Manual SEPAR 31. Inflamometría en asma y cómo medir la inflamación bronquial

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Inflamometr铆a en asma y c贸mo medir la inflamaci贸n bronquial

Coordinadores: Carlos Almonacid Vicente Maci谩n

Manual

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Separ de Procedimientos

Inflamometr铆a en asma y c贸mo medir la inflamaci贸n bronquial

Manual SEPAR de Procedimientos Coordinación:

Carlos Almonacid Vicente Macián Participantes:

Andrés Briones Raquel Martínez Tomás Enrique Cases María del Camino Muñiz Luis A. Pérez de Llano Montserrat Torrejón José Belda Yolanda Torralba

Raúl Galera Eduardo López-Collazo Francisco García-Río Jordi Giner Alfons Torrego Oriol Sibila Vicente Plaza

ISBN Obra completa: 84-7989-152-1 ISBN Módulo 31: 978-84-933323-8-8 Dep. Legal: B 11860-2015 Copyright 2015. SEPAR Editado y coordinado por RESPIRA-FUNDACIÓN ESPAÑOLA DEL PULMÓN-SEPAR Reservados todos los derechos. Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida ni transmitida en ninguna forma o medio alguno, electrónico o mecánico, incluyendo las fotocopias, grabaciones o cualquier sistema de recuperación de almacenaje de información, sin el permiso escrito del titular del copyright.

Índice Introducción Carlos Almonacid Vicente Macián

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Técnicas invasivas en inflamometría Andrés Briones Raquel Martínez Tomás Enrique Cases

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Óxido nítrico en aire espirado María del Camino Luis A. Pérez de Llano

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Esputo inducido, inducción obtención y procesado Montserrat Torrejón José Belda

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Condensado exhalado Yolanda Torralba Raúl Galera Eduardo López-Collazo Francisco García-Río

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Temperatura del aire exhalado Jordi Giner Alfons Torrego Vicente Plaza

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Nariz electrónica Jordi Giner Oriol Sibila Vicente Plaza

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Preguntas de evaluación

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Abreviaturas ATS: American Thoracic Society DMMA: Diámetro de la mediana de la masa aerodinámica EPOC: Enfermedad pulmonar obstructiva crónica ERS: European Respiratory Society FENO: Fracción de óxido nítrico en el aire exhalado FEV1: Volumen espirado en el primer segundo de una espirometría forzada MDI: Metered-dose inhaler NO: Óxido nítrico SEPAR: Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica

INTRODUCCIÓN

Dr. Carlos Almonacid Sánchez Servicio de Neumología Hospital General Universitario de Guadalajara DUE Vicente Macián Gisbert Servicio de Neumología Hospital Arnau de Vilanova. Valencia

La inflamación juega un papel protagonista en la mayoría de las patologías respiratorias, especialmente en las más prevalentes y de mayor impacto sanitario, como son la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el asma.

Clásicamente, se han utilizado las técnicas funcionales respiratorias (espirometría, prueba broncodilatadora, prueba de provocación bronquial, pletismografía y medición de la capacidad de difusión de monóxido de carbono) para el diagnóstico, seguimiento, valoración de la respuesta al tratamiento y estimación de pronóstico de estas patologías. Si bien estas técnicas sirven para proporcionar datos relevantes desde el punto de vista fisiopatológico, no aportan mediciones directas del tipo, ni de la intensidad de la inflamación de las vías aéreas. Hasta no hace mucho tiempo, la única manera que teníamos para medir la inflamación era mediante técnicas invasivas como el análisis citológico del lavado broncoalveolar e histológico de la biopsia bronquial/transbronquial obtenido mediante técnicas endoscópicas. El problema de estas técnicas era que, al ser invasivas, podrían alterar el resultado del análisis.

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Sin embargo, en las últimas dos décadas han ido apareciendo y perfeccionándose nuevas herramientas diagnósticas que sí nos van a permitir medir la inflamación de forma directa y no invasiva, como pasaba con las técnicas endoscópicas. El estudio de los marcadores inflamatorios mediante técnicas no invasivas tiene un gran interés, puesto que se trata de pruebas en la que los resultados no pueden ser alterados por el uso de fármacos (anestésicos locales) o agentes mecánicos (pinzas de biopsia). Dentro de estas técnicas diagnósticas destacamos el análisis del esputo inducido, la determinación de la concentración de óxido nítrico en el aire espirado y el análisis de biomarcadores en el condensado de aire exhalado.

Nuestra Sociedad ya publicó en el año 2007 un manual que revisaba la sistemática de estos métodos. En este nuevo manual pretendemos hacer una puesta al día de estos procedimientos y revisamos otras potenciales opciones de futuro, como la nariz electrónica y la medición de la temperatura del condensado del aire exhalado, cuya utilidad aún está por determinar.

Esperamos y deseamos que este nuevo manual sea de utilidad y ayude a la difusión y un mejor conocimiento de estos procedimientos.

