1. 2 Fundamentos de la terapia monoclonal en el asma

TERAPIA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES EN PATOLOGÍA INFLAMATORIA CRÓNICA DE LA VÍA AÉREA. EL FUTURO YA ESTÁ AQUÍ.

Capítulo 2

Fundamentos de la terapia monoclonal en el asma Luis A. Pérez de Llano, MD, PhD Servicio de Neumología del Hospital Lucus Augusti. Lugo

TERAPIA CON ANTICUERPOS MONOCLONALES EN PATOLOGÍA INFLAMATORIA CRÓNICA DE LA VÍA AÉREA. EL FUTURO YA ESTÁ AQUÍ.

Fundamentos de la terapia monoclonal en el asma Luis A. Pérez de Llano, MD, PhD Servicio de Neumología del Hospital Lucus Augusti. Lugo

La inflamación en el asma El asma es una enfermedad inflamatoria crónica de la vía aérea de naturaleza heterogénea que clásicamente se ha asociado con una respuesta inflamatoria del tipo TH2. Durante la década de los 80 se profundizó en el conocimiento de la funcionalidad de los linfocitos T y se identificaron dos tipos de respuestas colaboradoras: la TH1 y la TH2. La respuesta TH1 es altamente efectiva en la eliminación de patógenos intracelulares, mientras que la TH2 es de gran importancia en la eliminación de microorganismos extracelulares y parásitos1. Esta división en dos subtipos se basó en los paneles de citocinas que los linfocitos podían secretar una vez activados y en los que modulaban la función de diversos tipos celulares. Se denominó TH1 a los linfocitos que migran a los tejidos infectados y colaboran en la activación de los macrófagos; son secretores de interferón γ (IFN-γ) e interleucina 2 (IL-2). Se denominó TH2 a los linfocitos que permanecen fundamentalmente en los tejidos linfoides y colaboran en la activación de los linfocitos B (LB); liberan IL-4, IL-5 e IL-132.La diferenciación en TH1 o TH2 a partir de los linfocitos novatos (naive) se determina en la sinapsis inmunitaria, en función de las citocinas que están presentes y que funcionan como terceras señales durante el proceso de activación. La respuesta TH2 puede ocurrir en asmáticos alérgicos y no alérgicos, y los triggers que la desencadenan son bien conocidos en el primer caso y no tanto en el segundo.

Inflamación TH2 Clásicamente, se han utilizado los términos alergia y atopia de forma intercambiable, pero este último ha adquirido el matiz de «sujeto con predisposición a sensibilizarse a ciertos alérgenos mediante un mecanismo inmunitario mediado por anticuerpos IgE». Desde ese punto de vista, alergia se emplearía para caracterizar a las enfermedades mediadas por la IgE, y atopia, en el sentido de ‘predisposición a padecer alergia’. En el asma, la diferenciación fenotípica más antigua fue la de asma extrínseca/intrínseca, propuesta por Rackerman en 19473. Este autor,

en un número limitado de pacientes, comprobó que en parte de ellos (pero no en el resto) los síntomas ocurrían con la concurrencia de factores desencadenantes. El asma extrínseca característicamente aparece en la infancia, va acompañada de sensibilización alérgica (definida por la presencia de IgE específica frente a alérgenos identificables) y de procesos atópicos concomitantes, y algunos de sus desencadenantes han podido ser identificados. El asma intrínseca aparece en edades tardías (sobre los 40 años), se asocia con sensibilidad a AINEs pero no a alérgenos identificables, y su fisiopatología ha sido menos comprendida y estudiada. Si intentásemos situar esta diferenciación en la concepción actual de fenotipos, el asma extrínseca correspondería al asma alérgica de inicio temprano, y la intrínseca, al asma eosinofílica del inicio tardío de la clasificación propuesta por Wenzel4.

Como se ha dicho anteriormente, la inflamación TH2 puede ocurrir tanto en asmáticos alérgicos como en no alérgicos, pero mientras que los triggers que desencadenan la respuesta son bien conocidos en este último caso, no lo son tanto en el primero5.Brevemente, la sensibilización alérgica empieza cuando los antígenos son presentados a las células T naive por las células presentadoras de antígenos (fundamentalmente, pero no exclusivamente, las células dendríticas), lo que dirige su desarrollo hacia un fenotipo TH2 y estimula la liberación de citocinas propias de este fenotipo (IL 4, IL 5, IL 9, IL 13). La IL4 recluta más células TH para el linaje TH2, mantiene las células TH2 en ese linaje y, junto con la IL13, transforma las células B en productoras de IgE. La IgE se une al receptor de alta afinidad del mastocito (FcεR1) y lo sensibiliza al alérgeno (fase de sensibilización, preclínica). La exposición alergénica subsiguiente conduce a su ligazón con la IgE unida al mastocito, lo que resulta en la desgranulación de éste y en la liberación de mediadores preformados (ej: histamina) o formados de novo (ej: leucotrienos), lo que desencadena síntomas agudos (fase de inflamación aguda) y la liberación de citocinas y quimiocinas, que atraerán células al lugar de la inflamación (fase de inflamación crónica). Esta cascada inflamatoria está esquematizada en la figura 1.

Figura 1. Inflamación TH2 alérgica

Recientemente, se aislaron células linfoides innatas del tipo 2 (ILC2) en grandes cantidades en los pólipos nasales de pacientes con rinosinusitis crónica y asma no alérgica, eosinofílica, de inicio tardío6. Después de ser estimuladas por citocinas procedentes del epitelio bronquial (IL 25, IL 33, TSLP) como consecuencia de la acción de virus, bacterias o irritantes, los ILC2 producen grandes cantidades de IL5, IL13 y, en menor cuantía, IL4. Esta elevada producción de IL5 podría explicar el alto grado de eosinofilia existente en el asma no alérgica (Figura 2).

Figura 2. Inflamación TH2 no alérgica

Todo esto explica que la inflamación TH2 en pacientes alérgicos y no alérgicos presente más similitudes que diferencias, como es bien sabido desde el clásico estudio de Humbert7.Incluso el mediador por excelencia de la respuesta alérgica –la IgE– podría tener un papel relevante en la respuesta inmunitaria del asma no alérgica TH2 de acuerdo con las siguientes hipótesis: • Los pacientes con asma no atópica pueden producir IgE específica a nivel local (no detectable a nivel sistémico) que podría ser relevante en el proceso inflamatorio subyacente.

Mouthuy y colaboradores8 diseñaron un interesante estudio para el que reclutaron a 53 pacientes con asma (24 atópicos con pruebas positivas –al menos para D pteronyssimus– y 29 no atópicos) y 25 controles sanos no atópicos. La gravedad del asma fue similar en ambos grupos de asmáticos. Midieron en el esputo IgE total e IgE específica para DP (IgEDP). Encontraron que los no atópicos tienen más IgE total y más IgEDP que los controles.

No había diferencias significativas entre no atópicos y atópicos. Además, se apreció más eosinofilia y más IL5 en no atópicos que en controles.

