Prueba experimental de selección genómica de resistencia al virus del síndrome de la Mancha Blanca para aumento de supervivencia en el camarón blanco

Autores: Marie Lillehammer 1, Rama Bangera2, Marcela Salazar3, Sergio Vela2, Edna C. Erazo3 , Andrés Suarez3, James Cock 3, Morten Rye 2 & Nicholas Andrew Robinson 1,4

1Breeding and Genetics, Nofima, 1430 Ås, Noruega. 2Benchmark Genetics Norway AS, 6600 Sunndalsøra, Noruega. 3Benchmark Genetics Colombia, Bogotá, Colombia. 4 Laboratorio de Acuicultura Sostenible - Templado y Tropical (SALTT), Escuela de Biociencias, Universidad de Melbourne, Parkville 3010, Australia.

Artículo publicado por Sicentific Reports www.nature.com/scientificreports

nick.robinson@nofima.no El virus del síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) causa importantes pérdidas en el cultivo de camarón alrededor del mundo. El desarrollo de poblaciones de camarón resistentes es una opción atractiva para el manejo de la enfermedad. Sin embargo, la heredabilidad de resistencia al WSSV es generalmente baja y la mejora genética por selección convencional ha sido lenta. Este estudio fue diseñado para determinar la potencia y precisión de una selección genómica para mejorar la resistencia al WSSV en Litopenaeus vannamei. Los organismos se pusieron a prueba con WSSV y la resistencia se evaluó como muertos o vivos (DOA) 23 días después de ser infestados. Todos los camarones de la prueba de ensayo fueron genotipados para 18,643 polimorfismos de un solo nucleótido. Los candidatos a reproductores (G0) se clasificaron según valores genómicos reproductivos para su resistencia al WSSV. Se produjeron dos poblaciones G1, una de reproductores G0 con valores genéticos estimados altos, y la otra con valores genéticos bajos. Se produjo una tercera población a partir del apareamiento “aleatorio” del stock de reproductores. La supervivencia promedio fue del 25% en los grupos de bajo valor genómico, 38% en grupo de los aleatorios y 51% en el grupo de los de alto valor genómico. La heredabilidad genómica para los DOA (0.41 en G1) fue alta para este tipo de rasgo. La ganancia genética y la alta heredabilidad obtenidas demuestran claramente un gran potencial para mejoras genéticas adicionales de resistencia al WSSV en la población evaluada de L. vannamei usando la selección genómica.

La enfermedad causada por el virus del síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) es un grave problema para el cultivo de camarón a nivel mundial. Infecta a la mayoría de especies de camarón usadas para cultivo y es altamente virulento causando normalmente la muerte en unos pocos días1 . Las prácticas de cultivo, principalmente enfocadas a eliminar el agente causal, pueden reducir los riesgos económicos asociados con la enfermedad de la Mancha Blanca2, pero su eliminación en sistemas de estanques abiertos a menudo es imposible3 . Las principales estrategias utilizadas en todo el mundo para hacer frente a infecciones virales en camaroneras implican el uso

de protocolos de bioseguridad y obtener camarón de rápido crecimiento, libre de patógenos pero susceptible al WSSV, antes de que ocurra una infección y la muerte4–6 , o cultivar camarón cuando la temperatura del agua es más alta y la enfermedad no prospera2. Las estrategias de eliminación pueden ser efectivas si se combinan con buenas prácticas de manejo7, pero el camarón a menudo sucumbe rápidamente a enfermedades y la provisión de poblaciones libre de patógenos resistentes al WSSV beneficiaría enormemente a la industria.

El camarón carece de un sistema inmunológico adaptativo, dependiendo del sistema inmunológico innato para prevenir, tolerar y eliminar infecciones, consulte sobre la inmunidad de crustáceos8. Por lo tanto, varios enfoques convencionales utilizados en otros animales, como la vacunación para estimular la respuesta inmune y brindar protección, han tenido un éxito limitado para camarón. Aunque la estimulación del sistema inmunológico innato a través de la preparación inmunitaria para prevenir y controlar enfermedades específicas en camarón parece prometedora, la eficacia de tales métodos aún no ha sido probada en condiciones de campo9-11. Se está generando conocimiento sobre la respuesta defensiva a la infección, pero los mecanismos específicos asociados con una mayor resistencia o tolerancia a la enfermedad en poblaciones o individuos específicos, no han sido concluyentes. No obstante, existe información sustancial que se puede utilizar para orientar a los laboratorios en sus esfuerzos por producir poblaciones resistentes.

Las estimaciones de heredabilidad de resistencia al WSSV en Litopenaeus vannamei oscilan entre 0.01 y 0.31 dependiendo del lote de camarón, el rasgo analizado (por ejemplo, días de supervivencia o binarios vivo o muerto), el método de ensayo aplicado y los modelos estadísticos utilizados para la estimación de parámetros genéticos12-16 . La mejora simultánea del crecimiento y resistencia al WSSV con la selección índice tradicional, se complica por una correlación genética negativa (-0.55 a – 0.64) entre estos rasgos12,16. La heredabilidad del número de copias virales de la Mancha Blanca (0.18) y la supervivencia en estanques (0.16) ante los brotes de WSSV en camaroneras es baja16,17. La ganancia genética después de la selección depende de la heredabilidad del rasgo seleccionado en esa población y su varianza fenotípica (varianza genética), la precisión de la estimación del valor genético y la intensidad de la selección aplicada. La ganancia genética reportada por generación para la resistencia al WSSV varía del 1.7 al

Porcentaje de mortalidad acumulada

Días del experimento

Figura 1. Mortalidad acumulada observada con la infección del WSSV entre los animales de entrenamiento G0. El número total de animales evaluados en la prueba de ensayo fue 1459.

6.5%16,18,19 .

