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Estructura y patrones de concurrencia de comunidades bacterianas asociadas con brotes de la enfermedad de heces blancas en la acuicultura del camarón blanco del Pacífico Penaeus vannamei
Autores: Yustian Rovi Alfiansah1,2,3
Sonja Peters1 Jens Harder4 Christiane Hassenrück1,7
Astrid Gärdes1,5,6,7
Artículo publicado por Sicentific Reports www.nature.com/scientificreports
yustian.alfiansah@leibniz‑zmt.de Las enfermedades bacterianas causan fallas en la producción de camarón. Para comprender las condiciones ambientales y la dinámica de la comunidad bacteriana que contribuye a los eventos de la enfermedad de heces blancas (WFD), analizamos la calidad del agua y comparamos comunidades bacterianas en el agua, así como en los intestinos y las heces de camarones sanos y enfermos, respectivamente, mediante la secuenciación del gen ARNr 16S y qPCR de la proteína reguladora transmembranosa (toxR), hemolisina termolábil (tlh) y genes de hemolisina directa termoestable del patógeno Vibrio parahaemolyticus como proxy de virulencia. La WFD ocurrió cuando el pH disminuyó a 7.71–7.84, y Alteromonas, Pseudoalteromonas y Vibrio dominaron las comunidades bacterianas acuáticas. La gravedad de la enfermedad se correlacionó además con un aumento de las proporciones de Alteromonas, Photobacterium, Pseudoalteromonas y Vibrio en las heces del camarón.
Estas bacterias patógenas oportunistas constituyeron hasta el 60% y 80% de las secuencias de las muestras de las etapas temprana y avanzada del brote de la enfermedad, respectivamente, y exhibieron un alto grado de concurrencia. Además, toxR y tlh se detectaron en el agua solo en el evento de la enfermedad. En particular, la resiliencia de la comunidad bacteriana en el agua se produjo cuando el pH se ajustó a 8. Luego, la WFD cesó sin un evento de mortalidad. En conclusión, el pH fue un indicador confiable del riesgo de brote de la WFD. El oxígeno disuelto y la composición del agua y bacterias intestinales también pueden servir como indicadores para una mejor prevención de eventos de WFD.
Las enfermedades bacterianas son un problema importante para la acuicultura en estanques de Penaeus vannamei en Asia y América Latina. Han causado graves pérdidas económicas anuales alcanzando aproximadamente mil millones de dólares durante la última década1,2. Entre las enfermedades bacterianas reportadas, la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) y la enfermedad de las heces blancas (WFD) son las más infecciosas y letales3,4. Esta última ha estado ocurriendo con frecuencia en cultivos de camarón en Asia desde
Tabla 1. Parámetros biogeoquímicos del estanque con camarones sanos (P1) y los estanques que experimentaron la enfermedad de heces blancas (P2, P3, P4) antes, durante (en negrita) y después de los eventos de la enfermedad. DO: oxígeno disuelto, SPM: partículas suspendidas, Chl a: clorofila a, TPPV: total de Vibrio presunto patógeno cultivable, suc (-): colonias fermentadoras de no sacarosa (colonias verdes), suc (+): colonias fermentadoras de sacarosa (colonias amarillas).
Parámetros Estanque 1
50 60 Estanque 2
70 50 53 60 Estanque 3
60 63
8.12 8.40 8.21 8.18 7.79 7.93 8.02 7.84 70
7.96 Estanque 4
60 67 70
7.74 7.71 8.17
30.32 29.91 30.05 31.14 30.94 30.94 29.56 30.61 30.87 30.29 30.23 30.57
6.10 6.10 6.20 5.60 5.57 5.80 6.32 5.98 6.02 5.93 5.68
6.58 19.60 25.60 18.50 19.10 41.70 25.60 25.70 38.50 38.60 30.70 38.00 49.90
88.66 21.19 39.60 28.96 45.76 10.22 70.28 69.76 69.79 31.64 45.97 94.90
35.53 34.47 33.36 32.92 34.73 34.02 36.12 34.17 34.09 35.64 34.02 33.27
181.17 194.82 151.88 161.49 184.34 168.74 193.03 196.38 186.52 174.94 183.47 175.60
00 400 400 4,000 600 300 4,700 700 300 4,000 1,100
7,800 6,700 3,000 4,100 1,700 6,400 3,700 1,700 9,700 4,400 2000 8,800
0.063 0.886 0.086 0.914 0.795 0.095 0.245 0.793 0.524 0.031 0.770 0.333
0.001 0.219 0.001 0.019 0.199 0.002 0.001 0.217 0.006 0.002 0.205 0.005
0.029 0.076 0.006 0.046 0.061 0.061 0.011 0.078 0.003 0.003 0.087 0.842
0.662 1.017 0.186 0.482 1.088 0.088 0.373 1.060 0.650 0.062 1.041 0.236 0.185 0.643 2.775 0.394 0.554 1.554 0.859 0.803 0.494 0.297 0.566 0.197
20093,5,6, lo que redujo la supervivencia del camarón al 20-30%6 . Los eventos de la WFD se caracterizan por la presencia de filamentos fecales blancos que flotan en el agua de cultivo3,6. Por lo general, ocurren después de aproximadamente 50 días de cultivo6, provocando un retraso en el crecimiento del camarón, cosechas no rentables e incluso una mortalidad masiva7 .
La pérdida de microvellosidades y la posterior lisis en el hepatopáncreas y el intestino medio asociadas con la WFD, indican un proceso patológico en el intestino del camarón6. Fueron reportados Enterocytozoon hepatopenaei (EHP), cuerpos vermiformes que se asemejan a protozoos gregarinos y ciertas especies de Vibrio cultivables como V. parahaemolyticus, V. fluvialis, V. mimicus, V. alginolyticus y Vibrio sp., como posibles agentes causantes de la enfermedad3,6,8,9 . Además, el deterioro de la calidad del agua con concentraciones de oxígeno por debajo de 3.0 mg L-1 y alcalinidad por debajo de 80 ppm, causó tasas máximas de mortalidad durante los brotes de la WFD10. Sin embargo, la etiología de la WFD en el cultivo de camarón en estanques sigue sin ser concluyente6,8,11 . Por ejemplo, los camarones infectados con EHP no siempre produjeron heces blancas11 , mientras que Vibrio como V. alginolyticus
Figura 1. Análisis de componentes principales (PCA) de los parámetros ambientales observados. Las etiquetas de puntos indican el estanque sin la enfermedad de heces blancas (estanque P1 sin WFD) y los estanques con eventos de enfermedades (P2, P3 y P4). Los parámetros del agua presentados en el PCA se tomaron los días 60, 53, 63 y 67 para P1, P2, P3 y P4, respectivamente. SPM: material particulado en suspensión; suc (+) TPPV: total de colonias fermentadoras de sacarosa de Vibrio presuntamente patógenas (colonias amarillas de Vibrio presuntamente patógenas); suc (-) TPPV: colonias no fermentadoras de sacarosa de Vibrio presuntamente patógenas (colonias verdes); DO: oxígeno disuelto; Chl a: concentración de clorofila a; NO2 -: nitrito; NO3 ‑: nitrato; NH4 +: amonio; Silicato r-: silicato reactivo; PO4 3-: fosfato.
también fue reportado como probiótico para P. vannamei12,13 .