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TÉCNICAS INVASIVAS EN INFLAMOMETRIA

Dr. Andrés Briones Gómez Dra. Raquel Martínez Tomás Dr. Enrique Cases Viedma Servicio de Neumología Hospital Universitari i Politècnic La Fe. Valencia

INTRODUCCIÓN Y PROPÓSITOS En este capítulo se realiza una revisión sobre el uso de la broncoscopia y la ecobroncoscopia (EBUS) en el estudio de las enfermedades inflamatorias de la vía aérea como el asma y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).

La broncoscopia flexible no está indicada de forma asistencial rutinaria en la valoración clínica de un paciente con asma o EPOC. Su indicación es aplicable en el estudio de síntomas o complicaciones (atelectasia, infección, comorbilidad), siempre tomando las precauciones necesarias en cada caso. Por otro lado, la obtención de muestras de las vías respiratorias de estos pacientes para el estudio de los mecanismos inflamatorios que los regulan, constituye un campo fundamental de la investigación neumológica siendo la broncoscopia una alternativa válida para conseguir muestras de forma directa y poco invasiva1.

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PERSONAL, DOTACIÓN, CUALIFICACIÓN, FORMACIÓN CONTINUADA La broncoscopia debe llevarse a cabo en un hospital, aunque se realice con carácter ambulatorio. La exploración se debe hacer habitualmente en la Unidad de Endoscopia Respiratoria, aunque, en otras ocasiones, se puede realizar en quirófano, Unidad de Vigilancia Intensiva (UVI), servicios de urgencias o sala de hospitalización convencional.

La localización de la Unidad de Endoscopia Respiratoria depende de la organización del hospital, pero es conveniente su proximidad a las áreas de hospitalización de Neumología y cuidados respiratorios intermedios, así como de los quirófanos y unidad de vigilancia intensiva (UVI).

El manual de procedimientos SEPAR de 20082 sobre requisitos mínimos para una Unidad de Endoscopia Respiratoria recogió los requerimientos de espacio físico para una unidad que realice unos 1.000 procedimientos anuales y cuente con docencia MIR. Actualmente, y debido al incremento de la complejidad de las broncoscopias, más que en cantidad hay que pensar en la calidad de los procedimientos por lo que toda Unidad que realice más de 500 estudios endoscópicos al año debe contar con: •

Sala de trabajo, que debe tener un espacio suficiente (25 m2), con toma de oxígeno y dos tomas de vacío (aspiración por el broncoscopio y por la boca), y una de ellas con protección plomada para el uso de radioscopia.

También es recomendable disponer de sistemas de ventilación que produzcan entre 12 a 14 cambios de aire por hora y presión negativa, para evitar contaminaciones.

•

Sala de recuperación post-broncoscopia que debe disponer de toma de oxígeno y vacío.

BRONCOSCOPIA Revisaremos en primer lugar la técnica invasiva que más se ha usado en el campo de las enfermedades inflamatorias como la EPOC y el asma, con especial hincapié en las posibilidades que permite la realización de la broncoscopia (Tabla I), entre las que incluimos en este capítulo el lavado broncoalveolar, la prueba de provocación segmentaria, la prueba de provocación con alérgenos nebulizados, el cepillado y la biopsia bronquial.

Por último comentaremos las opciones que pueden ofrecer, en el campo de las enfermedades inflamatorias pulmonares, dos técnicas novedosas que posiblemente formen parte o lo hagan en el futuro, de la cartera de servicios de las unidades de neumología intervencionista.

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Lavado broncoalveolar (LBA) El uso del lavado broncoalveolar (LBA) ha proporcionado datos importantes en el campo de la inmunidad local, inflamación y mecanismos de diversas patologías respiratorias, entre ellas el asma. Consiste en la instilación de 100-400 ml de suero salino isotónico y estéril, idealmente a temperatura corporal para evitar la broncoconstricción inducida por frío, en alícuotas de 20 a 60 ml dejando el broncoscopio encajado en un segmento pulmonar.

Posteriormente, se procede a la recuperación del fluido de manera moderada e intermitente. La cantidad de fluido recuperado varía desde un 50% en pacientes con asma moderada a grave hasta el 80-90% en el asma leve. Es importante procesar el líquido en las horas siguientes o bien mantenerlo en frío (4ºC).

El LBA permite estudiar la pequeña vía aérea, que es inaccesible visualmente al broncoscopista, y apenas existen técnicas alternativas al LBA que permitan valorar esta región anatómica.

En el LBA de pacientes asmáticos podemos observar un aumento de celularidad, a expensas principalmente de eosinófilos, incluso cuando la enfermedad es leve y estable. En los casos de asma grave puede hallarse un predominio de neutrófilos.

Asimismo, se ha evidenciado un incremento de mediadores de la cascada inflamatoria (leucotrienos, prostaglandinas, citosinas, histamina, triptasa y moléculas de adhesión solubles)3.

También se ha utilizado el LBA para evaluar el efecto del tratamiento farmacológico en la vía aérea.

Prueba de provocación segmentaria La prueba de provocación segmentaria (PPS) consiste en una exposición a alérgenos en pacientes alérgicos, con y sin asma, y se utiliza a menudo para definir los mecanismos subyacentes al desarrollo de la inflamación en la vía aérea.

Los alérgenos pueden administrarse en forma de aerosol, con una distribución dispersa por ambos pulmones, o bien en disolución mediante instilación directa a través del broncoscopio sobre una localización determinada de la vía aérea.