Si existen loci con un gran efecto sobre la resistencia al WSSV, entonces la selección asistida por marcadores (MAS) podría ser una forma eficaz de aumentar la resistencia. Un análisis de asociación basado en un conjunto de genes para la resistencia al WSSV (vivo/ muerto) en L.vannamei identificó un total de 5 SNPs dentro de genes relacionados con la inmunidad; sin embargo, estos SNPs no se validaron más en una población más grande para su aplicación con MAS20. Robinson et al.21 identificaron vinculaciones entre varios grupos que contienen loci de rasgos cuantitativos asociados con el tiempo hasta la muerte después de una infección por WSSV en el camarón tigre negro (Penaeus monodon). Sin embargo, como los efectos estimados de los marcadores sobre la supervivencia en horas fueron relativamente pequeños, es probable que la resistencia al WSSV sea un rasgo cuantitativo típico, afectado por los efectos aditivos de muchos genes de efecto reducido22. Muchos de los polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs) que se mapearon cerca de los loci asociados con la supervivencia, ocurrieron cerca de las transcripciones con homología con genes inmunes innatos putativos de interés. Por ejemplo, la proteína lectina de tipo c que puede estar involucrada en el reconocimiento inmunológico y fagocitosis de microorganismos23, se expresa más en camarones resistentes que en camarones susceptibles expuestos al WSSV24-27. Este gen fue mapeado en una región QTL en el grupo vinculado 43.

La selección genómica28,29 se ha propuesto como la forma más efectiva de selección disponible para rasgos cuantitativos (poligénicos) típicos30. Por lo tanto, supusimos que la selección genómica podría usarse para mejorar la ganancia genética para resistencia al WSSV. En este estudio, ensayamos de manera experimental con familias de camarón blanco con el virus WSSV y usamos data del genotipo de polimorfismo de un solo nucleótido de reproductores y candidatos para evaluar la potencia y la precisión de la selección genómica para mejorar la resistencia al WSSV. Los candidatos reproductores (G0) se clasificaron en términos de valores genómicos de

reproducción para la resistencia al WSSV. Los candidatos reproductores se aparearon para producir dos poblaciones G1, una con valores genómicos reproductivos estimados como altos y la otra con valores genómicos bajos. En un ensayo se comparó la supervivencia de la población G1 y de la descendencia de reproductores apareados “al azar”.

Resultados

El filtrado de los 465,500 SNPs putativos identificados a partir del ARNmseq dio como resultado 10,323 SNPs (Tabla S1) que se seleccionaron para su inclusión en la matriz de SNP personalizada de Illumina de 18 K (MAF > 0.1, cobertura > 51X y eliminación de SNP múltiples por cóntigo (contig en inglés) y alelos SNP fijados en líneas R y S). Del total de 19,290 SNPs impresos en el chip, el control de calidad posterior al genotipado dejó genotipos para 18,643 SNPs que se consideraron aceptables para la predicción del valor genómico estimado de reproducción (gEBV).

En la prueba de ensayo con G0, la mortalidad aumentó rápidamente hasta alrededor del día cinco como se esperaba y luego, en lugar del aplanamiento habitual, algunos animales continuaron muriendo cada día hasta que terminó la prueba (Fig. 1). La prueba finalizó a los 22 días de acuerdo con las prácticas estándar, aunque algunos animales aún estaban muriendo, para facilitar comparaciones consistentes entre G0 y G1.

Las estimaciones de heredabilidad para los rasgos vivos o muertos (DOA) y días de supervivencia (DS) fueron similares para la población G0 general (0.30 para DOA y 0.53 para DS) a las de los animales de la línea R pura (DOA 0.22 y DS 0.39) y para la línea de animales resistentes cruzados por susceptible (RxS) (DOA 0.34 y DS 0.48, Tabla 1). Se obtuvieron estimaciones similares con y sin el efecto fijo de la línea incluida en el análisis. El efecto fijo de la línea reveló un 0.19 mayor probabilidad de supervivencia para RxR de raza pura que para RxS de raza cruzada. Para el rasgo DS, el efecto de ser de raza pura fue 2.71 días más de supervivencia.

Se encontró que la variación genética dentro de la línea resistente pura (línea

Tabla 1. Estimación de componentes de la varianza y heredabilidad para ambos rasgos a partir del análisis de data de G0 junta o de cada grupo genético (de raza pura o cruzada) por separado.

Tabla 2. Potencia del experimento para evaluar la selección genómica asumiendo que un macho se aparea con una hembra para generar cada familia separada.

Data DOA DS

Varianza Fenotípica Varianza genética Heredabilidad Varianza Fenotípica Varianza genética Heredabilidad Toda la data 0.23 0.07 0.32 ± 0.05 63.1 34.6 0.55 ± 0.05 RxR Pura 0.26 0.056 0.22 ± 0.06 58.4 22.5 0.39 ± 0.07 RxS cruzada 0.18 0.061 0.34 ± 0.07 57.6 27.7 0.48 ± 0.08

Número de familias Potencia

Alto-gEBV Aleatorio-gEBV Bajo-gEBV Alto-gEBV vs. Aleatoria-gEBV Alto-gEBV vs. Bajo-gEBV

R) y los animales cruzados de la línea RxS era sustancial (0.056 para DOA en la línea R pura, 0.061 para DOA en la línea cruzada RxS y 22.5 para DS en la línea R pura y 27.7 para DS en individuos de la línea cruzada RxS), por lo que podría esperarse una buena respuesta de selección. Esto está respaldado por la precisión de los valores reproductivos estimados mediante la validación cruzada del conjunto de datos completo, que fue 0.69 para DOA y 0.64 para DS.

Análisis de potencia. El análisis de potencia indicó que el número mínimo de padres seleccionados en el grupo de alta resistencia debe ser de 30-40 machos y hembras cuando hay 20 machos y hembras en el grupo aleatorio (Tabla 2).

Evaluación de la selección genómica en G1. De los 1885 animales puestos a prueba, se eliminó 1 familia de 35 hermanos (grupo aleatorio-gEBV) debido a la falta de data de los padres, no se pudo confirmar que 3 animales derivaran de los padres utilizados en el experimento, dejando 1847 registros de 59 familias G1 (32 alto, 19 aleatorio y 8 bajo-gEBV) para el análisis.

La mortalidad acumulada aumentó a un ritmo más lento y se estabilizó a un nivel más bajo en la prueba de ensayo para el grupo de alto gEBV en comparación con los grupos aleatorios y de bajo gEBV (Fig. 2). El grupo de bajo gEBV tuvo la tasa de mortalidad más rápida y alcanzó los niveles más altos de mortalidad acumulada de los tres grupos (mortalidad acumulada al final de la prueba de 75% en la baja, 63% en la aleatoria y 49% en el grupo de alto gEBV), lo que proporciona una tasa de supervivencia mejorada del 13% en el grupo de alto gEBV. El grupo aleatorio gEBV G1 alcanzó la misma mortalidad acumulada final durante la prueba que se observó en la población de entrenamiento G0 (63%, Fig. 1).