A menudo, los antibióticos y las células bacterianas beneficiosas viables (probióticos) se aplican en el cultivo de camarón para mejorar el crecimiento del camarón y evitar brotes de enfermedades14-17, sin
Figura 2. Contribución de géneros bacterianos más dominantes en las comunidades de agua de estanques (A) e intestinos y heces de camarón (B). Las muestras se recolectaron de un estanque con camarones sanos (P1) y estanques con camarones enfermos (P2, P3 y P4). Se tomaron muestras de intestino (P1) para bacterias intestinales (IB) y heces fecales (P2, P3, P4) para bacterias de heces fecales (FSB) en los días de cría 60, 53, 63 y 67 para P1, P2, P3 y P4, respectivamente. FL: fracción de vida libre, PA: fracción asociada a partículas, bWFD: antes del evento WFD, WFD: durante el evento WFD, aWFD: después del evento WFD.
éxito. La evaluación común del número de bacterias heterótrofas cultivables, así como los recuentos de Vibrio en un medio de agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS), no pudieron predecir el evento patógeno. Sorprendentemente, la WFD todavía estaba presente a pesar de que los conteos de Vibrio cultivado eran tres veces más bajos que los de bacterias heterotróficas (comunicación personal con propietarios de estanques de camarón). Además, el método de recuento en placa, que selecciona ciertas bacterias patógenas18, demostró ser inadecuado para identificar la población bacteriana19 que puede estar asociada con la enfermedad. Por lo tanto, estas prácticas no han tenido éxito para predecir la WFD en el cultivo de P. vannamei.
La composición de las bacterias intestinales tiene una fuerte influencia en la salud del camarón17,20,21. Por ejemplo, la WFD puede iniciarse en camarón sano mediante el trasplante de microbiota intestinal de un camarón enfermo22. La composición de la comunidad bacteriana (BCC) en los intestinos de los camarones puede cambiar dinámicamente después del desarrollo del camarón23 y las dietas16,24,25. Además, el hábitat del camarón, es decir, la columna de agua y el sedimento subyacente, puede afectar a las bacterias intestinales (IB) con la de los camarones silvestres, difiriendo de las de los camarones domesticados/ cultivados26,27 .
Sin embargo, hay poca información sobre la interacción entre los parámetros del agua de cultivo, las IB, las heces fecales bacterianas (FSB) y la BCC en el agua de los estanques antes, durante y después de los brotes de enfermedades. Además, la investigación de las comunidades bacterianas en el agua de los estanques (WB) durante los eventos de WFD está descuidada. Por lo tanto, se necesita información más extensa sobre la dinámica de la comunidad bacteriana, incluidas las bacterias patógenas en el agua del estanque y en asociación con camarón en etapas de enfermedad y sin enfermedad, para comprender y prevenir la WFD y para tratar los camarones enfermos. Además, proponemos que los cambios repentinos en la calidad del agua afectarán en primer lugar a las comunidades bacterianas del agua del estanque (bacterias del agua/WB) y posteriormente, a la fisiología del camarón y sus IB.
1Centro de Investigaciones Marinas Tropicales Leibniz (ZMT), 28359 Bremen, Alemania. 2Centro de Investigación de Oceanografía (RCO-LIPI), Yakarta 14430, Indonesia. 3Centro de Investigación Acuícola (ZAF), Instituto Alfred Wegener (AWI), 27570 Bremerhaven, Alemania. 4Departamento
de Ecología Molecular, Instituto Max Planck de Microbiología Marina (MPI-MM), 28359 Bremen, Alemania. 5División de Biociencias/ Oceanografía Biológica Polar, Instituto Alfred Wegener (AWI), 27570 Bremerhaven, Alemania. 6Hochschule (HS) Bremerhaven, 27568 Bremerhaven, Alemania. 7Estos autores también contribuyeron: Christiane Hassenrück y Astrid Gärdes. correo electrónico: yustian.alfiansah@leibniz-zmt.de
En la columna de agua, las bacterias se encuentran de forma libre (FL) o asociadas a partículas (PA), o alternando entre estos diferentes estilos de vida28. Como se sabe, los microorganismos patógenos oportunistas favorecen un estilo de vida asociado a partículas, especialmente a agregados más grandes, pudiendo constituir puntos calientes de patógenos29-31, mientras que al mismo tiempo sirven como alimento alternativo para camarones y peces32,33 . Durante los eventos de WFD, las heces fecales, que contienen entre otras bacterias patógenas oportunistas, se desintegran en el agua de cultivo y se liberan las bacterias fecales. Luego pueden enriquecer el WB34 dando como resultado una alta carga de posibles bacterias patógenas oportunistas predominantemente en una fracción de partículas. Por tanto, planteamos la hipótesis de que un brote de la enfermedad puede verse facilitado por el consumo de agregados contaminados. Por lo tanto, es necesario un monitoreo separado de las bacterias FL y PA para predecir la transferencia de enfermedades entre camarones en un sistema de cultivo cerrado.
Para abordar las necesidades de la investigación y las hipótesis descritas anteriormente, proporcionamos una descripción general completa de la dinámica bacteriana y la calidad del agua en los estanques de camarón durante el transcurso de un evento de WFD, al (i) investigar los parámetros de calidad del agua, (ii) dilucidar el BCC en agua de cultivo (WB), separando bacterias FL y PA, en los intestinos de L. vannamei (IB) sanos y en heces fecales blancas (FSB), (iii) cuantificando el Vibrio patógeno por su número de copias del gen de virulencia, y (iv) analizando los patrones de concurrencia de bacterias en camarones sanos y enfermos. Realizamos la secuenciación del amplicón del gen del
Tabla 2. Análisis de similitud por pares (ANOSIM) y valores de disimilitud de Bray-Curtis comparando la composición de la comunidad bacteriana (BCC) en el intestino de camarones sanos (IB) y el de heces fecales blancas (FSB). Estanque P1 con camarones sanos; Estanques P2, P3 y P4 con camarones enfermos. Triángulo inferior: valores ANOSIM R y valores ajustados de p por Benjamini‑Hochberg (entre paréntesis). Los valores escritos en negrita indican comunidades fuertemente separadas. Diagonal: disimilitud promedio de Bray-Curtis dentro del estanque (en cursiva). Triángulo superior: disimilitud media de Bray-Curtis entre estanques (subrayado). Número de muestras por estanque: N = 10.