La metodología para la realización de la PPS con broncoscopio no está estandarizada. Habitualmente se debe titular la dosis de antígeno que se va a administrar mediante una prueba de provocación específica, calculando el PC20 (dosis que provoca una caída en el FEV1 de más del 20%). Se debe de fijar el broncoscopio

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en la zona donde se vaya a instilar la dosis calculada de antígeno, evitando así que entre en otros segmentos. Habitualmente se administra en alícuotas de 5 a 20 ml. A continuación se realiza un primer LBA para el reclutamiento de las células inflamatorias en la vía aérea a los pocos minutos, y otro que generalmente es a las 3-24 horas o a los 2-16 días4.

El perfil celular varía: los mastocitos son las células que aparecen en la respuesta inmediata, los neutrófilos a las pocas horas y los eosinófilos en la respuesta tardía5.

Prueba de provocación con alérgenos nebulizados El estudio de alergia respiratoria mediante la prueba de provocación con alérgenos nebulizados tiene varios problemas: por motivos de seguridad la cantidad de alérgeno nebulizado administrado era baja y no toda la cantidad inhalada llegaba a la vía aérea distal, y el lugar donde se depositaba era desconocido, por lo que se realizaba a ciegas y de manera no controlada.

Al realizar la PPS mediante broncoscopia se puede utilizar una mayor dosis de alérgeno para inducir una mayor inflamación local con menos efectos secundarios en cuanto a broncoconstricción general. Esta técnica permite utilizar diferentes dosis del mismo alérgeno en diferentes puntos de la vía aérea, incluida la pequeña vía aérea, o la adición de agentes farmacológicos con el objetivo de bloquear in situ la respuesta inflamatoria.

Además, se pueden testar múltiples segmentos con diferentes dosis de antígeno (para estudios dosis-respuesta) o con la misma dosis en múltiples segmentos (para estudios intervencionistas).

La principal limitación de este procedimiento es la variabilidad inter e intrasegmento en la respuesta inflamatoria, a lo que se añade el hecho de que el modelo no necesariamente imita lo que ocurre en las exacerbaciones asmáticas inducidas por alérgenos.

Aunque se sabe que puede producir cambios medibles en la función pulmonar, esta técnica ha demostrado ser una herramienta segura para la investigación. En general, no es preciso aplicar medidas adicionales diferentes a las que se harían en cualquier paciente asmático al que se le va a realizar una broncoscopia6.

Biopsia bronquial En los pacientes asmáticos, a diferencia de otros métodos menos invasivos, se obtiene una muestra de tejido conservado que proporciona información histopa-

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tológica para el estudio detallado de las diferentes estructuras de la pared bronquial, así como para cuantificar las células inflamatorias mediante técnicas de inmunohistoquimia y para el estudio de citocinas mediante una combinación de inmunohistoquimia e hibridación in situ7.

Si se va a efectuar un LBA en el mismo procedimiento es recomendable realizar éste previo a las biopsias. Se suele aconsejar un máximo de seis biopsias bronquiales, con una profundidad subepitelial de al menos 0,3 a 0,5 mm.

Se pueden utilizar diferentes tipos de pinzas, aunque las más usadas son las tipo fórceps cocodrilo. Las muestras se obtienen normalmente en las bifurcaciones de bronquio segmentarios y subsegmentarios, en secuencia distal a proximal para evitar la contaminación con un posible sangrado.

Las muestras deben procesarse inmediatamente para su adecuada conservación.

Puede ser mediante congelación, en parafina o resinas. En las dos últimas las secciones obtenidas pueden ser más finas y, por tanto, la resolución es mayor, aunque las muestras congeladas son las más adecuadas para realizar hibridación in situ, así como el análisis mediante proteína C reactiva de la expresión del ARN mensajero de citocinas o moléculas de adhesión.

En los pacientes EPOC existen métodos que resultan útiles y son menos invasivos para el estudio de la inflamación de la vía aérea. En especial, el esputo inducido permite el estudio de citocinas y mediadores inflamatorios, aunque la información que proporciona es diferente y complementaria a la obtenida mediante biopsias bronquiales8.

Se debe de individualizar la indicación de la broncoscopia en pacientes con EPOC grave. Y en aquellos en los que el riesgo de la biopsia bronquial sea muy elevado puede practicarse un cepillado bronquial, útil para el estudio de muestras epiteliales bronquiales9.

Cepillado bronquial Resulta útil para el estudio de células in vitro. La mayoría de las células obtenidas son células epiteliales bronquiales. Liberan mediadores inflamatorios y participan en la respuesta inmunitaria de la vía aérea como células presentadores de antígeno, en comparación con sujetos sanos.

Para su realización se intenta evitar el uso de lidocaína tópica una vez se pasan las cuerdas vocales, ya que dicho anestésico puede alterar la viabilidad de las células recuperadas.

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Se puede realizar tras el LBA, sirviendo también el lavado para eliminar los restos de lidocaína que se puedan haber depositado en la vía aérea. La seguridad de esta técnica en pacientes asmáticos es buena; generalmente se describe tos y sangrado leve.