• Los pacientes con asma no atópica producen IgE específica, no contra los aeroalérgenos comunes, pero sí contra superantígenos (proteínas bacterianas o virales que tienen la capacidad de estimular gran número de células T y que no requieren procesamiento fagocítico), y esta inmunización sería relevante en la patogenia del proceso asmático. El estudio GALEN evaluó la prevalencia en Europa de IgE específica contra enterotoxinas del Staphylococcus aureus (SE-IgE). Se encontró una prevalencia del 29% sin variaciones geográficas y, lo que es más importante, que la concentración sérica de IgE era más elevada en las personas con positividad de la SE-IgE que en las que tenían un prick-test positivo. Un resultado positivo para la SE-IgE se asoció significativamente con el diagnóstico de asma (OR 2.10) de forma independiente al resultado del test cutáneo9. Bachert y colaboradores diseñaron un estudio con 69 controles, 152 asmáticos no graves y 166 con asma grave para medir los niveles de IgE total, SE-IgE, IgE específica para ácaros e IgE específica para polen. Se encontró que la positividad de la SE-IgE era considerablemente mayor en asmáticos graves (59%) que en controles (13%). Además, el 21% de los asmáticos graves con positividad a la enterotoxina eran no atópicos. La presencia de SE-IgE suponía riesgo

para asma (OR 7.25) y asma grave (OR 11), mientras que la presencia de IgE para ácaros o polen no aumentaba el riesgo de sufrir la enfermedad o de que ésta fuese más grave10.

Staphylococcus aureus Las células dendríticas plasmocitoides juegan un papel crucial en la respuesta inmune innata frente a infecciones (predominantemente virales), pero también están envueltas en respuestas inmunes de tipo alérgico. Actúan en la encrucijada en que confluyen la respuesta inmune innata y la adaptativa, influenciando cada una de ellas. Un ejemplo de ello es que la unión de la IgE al receptor de alta afinidad de su superficie (cuya expresión depende de los niveles circulantes de IgE) disminuye la actividad antiviral de las células dendríticas. Por lo tanto, una disminución en la expresión de estos receptores por acción del omalizumab aumentaría la capacidad de estas células para evitar infecciones virales, hipótesis que expone Lommatzsch en un artículo de revisión11. Un ejemplo de ello sería el estudio publicado por Busse y colaboradores12, en el que se apreció que el tratamiento anti-IgE abolía por completo los picos de exacerbaciones asmáticas que ocurren en primavera y otoño, característicamente relacionados con infecciones por Rhinovirus.

Toda la red de células moduladoras, efectoras y citocinas que constituye la respuesta TH2 en el asma fija una serie de dianas terapéuticas que pueden ser neutralizadas por terapias biológicas. A continuación, describiremos brevemente las principales células implicadas en este tipo de reacción inflamatoria.

Células implicadas en la respuesta inflamatoria TH2 Mastocitos Los mastocitos son células inflamatorias de origen hematopoyético que responden a señales de inmunidad innata y adaptativa. Se activan en el momento en que la IgE, unida a un antígeno polivalente, se liga al FcεR1. La densidad de este receptor en la superficie del mastocito se sobreexpresa en presencia de niveles elevados de IgE y en presencia de IL4.

Los mediadores producidos por los mastocitos se clasifican en preformados y sintetizados de nuevo. Algunos de ellos, como el TNF-α, pueden ser incluidos en ambas categorías. Los mediadores preformados (histamina, proteasas, carboxipeptidasa A y proteoglicanos) están almacenados en gránulos citoplasmáticos. En el momento de la activación, estos gránulos contactan con la membrana celular, y en unos minutos se liberan en los mediadores al medio extracelular. La histamina produce contracción del músculo liso bronquial, actúa sobre las células endoteliales, estimula las terminaciones nerviosas y aumenta la producción de moco. La triptasa puede activar fibroblastos, fomentar el acúmulo de células inflamatorias y potenciar la broncoconstricción inducida por la histamina. Los mastocitos activados sintetizan rápidamente mediadores eicosanoides de la membrana celular, lugar donde éstos se almacenan. El ácido araquidónico liberado es convertido por la COX en prostaglandina D2 (no producida por basófilos), o, por la 5-lipoxigenasa en colaboración con la FLAP, en LTA4, que será convertido en LTB4 o conjugado con glutatión para formar LTC4. Los cisteinilleucotrienos son potentes broncoconstrictores, aumentan la permeabilidad vascular, inducen la producción de moco y atraen eosinófilos. La PGD2, además, es un broncoconstrictor y atrae eosinófilos y basófilos. El TNF-α es una citoquina también almacenada y liberada por los mastocitos. Sobrerregula las moléculas de adhesión epitelial, aumenta la hiperrespuesta bronquial y tiene efectos antitumorales. Otras citocinas producidas por los mastocitos son: IL-

3, GM-CSF e IL-5, que son fundamentales para el desarrollo y la supervivencia del eosinófilo, e IL-6, IL-10 e IL-13. También producen algunas quimiocinas que incluyen CXCL8 (IL-8) y CCL3 (macrophage inflammatory protein 1α, MIP1α). La activación de los mastocitos da lugar al inicio de una reacción de hipersensibilidad inmediata, además de una reacción tardía. La reacción inmediata está determinada por los mediadores preformados, que al ser liberados producen tos, broncoespasmo, edema y secreción mucosa. La reacción tardía está mediada por citocinas y quimiocinas y puede ocurrir 6-24 horas después de la reacción inmediata. Se caracteriza por edema y aflujo de células inflamatorias y es importante en la persistencia del asma.

Basófilos Los basófilos comparten con los mastocitos muchas propiedades, incluida la expresión del FcεR1, secreción de citocinas TH2 y liberación de histamina después de la activación, pero constituyen un linaje diferente con particularidades. Es especialmente reseñable su rápida y potente expresión de IL4 e IL13. Los basófilos se desarrollan desde progenitores CD34+, se diferencian y maduran en la médula ósea y circulan en la periferia, donde constituyen < 1% de los leucocitos periféricos, y se cree que tienen una vida media de pocos días. La IL3 es la citocina dominante en su diferenciación y es suficiente para que se produzcan basófilos a partir de células madre. Aunque no es una célula que esté de forma predominante en los tejidos, expresan integrinas y receptores citocínicos y quimiocínicos y pueden infiltrar tejidos inflamados, particularmente la piel con dermatitis atópica y la vía aérea de pacientes con alergias respiratorias. Los basófilos expresan un completo FcεRI (αβγ2), expresión que se correlaciona directamente con la concentración de IgE libre. La agregación FcεRI a la IgE unida a un Ag multivalente lleva a la activación del basófilo, a la exocitosis de los gránulos y a la liberación de mediadores. C3a y C5a también activan los basófilos a través de sus receptores de superficie. IL3, IL5, GM-CSF, el factor liberador de la histamina, al mismo tiempo que varias quimiocinas, facultan a los basófilos para una mayor desgranulación a la par que para una mayor secreción de IL4 e IL13 después de la activación del FcεRI, pero no actúan en soledad. TLR2 y TLR 4 (toll-like receptors: estos receptores son transmembranosos, reconocen patrones moleculares expresados por un amplio espectro de agentes infecciosos y estimulan una variedad de respuestas inflamatorias; además, la señalización mediada por los TLRs en las células presentadoras de antígeno representa una parte importante en el vínculo entre la respuesta inmune innata y la adaptativa) también se expresan en los basófilos, y su activación lleva a la secreción de IL4 e IL13 y a la potenciación de la activación IgE y no-IgE inducida. De forma parecida, la IL-33, un miembro de la superfamilia IL1, activa los basófilos a través del receptor ST2, lo que resulta en una expresión de IL4 e IL13 y una potenciación de la desgranulación IgE-mediada.

Como en el caso de los mastocitos, los mediadores producidos por los basófilos se dividen en mediadores preformados, mediadores lipídicos de nueva formación y citocinas/quimiocinas.