BCC IB P1
FSB P2 FSB P3 FSB P4 MI P1 MFS P2 MFS P3 MFS P4
0.63 0.92 0.95 0.93
(0.80, 0.002) 0.65 (0.87, 0.002) (0.22, 0.006) 0.75 0.70
0.80 0.73 (0.75, 0.002) (0.24, 0.002) (-0.01, 0.523) 0.75
Figura 3. Valores de disimilitud de Bray-Curtis de WB en las fracciones de vida libre (A) y en las asociadas a partículas (B) en comparación con las bacterias intestinales (IB) o de heces fecales (FSB) para muestras de P1 y P2-P4, respectivamente. bWFD: antes del evento WFD, WFD: durante el evento WFD, aWFD: después del evento WFD. P1: estanque con camarones sanos; P2, P3 y P4: estanques con camarones enfermos.
ARNr 16S y la cuantificación del gen del factor de virulencia mediante qPCR de la proteína reguladora transmembrana (toxR), hemolisina termolábil (tlh) y hemolisina directa termoestable (tdh) de V. parahaemolyticus patogénico. Además, discriminamos características de subpoblaciones bacterianas concurrentes para camarones sanos y enfermos.
Resultados
Los eventos de WFD investigados en este estudio ocurrieron en estanques de camarón, cuyos parámetros de agua y WB durante el ciclo completo de cultivo no reportaron eventos de enfermedades en otros lugares35. Los eventos de WFD ocurrieron en estanques con densidades de población moderada (P2) y altas (P3 y P4) a los 52, 63 y 67 días de cultivo, respectivamente, lo que sugiere que la enfermedad puede ocurrir independientemente de la densidad de siembra de camarón. El evento WFD coincidió con un cambio repentino en los parámetros del agua del estanque, un cambio en el WB y estrés en los camarones cultivados, indicado por una disminución del apetito 2-3 días antes del inicio de la enfermedad.
Los estanques con camarones infectados se caracterizaron por un pH más bajo (7.71–7.84), oxígeno disuelto/OD (5.57–
Tabla 3. Concentración de genes toxR y tlh en camarón (intestinos de camarones sanos y heces fecales de camarones enfermos) y muestras de agua de estanque. Las muestras de agua se separaron en fracciones de vida libre (FL) y asociadas a partículas (PA). N es el número de muestras para intestino y heces fecales y réplicas para muestras de agua; Q muestras cuantificadas; SD desviación estándar; PA fracción asociada a partículas; FL fracción de vida libre; LoQ límite de cuantificación. Las diferentes letras en superíndice después de los valores en las fracciones de PA y FL de las muestras de agua indican que las muestras diferían significativamente de acuerdo con las pruebas post‑hoc de TukeyHSD. El número de copias de genes toxR y tlh se testearon por separado.
Sample Pond N Shrimp % Q (Nq/N) Min–Max Q level Mean Q ± SDA NOVA
toxR, tlht oxRt lh toxR tlht oxRt lh
IntestineP 11 0 90 (9/10) 1.2–6.90 .9–6.94 .5 ± 1.8 3.9 ± 2.5
Fecal string P2 10 90 (9/10) 1.5–5.00 .9–5.53 .7 ± 1.0 3.7 ± 1.2
Fecal string P3 10 100 (10/10) 2.1–6.61 .6–6.63 .7 ± 1.4 3.5 ± 1.5
Fecal string P4 10 90 (9/10) 1.6–6.42 .1–6.53 .9 ± 1.5 4.3 ± 1.6
Water
PA
FL P1 30 < LoQ < LoQ < LoQ < LoQ
P2 3 100 (3/3) 13.9–15.9 11.7–13.8 14.9 ± 1.3 a 13.0 ± 1.2 a
P3 3 100 (3/3)3
P4 3 100 (3/3)6 .4–6.76
.4–6.85 .1–7.04
.8–6.46 .6 ± 1.9 bc
.7 ± 0.2 b 6.7 ± 0.5 b
6.0 ± 0.3 b
P1 30 < LoQ < LoQ < LoQ < LoQ
P2 3 100 (3/3) 11.7–14.2 14.2–16.1 13.2 ± 1.3 a 14.9 ± 1.0 a
P3 3 100 (3/3)2 .9–4.71 .5–2.65 .0 ± 0.8 bc 2.2 ± 0.6 c
P4 3 100 (3/3)4 .3–5.94 .0–5.43 .8 ± 0.9 c 4.7 ± 0.7 b df: 3, 36 F-value: 0.71 p: 0.55 df: 3, 36 F-value: 0.14 p: 0.93
df: 5, 12 F-value: 49.05 p: < 0.001 df: 5, 12 F-value: 126.08 p: < 0.001 Q Unit (Log copies)
per mL volume of intestine
per mL volume of faecal string
per L of pond water
5.98 mg mL– 1), mayor turbidez (38.0–41.7 NTU) y contenían más colonias de Vibrio presuntamente cultivables que no fermentaban sacarosa. (4.000–4.700 UFC mL− 1). Por el contrario, el estanque con camarones sanos (P1) tenía un pH más alto (> 8), OD (> 6 mg mL-1), menor turbidez (< 30 NTU) y menos recuentos de UFC de colonias de Vibrio presuntamente patógenas que no fermentaban la sacarosa (0-400 UFC mL− 1; Tabla 1). Teniendo en cuenta el bajo pH durante los eventos de WFD, los propietarios de la camaronera agregaron piedra caliza por la noche después de observar los primeros síntomas de la enfermedad. Este tratamiento se realizó hasta que desaparecieron los síntomas de la enfermedad. Agregaron aproximadamente 0.4 a 1.5 toneladas por estanque (volumen de agua aproximado de 3,500 a 3,700 m3) durante 3 días. Este tratamiento afectó la calidad del agua, particularmente el valor del pH, que aumentó a más de 8, mientras que el número de Vibrio presuntamente patógeno que no fermentaba sacarosa disminuyó de 3 a 6 veces después de los brotes de WFD (Tabla 1).
Los parámetros ambientales en P1 en el día 60 y en P2, P3 y P4 en los brotes de WFD se trazaron en un PCA para caracterizar los estanques (Fig. 1). Los estanques con camarones sanos y enfermos se separaron a lo largo del PC1, representando el 60% de la variación en la data, y se determinó principalmente por la abundancia de Vibrio patógeno presuntamente cultivable, concentraciones de amonio y fosfato, pH, temperatura y turbidez. Las concentraciones de nitrato y silicato reactivo, y la salinidad, se encontraban entre los parámetros del agua que más contribuyeron al PC2.
Composición de la comunidad bacteriana (BCC). Se secuenciaron un total de 80 muestras de agua de estanque, intestinos de camarón, heces fecales blancas, cepas presuntamente patógenas de Vibrio y probióticos comerciales, resultando en 3,917,111 secuencias de alta calidad que van desde 7,892 a 200,098, con una media de 48,963 secuencias por muestra.