EBUS EN ENFERMEDADES INFLAMATORIAS PULMONARES Desde la introducción del EBUS (endobronchial ultrasound) o ecobroncoscopio, su uso se ha extendido de forma exponencial por las unidades de Neumología Intervencionista de los diferentes hospitales.

Su indicación actual es la evaluación para diagnóstico y estadificación en casos de neoplasias con infiltración ganglionar mediastínica sobre todo en los pacientes con cáncer de pulmón no microcítico.

Aunque esta es la indicación primordial, recientes estudios sugieren que el EBUS juega un papel cada vez mayor en la evaluación de lesiones periféricas más allá de le visión directa del broncoscopio y en enfermedades parenquimatosas pulmonares no malignas.

En el caso del asma el EBUS permite, con la colocación de una sonda ultrasónica radial de 20 MHz a nivel intrabronquial, la evaluación de la estructura de la pared de la via aérea. La sonda ecográfica, introducida a través del canal del broncoscopio, gira 360º y permite una capacidad de penetración de hasta 2 cm.

La medición del engrosamiento de la pared de la vía aérea se ha asociado con la presencia de asma, de tal forma que aquellos pacientes con asma presentan mayor engrosamiento de la pared bronquial que los pacientes sin asma10.

De hecho la evaluación de la estructura mural bronquial usando el EBUS permite además valorar la relación entre el remodelado de la vía aérea y la hiperrespuesta bronquial (ésta última medida por el valor de PC20 en el test de metacolina).

En el caso de pacientes EPOC, la experiencia de uso de EBUS también es menor, al igual de lo que sucede en la broncoscopia. Se ha usado para evaluar los patrones de remodelado de la vía aérea y el efecto del tratamiento del EPOC en las características de la inflamación de la vía aérea11.

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ALVEOLOSCOPIA En 2009 se publicaron los primeros datos de esta prometedora nueva técnica de imagen biomédica en tracto respiratorio inferior.

La colocación de una finísima sonda semiflexible a través del canal del broncoscopio permite llegar hasta los conductos alveolares, evaluando in vivo las vías respiratorias y en particular el ácino pulmonar. Usando la denominada microscopia láser confocal podemos obtener imágenes en tiempo real y en tres dimensiones de los conductos alveolares siendo capaces de medir el diámetro de éstos y el engrosamiento de la capa elástica media o de la vasculatura alveolar.

Gracias a ello es esperable en el futuro una estandarización de la técnica para evaluar las diferencias regionales que se puede dar en enfermedades pulmonares difusas, entre las cuales sin duda entrarán el asma y la EPOC. Además de su uso en investigación, su aplicación en el diagnóstico de enfermedades pulmonares sobre todo en estadios precoces (al igual que acontece en enfermedades del tracto digestivo) podrá ser una realidad en los próximos años12 (Fig. 1, 2 y 3).

Utilidad de la broncoscopia para el estudio de enfermedades inflamatorias como el asma y la EPOC

Descripción del perfil inflamatorio y citocinas en la EPOC. Identificación de las células y mediadores inflamatorios asociados al asma.

Caracterización de la respuesta inflamatoria mediada por Th1 y Th2 en el asma.

Efectos del tratamiento del asma en las características de la inflamación de la vía aérea.

Evidencia de afectación inflamatoria en el parénquima en el asma.

Novedades en los patrones de remodelación de la vía aérea.

Características inflamatorias diferenciales en los distintos fenotipos de asma y EPOC. Características de la inflamación de la vía aérea en el asma infantil.

Características de la respuesta celular, citocinas y quimiocinas en la prueba de provocación con alérgenos.

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Fig. 1. Imagen de bronquio en paciente con asma: es un patrón lamelar viéndose las fibras paralelas, homogéneas.*

Fig. 2. EPOC: imagen de bronquio con patrón de pérdida de fibras.*

Fig. 3. EPOC: alveolos grandes con presencia de macrófagos ya que se trataba también de un fumador.*

*Imágenes de microscopía laser confocal.

Cortesía de Borja Cosío y Jaume Sauleda.

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BIBLIOGRAFíA 1. Busse WW, Wanner A, Adams K, et al. Investigative bronchoprovocation and bronchoscoscopy in airway diseases. Am J Respir Crit Care. 2005; 172:807–16.

2. Flandes-Aldeyturriaga J, Ortega A. Necesidades y organización de una unidad de endoscopia respiratoria. Manual de Procedimientos SEPAR 2008.

3. Bradley BL, Azzawi M, Jacobson M, et al. Eosinophils, T-lymphocytes, mast cells, neutrophils, and macrophages in bronchial biopsy specimens from atopic subjects with asthma: comparison with biopsy specimens from atopic subjects without asthma and normal control subjects and relationship to bronchial hyperresponsiveness. J Allergy Clin Inmnunol. 1991; 88:661–74.

4. Jarjour NN, Calhoun WJ, Kelly EA, et al. The inmediate and late allergic response to segmental bronchopulmonary provocation in asthma. Am J Respir Crit Care Med. 1997; 155:515–20.

5. Gratziou C, Carroll M, Montefort S, et al. Inflamatory and T-cell profiles of asthmatic airways 6 hours after local allergen provocation. Am J Respir Crit Care Med. 1996; 153:515–20.