La supervivencia promedio de las familias en el grupo alto gEBV al 51% fue significativamente mayor que la del grupo aleatorio (38%) que fue, a su vez, significativamente mayor que la supervivencia del 25% del grupo de bajo gEBV (Fig. 3). El rango de supervivencia dentro de las familias fue grande, con la mayor variación en las familias de alto gEBV, que también tuvieron el rango más grande de supervivencia familiar promedio. Las familias con la mayor proporción de descendientes que sobrevivieron heredaron una mayor proporción de genes de línea resistente (100% versus 75% o 50%), en los grupos alto, aleatorio y bajo (Fig. 3). Ninguna familia del grupo bajo tuvo una supervivencia superior al 50%, mientras que la mitad del grupo alto tuvo una supervivencia superior al 50% con cuatro de estas familias, de un total de 32, con una supervivencia superior al 70%.

La heredabilidad de DOA en la población G1 (Tabla 3) fue mayor que la de la población G0 (Tabla 1), independientemente de si el efecto del grupo de selección se ajustó en el modelo o no. La respuesta estimada obtenida para la selección fue mayor que la predicha (Fig. 4, asumiendo heredabilidad para DOA de 0.3 como se calcula para el G0, Tabla 1), y las diferencias fenotípicas entre

los grupos fueron mayores que el efecto de grupo estimado estadísticamente. Se encontró que el gen Tank tenía un efecto bajo pero significativo sobre el DOA y, por lo tanto, se incluyó en el modelo de análisis como un efecto fijo.

Discusión

La supervivencia promedio en la población G1 aumentó de 38 a 51% después de una generación de selección genómica para alta resistencia al WSSV para el rasgo binario vivo o muerto (DOA), en relación con la supervivencia promedio en camarones G1 seleccionados al azar (Fig.4). La selección para baja resistencia al WSSV dio una respuesta muy similar en la dirección opuesta. Esto demuestra claramente el poder de la selección genómica como una herramienta para desarrollar camarón L. vannamei resistente al WSSV utilizando esta población “sintética” particular que contiene una gran variación de resistencia al WSSV. Debido a la gran variación en el rasgo DOA, y una heredabilidad relativamente alta, se esperaría que una mayor selección para producir un G2 produzca mayores ganancias genéticas que las evaluadas con la producción del G1.

Se espera más ganancias genéticas para el rasgo de supervivencia de días (DS), con heredabilidad genómica (h2 DS) de 0.55 y varianza genética aditiva (VA DS) de 34.6, que para DOA (h2 DOA de 0.32, VA DOA de 0.07) (Tabla 1). Dado que en la bibliografía se observa una correlación positiva fuerte y constante entre DS y DOA (por ejemplo, r > 0.8) 31, es probable que la mejora en un rasgo dé como resultado la mejora del otro. Esto se confirmó en nuestro estudio, ya que el camarón del grupo seleccionado por alta resistencia sobrevivió 2 días más que el camarón seleccionado del grupo aleatorio, que nuevamente sobrevivió 2 días más que el grupo seleccionado por baja resistencia (no se muestran resultados). Además, los productores prefieren las poblaciones de camarón que sobreviven a las que simplemente tardan unos días más en morir en presencia de WSSV. Por lo tanto, sugerimos que la selección genómica para resistencia al WSSV debe basarse en el rasgo DOA y no en el rasgo DS, a pesar de una mejora potencialmente más rápida si DS fuera el rasgo seleccionado. La validación cruzada, mediante la eliminación de valores individuales y la comparación con el valor predicho de data restante, se ha utilizado anteriormente para predecir la precisión de la selección genómica, por ejemplo32. La precisión de las predicciones genómicas a través de la validación cruzada se ha reportado en L. vannamei para la resistencia a enfermedades bacterianas20 , rasgos de eficiencia alimentaria33 y tasa de crecimiento34,35. Sin embargo, la validación cruzada solo proporciona una estimación o predicción de la probable ganancia genética.

La ganancia genética realizada es una medida directa de la ganancia genética y de la eficacia de un método de selección. Por lo tanto, preferimos la ganancia genética realizada a la validación cruzada como un medio para evaluar distintos métodos de selección. Hemos medido por primera vez la ganancia genética obtenida de la selección genómica para la resistencia a enfermedades en una especie de crustáceo, aportando a evaluaciones previas de ganancia genética obtenida por selección genómica para la resistencia a enfermedades en otra especie acuática, la trucha arcoiris36 .

Usamos cálculos de potencia para diseñar un experimento de selección para: (1) dar una potencia > 0.95 para detectar la respuesta de selección que esperamos de la heredabilidad estimada y el diferencial de selección y (2) dar tantas familias de alta resistencia como sea posible, adecuadas para el mejoramiento posterior de mayor resistencia. Para lograr esto, nos propusimos producir 30 familias de alta resistencia, 20 aleatorias y 10 familias de baja resistencia. Sin embargo, no todos los candidatos maduraron y estuvieron disponibles para realizar los cruces planificados. Debido a la falta de candidatos reproductores disponibles, produjimos 32 familias de alta, 20 aleatorias y 8 de baja resistencia.

La respuesta de selección predicha, basada en la heredabilidad estimada a partir del G0 y el diferencial de selección real después del apareamiento (es decir, el valor de reproducción promedio de los padres dentro de cada grupo de selección) fue de 0.075 para el grupo resistente seleccionado y -0.084 para el grupo susceptible seleccionado. Sin embargo, la respuesta obtenida de la selección fue superior a la prevista (Fig. 4) y estadísticamente significativa (p < 0.05). La diferencia real de la supervivencia entre los grupos en G1 fue de 0.13 en cada dirección.

Porcentaje de mortalidad acumulada

Días del experimento

Figura 2. Porcentaje de mortalidad acumulada durante días ploteada en la prueba de ensayo para animales G1 en los grupos de alto gEBV (círculos cerrados), aleatorio (cuadrados abiertos) y bajo (triángulos abiertos). El número total de animales evaluados en la prueba de ensayo fue 1883 (alto 1027, aleatorio 622 y bajo 234).