Después de fusionar los perfiles de la unidad taxonómica operativa (OTU) de las réplicas técnicas que se recopilaron para las fracciones FL y PA en P2, P3 y P4 en los eventos de WFD, la secuenciación de data para los análisis de la comunidad bacteriana consistió en 70 muestras con un promedio de 58,336 secuencias por muestra. El análisis Clúster y el escalamiento multidimensional no métrico (NMDS) de estas muestras, mostró comunidades bacterianas muy heterogéneas que se agruparon en siete clústeres con un umbral de disimilitud de Bray-Curtis de 0.95. Dentro del clúster, las disimilitudes promedio de Bray-Curtis variaron de 0.51 a 0.72. El WB en las fracciones FL y PA en eventos no relacionados con la enfermedad se congregaron en dos grupos, distintos del WB en eventos relacionados con la enfermedad. Las secuencias generadas a partir de las cepas bacterianas cultivadas en el agar TCBS de P1 se afiliaron exclusivamente al género Vibrio. Se agruparon junto con IB de P1, que también fueron dominados por Vibrio (Información complementaria Fig. 1).
A pesar de la alta heterogeneidad general, las comunidades bacterianas en el agua del estanque (WB) en P1 mostraron una composición similar de taxones bacterianos dominantes en todo el tiempo de muestreo de la investigación. Basado en la secuenciación del ARNr 16S, el WB en P1 estaba compuesto predominantemente por los taxones bacterianos Salegentibacter (Bacteroidia), Exiguobacterium (Bacilli) y Halomonas y Psychrobacter (Gammaproteobacteria). Estos taxones también se encontraron en el WB del FL y las fracciones de PA de P2, P3 y P4 antes y después del evento de la enfermedad (Fig. 2A). Durante el
evento de la enfermedad, el WB de P2, P3 y P4 se alteró con Mesoflavibacter (Bacteroidia), Arcobacter (Campylobacteria) y Alteromonas, Marinomonas, Photobacterium, Pseudoalteromonas y Vibrio (Gammaproteobacteria) dominando BCC (Fig. 2A). Esos géneros mostraron solo proporciones bajas en el WB de P1 en todos los puntos de muestreo y en ambas fracciones, con la excepción de Vibrio.
Los miembros dominantes de las bacterias intestinales (IB) fueron Gammaproteobacteria de los géneros Acinetobacter, Pseudomonas y Vibrio, mientras que las muestras de bacterias de heces fecales (FSB) estuvieron dominadas por Arcobacter (Campylobacteria) y Gammaproteobacteria de los géneros Alteromonas, Marinomonas, Photobacterium, Pseudoalteromonas y Vibrio (Fig. 2B). Curiosamente, no se encontraron secuencias afiliadas a Acinetobacter ni a Pseudomonas en FSB. Por el contrario, Alteromonas, Marinomonas, Photobacterium y Pseudoalteromonas estaban ausentes en los intestinos sanos de los camarones. Esta clara distinción entre IB y FSB fue respaldada por la prueba de similitudes ANOSIM, que mostró que IB difería del FSB de P2, P3 y P4, mientras que FSB entre los estanques con camarones infectados, fue más similar (Tabla 2). Especialmente, en las muestras de heces fecales (FS) de P2, Alteromonas constituía más del 50% de todas las secuencias en siete de cada diez muestras, mientras que en las tres muestras restantes, Alteromonas todavía constituía hasta el 40%.
El WB de las fracciones FL y PA de los estanques con camarones infectados en eventos no relacionados con la enfermedad fue muy diferente al FSB. Sin embargo, durante los eventos de enfermedad, FSB y WB compartieron composiciones similares de comunidad bacteriana, como lo indica la disminución constante de los valores de disimilitud de Bray-Curtis en todos los estanques enfermos (Fig. 3; Tabla complementaria 1). Por el contrario, en el estanque con camarones sanos, el IB y WB fueron muy diferentes en todos los momentos de muestreo (Fig. 3). Detección y cuantificación de genes de virulencia. Nuestros pares de primers detectaron genes toxR, tlh y tdh del control positivo V. parahaemolyticus DSM 10,143
Figura 4. Concurrencia de la red bacteriana generada por SPIEC-EASI. El tamaño del nodo corresponde a la proporción de la secuencia promedio de unidades taxonómicas operativas en muestras intestinales y fecales. La red de módulos detectados por el clúster de Louvain se muestra en diferentes colores, agrupados por las muestras en las que se produjeron predominantemente: sanos, enfermos, ambos (general). La red de módulos identificados como característicos para camarones sanos y enfermos mediante modelos forestales aleatorios se indican mediante (-) y (+), respectivamente. El ancho del borde corresponde a la fuerza de la asociación entre las OTUs.
con un límite de cuantificación de 26 células mL-1 (Tablas complementarias 2 y 3). Identificamos a estos tres genes en muestras de WB, IB y FSB, pero solo se pudieron detectar y cuantificar dos genes de virulencia (toxR y tlh) (Tabla 3). Las concentraciones (número de copias) del gen toxR y tlh en los intestinos y el FS no difirieron entre sí (Tabla 3). Variaron en un rango de 3.7 a 4.5 y de 3.5 a 4.3 log copias de genes, que eran igual a 4,926 a 33,665 y de 3,140 a 19,907 copias de genes por mL de volumen de heces fecales o intestino para toxR y tlh, respectivamente.
La concentración de genes toxR y tlh en el agua del estanque difirió significativamente entre las fracciones FL y PA (toxR: MANOVA, Pillai2,6 = 0.623, p = 0.05; tlh: MANOVA,
otros dos estanques con camarón enfermo (Tabla 3). Por el contrario, no se detectaron genes virulentos en el agua P1 en todos los momentos de muestreo, así como en el agua de los estanques restantes (P2, P3 y P4) en los momentos de muestreo sin enfermedad. Redes de concurrencia bacteriana. Después de filtrar las OTUs, y con una baja cobertura de muestra, se conservaron 269 OTUs de las muestras de IB y FSB para el análisis de redes de concurrencia utilizando una estimación de covarianza inversa dispersa para la inferencia ecológica (SPIEC-EASI). El clúster Louvain pudo generar 15 módulos de concurrencia bacteriana (Fig. 4 y Tabla complementaria 4). Los módulos de red con proporciones de secuencia más altas de miembros OTU en muestras de comunidades Pillai2,6 = 0.854, p < 0.05). La fracción PA y bacterianas de camarón y AP, se visualizaron FL del agua P2 contenía un mayor número en un mapa de calor (heatmap) (Fig. 5). Entre de copias del gen toxR (14.9 ± 1.3 y 13.2 los 15 módulos, dos módulos (M2 y M14*) ± 1.3 log copias L-1, respectivamente), que representaron OTUs concurrentes exclusivos diferían de las fracciones respectivas de los de muestras IB de camarones sanos.