6. Krug N, Teran LM, Redington AE, et al. Safety aspects of local endobronchial allergen challenge in asthmatic patients. Am J Respir Crit Care Med. 1996; 153:1391–7.

7. Jeffery P, Holgate S, Wenzel S. Methods for the assessment of endobronchial biopsies in clinical research: application to studies of pathogenesis and the effects of treatment. Am J Respir Crit Care Med. 2003; 168(Supl.):S41–6.

8. Rytyla PH, Laitinen A, Lindqvist A. Comparison between bronchial biopsy and induced sputum in patients with chronic bronchitis and chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med. 1999; 159:A515.

9. Takizawa H, Tanaka M, Takami K, et al. Increased expression of inflammatory mediators in small-airway epithelium from tobacco smokers. Am J Physiol Lung Cell Mon Physiol. 2000; 278: L906–13.

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10. Kita T, Fujimura M, Kurimoto N, et al. Airway Wall structure assessed by endobronchial ultrasonography and bronchial hyperresponsiveness in patients with asthma. J Bronchology Interv Pulmonol. 2010; 17:301–6.

11. Shaw TJ, Wakely SL, Peebles CR, et al. Endobronchial ultrasound to asses airway wall thickening: validation in vitro and in vivo. Eur Respir J. 2004; 23:813–17.

12. Yserbit J, Dooms C, Ninane V, et al. Perspectives using probe-based confocal laser endomicroscopy of the respiratory tract. Swiss Med Wkly. 2013; 143:w13764.

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ÓXIDO NÍTRICO EN EL AIRE ESPIRADO

DUE María del Camino Muñiz Fernández Dr. Luis A. Pérez de Llano Servicio de Neumología Complexo Hospitalario Universitario Xeral-Calde. Lugo

INTRODUCCIÓN Y PROPÓSITOS Desde que en 1991 un grupo de investigadores del Instituto Karolinska1 demostrara que la presencia de óxido nítrico (NO) podía ser cuantificada en el aire exhalado de humanos y que la concentración de este gas estaba significativamente más elevada en los sujetos asmáticos, se pusieron en marcha múltiples trabajos diseñados para concretar el papel de la molécula en el asma, tanto en lo referente al papel que puede desempeñar en la patogenia de la enfermedad como a lo relativo a su potencial utilidad como marcador pronóstico o diagnóstico. Ello ha dado lugar a que en los últimos 20 años aparezcan más de 1.500 referencias en PubMed centradas en el papel del NO. En este capítulo, eminentemente práctico, se enumerarán las indicaciones de la medición de la fracción de óxido nítrico en el aire exhalado (FENO), se describirá la metodología que se debe seguir para una adecuada realización de la prueba y se expondrán las dificultades y limitaciones que presenta.

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FUNDAMENTOS TEÓRICOS La utilidad de la medición de la FENO en la práctica clínica descansa en su capacidad para reflejar la inflamación bronquial subyacente y, de forma más concreta, la inflamación eosinofílica. Esta relación es el punto clave, ya que sabemos que la presencia de un elevado número de eosinófilos en muestras respiratorias (esputo inducido, biopsia bronquial, etc.) orienta hacia un patrón inflamatorio del tipo Th2 (característico del asma) y, además, predice una respuesta al tratamiento con esteroides (inhalados o sistémicos) en pacientes con enfermedad de la vía aérea.

El uso de la FENO se ha generalizado después de que algunos estudios (no todos, alguno resultó discordante) hubieran mostrado una significativa correlación entre sus niveles y el recuento de eosinófilos en diferentes muestras biológicas2. Dado que la FENO puede reflejar la eosinofilia subyacente, es lógico que sirva para predecir la respuesta a los esteroides, exhibiendo una relación de dosis-respuesta, y de forma más consistente que la espirometría, el test broncodilatador, la medición del PEF o el test de metacolina3,4.

INDICACIONES La ATS recomienda la medición de la FENO para el diagnóstico de inflamación bronquial eosinofílica y para estimar la probabilidad de respuesta al tratamiento con corticoides en pacientes con síntomas sospechosos de ser debidos a patología de la vía aérea. En adultos, se sitúa el punto de corte en 50 ppb5. Esto quiere decir que, en un contexto clínico de alta probabilidad de asma, la medición de la FENO podría ser de utilidad diagnóstica, y así lo reconoce la última versión de la Guía Española Para el Manejo del Asma (GEMA), pendiente de una inminente actualización6. Además, también se ha mostrado útil para identificar qué pacientes con asma de control difícil se pueden beneficiar de una escalada terapéutica7.

Los niveles de FENO no son útiles para diferenciar grados de severidad del asma.

Tampoco se correlacionan con el grado de obstrucción bronquial estimado con la espirometría ni con los valores obtenidos en cuestionarios de síntomas. Ajustar la dosis de corticoides inhalados en base a los niveles de FENO –en comparación con los síntomas del asma– sólo logró beneficios modestos en el mejor de los casos y supuso un aumento de la dosis de medicación en niños8; en consecuencia, las guías desaconsejan esta estrategia.