El mediador más importante almacenado en gránulos de los basófilos es la histamina. Los niveles de proteasas y heparina parecen más bajos que en el caso de los mastocitos. Los basófilos producen rápidamente LTC4 y sus productos peptidolíticos LTD4 y LTE4 después de su activación. Al revés que los mastocitos, los basófilos no producen PGD2. Las citocinas expresadas por los basófilos activados incluyen IL4, IL13 y GM-CSF, muy relevantes para la subsiguiente diferenciación TH2. Los basófilos que expresan IL4, IL13 y CD154 han sido considerados muy importantes para la amplificación de la síntesis de IgE.

El papel fisiológico de los basófilos es todavía una incógnita, aunque se cree que juegan un papel en la defensa contra los parásitos. Han sido identificados en procesos inflamatorios cutáneos y de la vía aérea. Recientes estudios murinos sugieren un papel directo de estas células en la presentación antigénica para la inducción de respuestas TH2, con la expresión de MHC clase II y producción de IL4.

Eosinófilos Son granulocitos y su presencia en elevado número en sangre puede verificarse en infecciones parasitarias, alergia, asma, enfermedades gastrointestinales, reacción a fármacos, etc.

Los mediadores IL-5, IL-3 y GM-CSF son promotores del desarrollo de eosinófilos desde su progenitor hematopoyético (CD34+). Se desarrollan en la médula ósea y se liberan a la circulación, sobre todo por estimulación con la IL5, aunque siempre hay un pool de eosinófilos maduros que persiste en la médula ósea. La IL5 producida en el proceso inflamatorio actúa distalmente en la médula ósea para que los eosinófilos sean liberados. Una vez abandonada ésta, siguiendo la estimulación de la IL5, estas células entran en la circulación e infiltran tejidos. La vida media de los eosinófilos en la circulación es de 8-18 horas. La mayoría de los eosinófilos se localizan en los tejidos, particularmente en las superficies mucosas con inflamación, predominantemente TH2. La IL 4 y la IL13 (no la IL5) juegan un papel central para impulsar el tráfico de eosinófilos hacia el tejido mucoso sobrerregulando coneotaxina (CCL11 y CCL26) y la molécula de adhesión (VCAM-1). También son potentes quimioatractores PAF, LTD2, C5a y CCL5 (RANTES). La supervivencia de la célula en los tejidos se ve favorecida por IL-3, IL-5, GM-CSF, IL-33 e interferon-γ. No hay un claro consenso acerca de cómo se activan los eosinófilos. Pueden ser activados por una serie de mediadores que incluyen IL-3, IL-5, GMCSF, CC quimiocinas y PAAF. Sus productos se liberan por exocitosis y citolisis. Los eosinófilos liberan mediadores proinflamatorios que incluyen proteínas catiónicas almacenadas en los gránulos, eicosanoides sintetizados de novo y citocinas. La proteína básica mayor (MBP) supone más del 50% de lo almacenado, es muy catiónica, carece de actividad enzimática y puede aumentar la permeabilidad de la membrana. En asmáticos, se correlaciona con la hiperreactividad bronquial. La neurotoxina derivada del eosinófilo (EDN) y la proteína catiónica eosinofílica (ECP) han demostrado toxicidad in vitro a parásitos y algunos virus. La peroxidasa eosinofílica (EPO) representa ~25% de la proteína granular y es tóxica para microorganismos y para las células huésped. La proteína de cristales de Charcot-Leyden (galectin-10) es una proteína hidrofóbica, de función desconocida, producida en grandes niveles por los eosinófilos.

Se puede encontrar en el esputo de pacientes con asma. Los eosinófilos, además, son una fuente de mediadores derivados de lípidos: LTC4, PGE2, tromboxano y PAF. También pueden producir un notable número de citocinas y quimiocinas (aunque en menos cantidad que otros leucocitos), que incluyen TGF-β, IL-3, IL-4, IL-5, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, IL-18, TNF-α, CCL5 y CCL11.

Hay una variación significativa en las cifras de eosinófilos a lo largo del día: los niveles más altos se dan por la tarde-noche, y los más bajos, por la mañana. Su elevación es típica del asma atópica, reacciones a fármacos, síndrome hipereosinofílico y algún tipo de inmunodeficiencia.

En las enfermedades atópicas, se encuentran principalmente aumentados en secreciones nasales, esputo y BAL. Estudios murinos apoyan un papel de los eosinófilos en el remodelado aéreo, HRB y producción de moco.

Células linfoides innatas de tipo 2 (CCL-2). Las células linfoides innatas son un grupo de células del sistema inmune innato que no responden de forma antigenoespecífica (carecen

de receptores presentes en otros linajes: B y T). Son células no T, no B, no efectoras. Se clasifican en base a las citocinas que pueden producir: ILC 1 (IFN gamma y TNF), que incluyen las células CLI1 y NK, ILC2 (IL4, 5, 9, 13) e ILC3 (IL 17 y 22). Estímulos como alérgenos o infecciones parasitarias llevarían a la liberación desde el epitelio de factores inductores de los ILC2 (IL 25, IL33, TSLP: linfopoyetina estromal tímica, de importante papel en la maduración de las células T a través de la activación de las células presentadoras de antígeno). Estas citocinas inducen la proliferación de las ILC2 y su producción de citocinas TH2.

Natural Killers. Como componentes del sistema inmune innato, no precisan una sensibilización previa para actuar. Son mediadores de la toxicidad celular y liberan quimiocinas y citocinas implicadas en la inmunidad frente a tumores y microorganismos. El hecho de que la IgE pueda activar estas células a través de un receptor (CD16) que normalmente liga IgG, implica que los NK podrían participar en respuestas alérgicas IgE-mediadas. En concreto, en asmáticos, el fenotipo de las NK está alterado y podría contribuir a provocar un ambiente proinflamatorio del tipo TH2.

Células TH9 Inicialmente, se postuló que la IL9 era una citosina TH2-específica, inducida por IL2, IL4 y TFG β. Posteriormente, se identificó un subtipo diferenciado de LT, los LT9. La IL-9 es un factor de crecimiento del mastocito que impulsa la producción de anticuerpos por parte de los LB (mediada IL-4) y que también puede inducir metaplasia de las células caliciformes. La IL-9 tiene una elevada expresión en los pulmones de asmáticos, y su neutralización con un monoclonal puede atenuar la respuesta inducida en ratones por ovoalbúmina y Aspergillus fumigatus. En un modelo experimental de asma, la administración de un anticuerpo para bloquear esta inmunoglobulina redujo el número de mastocitos y el desarrollo de remodelado.

Aunque en un principio se consideró que las células T eran la mayor fuente de IL-9, recientes experimentos con ratones sugieren que podría ser sintetizada en mayor cantidad por células ILC2.

Células Treg El papel preciso de las células Treg en pacientes con patología alérgica ha sido ampliamente debatido. En asmáticos graves, el número de células Treg presentes en sangre y esputo es más bajo –y su actividad supresora está más reducida –que en sujetos sanos. Más aún, el porcentaje de células Treg también está disminuido en el BAL de niños con asma. En adultos, los datos son más controvertidos, con publicaciones que encuentran aumento de Treg en los pulmones de asmáticos y otras que hallan reducción en su número. A pesar de estas discrepancias, hay unanimidad en considerar que la función de Treg está disminuida en asmáticos, y es interesante notar que se ha visto que esta disfunción observada en pacientes alérgicos afecta sólo la regulación de las respuestas TH2.

Inflamación no-TH2, asma neutrofílica Aunque la inflamación TH2 es la más característica del asma, no todos los asmáticos presentan este tipo de respuesta inmunitaria, y en algunos pacientes –en particular en los graves– subyace un patrón inflamatorio mixto en que coexisten eosinófilos y neutrófilos, célula esta última que predomina en el recuento celular de un gran porcentaje de asmáticos no controlados13. La

llamada asma neutrofílica está modulada por la acción de LTH1 y, especialmente, de TH17.