Consistían en Acinetobacter, Pseudomonas y dos OTUs Vibrio. Curiosamente, estas OTU de Acinetobacter, Pseudomonas y Vibrio estaban ausentes en todos los WB, incluidos los de P1. Las OTUs representadas en los módulos 1, 5 y 6 ocurrieron tanto en camarones sanos como enfermos, y estaban afiliadas exclusivamente con Vibrio (M1, M6) y Photobacterium (M5). Diez módulos (M3, M4, M7, M8, M9, M10, M11, M12 y M15) compuestos por OTUs que se encuentran predominantemente en camarones infectados.
El módulo 3 constaba exclusivamente de OTUs de Alteromonas, mientras que los módulos restantes constaban de más de tres géneros. En particular, las OTU de Vibrio aparecieron en muestras de camarón sano y enfermo, y contribuyeron a los módulos de la red general (M1, M6), así como a los característicos de camarones sanos (M14) o enfermos (M12), aunque asociados con otros taxones diferentes. Por ejemplo, en M12 Vibrio coexistió con Arcobacter y Pseudoalteromonas, mientras que en M14 Vibrio de las OTUs se asociaron con Acinetobacter. Los modelos de bosque aleatorios por pares se utilizaron para seleccionar el módulo de la red más adecuado para distinguir las muestras de camarones enfermos de los sanos, en función de la disminución media de Gini y la precisión (Tabla 5 complementaria). Los bosques aleatorios confirmaron M2 y M14 como los más característicos para muestras de camarones sanos, y M3, M4, M12 para muestras de camarones enfermos.
Discusión
Para comprender mejor la WFD en el cultivo de Penaeus vannamei, medimos la calidad del agua y analizamos la dinámica de las comunidades bacterianas. Con base en la estimación visual del número de heces fecales blancas (FS) en los estanques, discriminamos el evento WFD en dos fases: inicio de la enfermedad (síntomas tempranos), representado por P3 y P4 con números más bajos de FS blanco, y brote temprano (P2), con mayores números de FS blanco. Debido a que las comunidades bacterianas de heces frescas del camarón, y las del intestino completo de P. vannamei sanos han demostrado ser comparables17,34 , solo disecamos los intestinos de camarones sanos y los analizamos junto con las heces fecales frescas recolectadas de camarones enfermos. Además, si los camarones ya habían defecado, era difícil distinguir los camarones sanos de los infectados, ya que el intestino del camarón ya estaba vacío. La calidad del agua tiene un gran impacto en el estado de salud y crecimiento del camarón21 así como en el BCC en el agua de estanques de camarón36. El input (entrada regular) de alimento, causa efectos negativos no deseados en la calidad del agua, que eventualmente limita el crecimiento del camarón.
Figura 5. Proporción de secuencia de los miembros de la red de módulos más dominantes y diferenciadores entre camarones sanos (-) y enfermos (+), así como su contribución a la fracción asociada a partículas de los respectivos estanques y tiempos de muestreo. Su identificación taxonómica se proporciona a nivel de género. No se utilizaron muestras de agua para la construcción de la red.
Los pellets no consumidos, que no son incorporados por los camarones, junto con los desechos de materia orgánica (es decir, las heces), estimulan el crecimiento de fitoplancton y bacterias, lo que da como resultado la inestabilidad del bacterioplancton37. La actividad metabólica elevada debido a una floración de bacterioplancton heterótrofo ejerce una mayor demanda de oxígeno e influye en otros parámetros físicos como la cantidad de partículas en suspensión y la turbidez38 , así como las concentraciones de nutrientes inorgánicos39. Las actividades microbianas, incluida la degradación de la materia orgánica, la respiración y el proceso de nitrificación, y la acumulación de dióxido de carbono disuelto, afectarán la concentración de iones de hidrógeno en el agua del estanque, provocando una disminución del pH y alcalinidad38 como se observó en los estanques con camarones enfermos. Por el contrario, una intervención externa mediante la adición regular de piedra caliza, que puede ser rica en carbonato de calcio y silicato reactivo, puede amortiguar el pH y el nivel de alcalinidad38, que fue el caso del estanque con camarones sanos. Un rango de salinidad de 32.7 a 34.6 psu en el agua del estanque favoreció el predominio de bacterias heterótrofas marinas.
En eventos no relacionados con enfermedades, Exiguobacterium, Halomonas, Psychrobacter, Salegentibacter y Sulfitobacter dominaron las comunidades bacterianas en el agua del estanque (WB), probablemente desempeñando un papel en la nitrificación40-42, la degradación de la materia orgánica y la oxidación del sulfito43. También pueden inhibir el crecimiento de bacterias patógenas potenciales en el agua del estanque, por ejemplo Pseudoalteromonas y Vibrio, como se reportó en estudios anteriores16,35,44 . Además, las bacterias intestinales (IB) de los camarones sanos estuvieron dominadas por Acinetobacter, Pseudomonas y Vibrio que corresponden a las reportadas por estudios
previos15,33,34. Curiosamente, los genes toxR y tlh pertenecientes a V. parahaemolyticus se detectaron en concentraciones similares en los intestinos de camarones sanos y enfermos. Además, predecimos que Acinetobacter, Pseudomonas y otros Vibrio pueden inhibir la patogenicidad de V. parahaemolyticus. Se sabe que estos taxones bacterianos aparentemente beneficiosos impulsan procesos de nitrificación, acumulan poli-ßhidroxibutirato (PHB) que puede estimular el crecimiento de bacterias beneficiosas y actúan como bacterias antagonistas contra patógenos13,26,32,45-48. Por ejemplo, pueden inactivar la acil-homoserina lactonas (AHL), un tipo de molécula sensible que regula la virulencia de las bacterias patógenas48 . Además, las IB diferían considerablemente del WB en eventos no relacionados con la enfermedad. Dado que Acinetobacter y Pseudomonas son intolerantes a una alta salinidad46,47, proponemos que no pueden persistir en el agua salina del estanque. Por lo tanto, no enriquecieron al WB, lo que resultó en las altas diferencias observadas en la comunidad.
Nuestro estudio indica que una alteración de pulso49, como una disminución repentina del pH (por debajo de 8) y del oxígeno disuelto (por debajo de 6 mg L-1), y un aumento de nutrientes inorgánicos como se observó en P2-P4, pueden afectar a los camarones y las comunidades bacterianas en aguas de estanques de camarón (WB). La alteración de pulso provocó estrés en los camarones, que a su vez puede haber inducido cambios en las comunidades bacterianas intestinales, resultando en bacterias patógenas oportunistas, como Alteromonas, Marinomonas, Photobacterium, Pseudoalteromonas y Vibrio, convirtiéndose en dominantes en las comunidades bacterianas en heces fecales blancas (FSB).