Dado que los niveles de la FENO aumentan rápidamente una vez que se interrumpe el tratamiento antiiflamatorio (corticoides inhalados fundamentalmente), este biomarcador podría ser potencialmente útil para medir la adherencia al tratamiento. Sin embargo, los estudios que han demostrado esta utilidad utilizan

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una metodología muy laboriosa y de difícil incorporación a la práctica clínica habitual, ya que los cambios en la medicación deben seguir una muy estricta supervisión y las mediciones de la FENO deben hacerse de forma muy frecuente9.

REQUERIMIENTOS Espacio físico Es recomendable realizar la medición de la FENO en una habitación aislada acústicamente (para que el paciente se concentre en la maniobra de medición), con unas condiciones de temperatura y humedad constantes y libre de sustancias que puedan interferir en la determinación (gases anestésicos volátiles y desinfectantes que contengan alcohol).

Personal Enfermera/o (DUE, Grado en Enfermería) con formación y experiencia en la realización de Pruebas de Función Pulmonar.

Equipos Sensor de quimioluminiscencia: hasta hace unos años era el más utilizado en los Laboratorios de Función pulmonar. Este equipo permite determinar la concentración de NO en fase gaseosa, al reaccionar el NO de la muestra con el ozono y producirse dióxido de nitrógeno en estado excitado. El dióxido de nitrógeno pasa a estado relajado emitiendo luz en una relación estequiométrica con la cantidad de NO presente en la muestra. Es el método más sensible, si bien se trata de un dispositivo costoso, estático y que precisa mantenimiento periódico. Estos equipamientos vienen asociados a un software que permite un análisis exhaustivo de los resultados. Se trata de equipamientos de altísima fiabilidad, pero que por lo dicho anteriormente tienen un uso restringido al laboratorio de función pulmonar de ámbito hospitalario.

Sensor electroquímico: son equipos portátiles de pequeñas dimensiones y ligeros constituidos por un sensor que analiza el NO a partir de una reacción electroquímica. Hoy en día son los más utilizados en la práctica clínica debido a su fácil manejo y bajo coste. Sin embargo hay que tener en cuenta que los valores de la FENO medidos por estos equipos son mayores que los medidos por los equipos de quimioluminiscencia. Se han publicado estudios que demuestran que existe correlación entre las mediciones de ambos aparatos10. Además, también hay diferencias considerables entre los valores de FENO que ofrecen diferentes equipos electroquímicos11.

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Las especificaciones para los equipos que recomienda la normativa ATS/ERS se recogen en la Tabla I.

Tabla I. Especificaciones de los equipos según la normativa ATS/ERS 2005

Parámetro

FENO

FENO nasal

Sensibilidad

1 ppb (ruido < 0.5 ppb)

10 ppb

Ratio señal/ruido

≥ 3:1

Igual que FENO exhalado

Exactitud

Mejor que 1 ppb

Mejor que 10 ppb

Rango

1-500 ppb

10 ppb-50 ppm

Tiempo de respuesta

< 500 ms

< 500 ms

Tiempo de respuesta del sistema

Debe ser medido y reportado por el investigador

Lo mismo que el FENO

Variación

<1% de la escala completa /24 h

Lo mismo que el FENO

Reproductibilidad

Mejor que 1 ppb

Mejor que 10 ppb

Metodología para la recogida de la muestra Existen dos métodos para la recogida de la muestra: online y offline12. El término medida offline se usa para describir aquellos métodos en los cuales el sujeto expulsa una o múltiples veces el aire en un reservorio impermeable al NO. El reservorio se sella y posteriormente se analiza la concentración del biomarcador. La otra forma, medida online, implica que la muestra de gas es espirada directamente en el analizador de NO.

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Las ventajas que presentan las medidas offline frente a las medidas online son las siguientes: •

Facilidad para recoger la muestra espirada independientemente del lugar donde se encuentre el analizador (como puede ser, lugar de trabajo, escuela, etc.). Esta ventaja prácticamente ha desaparecido debido a la aparición de los nuevos equipos portátiles.

•

Independencia de los tiempos de respuesta del analizador.

•

Uso más eficiente del analizador porque se pueden recoger muestras de varios pacientes simultáneamente y se requiere menos tiempo de análisis por paciente.

•

Por otra parte, los inconvenientes de las medidas offline son:

•

Posibles contaminaciones de gases no provenientes de las vías respiratorias bajas.

•

Error introducido por el almacenamiento de la muestra.

•

Mayor complicación para la retroalimentación y evaluación instantánea de la técnica.

PROCEDIMIENTO Recomendaciones previas •

Evitar la toma de tratamiento broncodilatador y corticoide inhalado y/o sistémico previo a la medición. En los casos en los que se utilice esta medición para modificar el tratamiento según sus resultados, el paciente realizará el tratamiento habitual y se recogerá el nombre del fármaco, la dosis y la hora.

•

Realizar la medición dos horas después de la última ingesta.

•

Evitar la ingesta de alimentos ricos en nitratos (lechuga, espinacas) así como la ingesta de bebidas estimulantes (café, té, alcohol) en las horas previas a la medición.

•

Evitar la realización de ejercicio físico en la hora previa a la medición.

•

Realizar la medición de la FENO antes de otras pruebas de función pulmonar.