En este contexto fisiopatológico, las células dendríticas juegan un papel crucial, ya que dirigen los procesos de diferenciación que llevan a la polarización hacia diferentes subpoblaciones de LT14. En particular, el compromiso con un linaje concreto de células T es muy dependiente del “ambiente inflamatorio” de la vía aérea, constituido por moléculas coestimulantes y citocinas15.

Algunos estudios recientes demuestran que no todos los casos de asma con predominio neutrofílico corresponden a pacientes graves y de edad avanzada. En concreto, el estudio de McGrath y colaboradores16, llevado a cabo en asmáticos leves y moderados, mostró que el 47% de los pacientes incluidos no presentaban eosinofilia en ninguna de las ocasiones en que se obtuvo un esputo inducido.

Antes del descubrimiento de los LT17, se creía que las células TH1 (cuya diferenciación está mediada por las células dendríticas productoras de IL12 y de interferones de tipo 1 y que requieren la expresión del factor de transcripción T-bet) eran las responsables de la fisiopatología del asma neutrofílica. De hecho, se sabe que algunas citocinas TH1, como interferon-γ (IFN-γ), y el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) están aumentados en pacientes con asma grave.

Sin embargo, estudios más recientes sugieren que las células TH17, productoras de IL17A e IL17F, pueden ser fundamentales para que este tipo de inflamación neutrofílica predomine en algunos asmáticos. Además de los LT17, las células T TCRγδ, las células NK y las ILC3 pueden ser una fuente copiosa de producción de IL17, y su importancia podría diferir en los distintos endotipos asmáticos. Se ha demostrado una sobreexpresión de IL17A e IL17F en el tejido bronquial de pacientes con asma, y también que sus niveles guardan relación directa con la gravedad de la enfermedad, especialmente en los casos graves de predominio neutrofílico.

En un ambiente inflamatorio con predominio de las citocinas IL-1β, IL-6, y TGF-β, las células dendríticas podrán interactuar con los LT naive a través de su ligando CD40. Estas citocinas son responsables de la sobrerregulación del factor de transcripción RORγt, que es específico para el compromiso con el linaje Th17, y también aumentan la expresión del receptor para la IL23, que es responsable de mantener a los LT17 en un estado funcionalmente activo.

Los alérgenos y otros factores ambientales, como microorganismos, las partículas diesel y el tabaco, pueden activar la respuesta inflamatoria TH17 en asmáticos. Cualesquiera que sean sus fuentes celulares, una vez liberadas, la IL17A y/o la IL17F estimulan las células bronquiales epiteliales y los fibroblastos subepiteliales para que secreten poderosos factores quimiotácticos para el neutrófilo, como IL-8 (CXCL8) y CXCL1/GRO-α (Figura 3). El asma neutrofílica asociada a TH17 se caracteriza habitualmente por formas clínicas graves muy difíciles de controlar por su resistencia a la acción de los esteroides13.

Figura 3. Inflamación no-TH2

Endotipos inflamatorios Entendemos por “fenotipo” las características observables de un individuo, siendo éstas el resultado de la interacción de los genes (genotipo) y del medio ambiente. El endotipo es la evolución de un concepto que va más allá del fenotipo al centrarse en la vía biológica específica que trata de explicar las características del fenotipo. Por lo tanto, un mismo endotipo se podrá expresar en diferentes fenotipos, y un mismo fenotipo podrá proceder de endotipos distintos. No existe ningún consenso sobre las clasificaciones de los distintos fenotipos ni endotipos. Se trata, en consecuencia, de un tema controvertido y no exento de polémica.

Los fenotipos se han definido en función de sus características clínicas, desencadenantes y proceso inflamatorio subyacente, pero no existe una clasificación completa y precisa. Los principales problemas para clasificar el alma según sus fenotipos son: • No existe una clasificación definitiva de los fenotipos y, por lo tanto, hay una considerable superposición entre los que se describen en cada una de las denominaciones de asma. Por ejemplo: “asma con obstrucción fija” y “asma neutrofílica” o “asma con frecuentes exacerbaciones” y “asma eosinofílica de inicio tardío”.

• Los fenotipos clínicos e inflamatorios no son estables a lo largo del tiempo y pueden variar en un mismo paciente, bien espontáneamente, bien por acción del tratamiento. Kupczyk y colaboradores agruparon a 169 asmáticos (93 graves) en diferentes clústers de acuerdo con una serie de características clínicas y fisiológicas. También fueron clasificados por el patrón inflamatorio en el esputo. Fueron reevaluados un mínimo de 6 veces durante 1 año.

Se comprobó que un 23-30% de los pacientes cambiaron de fenotipo definido por parámetros fisiológicos en asma leve-moderada, y que este porcentaje era aún mayor en pacientes

con asma grave18. Curiosamente, cuando los asmáticos eran clasificados de acuerdo con parámetros clínicos y fisiológicos, estos eran más estables a lo largo del tiempo que cuando se agrupaban por patrones inflamatorios.

• No es posible lograr una buena identificación entre los parámetros clínicos y fisiológicos y el sustrato inflamatorio. McGrath y colaboradores16, como previamente se ha comentado, incluyeron en su estudio a pacientes jóvenes (edad media 30 años), con asma de inicio temprano en la mayoría de los casos, y hallaron –al contrario de lo que cabría esperar– que el fenotipo inflamatorio eosinofílico no era ni mucho menos universal en ellos, incluso si no estaban recibiendo corticoides inhalados. Moore y colaboradores, en una de las muchas publicaciones del SARP (Severe Asthma Research Program)19, clasificaron a 423 asmáticos en 4 clústers y examinaron la concordancia entre fenotipos clínicos e inflamatorios. La eosinofilia en el esputo era más frecuente en los clústers que agrupaban a los pacientes con asma leve-moderada de inicio temprano, mientras que la neutrofilia prevalecía en los clústers de asmáticos moderados-graves con inicio tardío; pero los porcentajes de individuos con estos patrones (41% y 83% respectivamente), distan de ser definitorios.

• Por otra parte, establecer el patrón inflamatorio de los pacientes con asma no es sencillo, ya que la prueba estándar para ello, el recuento celular en el esputo, es muy laboriosa y de complicada realización fuera de los centros de referencia. Por ello sería muy importante contar con biomarcadores fiables. Se han investigado, especialmente, biomarcadores de inflamación tipo TH2 (eosinófilos en sangre, óxido nítrico en el aire exhalado: FENO, periostina…), pero los resultados han sido discordantes. La periostina había despertado grandes expectativas después de un estudio de Jia y colaboradores20 en el que, en 67 asmáticos moderados-graves, ésta obtuvo un área bajo la curva ROC de 0,84 para predecir eosinofilia en el esputo con un punto de corte de 25 ng/ml. Sin embargo, un estudio posterior en el que se llevó a cabo una validación externa en 110 pacientes con asma leve-moderada y se replicó posteriormente en 37 pacientes con asma moderada-grave, contradijo estos resultados al encontrar un área bajo la curva de 0,55 para la perisotina, muy lejos del valor de los eosinófilos en sangre (0,89), el mejor biomarcador para predecir eosinofilia en el esputo21.

En lo referente a asma no eosinofílica, neutrofílica o noTH2, se han hecho incluso menos progresos todavía para encontrar un biomarcador fiable.

