qual nenhuma substância foi colocada em contato com as células. Diante dos resultados observados, deve-se considerar que o sucesso na clínica ortodôntica não envolve somente o domínio da técnica corretiva para atingir o ideal em oclusão dentária, mas, também, requer a aplicação das normas de biossegurança e a preocupação com as consequências locais e sistêmicas dos materiais dentários utilizados para tal. A avaliação quanto aos possíveis efeitos citotóxicos deve ser verificada a fim de se obter maior segurança quanto ao uso de um determinado material. ConclusÃO Pode-se concluir com a realização desse trabalho que todos os alginatos avaliados demonstraram citotoxicidade celular, não apresentando diferenças estatísticas entre si.

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