•

Recoger en la historia clínica la presencia de un proceso respiratorio infeccioso agudo.

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Preparación del equipo El equipo de quimioluminiscencia requiere una calibración de NO a 0 ppb antes de cada prueba, comprobación diaria de circuitos, la calibración de la bombona de NO cada 2 semanas, un cambio de filtros mensual y del depurador cada 6 meses.

El equipo electroquímico no necesita una calibración diaria previa a la realización de las mediciones; se seguirán las recomendaciones del fabricante en cuanto a los controles de los sensores.

Técnica de la medición Técnica online (Fig. 1): es aquella en la que el aire exhalado es analizado de forma continua por el equipo de medición y es la seguida en la práctica totalidad de laboratorios de función pulmonar.

•

Acomodar al paciente en una silla con espalda recta.

•

Explicar el procedimiento al paciente.

•

No utilizar pinza nasal.

•

Pedir al paciente que realice una espiración máxima.

•

Hacer una inspiración hasta TLC; dependiendo del equipo se hará desde el aire ambiente (quimioluminiscencia) o bien desde el interior del equipo (electroquímico).

•

A continuación se procederá de forma inmediata a la espiración (contener la respiración podría afectar al resultado final).

•

Esta espiración se hará a un flujo constante (50 ml/s) durante 10 segundos y contra una presión positiva entre 5 y 20 cm de H2O, lo que elevará el velo del paladar y aislará las fosas nasales del resto de la vía aérea. Para ello, el equipo mostrará algún tipo de indicador visual o de señal lumínica sonora que permita al paciente realizar la maniobra correctamente.

•

Se realizarán un máximo de seis maniobras con un tiempo mínimo de descanso entre ellas de 30 segundos, para obtener al menos dos reproducibles (con una diferencia menor de un 10%). Se expresará el resultado como la media de esas dos maniobras.

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Fig. 1. Procedimiento online de medición de la FENO.

Cálculo y presentación del resultado Una vez conseguida una maniobra correcta, se obtiene una gráfica de los niveles de NO a lo largo del tiempo de exhalación. Esta gráfica consta de una primera fase de lavado, seguida de una fase de meseta que normalmente es reproducible y plana (Fig. 2).

En ocasiones se observa un pico de NO entre la fase de lavado y la meseta. Esto ocurre cuando el paciente inhala por la nariz, cuando el velo del paladar está abierto al inicio de la espiración o cuando el sujeto hace una pausa cuando se encuentra en TLC. Estos picos se ignoran y solo se interpreta la fase de meseta. Ésta debe tener una duración de al menos tres segundos (150 ml) y la diferencia entre el punto inicial y el final no podrá ser mayor del 10%. El valor final de la FENO se obtendrá de la media de las cifras de NO en el período de meseta. Para ello se requiere un tiempo mínimo de exhalación de seis segundos en adultos aunque los equipos solicitan una espiración de 10 segundos para conseguir una medición de garantía. El resultado se expresa en partes por billón (ppb).

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Fig. 2. Registro de medición de FENO. Gráfica superior: registro de la gráfica durante la maniobra.

Gráfica inferior: resultado final de la maniobra, en la que se aprecia la meseta.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS Y CONDICIONANTES Sería ideal tener unos valores de referencia para la FENO, del mismo modo que los utilizamos en la espirometría, pero el gran número de factores que influyen en su medición convierte este deseo en algo utópico. De hecho, un informe elaborado por la ATS sugiere que se establezcan puntos de corte en función del uso que se le quiera dar a la prueba (diagnóstico de asma o predicción del control de la enfermedad)5 y siempre teniendo en cuenta el equipo utilizado y las condiciones del paciente concreto. Un intento de establecer valores de referencia fue abordado por

26

Olin y col., que propusieron la ecuación: Ln (FENO) = -0.0026 + 0.013 x altura (en cm) + 0.010 x edad (en años).

Sin embargo, como los propios autores reconocen, esta herramienta matemática sólo es capaz de explicar un 9-11% de la variación y sugieren que se tengan en cuenta unos límites altos de normalidad que van desde 24 ppb hasta 54 ppb (dispositivo de quimioluminiscencia) dependiendo de la edad y de la altura13. Como se citó con anterioridad, la ATS coloca el punto de corte de normalidad en 50 ppb. En la práctica clínica habitual, lo más útil es monitorizar los valores de la FENO durante el seguimiento del paciente y establecer conclusiones clínicas en base a los cambios.

Hay numerosas circunstancias, además del equipo en sí, que pueden hacer variar los valores de la FENO (Tabla II).

Tabla II. Factores que pueden alterar la medición de FENO

Proceso

Influencia en el FENO

Tabaco

↓

Infección

↑

Atopia

↑

Rinitis

↑

Dieta rica en nitratos

↑

Obesidad

↓

Altura

↑

Espirometría previa

↓

Insuficiencia renal

↑

Insuficiencia cardiaca

↓

Cirrosis hepática

↑

LES

↑

Esclerodermia

↑

EPOC

↑

Fibrosis pulmonar

↑

27

FENO BRONQUIAL Y ALVEOLAR Varios autores han descrito un modelo matemático, denominado bicompartimental (vías aéreas y alvéolos) que permite diferenciar la contribución de las vías aéreas distales a la producción de NO14. El NO exhalado se produce fundamentalmente en las vías aéreas conductoras, aunque una pequeña cantidad procede directamente de los alveolos. El aire espirado es conducido desde los alveolos a través de las vías aéreas, donde es enriquecido por el NO procedente de la pared bronquial. Esto implica que, en cada punto del trayecto, hay dos determinantes de la concentración local de NO: el flujo que lleva el aire que contiene el NO procedente de las partes más distales y la difusión local de NO desde las paredes bronquiales a la luz.