Para poder definir un fenotipo o endotipo “verdadero”, es preciso que se cumpla toda una serie de requisitos que se detallan en la tabla 1. Sin embargo, hasta la fecha no disponemos de ninguna clasificación de fenotipos –ni de endotipos– que cumpla todas estas premisas. Los endotipos más aceptados son los siguientes22 (Tabla 2):

Tabla 1. Requisitos para definir a un fenotipo como verdadero

Tabla 2. Endotipos de asma

• Asma eosinofílica de inicio temprano: Es la más frecuente, supone cerca del 50% de todas las asmas, comienza en la infancia o adolescencia temprana, hay evidencia de sensibilización a alérgenos medioambientales, está ligada a otras enfermedades alérgicas (rinitis, sinusitis, dermatitis…) y puede ser de leve a grave. Su sustrato inmunopatológico es una reacción TH2 (tal y como antes se explicó) y está ligado a ciertos biomarcadores como la IgE, IgE específica, eosinofilia en sangre y esputo, FENO y periostina. Debe de tener una base genética, ya que son frecuentes los antecedentes familiares, y se han desarrollado nuevas moléculas que pueden ser eficaces en su tratamiento.

• Asma eosinofílica de inicio tardío. Este endotipo difiere del anterior en la falta de sensibilización específica, en su inicio más tardío y en su mayor tendencia a la gravedad, con más exacerbaciones y mayor obstrucción espirométrica. Puede asociarse a rinosinusitis, poliposis y enfermedad respiratoria exacerbada por la aspirina. Su sustrato inflamatorio es también TH2, pero sería más resistente a la acción de los corticoides, por lo que se contemplaría el tratamiento con otros fármacos, como los anti-IL5.

• Enfermedad respiratoria exacerbada por la aspirina. A pesar de que coexiste con el asma eosinofílica de inicio tardío, se tiende a considerar un endotipo individualizado de ésta, ya que tiene la particularidad de empeorar después de la ingestión de AINES y de asociarse con una elevada producción de cisteinil-leucotrienos y con una excesiva expresión de leucotrieno-c4-sintetasa. Por este motivo, el tratamiento con antileucotrienos es eficaz en este endotipo.

• Micosis broncopulmonar alérgica: Endotipo que se produce por un mecanismo de hipersensibilidad a un hongo, generalmente el Aspergillus fumigatus, y que se caracteriza por la producción de moco, bronquiectasias, presencia de IgG e IgE frente al hongo, eosinofilia y obstrucción bronquial. El tratamiento de elección son los esteroides sistémicos, aunque se han descrito pequeñas series en las que el omalizumab fue efectivo.

• Broncoconstricción inducida por el ejercicio: Aparece especialmente en personas jóvenes, atletas atópicos, suele ser una forma leve, y tiene un sustrato TH2 variable, aunque se cree que es mediada, al menos parcialmente, por un mecanismo TH2. No se ha identificado predisposición genética ni biomarcador alguno.

• Asma neutrofílica: Suele asociarse a formas graves de asma, con obstrucción bronquial fija y engrosamiento de la pared bronquial. Los corticoides son poco eficaces en ella, y se ha sugerido que los macrólidos podrían mejorar el curso de los asmáticos con neutrofilia. Hay poca evidencia de que algún monoclonal en un futuro próximo pudiera ser útil en este endotipo, y los intentos previos (anti-TNF o anti-IL17) han fracasado hasta la fecha.

• Asma asociada a la obesidad: La relación entre obesidad y asma sigue siendo controvertida, ya que no está claro si la primera es una comorbilidad de la segunda o es un endotipo diferenciado del resto. Quizás habría que diferenciar dos escenarios clínicos: asmáticos con inflamación TH2 que, además, son obesos, y obesos que pueden presentar alteraciones en la mecánica ventilatoria que simulan asma o desarrollan un estado proinflamatorio que conduce a hiperrespuesta bronquial. Los estudios de clústers identifican una forma de asma que se inicia tardíamente, cursa con poca o nula inflamación TH2, es raramente alérgica y predomina en mujeres muy sintomáticas. Este sería un endotipo que podría mejorar con cirugía bariátrica.

Aun siendo imperfecta toda clasificación en diferentes endotipos de asma, es vital en los casos de asma grave y de control difícil, ya que estos pacientes serían susceptibles de recibir, en muchos casos, anticuerpos monoclonales dirigidos contra mediadores muy específicos de la inflamación. En casos de asma más leve, fácilmente controlables con medicación inhalada, esta clasificación es menos relevante, ya que de ella obtendrán pocos beneficios terapéuticos o pronósticos.

Corticoides: El mejor antiinflamatorio para el asma TH2 es inasumible por sus efectos adversos Generalidades. Mecanismo de acción. Efecto dosis-respuesta Los corticoides son el fármaco más potente y efectivo en el tratamiento del asma. En su formulación inhalada (CI), reducen la inflamación y la hiperrespuesta, mejoran la función pulmonar y disminuyen los síntomas y las exacerbaciones23. No está tan claro si pueden evitar la pérdida de función pulmonar a largo plazo (de hecho, el estudio del CAMP no encontró diferencias en el FEV1 final entre el uso de placebo o el empleo precoz de budesonida24), ni tampoco si son capaces de revertir el remodelado bronquial (aunque alguna investigación sí demostró este efecto sobre el grosor de la membrana basal reticular al cabo de 12 meses25).

En todo caso, lo que sí parece bien demostrado es que se trata de un tratamiento capaz de reducir la mortalidad por asma 26.

Los CIs ejercen su acción (al menos según el “mecanismo genómico”) después de unirse al receptor esteroideo situado en el citosol de la célula. Los corticosteroides libres atraviesan la membrana plasmática celular por su elevada liposolubilidad para unirse al receptor glucocorticoideo (RG), localizado en el citoplasma. Su expresión está regulada por el gen NR3C1 situado en el brazo largo del cromosoma 5, el cual produce dos isoformas diferentes: RGα y RGβ. La primera es la isoforma predominante y la única con capacidad de unirse al glucocorticoide para realizar funciones de activación o represión. En su forma inactiva, el RG se encuentra unido a un complejo heterodinérico formado por heat shock proteins, que evita que migre hacia el núcleo. Cuando se une al corticoide, el receptor se libera del heterodímero y se desplaza al núcleo celular (translocación), donde se une a un lugar específico del ADN conocido como “elementos de respuesta a los corticoides”, sensibles a éstos y capaces de activarse e inducir la transcripción de genes que codifican la producción de proteínas antiinflamatorias (transactivación). En este proceso participan varias moléculas coactivadoras que contribuyen a abrir la estructura de la cromatina del ADN a través de la acetilación de las histonas. Actualmente se considera que el mecanismo más importante de acción de los GCs se centra en su capacidad para suprimir la acción de factores de transcripción proinflamatorios (transrepresión). Esto puede ocurrir mediante la acción directa a través de los “elementos de respuesta a los GC” del ADN o, en gran medida, mediante interacción proteína-proteína entre el RGC activado y factores de transcripción nuclear como las proteínas activadoras de tipo I (AP-1), el NF-κβ o algunas proteínas activadoras de la transcripción (STAT). Igualmente, la transrepresión puede producirse por cambios en la estructura de la cromatina de ADN mediante la acetilación-desacetilación de las histonas. Cuando se activan factores de transcripción proinflamatorios (como el NF-κβ o el AP-1) e interactúan con histona-acetil-transferasa, se inicia el desenrollamiento del ADN. El RC activado puede impedir esta acetilación de las histonas. Hay estudios recientes que sugieren que los CIs pueden actuar de forma rápida sin modificar la expresión génica. El mecanismo “no-genómico” mejor descrito es la activación de la sintetasa endotelial del óxido nítrico27.