El modelo estadístico utilizado para analizar la data de G1 dio un efecto de selección estimado de 0.1, es decir, lo que implica que la supervivencia debería ser 0.1 más alta o más baja en los grupos de selección que en el grupo aleatorio. Sin embargo, la respuesta estimada a la selección probablemente esté subestimada porque el modelo tiene como objetivo distinguir entre el efecto de la genética y el efecto de la selección, mientras que estos efectos son por naturaleza confusos. Como se trataba de una prueba de experimentación controlada con algunos otros factores para corregir, sugerimos que las diferencias fenotípicas entre grupos son una buena estimación de ganancia genética.

Las estimaciones de heredabilidad difirieron entre G0 y G1, lo que podría explicar la discrepancia entre las predicciones y la respuesta de selección obtenida, si la respuesta predicha se basó en una subestimación de la varianza genética. Nuestra experiencia es que pocas muertes nuevas ocurren después del día 15 de la prueba de ensayo (como se observó en el ensayo de los animales G1) cuando la prueba normalmente finaliza a los 22 días. El bajo nivel sostenido de mortalidad hasta el final de la prueba en la población G0 fue anormal y podría atribuirse a una carga viral inferior a la normal en el tejido infectante (que se obtuvo de una población de animales resistentes). No está claro cómo el terminar la prueba antes de que cesaran las mortalidades afectaría las estimaciones de los parámetros genéticos para DOA y DS; sin embargo, esta discrepancia podría explicar las diferencias de heredabilidad entre G0 y G1. Si estimamos la respuesta esperada en base a la estimación de heredabilidad de la población G1, esta estimación es similar al coeficiente de regresión estimado para el grupo de selección, pero aún por debajo de la ganancia genética real actual, medida como la diferencia fenotípica entre el grupo seleccionado y el grupo control.

En general, nuestras estimaciones de heredabilidad de resistencia al WSSV basadas en la genómica fueron mayores que las estimaciones obtenidas en evaluaciones convencionales previas12-16 . La mayor heredabilidad encontrada en G1 en comparación a G0 podría deberse a una diferencia en la heredabilidad verdadera,

A: Alta

Proporción sobreviviente

B: Aleatoria

Proporción sobreviviente

C: Baja

Proporción sobreviviente

Desconocido Promedio entre familias

Alto gEBV Medio gEBV Bajo gEBV

Familia

Familia

Familia

Figura 3. Proporción sobreviviente en cada familia experimental para grupos G1 seleccionados de alto (A) aleatorio (B) y bajo (C) gEBV. El sombreado de las gráficas de barras indica el % de ascendencia de línea resistente en esa familia (negro 100%, gris 75%, blanco 50%, y rayas cuando se desconoce el origen de la población de uno de los padres. Las líneas horizontales muestran la proporción promedio entre las familias sobrevivientes para los grupos G1 alto (verde), aleatorio (naranja) y bajo (rojo) gEBV. Las líneas continuas se refieren a la población G1 que está representada en cada gráfica.

debido a diferentes condiciones de prueba y/o diferente composición genética entre las poblaciones. Sin embargo, también podría deberse a inexactitudes en la estimación, ya que una estimación está más cerca de la verdadera heredabilidad que la otra. Los posibles efectos no genéticos comunes en hermanos completos (full-sib en inglés) no se ajustaron debido a la confusión con el efecto genético y podrían causar una sobreestimación de la varianza genética. Sin embargo, como los camarones puestos a prueba eran jóvenes y fueron mezclados tan pronto alcanzaron un tamaño adecuado para el marcado, esperamos que el efecto común full-sib sea pequeño. Las condiciones de prueba se controlaron y estandarizaron y, por lo tanto, no deberían haber causado grandes diferencias entre las dos generaciones consecutivas, aunque aún podrían existir variaciones aleatorias en la presión de la enfermedad y otros factores ambientales. Sin embargo, las estructuras de las dos poblaciones analizadas fueron bastante diferentes, lo que podría afectar la heredabilidad.

La población G0 consistió en una mezcla de animales de línea resistente de raza pura y una línea cruzada de animales resistente susceptibles. La diferencia en la susceptibilidad entre estos dos grupos genéticos se ajustó como un efecto fijo en el modelo de análisis, pero se asumió que la varianza genética era la misma dentro de estas dos poblaciones, aunque la selección natural para la resistencia en la línea de raza pura podría haber reducido la heredabilidad. El G1 constaba de animales con varios niveles de composición de cepas, y el G1 también consistía en subgrupos que se seleccionaban por su alta o baja resistencia. Por lo tanto, se esperaría que las poblaciones estudiadas tuvieran una variación genética inusualmente alta para la resistencia, ya que constituían una combinación de cepas con diferentes antecedentes de selección debido a la aplicación de una selección genómica divergente.

Las correcciones estadísticas realizadas para tener en cuenta la cepa en G0 y en el grupo de selección G1 llevaron a un sesgo a la baja en la estimación de heredabilidad, ya que la varianza genética entre grupos se ajusta como un efecto fijo. El argumento para hacer esta corrección es que la variación genética dentro de la población mixta no es representativa para la mayoría de la población de reproductores. Los análisis de G1 con y sin corrección para el grupo de selección muestran que aproximadamente el 10% de la varianza genética existe entre los grupos, mientras que el 90% de la varianza genética está contenida dentro del grupo. Esta alta varianza genética dentro del grupo, y generalmente una mayor heredabilidad con la genómica que con los métodos convencionales, sugiere que una mayor selección genómica para producir un G2 debería lograr niveles similares de progreso genético como se documentó para el G1.

Nuestro hallazgo de estimaciones similares de heredabilidad para la población general G0, para animales de la línea pura R y animales de la línea cruzada RxS, y nuestros hallazgos de un nivel intermedio de resistencia al WSSV en animales de la línea cruzada RxS entre lo encontrado en animales de las líneas pura R y S, indican efectos aditivos de los alelos que controlan la resistencia para los rasgos DOA y DS.

En este estudio no se pudo dilucidar el papel de la dominancia o la heterosis ya que la línea pura S no se pudo comparar en la misma prueba (la línea S es altamente susceptible). Por lo tanto, no pudimos identificar posibles efectos genéticos no aditivos de estos experimentos.

Tabla 3. Componentes de varianza estimados y heredabilidades para “días o vivos” a partir del análisis de data de G1 con o sin grupo de selección ajustado como efecto fijo.