En esta etapa, deducimos que se había producido disbiosis en las IB, lo que también se reportó en estudios previos relacionados con WFD22,50. Observamos un cambio gradual de FSB dominado por bacterias presumiblemente beneficiosas a FSB dominado por patógenos potenciales, lo que coincidió con la progresión de la enfermedad desde los estanques con síntomas tempranos, hasta el estanque en el brote temprano. Esto sugiere que los cambios en las comunidades bacterianas intestinales pueden estar estrechamente asociados con la gravedad de la enfermedad del camarón. Esta hipótesis está respaldada por estudios previos17, que informan que los cambios en las bacterias intestinales del camarón ocurrieron en paralelo con cambios en la gravedad de la enfermedad, lo que refleja la transición de un estado saludable a un estado enfermo.
Entre los taxones patógenos potenciales que dominaron las comunidades FSB en nuestro estudio, Photobacterium, Pseudoalteromonas y Vibrio correspondieron a los previamente observados como asociados con los eventos de WFD22 . Sin embargo, algunos géneros como Aeromonas, Candidatus Bacilloplasma, Phascolarctobacterium y Staphylococcus, que se reportaron presentes en un estudio anterior20,22, estuvieron ausentes en nuestras muestras durante el evento WFD. Sin embargo, es importante considerar que la ubicación geográfica, el manejo de las camaroneras, y los diferentes enfoques metodológicos pueden influir en la detección de taxones bacterianos.
Los cambios de WB ocurrieron en las fracciones FL y PA durante los eventos de la enfermedad, que coincidieron con la disminución del pH. Proponemos que un pH más bajo altera las tasas de crecimiento de las bacterias heterótrofas, como también se reportó anteriormente51, lo que resulta en un predominio de bacterias oportunistas y potencialmente patógenas como Alteromonas, Pseudoalteromonas y Vibrio en WB. Dado que las heces del camarón se desintegran fácilmente en el agua del estanque (hasta un 27% en 12h)34, y podrían desintegrarse más rápido debido al movimiento del agua y la aireación mecánica, sugerimos que FSB enriqueció WB, contribuyendo así al dominio de Alteromonas en FL y PA, como se observa en el WB de P2. La desintegración de las heces facilitará la dispersión bacteriana, así como el enriquecimiento de proteínas y nutrientes inorgánicos de las heces34 .
El enriquecimiento del WB por bacterias patógenas oportunistas pareció correlacionarse además con la gravedad de la enfermedad y el número de camarones infectados. Esto se refleja en las concentraciones significativamente más altas de genes toxR y tlh en las muestras de agua de los estanques de la fase temprana del brote, en comparación con los estanques de la fase de síntomas tempranos. Además, si se libera una mayor cantidad de bacterias patógenas en el agua del estanque y se incorporan al material particulado, se acelerará la propagación de la enfermedad entre los camarones, ya que los camarones sanos pueden consumir partículas cargadas de patógenos e intoxicarse. Por lo tanto, en este escenario, los FSB no solo contribuyen a la abundancia bacteriana, la estructura y la función del WB, sino que también refuerzan una retroalimentación perjudicial sobre la salud del camarón.
La infección del tejido del camarón es causada por la producción de hemolisinas por bacterias patógenas (por ejemplo, V. parahaemolyticus), tras la activación de sus genes de factor de virulencia52–54. Sin embargo, su capacidad para provocar enfermedades depende de factores abióticos (por ejemplo, pH, salinidad y temperatura) y bióticos (concurrencia de bacterias) que sustentan su brote55,56. Exploramos tales interacciones bióticas utilizando redes de concurrencia bacteriana. Los ensamblajes de las OTUs de camarones sanos concurrentes podrían distinguirse claramente de los de camarones enfermos. Proponemos que Acinetobacter y Pseudomonas que componen el módulo de red 2, así como Acinetobacter y dos OTUs de Vibrio que componen el módulo de red 14, son parte de la comunidad bacteriana nativa benéfica de camarones sanos.
La detección de OTUs de Vibrio en camarones sanos e infectados y en módulos de concurrencia inversamente correlacionados, sugiere la presencia de diferentes cepas de Vibrio con interacciones contrastantes. Si bien algunas OTUs de Vibrio pueden representar patógenos oportunistas, otras pueden incluso ser beneficiosas en proporciones bajas57,58. Alternativamente, la concurrencia con otras bacterias como Acinetobacter puede prevenir la activación de genes factor de virulencia, a pesar de la presencia de Vibrio potencialmente patógeno en los intestinos de camarones sanos. Por el contrario, el cambio en los patrones de concurrencia asociados con Vibrio en
camarones enfermos que se presume son beneficiosos para otros taxones oportunistas y potencialmente patógenos (red 12), puede contribuir al brote de la enfermedad.
Teniendo en cuenta las diferencias de las comunidades de IB de camarones sanos y WB en un evento sin enfermedad con respecto a las muestras de WFD, así como los patrones de concurrencia en muestras de camarones sanos y enfermos, destacamos que la disbiosis en IB y el cambio de bacterias halófilas dominadas hacia bacterias patógenas dominadas en el agua de estanques, contribuyen a la etiología del brote de WFD estudiado. Hacemos hincapié en que el reajuste inmediato de los parámetros de la calidad del agua, específicamente el ajuste del pH por encima de 8, permitirá que WB vuelva a su composición previa a la perturbación y termine el brote, seguido de la recuperación de la WFD, como lo indica la ausencia de síntomas y genes de virulencia detectables en WB, y sin mortalidad de camarón.
Esto implica una resiliencia de las comunidades bacterianas en el agua de los estanques después de breves perturbaciones, como también se puede observar en otros ambientes49,59,60. Sin embargo, señalamos que la exposición prolongada al deterioro del agua y proporciones elevadas de patógenos, puede aumentar la gravedad de la enfermedad y conducir a una mortalidad masiva de camarones cultivados como se observó anteriormente5,61 .
Nuestros hallazgos sobre la aplicación de probióticos comerciales para curar la WFD en camarón, revelaron que las bacterias probióticas como Lactobacillus estaban ausentes en WB, IB y FSB, lo que sugiere que tal aplicación no fue efectiva. Lactobacillus ya no fue detectable después de que se diluyó en el agua del estanque. En lugar de esparcir los probióticos en el agua del estanque, proponemos agregarlos a los pellets que serán consumidos por los camarones. Con este método, la colonización de bacterias probióticas en el intestino del camarón puede ocurrir de manera más efectiva.