Si tenemos en cuenta que los CIs se distribuyen de forma muy poco homogénea en los bronquios y que la mayoría de ellos se deposita en las partes proximales sin llegar a alcanzar la pequeña vía aérea, resulta bastante sorprendente que su acción antiinflamatoria sea tan potente y efectiva. Dicho de otro modo, los corticoides actúan sobre un pequeño porcentaje de todas las células que participan en el proceso inflamatorio (la mayoría de ellas no llegaría a incorporar el complejo esteroide-receptor al núcleo) y, a pesar de ello, sus efectos clínicos son notables. La explicación más plausible es que, aunque la acción de los CIs sea local (“tópica”, se podría decir), ésta se traduce en una modificación de la respuesta inflamatoria que alcanza a toda la vía aérea o, al menos, a gran parte de ésta. Es decir, la acción de los CIs –a pesar de ser local– sería suficiente para reducir la liberación de mediadores inflamatorios (citocinas, factores quimiotácticos, endoteliales, etc.), y ello afectaría al reclutamiento o funcionalidad de células reguladoras y efectoras. Otra posibilidad sería que la absorción por parte de la circulación sistémica propiciase una mejor distribución de los CIs en el árbol bronquial. Meijer y colaboradores randomizaron a 120 pacientes con asma para recibir 30 mg de prednisolona oral, 2.000 μg de propionato de fluticasona y 500 μg de propionato de fluticasona. Observaron que la administración inhalada del CI resultó en una mayor reducción de la hiperrespuesta bronquial que con el corticoide oral y, lo que es más interesante, la dosis elevada de fluticasona logró una reducción de la eosinofilia periférica similar a la que se consiguió con el corticoide oral y mayor que la obtenida con la dosis baja28. Esto demuestra que el efecto de los CIs no es solamente tópico, sino también sistémico (después de su paso del tejido pulmonar a la sangre, el corticoide podría actuar en sangre periférica aumentando la apoptosis de los eosinófilos y también en la médula ósea suprimiendo los progenitores).

A pesar de que el uso de los CIs en el asma se extendió durante los años 80 del pasado siglo, no se conoce con detalle cómo actúan sobre los diferentes pasos de la cascada inflamatoria, ya que los estudios que se hicieron para discernir esta cuestión se llevaron a cabo antes de que la fisiopatología del asma fuese conocida con el detalle actual. En la tabla 3 se recogen los efectos de los CIs sobre los mediadores inflamatorios29.

Tabla 3. Efectos de los corticoides inhalados sobre los mecanismos inflamatorios del asma

Desde la publicación del estudio GOAL30 sabemos que podemos incrementar el número de asmáticos controlados aumentando la dosis de CIs, pero también hemos aprendido que habrá un porcentaje relevante de pacientes que no obtendrá el control a pesar de esta estrategia. Esto pone sobre la mesa una antigua controversia: ¿Hay un efecto dosis-respuesta en el tratamiento con CIs? La mayoría de los autores cree que la curva dosis-respuesta alcanza rápidamente un máximo y al mismo tiempo se llega a una meseta en la que sólo se logran pequeñas mejorías con grandes aumentos en la dosis de CI. Sin embargo, podría ocurrir que existiese una relación dosis-respuesta que no hubiera sido manifiesta por un fallo de diseño (por ejemplo, al haber probado dosis insuficientes durante un periodo de tiempo demasiado corto), por mala selección de la muestra (endotipos de asmáticos con una inflamación no TH2) o por una inadecuada selección de variables (por ejemplo, medir el FEV1 sin estimar la hiperrespuesta bronquial o la celularidad del esputo). Gershman y colaboradores randomizaron a 24 asmáticos para recibir fluticasona a dosis de 100 μg o 1.000 μg al día. Observaron que, al cabo de 6 semanas, el FEV1 mejoraba en ambos grupos sin diferencia significativa, pero el descenso de los eosinófilos en el esputo inducido fue mayor en los que recibieron dosis elevadas, sin que ello tuviese una repercusión notoria en la clínica o en la hiperrespuesta bronquial31.

Motivos por los que un paciente con asma no responde al tratamiento con esteroides: • Su endotipo inflamatorio no es sensible a la acción esteroidea. El estudio de Woodruff mostró, de una forma que deja poco lugar a dudas, que los asmáticos con un perfil inflamatorio TH2 más acusado (“TH2 high”) mejoraban significativamente con el tratamiento esteroideo, mientras que los pacientes con un perfil TH2 bajo o ausente (“TH2 low”) mostraban una respuesta pobre (incluso nula en muchos casos)32. La inflamación neutrofílica –muchas veces promovida por el tabaco– conlleva una mayor resistencia a la acción de los corticos-

teroides33 y, además, se relaciona con una mayor obstrucción irreversible y con una pérdida acelerada del FEV134,35.

• Es un paciente corticorresistente. Se han descrito ciertos mecanismos de resistencia a nivel molecular: -- Competencia por el RGβ. En algunas personas habría un predominio de esta isoforma, que es biológicamente inactiva.

-- Defectos en la translocación del complejo GC-RGα.

-- Desequilibrio acetilación-desacetilación de las histonas. Cuando se activan factores de transcripción proinflamatorios (como el NF-κβ o el AP-1) e interactúan con histonaacetil-transferasa, se inicia el desenrollamiento del ADN. El RG activado puede impedir esta acetilación de las histonas.

• La respuesta es sólo parcial. Esto se puede observar en pacientes asmáticos con una intensa inflamación TH2 (por ejemplo, algunos casos graves de asma eosinofílica de inicio tardío), en los que el tratamiento con CIs disminuye parcialmente la respuesta inflamatoria y mejora la situación clínica sin lograr el control de la enfermedad. Este sería el “paciente tipo” incluido en los estudios actuales con monoclonales36. En este caso, cabe preguntarse si dosis de CIs mayores de las habituales (megadosis) podrían conseguir mejorías adicionales, pero no hay mucha información al respecto. El citado estudio de Meijers sí mostró un efecto dosis-respuesta al compararse 500 y 200 μg de fluticasona28. Ayres y colaboradores reclutaron a 671 pacientes con asma grave y los randomizaron para recibir fluticasona 1 mg, fluticasona 2 mg o budesonida1600 μg. Al cabo de 6 semanas, la dosis más alta de fluticasona había logrado mejores valores de PEF vespertino y de FVC con respecto a la dosis de 1 mg, sin grandes diferencias en las variables clínicas, y con el coste de una significativa mayor reducción en el cortisol plasmático37. Por lo tanto, parece que dosis elevadas o muy elevadas de CIs logran beneficios adicionales en ciertas variables respecto a dosis bajas o intermedias (especialmente en marcadores inflamatorios), pero no está claro que ello tenga un impacto clínico relevante. No parece que se consigan mejorías apreciables en los síntomas, pero habría que disponer de estudios a largo plazo para saber si hay un impacto sobre el riesgo futuro (exacerbaciones, remodelado), y siempre teniendo en cuenta que, en lo referente a efectos adversos, sí hay un evidente efecto dosis-respuesta. También queda por conocer qué ocurriría si se seleccionase una población de pacientes con inflamación TH2, más susceptible a la acción de los CIs. Otra opción sería que, en lugar de usar dosis mayores que las convencionales, se utilizasen formulaciones de CIs en partículas de pequeño tamaño, capaces de alcanzar las pequeñas vías aéreas. De nuevo, hay poca experiencia al respecto. Hodgson y colaboradores seleccionaron una población de 30 asmáticos con enfermedad refractaria a pesar de estar recibiendo altas dosis de CIs y con eosinofilia persistente en la vía aérea. Además, tenían que haber demostrado una respuesta al menos parcial a 30 mg de prednisolona durante 2 semanas (clínica y también en el recuento de eosinófilos en el esputo). Después de la prueba con el corticoide oral, los asmáticos fueron randomizados para recibir 320 μg de ciclesonida o placebo añadidos a su medicación habitual. Al cabo de 8 semanas, se lograron mejorías no significativas en el recuento de eosinófilos en el esputo inducido y en el óxido nítrico

de procedencia alveolar38. Por lo tanto, no existe evidencia de que los CIs dispensados en formulaciones de pequeño tamaño consigan controlar a pacientes que siguen no controlados con los CIs de partículas de gran tamaño.