Modelo Varianza Fenotípica Varianza Genética Heredabilidad Con grupo de selección ajustado 0.26 0.11 0.41 ± 0.09 Sin grupo de selección ajustado 0.27 0.13 0.47 ± 0.09

Obtenido Predicción

Alto Aleatorio Bajo

Figura 4. Efecto de la selección genómica que muestra la ganancia genética obtenida y predicha (ΔG) en el rasgo DOA para grupos de selección alto, aleatoria y bajo gEBV.

Se identificaron varios factores que hacen atractiva la selección genómica para resistencia al WSSV en L. vannamei. Primero, la metodología basada en la genómica identificó la variación genética de resistencia en la población inicial G0. Nuestros ensayos previos que caracterizan las poblaciones iniciales muestran que las líneas híbridas contienen un nivel de resistencia al WSSV en algún lugar entre el de los animales de la línea pura R y de la línea S, indicando posibles efectos aditivos de los alelos que promueven la resistencia. En segundo lugar, la detección de diferencias significativas

entre los grupos de selección muestra que la selección aumentó la resistencia al WSSV en esta primera generación de selección. En tercer lugar, se detectó una amplia variación dentro de los grupos, particularmente en el grupo de alto gEBV. Lo más probable es que esto refleje que la proporción de la línea R en el grupo de alto gEBV podría, en teoría, oscilar entre 0 y 100% (siendo los padres una mezcla de individuos puros de la línea R y de la línea RxS). La varianza genética significativa que queda en el G1, incluso cuando se tuvo en cuenta el grupo de selección en el modelo, junto con una mayor heredabilidad en G1 que en G0, indicando que no hay pérdida de variación genética por resistencia debido a la selección, indicando que realizar una mejora adicional a través de la selección podría ser posible con una respuesta de selección continua durante varias generaciones. En cuarto lugar, la respuesta de selección fue mayor de lo esperado a partir de la intensidad de selección aplicada, la heredabilidad estimada y la varianza genética aditiva. Finalmente, la supervivencia mejorada de un 13% en una generación es mayor que la de metodologías de selección convencional y la ganancia genética es comercialmente interesante.

Los niveles de supervivencia que reportamos de un poco más del 60% en las mejores poblaciones, pueden no parecer tan satisfactorios para una producción comercial. Sin embargo, cuando la vacunación se utiliza como medio para proteger a la población contra epidemias, la población puede protegerse eficazmente sin vacunar a todos los individuos debido al efecto manada, ver ejemplo37. Anche et al.38 sugieren que la tasa de reproducción básica, R, es el parámetro clave que determina el riesgo y la gravedad de las enfermedades infecciosas. Además, sugieren que la mejora genética de R0 podría usarse para el control de enfermedades infecciosas en una población de huéspedes. Por lo tanto, el efecto manada de los animales resistentes podría tener un efecto similar al de la vacunación parcial si la resistencia está asociada con una R reducida.

En las pruebas de ensayo para la resistencia usamos los animales que no se infectaron individualmente, sino que se mantuvieron en un ambiente que alentó la reproducción de la enfermedad. Por lo tanto, sugerimos que no solo seleccionamos por resistencia, sino también por una R baja y deseable. El nuevo análisis de data sobre las epidemias de WSSV y Taura (TSV) en camarón, sugiere que la R de Taura se redujo mediante reproductores a un nivel que contenía la enfermedad, mientras que en el caso del WSSV la reducción no fue suficiente para controlar la enfermedad39. Además, sugieren que la heredabilidad de la resistencia no es suficiente por sí sola para evaluar la ganancia económica de la selección para la resistencia a una enfermedad específica, porque ignora el hecho de que los animales resistentes ya no infectan a otros animales.

La presión del inóculo con la producción comercial es casi con certeza mucho más baja que en nuestras pruebas de ensayo en las que varias familias ahora muestran una supervivencia del 70%. Anche et al.38 señalan que niveles de alrededor del 70% de supervivencia fueron suficientes en el caso de Taura para mantener la enfermedad bajo control. Por lo tanto, de manera similar en que las epidemias de enfermedades pueden ralentizarse o detenerse cuando se vacuna un cierto nivel de la población, un cierto nivel de animales resistentes en una población, junto con prácticas que desfavorecen la enfermedad, pueden reducir R a cerca de uno y ser suficiente para controlar el WSSV en poblaciones comerciales. Hemos demostrado que al usar la selección genómica podemos aumentar rápidamente el nivel de resistencia y, con suerte, podremos usar esta herramienta para ofrecer a los productores, poblaciones de camarón que puedan sobrevivir y producir en presencia de WSSV sin tener que erradicar totalmente el organismo causal.

Al aplicar la selección genómica para la resistencia a enfermedades, también debemos considerar que existe una correlación genética desfavorable entre la tasa de crecimiento y la resistencia al WSSV16,40 y que una tasa de crecimiento más rápida es deseable para el cultivo de camarón. Se podría lograr una mejora simultánea de ambos rasgos combinando una línea S de rápido crecimiento con una línea R de alta resistencia en un diseño multiplicador para el suministro comercial de reproductores. También es posible utilizar la selección genómica de tal manera que ambos rasgos se seleccionen positivamente, pero esto requiere más investigación. Otra consideración para la aplicación es la asequibilidad y la accesibilidad. La necesidad de genotipado agregará costos al programa de mejoramiento, pero también puede reducir la necesidad de un registro sistemático del pedigrí, que es costoso y también induce ineficiencias en el proceso de selección debido al cultivo separado, ya que puede derivarse de los genotipos. Ya se han identificado muchos marcadores SNPs para L. vannamei41 y tecnologías para el genotipado de ultra alto rendimiento se están volviendo más fácilmente disponibles y menos costosas de aplicar42 .

La otra gran dificultad que se enfrenta al seleccionar la resistencia al WSSV en camarón es que es prácticamente imposible utilizar sobrevivientes de las pruebas de ensayo como candidatos reproductores, ya que pueden transmitir verticalmente el virus e infectar a la población de crías. Además, la dificultad en las prácticas de limpiar a los sobrevivientes para incorporarlos a programas de reproducción que producen reproductores libres de patógenos específicos para el virus del síndrome de la Mancha Blanca son inmensas. La imposibilidad práctica de utilizar sobrevivientes, la falta de información sobre el rendimiento de supervivencia de los candidatos reproductores, y sus verdaderas relaciones genéticas con los candidatos (las relaciones de pedigrí han sido el estándar en estudios previos), limita la precisión de la selección fenotípica convencional. Estos problemas también limitan la intensidad de la selección y la variación genética que se puede utilizar. Se puede obtener una mayor precisión para la predicción de los valores genéticos obteniendo relaciones genómicas a partir de la data del genotipado de SNPs.