En conclusión, los factores ambientales estresantes, específicamente una disminución en el pH y el oxígeno disuelto, indujeron un cambio sustancial de la comunidad en WB y afectaron la fisiología del camarón, lo que a su vez resultó en cambios en la comunidad bacteriana intestinal y posteriormente en la aparición de WFD. Además, reportamos varios taxones de bacterias oportunistas como Arcobacter, Alteromonas, Marinomonas, Photobacterium y Pseudoalteromonas, que pueden contribuir o incluso causar WFD. Para evitar la pérdida de camarón, el manejo del cultivo de camarón debe enfocarse en mantener los sedimentos/lodos y la calidad del agua (es decir, pH, oxígeno disuelto, turbidez, nutrientes inorgánicos y SPM), así como para promover una composición estable de la comunidad bacteriana intestinal, donde las bacterias beneficiosas, incluso en niveles de proporciones bajos, son capaces de inhibir la patogenicidad de Vibrio.
Materiales y métodos
Sitios de recolección de muestras y muestreo Se recolectaron muestras de agua entre las 9 y las 11 am de un estanque con camarones sanos (P1, que sirvió como control) y 3 estanques de camarones (P2, P3 y P4) que experimentaron un evento de WFD entre 50 y 70 días de cultivo en octubre - noviembre de 2016. Todos los estanques fueron revestidos con plástico de polietileno de alta densidad (HDPE) y clorados 2 semanas antes de la siembra. La densidad de población inicial fue 40 (P2) y 90 postlarvas m − 3 (P1, P3 y P4), con el mismo origen de larvas de camarón (PL15, libre de patógenos específicos, Central Pertiwi Bahari Firm, Rembang, Java Central, Indonesia). Los estanques estaban ubicados en Rembang Regency, Java Central, Indonesia (6°37′41.13″S 111°30′1″E y 6°42′11.66″S 111°21′54″E). El muestreo de agua, así como las mediciones de parámetros ambientales, se describieron en un estudio anterior35. La data ambiental se publicó en PANGEA (https://doi.pangaea. de/10.1594/PANGAEA.908247 ).
Para el análisis de la comunidad bacteriana, se recolectaron diez heces fecales blancas frescas de las bandejas de alimentación de cada estanque con camarones infectados. Se recolectaron diez camarones sanos de P1 usando la bandeja de alimentación y se almacenaron con hielo inmediatamente en un contenedor frío. Luego fueron disecados en el laboratorio para recuperar el contenido de sus intestinos con herramientas de disección estériles. Antes de la disección, los camarones se limpiaron con etanol al 70% para esterilizar su cuerpo y evitar la contaminación del exoesqueleto. Todas las muestras se colocaron inmediatamente en tubos Eppendorf, se congelaron y almacenaron a -20°C hasta la extracción del ADN.
Recuento e identificación de cepas bacterianas presuntamente patógenas cultivadas en el agua del estanque Para obtener bacterias presuntamente patógenas cultivables (Vibrio) de todos los estanques, se sembraron 100 µL de muestra de agua sin diluir a 10-4 diluida en medio selectivo de sacarosa de sales biliares de citrato de tiosulfato (TCBS) (Roth, Karlsruhe, Alemania), seguido de incubación a 35 °C durante 24 h. Se contaron las colonias que crecieron en el medio TCBS para determinar el número de Vibrio presuntamente patógeno cultivable. Las cepas que crecieron en placas de TCBS de P1 al 60avo día de muestreo se combinaron mediante frotis y se recogieron en tubos Eppendorf que contenían 100 µl de agua de mar estéril y se almacenaron a -20 °C hasta la extracción de ADN y el análisis taxonómico basado en secuenciación. En total, las colonias de 6 placas TCBS se agruparon en 1 tubo Eppendorf por placa.
Análisis molecular de comunidades bacterianas Se filtraron 500 mL de muestras de agua para recolectar células bacterianas. Para distinguir entre las comunidades bacterianas de vida libre (FL) y las asociadas a partículas (PA), se realizó una filtración en serie a través de filtros de policarbonato de 3.0 µm y 0.2 µm (ø 47mm, Whatman, Dassel, Alemania) para el PA y fracciones bacterianas de FL, respectivamente.
El ADN genómico de las muestras de agua se extrajo según Nercessian et al.62, mientras que las células bacterianas de los intestinos, las heces fecales blancas y los aislados, se extrajeron mediante métodos de fenolcloroformo63. Los sedimentos de ADN se disolvieron en 40 µl de tampón TE (10 mM TrisHCl, 1 mM EDTA, pH 8.5). Las concentraciones de ADN se midieron fotométricamente y se verificó su pureza (relación de absorción de
luz a 260 a 280 nm) usando un lector de placas nanoquant (Infinite M200 Pro, Tecan, Alemania). La filtración, la extracción de ADN y las mediciones de la concentración de ADN genómico se realizaron por triplicado.
La amplificación del gen de ARNr 16S se realizó a partir de extractos de ADN genómico. Las secuencias de ADN de la región hipervariable V3-V4 del gen de ARNr 16S se obtuvieron a partir de la secuenciación de amplicones con el conjunto de primers SD-Bact-0314bS-17 (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′) / S D - B a c t - 07 8 5 - a A - 21 (5′-GACTACHVGGGTATCTAAKCC-3’)64. La secuenciación en LGC Genomics (Berlín, Alemania) se realizó en un Illumina MiSeq utilizando V3 Chemistry (Illumina) en una serie de 2 × 300 bp de extremos emparejados. La demultiplexación, es decir, la agrupación de secuencias por muestra, y la eliminación de las secuencias del primer de las lecturas de extremos emparejados sin procesar, se realizaron mediante LGC genomics (Berlín, Alemania). Las secuencias de ADN genómico de muestras de agua antes y después del período de enfermedad en P2, P3 y P4, así como P1 en los días de cultivo 50, 60 y 70 se recuperaron de un estudio anterior (PRJEB26390)35 .
Las secuencias se recortaron cuidadosamente con una ventana deslizante de cuatro bases a una calidad media mínima de 15 con trimmomatic v.03365 . Las secuencias recortadas se fusionaron utilizando PEAR v0.9.866. Luego, la Descomposición de Entropía Mínima (MED) se utilizó para agrupar las secuencias en OTUs67,68. La MED aplica el principio de oligotipificación67, que utiliza la entropía de Shannon para dividir de forma repetida los amplicones con una resolución de un solo nucleótido, proporcionando así descripciones más precisas de taxones muy relacionados, pero distintos69 .
Durante la MED, usamos un umbral de entropía de 0.0965 y una abundancia sustantiva mínima (-M) de 50 para evitar la poca generación de abundancia de OTUs, descomponiendo el conjunto de data en una posición de nucleótido a la vez (-d 1). Para cada OTU (nodo oligotipado), se clasificó taxonómicamente una secuencia representativa con SINA (SILVA Incremental Aligner) v1.2.11 utilizando la base de datos de referencia del proyecto SILVA ARNr (SILVA versión 132) con una similitud y calidad de alineación mínima de 0.9 y un último consenso de ancestro común de 0.770. Se eliminaron los linajes no deseados (como arqueas, cloroplastos y mitocondrias).