De todos modos, cabe preguntarse por qué, en algunos casos, pacientes con asma y un endotipo presuntamente sensible a la acción de los CIs sólo responden de forma parcial, y no hay muchas explicaciones a este hecho. Una de ellas sería que la inflamación TH2, aunque similar en lo referente a las células y mediadores que la integran, podría tener un origen diferente en pacientes alérgicos y no alérgicos. Así, el origen de la eosinofilia dependería más de los linfocitos TH2 en el primer caso y de las ILC2 en el segundo, con ciertas particularidades en los mediadores involucrados y, por tanto, en la respuesta al tratamiento. Las células epiteliales bronquiales liberan factores quimiotácticos para los eosinófilos, como la eotaxina3.

Las sobreexpresiones de este mediador (u otros mediadores) podrían dar lugar a cierta insensibilidad al tratamiento con CIs. Larose y colaboradores encontraron una relación entre la producción de esta quimiocina por parte de las células epiteliales bronquiales estimuladas por IL13 y la gravedad del asma y recuento de eosinófilos en el esputo, lo que implica que este mediador podría jugar un papel en la persistencia de la eosinofilia a pesar del tratamiento clásico39. Es necesario progresar mucho más en este tipo de investigaciones para aclarar este importante hecho clínico.

Tratamiento con corticoides orales El estudio GOAL, comentado con anterioridad, demostró que el tratamiento con 30 mg de prednisona podía lograr el control en un 7% de los pacientes que no habían podido obtenerlo con la estrategia terapéutica ascendente, alcanzando la máxima dosis de 500 μg de fluticasona cada 12 horas, con o sin salmeterol29. El grupo de Ten Brinke40 seleccionó a 22 pacientes con asma grave eosinofílica ( ≥ 2% eosinófilos en esputo) no controlada a pesar del uso de altas dosis de CIs ( > 1.600 μg) con o sin prednisona oral. Los randomizaron de forma ciega para recibir 40 mg de triamcinolonaim o placebo. Al cabo de 2 semanas, en el grupo de tratamiento activo (no en el grupo placebo) la eosinofilia en esputo había desaparecido prácticamente, había disminuido la necesidad de medicación de rescate y también había mejorado significativamente el FEV1. Por otra parte, Dente y colaboradores41 incluyeron a 59 pacientes con asma grave refractaria en un estudio en el que fueron randomizados para recibir 0,5 mg/kg de peso de prednisona o placebo. Al cabo de dos semanas, los que recibieron tratamiento activo mejoraron de forma significativa el FEV1 y vieron reducido el número de eosinófilos en esputo y de IL5 e IL8 en el sobrenadante.

En definitiva, parece que algunos efectos de los corticoides orales “superan” en cierta medida a los obtenidos con CIs a altas dosis. En la tabla 4 se recogen algunos de ellos, que quizás expliquen por qué se puede controlar por completo a algunos asmáticos sensibles a la acción de esteroides pero que no mejoran lo suficiente con dosis elevadas de CIs.

Tabla 4. Efectos adicionales de los corticoides orales respecto de los inhalados

Sin embargo, a pesar de su potencia antiinflamatoria, los efectos adversos de los corticoides sistémicos los hacen indeseables y peligrosos para el tratamiento crónico del asma. Estos efectos adversos son bien conocidos y han sido demostrados incluso en pacientes que no los usan de forma regular, pero sí al menos 30 días al año42.

El futuro del tratamiento del asma grave El futuro del tratamiento del asma grave no son, evidentemente, los corticoides. Cada vez se conoce con más detalle la fisiopatología de la enfermedad, tal y como se ha detallado en este capítulo. Y esto tiene dos implicaciones: el descubrimiento de potenciales dianas terapéuticas (prácticamente todos los mediadores y células descritos pueden serlo) y la diferenciación en grupos de pacientes afines en lo referente a su patrón inmunológico. Todavía no es posible saber si un solo fármaco monoclonal podrá ser suficientemente efectivo para controlar un porcentaje relevante de pacientes con asma grave que no alcanzan el control con la terapia inhalada estándar o si, por el contrario, será necesaria una combinación de varios de ellos.

Esto será desarrollado en un capítulo posterior.

Bibliografía 1. Abbas AK, Murphy KM, Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature 1996; 383: 787-793.

2. Mosmann TR, Coffman RL. TH1 and TH2 cells: Different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 1989; 7: 145-173.

3. Rackeman FM. A working classification of asthma. Am J Med 1947; 3: 601-606.

4. Wenzel SE. Asthma phenotypes: the evolution from clinical to molecular approaches. Nat Med 2012; 18(5): 716-725.

5. Brusselle G, Maes T, Bracke K. Eosinophilic airway inflammation in non allergic asthma.

Nature Med 2013; 19 (8): 977-979.

6. Mjösberg JM, et al. Nat Immunol 2011; (12): 1055-1062.

7. Humbert M, Durham SR, Ying S, et al. IL-4 and IL-5 mRNA and protein in bronchial biopsies from patients with atopic and non atopic asthma: evidence against “intrinsic” asthma being a distinct immunopathologic entity. Am J Respir Crit Care Med 1996; 154(5): 1497-1504.

8. Mouthuy J, Detry B, Sohy C, et al. Presence in sputum of functional dust mite-specific IgE antibodies in intrinsic asthma. Am J Respir Crit Care Med 2011; 184(2): 206-214.

9. Tomassen P, Jarvis D, Newson R, et al. Staphylococcus aureus enterotoxin-specific IgE is associated with asthma in the general population: a GALEN study. Allergy 2013; 68(10): 1289-1297.

10. Bachert C, van Steen K, Zhang N, et al. Specific IgE against Staphylococcus aureus enterotoxins: an independent risk factor for asthma. J Allergy Clin Immunol 2012; 130(2): 376-381.

11. Lommatzsch M, Korn S, Buhl R, et al. Against all odds: anti-IgE for intrinsic asthma?

Thorax 2014; 69(1): 94-96.

12. Busse WW, Morgan WJ, Gergen PJ, et al. Randomized trial of omalizumab (anti-IgE) for asthma in inner-city children. N Engl J Med 2011; 364(11): 1005-1015.

13. Moore WC, Hastie AT, Li X, Li H, Busse WW, Jarjour NN, Wenzel SE, Peters SP, Meyers DA, Bleecker ER (National Heart, Lung and Blood Institute’s Severe Asthma Research Program). Sputum neutrophil counts are associated with more severe asthma phenotypes using cluster analysis. J Allergy Clin Immunol 2014; 133(6): 1557-1563.

14. Trejo Bittar HE, Yousem SA, Wenzel SE. Pathobiology of severe asthma. Annual Review of Pathology 2015; 10: 511-545.

15. Vroman H, van den Blink B, M. Kool. Mode of dendritic cell activation: the decisive hand in Th2/Th17 cell differentiation. Implications in asthma severity?. Immunobiology 2015; 220: 254-261.