Los marcadores genéticos de todo el genoma permiten estimar el grado de relación genómica entre los animales experimentales y los animales reproductores candidatos individuales dentro de las familias. Mientras que las relaciones de pedigrí convencionales estiman la relación promedio en todo el genoma, la data de SNP permite la estimación de las relaciones genéticas en cada posición del genoma. La relación genómica entre cada animal y la data del rendimiento de los animales sometidos a pruebas de

ensayo se utiliza para estimar los valores genómicos de reproducción individual: por lo tanto, la selección combinada de familias e individuos es posible con la selección genómica. Sostenemos que la capacidad de evaluar el valor de reproducción individual a través de la selección genómica es la razón principal por la que se obtuvo una mayor tasa de ganancia genética con la selección genómica (13% de supervivencia mejorada por generación) que la lograda con la selección fenotípica convencional para resistencia al WSSV en L. vannamei 1.7% de DOA, 6.3% de supervivencia y 6.5% de respuesta de selección de supervivencia por generación16,18,19 .

Conclusión

Hemos demostrado que se puede lograr una mejora genética significativa y útil para la resistencia al WSSV en un programa de reproducción de L. vannamei aplicando selección genómica. En comparación con los métodos convencionales, el uso de data genómica dio como resultado estimaciones de heredabilidad más altas y mejoró la precisión de la selección a niveles que son comercialmente relevantes. A partir de un experimento de selección genómica y de predicciones de precisión de validación cruzada, demostramos que la densidad de marcador moderada de ~ 18 K utilizada era suficiente para una predicción precisa del valor de reproducción genómica. Este es el primer estudio en L. vannamei que demuestra la ganancia genética obtenida de la selección genómica. La selección genómica es particularmente prometedora para los programas de selección que ponen a prueba a los animales vivos con agentes infecciosos cuando los sobrevivientes no pueden utilizarse posteriormente como reproductores.

Materiales y métodos

Animales utilizados para el estudio. Para el estudio se utilizaron dos poblaciones de camarón blanco (Litopenaeus vannamei) que habían sido criados selectivamente durante varias generaciones por Benchmark Genetics (antes Ceniacua) en Colombia (Fig. 5). La primera población se derivó de una operación de reproducción en la costa atlántica de Colombia que comenzó en 1997. Esta población no ha estado expuesta al WSSV y en este documento se la denomina línea susceptible (línea S). La selección combinada familiar y dentro de la familia de esta población se centró en el crecimiento rápido, la resistencia al virus del síndrome de Taura, la supervivencia general en estanque y la robustez durante 16 generaciones bajo estrictos protocolos de bioseguridad. La segunda población, denominada en este documento la línea resistente (línea R), derivada de una población del Océano Pacífico en 2008, se seleccionó en masa con una alta intensidad (1 × 10−4) para sobrevivir en presencia de WSSV durante 7 generaciones. Las poblaciones del Atlántico y Pacífico se mantuvieron aisladas en sus respectivas costas de Colombia. Todos los animales que participaron en el estudio se consideraron puros (no infectados con el virus). Los animales de la línea S se sometieron a pruebas de PCR cada 3 meses para todos los patógenos de la lista de la OIE y resultaron negativos para todos los patógenos de la lista durante más de 4 años. Antes de la prueba de ensayo, se analizó por PCR una muestra representativa de los animales de la línea R para detectar WSSV43 y se encontró que eran poblaciones negativas. La respuesta general de las poblaciones iniciales del Atlántico y el Pacífico a la infección por WSSV se conocía a partir de ensayos anteriores. Las pruebas de ensayo previas indicaron que la línea S contiene poca variación fenotípica de resistencia (con tasas de supervivencia familiar en el rango de 0 a 6%). Las muertes ocurren muy rápidamente después de la infección y ningún animal sobrevive el ensayo más de 4 días. Por el contrario, la variación en la supervivencia posterior a la exposición en la línea R varía de 20 a 54% de 15 a 20 días después de la infección. La resistencia al WSSV de la descendencia híbrida F1, producida al cruzar las líneas R y S, es intermedia entre la de las líneas puras (Fig. 6).

Inicio de cruce de líneas Línea R

Línea R Línea R

Línea S

Población de entrenamiento

Relaciones g Población de reproductores candidatos (no puestos puestos a prueba)

Segundo ensayo de WSSV Alto-gEBV Aleatorio -gEBV Bajo -gEBV

Figura 5. Origen del camarón para el experimento. Los animales se dividieron en poblaciones de entrenamiento y candidatos reproductores para estimar los valores genómicos de reproducción (gEBV) de resistencia al virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) en la generación G0. Los candidatos reproductores G0 fueron seleccionados y apareados para producir grupos G1 de alto, aleatorio y bajo gEBV cuyo desempeño (supervivencia después de una prueba de ensayo experimental), se comparó para la evaluación final de potencia de selección genómica.

La primera prueba de ensayo utilizó 751 camarones de línea pura R y 696 camarones de línea R y S cruzados. Estos animales

se utilizaron con fines de entrenamiento para estimar los valores genómicos de reproducción. Los candidatos reproductores (no puestos a prueba con WSSV) consistieron en descendencia derivada de 34 cruces parentales de la línea RxR y 24 cruces parentales de la línea RxS (los cruces de la línea pura RxS y de la línea RxS hermanos de los animales del entrenamiento puestos a prueba). Para los fines de este experimento, esta población inicial de animales, que incluye los animales del ensayo y los candidatos reproductores, se les denomina población G0 (Fig. 5).

Pruebas de ensayo de WSSV en G0. Se dividió aleatoriamente camarón juvenil de G0 de peso promedio 3 g en dos tanques con 4 toneladas de agua de mar artificial a 30 ppt de salinidad, 26 °C de temperatura e infectados con WSSV en una prueba de ensayo iniciada el 18 de abril de 2018, utilizando tejido infectado picado. El tejido utilizado (con una carga viral de 1 × 106 copias/µg de ADN) se pesó y se administró a los tanques en una proporción del 3% de la biomasa total durante dos días consecutivos. Se registraron mortalidades y se removieron cada hora hasta el 10 de mayo (22 días) para garantizar que ningún animal fuera canibalizado y, por lo tanto, no registrado como muerto. Doce días después de la infección, los camarones se agruparon en un solo tanque para evitar la pérdida de presión de infección debido a la reducción de la densidad de individuos.