Con el fin de obtener resultados comparables a la data generada previamente35 para el análisis de WB, los perfiles OTU de muestras secuenciadas independientemente por triplicado de las fracciones FL y PA de P2, P3 y P4 en el evento WFD, se fusionaron tomando la suma de recuentos de secuencias por OTU.
Detección y cuantificación de genes de virulencia Tres genes de factor de virulencia pertenecientes a Vibrio que son regulador transcripcional (toxR), hemolisina termolábil (tlh) y hemolisina directa termoestable (tdh), se examinaron en una máquina de PCR cuantitativa (CFX Connect Real-time System Bio-Rad, München, Alemania) utilizando el conjunto de primers descritos anteriormente35. Las condiciones del qPCR fueron las siguientes: una mezcla de reacción compuesta por 10 µL de 2X SensiFast SYBR No-ROX (Bioline, Luckenwalde, Alemania), 1 µL de 25 mM MgCl2 (Roboklon EURx, Berlín, Alemania), 0.2 µL de 0.5 mM primer hacia delante y reverso (primer forward y reverse, en inglés) (Biomers, Ulm, Alemania), 8.8 µL de agua destilada estéril y 2 µl de plantilla de ADN (concentración 0.5–10 ng µL− 1).
La amplificación qPCR de 3 pasos se realizó de la siguiente manera: pre-desnaturalización a 95 °C durante 3 min, seguido de 40 ciclos de elongación que consisten en desnaturalización a 95 °C durante 10 s, recocido a 60 °C durante 15 s, y extensión a 72 °C durante 20 s, y se añadió un paso de disociación después del alargamiento final para mejorar la especificidad de amplificación. Se utilizó V. parahaemolyticus DSM 11058 (DSMZ, Braunschweig, Alemania) como control positivo para los genes toxR, tlh y tdh, mientras que V. vulnificus DSM 10143 (DSMZ, Braunschweig, Alemania) sirvió como control negativo. Se utilizó una dilución en serie del control positivo (concentración conocida) para estimar el número de copias genéticas a partir de muestras ambientales (Tabla de información complementaria 3). Los números de copias de genes para toxR y tlh se determinaron con la ecuación y = - 3.554x + 44.891 con R2: 0.994 y, y = - 3.300x + 42.982 con R2: 0.996, respectivamente.
Análisis de la data Se realizó un análisis de componentes principales (PCA) para examinar la relación entre los parámetros ambientales y para caracterizar los estanques durante los brotes de WFD. Las muestras de secuencia de ADN se clasificaron en WB (12 muestras de PA y 11 muestras de FL), bacterias de camarón, es decir, IB y FSB (10 y 30 muestras, respectivamente), cepas cultivables de Vibrio del estanque con camarones sanos (6 muestras) y bacterias probióticas (1 muestra). Los patrones de BCC en todas las muestras se visualizaron mediante un escalado multidimensional no métrico (NMDS) basado en las disimilitudes de BrayCurtis, mientras se realizaron pruebas de comparación por pares ANOSIM aplicando la corrección del valor-p de Benjamini-Hochberg para detectar la separación de comunidades bacterianas entre estanques para muestras de IB y FSB.
Los cambios en las disimilitudes de BrayCurtis entre FSB y WB de cada estanque enfermo antes, durante y después del evento de la enfermedad, se compararon mediante pruebas de suma de rangos de KruskalWallis, seguidas de pruebas de pares de Wilcoxon con corrección del valor-p de Benjamini-Hochberg. Se realizaron pruebas de suma de rangos de Kruskal-Wallis porque los valores de disimilitud de Bray-Curtis no estaban distribuidos normalmente.
Las diferencias en las concentraciones de genes toxR y tlh entre estanques se probaron usando ANOVA para camarones y MANOVA para muestras de agua para explicar la dependencia de las observaciones de las fracciones de FL y PA. Se realizaron ANOVA individuales por fracción una vez que el MANOVA indicó una diferencia en el número de copias de genes entre las fracciones FL y PA, seguido de múltiples comparaciones por pares (pruebas post-hoc de TukeyHSD) para evaluar la diferencia entre estanques.
Se analizaron las OTUs del intestino y heces fecales blancas (FS) para identificar subpoblaciones (módulos) de bacterias
concurrentes utilizando SPIEC-EASI (estimación de covarianza inversa dispersa para inferencia de asociación ecológica) versión 1.0.271. El método estadístico SPIEC-EASI comprende dos pasos, primero una transformación para la corrección de composición de la matriz OTU, y el segundo una estimación del gráfico de interacción a partir de la data transformada usando una selección de covarianza inversa dispersa71 .
El prefiltrado de las OTU se realizó antes del SPIEC-EASI para excluir las OTU raras y de baja cobertura de muestra, reteniendo solo las OTU que presentes en al menos cinco muestras con una proporción de al menos 0.1%. Los coeficientes de regresión de los resultados de SPIEC-EASI se extrajeron y se utilizaron como pesos de borde para generar una red de concurrencia bacteriana utilizando igraph72 .
Los pesos de borde negativos, que indicaron tendencias inversas entre las OTUs se excluyeron del clúster de Louvain, lo que luego se realizó para extraer módulos de red.
Los módulos característicos del IB del estanque sano y el FSB de cada uno de los estanques enfermos se identificaron utilizando modelos de bosque aleatorio mediante módulos eigengenes. Los módulos eigengenes y modelo de bosques aleatorios se calcularon utilizando los paquetes R WGCNA73 y randomForest74, respectivamente. Las proporciones de secuencia de los miembros de los módulos relacionados con camarón sano o los eventos de WFD (basados en la mayor media de disminución de Gini y precisión) se visualizaron en un mapa de calor.
Todos los análisis estadísticos, así como las visualizaciones de figuras, se realizaron en R (R versión 3.4.2, R Core Team, 2017, usando R Studio v.0.98.1056) con los paquetes vegan75, nlme76, gplots77 y los paquetes mencionados anteriormente. Disponibilidad de data
Las secuencias de ADN generadas en este estudio se depositaron en ENA con el número de acceso PRJEB37200 (https: // www. ebi.ac.uk/ena/data/view/PRJEB37200 ), mientras que los parámetros biogeoquímicos y los scripts R para análisis estadísticos se enviaron a PANGEA (https://doi.pangaea. de/10.1594/PANGAEA.908247 ) utilizando el servicio de data de la Federación Alemana de Datos Biológicos/GFBio78 en conformidad con la información mínima sobre cualquier (X) Sequence (MIxS) estándar79 .
Para más información sobre este artículo escriba a:
yustian.alfiansah@leibniz‑zmt.de