16. McGrath KW, Icitovic N, Boushey HA, Lazarus SC, Sutherland ER, Chinchilli VM, Fahy JV (Asthma Clinical Research Network of the National Heart, Lung, and Blood Institute). A large subgroup of mild-to-moderate asthma is persistently non eosinophilic. Am J Respir Crit Care Med 2012; 185(6): 612-619.

17. Al-Ramli W, Préfontaine D, Chouiali F, et al. TH17-associated cytokines (IL-17A and IL-17F) in severe asthma. JACI 2009; 123 (5): 1185-1187.

18. Kupczyk M, Dahlén B, Sterk PJ, Nizankowska-Mogilnicka E, Papi A, Bel EH, Chanez P, Howarth PH, Holgate ST, Brusselle G, Siafakas NM, Gjomarkaj M, Dahlén SE (BIOAIR investigators). Stability of phenotypes defined by physiological variables and biomarkers in adults with asthma. Allergy 2014; 69(9): 1198-1204.

19. Moore WC, Hastie AT, Li X, Li H, Busse WW, Jarjour NN, Wenzel SE, Peters SP, Meyers DA, Bleecker ER (National Heart, Lung, and Blood Institute’s Severe Asthma Research Program). Sputum neutrophil counts are associated with more severe asthma phenotypes using cluster analysis. J Allergy Clin Immunol 2014; 133(6): 1557-1563.

20. Jia G, Erickson RW, Choy DF, Mosesova S, Wu LC, Solberg OD, Shikotra A, Carter R, Audusseau S, Hamid Q, Bradding P, Fahy JV, Woodruff PG, Harris JM, Arron JR (Bronchoscopic Exploratory Research Study of Biomarkers in Corticosteroid-refractory Asthma, BOBCAT, Study Group). Periostin is a systemic biomarker of eosinophilic airway inflammation in asthmatic patients. J Allergy Clin Immunol 2012; 130(3): 647-654.

21. Wagener AH, de Nijs SB, Lutter R, Sousa AR, Weersink EJ, Bel EH, Sterk PJ. External validation of blood eosinophils, FE(NO) and serum periostin as surrogates for sputum eosinophils in asthma. Thorax 2015; 70(2): 115-120.

22. Wenzel SE. Asthma phenotypes: the evolution from clinical to molecular approaches. Nat Med 2012; 18: 716-725.

23. Barnes PJ. Current issues for establishing inhaled corticosteroids as the antiinflammatory agents of choice in asthma. J Allergy Clin Immunol 1998; 101: 427-433.

24. The Childhood Asthma Management Program Research Group. Long-term effects of budesonide or nedocromil in children with asthma. N Engl J Med 2000; 343(15): 1054-1063.

25. Ward C, Pais M, Bish R, Reid D, Feltis B, Johns D, Walters EH. Airway inflammation, basement membrane thickening and bronchial hyperresponsiveness in asthma. Thorax 2002; 57(4): 309-316.

26. Suissa S, Ernst P. Inhaled corticosteroids: impact on asthma morbidity and mortality. J Allergy Clin Immunol 2001; 107(6): 937-944.

27. Hafezi-Moghadam A, Simoncini T, Yang Z, et al. Acute cardiovascular protective effects of corticosteroids are mediated by non-transcriptional activation of endotelial nitric oxide synthase. Nat Med 2002; 8: 473-479.

28. Meijer RJ, Kerstjens HA, Arends LR, Kauffman HF, Koëter GH, Postma DS. Effects of inhaled fluticasone and oral prednisolone on clinical and inflammatory parameters in patients with asthma. Thorax 1999; 54(10): 894-899.

29. Barnes PJ. Current issues for establishing inhaled corticosteroids as the antiinflammatory agents of choice in asthma. J Allergy Clin Immunol 1998; 101: 427-433.

30. Bateman ED, Boushey HA, Bousquet J, Busse WW, Clark TJ, Pauwels RA, Pedersen SE (GOAL Investigators Group). Can guideline-defined asthma control be achieved? The Gaining Optimal Asthma Control study. Am J Respir Crit Care Med 2004; 170(8): 836-844.

31. Gershman NH, Wong HH, Liu JT, Fahy JV. Low- and high-dose fluticasone propionate in asthma; effects during and after treatment. Eur Respir J 2000; 15(1): 11-18.

32. Woodruff PG, Modrek B, Choy DF, Jia G, Abbas AR, Ellwanger A, Koth LL, Arron JR, Fahy JV. T-helper type 2-driven inflammation defines major subphenotypes of asthma.

Am J Respir Crit Care Med 2009; 180(5): 388-395.

33. Chaudhuri R, Livingston E, McMahon AD, Thomson L, Borland W, Thomson NC. Cigarette smoking impairs the therapeutic response to oral corticosteroids in chronic asthma. Am J Respir Crit Care Med 2003; 168(11): 1308-1311.

34. Shaw DE, Berry MA, Hargadon B, McKenna S, Shelley MJ, Green RH, Brightling CE, Wardlaw AJ, Pavord ID. Association between neutrophilic airway inflammation and airflow limitation in adults with asthma. Chest 2007; 132(6): 1871-1875.

35. Jang AS, Lee JH, Park SW, Park JS, Kim DJ, Park CS. Risk factors related to fixed airway obstruction in patients with asthma after antiasthma treatment. Ann Allergy Asthma Immunol 2007; 99(5): 408-412.

36. Nair P, Pizzichini MM, Kjarsgaard M, Inman MD, Efthimiadis A, Pizzichini E, Hargreave FE, O’Byrne PM. Mepolizumab for prednisone-dependent asthma with sputum eosinophilia. N Engl J Med 2009; 360(10): 985-993.

37. Ayres JG, Bateman ED, Lundback B, Harris TAJ. High dose fluticasone propionate, 1 mg daily, versus fluticasone propionate, 2 mg daily, or budesonide, 1.6 mg daily, in patients with chronic severe asthma. Eur Respir J 1995; 8 (4): 579-586.

38. Hodgson D, Anderson J, Reynolds C, Meakin G, Bailey H, Pavord, I, Shaw D, Harrison T. A randomized controlled trial of small particle inhaled steroids in refractory eosinophilic asthma (SPIRA). Thorax 2015; 70: 559-565.

39. Larose MC, Chakir J, Archambault AS, Joubert P, Provost V, Laviolette M, Flamand N. Correlation between CCL26 production by human bronchial epithelial cells and airway eosinophils: Involvement in patients with severe eosinophilic asthma. J Allergy Clin Immunol 2015; 136(4): 904-913.

40. Ten Brinke A, Zwinderman AH, Sterk PJ, Rabe KF, Bel EH. “Refractory” Eosinophilic Airway Inflammation in Severe Asthma. Effect of Parenteral Corticosteroids. Am J Respir Crit Care Med 2004; 170: 601-605.

41. Dente FL, Bacci E, Bartoli ML, Cianchetti S, Costa F, Di Franco A, Malagrinò L, Vagaggini B, Paggiaro P. Effects of oral prednisone on sputum eosinophils and cytokines in patients with severe refractory asthma. Ann Allergy Asthma Immunol 2010; 104: 464-470.

42. Zazzali JL, Broder MS, Omachi TA, Chang E, Sun GH, Raimundo K. Risk of corticosteroid-related adverse events in asthma patients with high oral corticosteroid use.

Allergy Asthma Proc 2015 (4): 268-274.