La infección fue confirmada por histopatología44 y con PCR anidada de muestras de pleópodos45. Se registró la fecha y hora de la mortalidad para proporcionar data sobre dos rasgos, vivo o muerto después de 22 días (DOA), que es un rasgo binario (evaluado 22 días después de la infección) y días de supervivencia (DS). Con el fin de analizar el DS, se asumió que los sobrevivientes murieron al día siguiente de finalizado el ensayo.

Recolección de muestras de tejido y genotipado. Se recolectaron muestras de tejido de camarón, pleópodos o músculos, de todos los animales muertos y sobrevivientes en abril/mayo de 2018 y noviembre de 2018, para sumergirlos en etanol al 95% a 4 °C y se almacenaron en tubos de centrífuga de 1.5

Promedio % supervivencia

Línea S Híbrido Línea R

Figura 6. Comparación de la supervivencia promedio en la población inicial híbrida, resistente y susceptible al WSSV.

ml. La genotipificación de SNP fue realizada por Neogen (EE. UU.) en noviembre de 2018. El ADN se extrajo utilizando un kit de extracción de ADN BioKits (Neogen, EE. UU., que utiliza perlas magnéticas patentadas con una alta afinidad con el ADN) y las muestras se genotipificaron con un SNP Illumina de 18 K personalizado con matriz diseñada por Neogen USA (descrita a continuación).

Polimorfismos de un sólo nucleótido. Todos los camarones fueron genotipados para 18,643 SNPs. Se desarrolló una matriz personalizada Illumina de L. vannamei para el genotipado de SNP (Neogen USA). Se identificaron y publicaron previamente un total de 8,967 SNPs41, mientras que otros 10,323 SNPs se identificaron mediante la nueva secuenciación de ARNm de la agrupación de hepatopáncreas, branquias y tejido de pleópodos de 20 individuos de la línea R de la generación 3 sin tratamiento previo y de 20 individuos de la línea S de generación 3 sin tratamiento previo. Los camarones se diseccionaron en condiciones estériles y las muestras se sumergieron completamente en RNAlater (Qiagen Alemania y se almacenaron a -80 °C para conservar el ARN hasta que pudiera purificarse y prepararse para la secuencia de ARN anteriormente descrita para P. monodon, Baranski et al. 46). No se realizó ninguna normalización de ARN antes de que las muestras se agruparan (creando un grupo de línea R y una de línea S) y se procesaron con 72 ciclos de secuenciación de extremos emparejados en dos carriles separados en un Genome Analyzer II (Illumina USA) según las instrucciones del fabricante. El programa “find variations” de CLC Assembly Cell se utilizó para detectar SNPs putativos en el conjunto de L. vannamei como se describe para P. monodon46 .

Los SNPs putativos que se identificaron en cóntigos de L. vannamei homólogos se filtraron para rechazar aquellos con un total de profundidad de secuencia inferior a 51, frecuencia de alelos menores inferior a 0.1 y aquellos que carecen de variación dentro de la línea R o dentro de la línea S (es decir, los SNPs que muestran diferencias alélicas fijas entre las dos líneas no fueron aceptados). En casos de que quedaran varios SNPs por cóntigo después del filtrado, el primer SNP de la lista fue el único aceptado. Finalmente, se utilizó la herramienta de búsqueda de alineación local básica (BLAST, National Center for Biotechnology Information, EE. UU.) para comprobar todas las secuencias de SNP de regiones flanqueantes en que coincidan con ellas mismas y con los 8,967 SNPs publicados anteriormente para filtrar cualquier SNP repetido. Tanto la secuencia flanqueante como los SNPs publicados se convirtieron en una base de datos BLAST con capacidad de búsqueda mediante el comando makeblastdb y las coincidencias se identificaron mediante el comando blastn

con valor e10-11 .

El control de calidad posterior a la genotipificación eliminó los SNPs que no se encontraban en las proporciones de equilibrio de Hardy Weinberg, con una frecuencia de alelos menores de menos de 0.05 o una tasa de llamada menor de 95%. Valor de reproducción genómica y estimación de parámetros. Se estimó una matriz de relación genómica (G) entre todos los animales en G0 como lo describe VanRaden47 . La evaluación genética se realizó utilizando un modelo animal en un paquete de modelo mixto multivariante DMU48. Todos los animales puestos a prueba con el virus y todos los candidatos reproductores se incluyeron en la estimación. Los rasgos DOA y DS se analizaron por separado, utilizando el modelo animal:

y = Xb + Zu + e donde y es un vector de fenotipos (DOA o DS), b es un vector de efectos fijos estimados de cruzamiento, equipado con dos niveles: cruzamiento de raza pura R o RxS, u es un vector de valores reproductivos estimados (gEBV) para animales experimentales y candidatos, u ~ N (0, Gσa 2), donde G es la matriz de relación genómica y σ a 2 es la varianza genética aditiva de y, y e es un vector de residuos aleatorio, que se supone que se distribuye normalmente con varianza σ2 . X y Z son matrices de diseño para vincular cada observación con la categoría de efectos fijo y el animal correcto. Los componentes de la varianza para ambos rasgos se estimaron por separado con modelos de un solo rasgo. Ambos rasgos se analizaron como rasgos continuos, es decir, se analizaron solo en la escala observada.

Precisión de la predicción genómica EBV. A partir de la data de G0, estimamos la precisión de la predicción del EBV genómico mediante validación cruzada. A cada animal se le asignó un número (1-10, creando 10 subconjuntos de validación no superpuestos seleccionados al azar), y el análisis se repitió 10 veces, cada vez enmascarando los fenotipos de todos los rasgos para uno de los subconjuntos de validación. La precisión (Acc) se estimó para cada rasgo como Acc = R gEBV, y , donde RgEBV,y es la correlación entre el fenotipo y el gEBV, utilizado para cada animal, los gEBV de la corrida en la que se enmascaró su fenotipo y h era la raíz cuadrada de la heredabilidad, estimada a partir del conjunto de datos.

Análisis de potencia. La respuesta a la selección se puede predecir basándose en parámetros genéticos estimados, dada una cierta intensidad de selección. Se aplicó un análisis de potencia para diseñar un ensayo de selección adecuado para documentar la ganancia genética y validar los parámetros genéticos dentro de las limitaciones de la infraestructura disponible. Se realizaron predicciones de potencia para evaluar la selección genómica para el rasgo DOA, porque se pensó que este rasgo tenía la mayor relevancia económica. El número total máximo de familias de hermanos completos se limitó a 60.

El número de descendientes analizados de cada familia se estableció en 25 para asegurarse de que el número total de animales experimentales no excediera la capacidad de la instalación de prueba. Se compararon diferentes opciones para la producción de grupos de selección. Se produjeron grupos de alto gEBV cruzando individuos G0 con los valores más altos de gEBV. De manera similar, se hicieron grupos de bajo gEBV a partir de cruces entre individuos con los gEBV más bajos.

El grupo familiar “aleatorio” se creó cruzando los individuos restantes al azar. Las diferencias esperadas entre las comparaciones de los grupos aleatorios y de alto gEBV, y entre los grupos de bajo y alto gEBV (ya que el rasgo se seleccionó en ambas direcciones), se basaron en los parámetros genéticos estimados y la intensidad de selección utilizada. El análisis de potencia asumió que las observaciones eran independientes (es decir, se ignoró la estructura familiar) y la potencia se estimó utilizando la fórmula t

β = t0.05 - �G/se (�G), donde t0.05 era el valor crítico necesario para rechazar la hipótesis nula de la no diferencia entre los grupos de selección (asumiendo una distribución normal estándar) y ΔG fue la diferencia esperada entre 2 grupos de selección. ΔG se estimó utilizando una ecuación univariante de reproducción 6.G = h2 � S, donde h2 es la heredabilidad estimada de los animales experimentales G0 y S es la selección fenotípica diferencial aplicada al producir las familias. se (ΔG) fue el error estándar de contraste entre dos grupos de selección, estimados como 1 + 1 σ 2 , donde n1 y n2 son el número de animales en cada grupo y σ2 es n1 n2 la varianza fenotípica estimada a partir de la prueba de ensayo de G0. La potencia se estimó como el área bajo la distribución normal estándar acumulada de - ∞ a 1 - tβ.

Experimento de selección. Los reproductores se seleccionaron del grupo de candidatos reproductores G0 según los gEBV de DOA estimados a partir de las pruebas de ensayo con WSSV realizadas en 2018. Los machos y las hembras, respectivamente, se clasificaron en gEBV, y se seleccionaron las dos puntas de la lista clasificada. Los mejores 60 machos y 60 hembras fueron seleccionados como posibles candidatos reproductores de alta resistencia y los 20 machos y 20 hembras inferiores fueron seleccionados como posibles candidatos reproductores de baja resistencia. Los animales no seleccionados para ninguna de estas listas, y los animales no puestos a prueba del G0, estaban disponibles como posibles progenitores de la “selección aleatoria”. Se produjeron sesenta familias, 32 de apareamientos entre animales de alta resistencia, 8 de apareamientos entre machos y hembras de baja resistencia y 20 de apareamientos entre animales seleccionados al azar (Tabla 4, cerca de la prueba de potencia de 30 alta, 20 aleatoria y 10 de baja con un valor de 0.96 en una escala de 0 a 1). El valor genómico reproductor promedio de los padres fue 0.25 para el grupo resistente, - 0.005 aleatorio y - 0.28 para el grupo susceptible.

Se evitó el apareamiento entre posibles hermanos completos o medios hermanos (parejas con una relación genómica cercana, > 0.1). Para efectos de este experimento, a la descendencia se la denomina población G1. Se generaron listas de apareamiento y los animales se reprodujeron mediante inseminación artificial en marzo de 2019 en el laboratorio de Ceniacua en Tumaco, Colombia. La inseminación artificial de reproductores seleccionados, que implica la extracción de espermatóforos de candidatos machos y la transferencia de la masa espermática a candidatas hembras inseminadas artificialmente, es descrita por12. Las hembras se colocaron en tanques

de incubación individuales. Después de la eclosión, se sembró una muestra aleatoria de aproximadamente 5,000 nauplios de cada familia en tanques separados de cultivo de larvas de 50 litros. Las larvas se alimentaron con una dieta mixta de Chaetoceros sp. Artemia sp. y micropellets.

En la etapa de postlarva 10 (PL10), se transfirió una muestra aleatoria de 200 postlarvas por familia a tanques separados a una densidad de 100/m2 para el rebrote hasta que alcanzaron un tamaño corporal adecuado para el etiquetado de elastómeros (aproximadamente 1g). Luego, los animales marcados se enviaron a las instalaciones de ensayo en Bogotá, Colombia, en mayo de 2019.

Los 1885 animales G1 se evaluaron en dos tanques. El tamaño de la familia osciló entre 12 y 53 registros (31 promedio). La prueba de ensayo continuó durante 23 días postinfección. La data de la prueba de ensayo se utilizó para estimar la ganancia genética y volver a estimar los parámetros genéticos, para validar los resultados de G0. La data de G1 se analizó con un modelo sirdam en Asreml49 DOA = Xβ + Zu + e donde DOA era un vector del fenotipo binario vivo o muerto. β era los efectos fijos del tanque y el grupo de selección (alta, aleatoria o baja resistencia) y X fue la matriz de diseño para vincular las observaciones a las categorías de efectos fijos. U era una matriz de efectos aleatorios de padre y madre, u G 1 σ 2 donde σ 2 era la varianza genética aditiva, G era la matriz de relación genómica entre los padres (el camarón de ensayo G1 no fue genotipado), y Z fue la matriz de diseño que asigna los registros DOA al padre y la madre de manera correcta.

El grupo de selección se ajustó como una regresión fija en lugar de categórica porque a pesar del diferente número de padres seleccionados para el apareamiento para producir los grupos de selección de alto y bajo gEBV, la intensidad de selección fue de una fuerza similar en ambas direcciones. La ganancia genética esperada de la intensidad de selección realizada y la heredabilidad en G0 se estimó mediante los valores genéticos reproductivos promedio de los padres multiplicados por la heredabilidad estimada. Se compararon las ganancias genéticas obtenidas y las predichas.

Disponibilidad de data

Todos los datos de secuencia procesados y sin procesar generados en este estudio se han almacenado en el archivo de lectura corta del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih. gov/sra ) con el nombre BioProject acceso PRJNA625155•

Para más información sobre este artículo escriba a: nick.robinson@nofima.no