Para el cálculo del componente alveolar (CANO; ppb) y para separar éste del componente bronquial (J’awNO; nL/s, airway generations 1-16) se utiliza la relación entre la producción de NO y el flujo espiratorio, por lo que este procedimiento requiere la determinación de la FENO a diversos flujos espiratorios. Sin embargo, la relativa simplicidad del modelo bicompartimental inicial se vio alterada por la comprobación de que puede existir una retrodifusión de NO en sentido contrario al flujo, lo que podría sobreestimar el valor del CANO e infraestimar el de J’awNO. Tener este fenómeno en cuenta obliga a sustraer del valor del CANO parte de lo atribuido al NO procedente de las vías aéreas (J’awNO/0.53). Desde un punto de vista práctico, el valo de la FENO medido a 50 ml/s es un aceptable equivalente del J’awNO. Como clarifica una excelente revisión de García-Río y col.15, la evidencia sobre la aplicación clínica de la medición del CANO es escasa y contradictoria.

28

BIBLIOGRAFíA 1. Gustafsson LE, Leone AM, Persson MG, Wiklund NP, Moncada S. Endogenous nitric oxide is present in the exhaled air of rabbits, guinea pigs and humans.

Biochem Biophys Res Commun. 1991(16); 181:852–7.

2. Schleich FN, Seidel L, Sele J, et al. Exhaled nitric oxide thresholds associated with a sputum eosinophil count ≥3% in a cohort of unselected patients with asthma. Thorax. 2010; 65(12):1039–44.

3. Smith AD, Cowan JO, Brassett KP, et al. Exhaled nitric oxide: a predictor of steroid response. Am J Respir Crit Care Med. 2005; 172:453–459.

4. Szefler SJ, Martin RJ, King TS, et al. Significant variability in response to inhaled corticosteroids for persistent asthma. J Allergy Clin Immunol. 2002; 109: 410–418.

5. Dweik RA, Boggs PB, Erzurum SC, et al. An official ATS clinical practice guideline: interpretation of exhaled nitric oxide levels (FENO) for clinical applications. Am J Respir Crit Care Med. 2011; 184(5):602–15.

6. Guía española para el manejo del asma (GEMA 2009). Disponible en: www. gemasma.com.

7. Pérez-de-Llano LA, Carballada F, Castro Añón O, et al. Exhaled nitric oxide predicts control in patients with difficult-to-treat asthma. Eur Respir J. 2010; 35(6):1221–7.

8. Petsky HL, Cates CJ, Li A, Kynaston JA, et al. Tailored interventions based NO exhalednitric oxide versus clinical symptoms for asthma in children and adults. Cochrane Database Syst Rev. 2009; (4):CD006340.

9. McNicholl DM, Stevenson M, McGarvey LP, et al. The utility of fractional exhaled nitric oxide suppression in the identification of nonadherence in difficult asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2012; 186(11):1102–8.

10. Fortuna AM, Feixas T, Casan P. Measurement of fraction of exhaled nitric oxide with the portable NIOX-MINO monitor in healthy adults]. Arch Bronconeumol. 2007; 43(3):176–9.

29

11. Korn S, Telke I, Kornmann O, et al. Measurement of exhaled nitric oxide: comparison of different analysers. Respirology. 2010; 15(8):1203–8.

12. ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med. 2005; 171:912-30.

13. Olin AC, Bake B, Torén K. Fraction of exhaled nitric oxide at 50 mL/s: reference values for adult lifelong never-smokers. Chest 2007; 131:1852–6.

14. Tsoukias NM, George SC. A two.compartment model of pulmonary oxide Exchange dynamics. J Appl Physiol. 85 (2):653–66.

15. García-Río F, Casitas R, Romero D. Utility of two-compartment models of exhaled nitric oxide in patients with asthma. J Asthma. 2011; 48(4):329–34.

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INDUCCIÓN Y OBTENCIÓN DEL ESPUTO INDUCIDO

DUE Montserrat Torrejón Lázaro Servicio de Neumología Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona Dr. José Belda Ramírez Servicio Neumología Hospital Universitari Arnau de Vilanova. Valencia

INTRODUCCIÓN El uso del esputo como muestra idónea para el estudio de las enfermedades respiratorias ha presentado diferentes ciclos de esplendor seguidos del consiguiente semi-abandono. Las clásicas aplicaciones del esputo en el estudio de la hemorragia broncoalveolar, las infecciones respiratorias, el recuento de cuerpos extraños relacionados con patología laboral (asbesto, etc.) y los procesos neoformativos tuvieron su auge, y progresivamente fueron decayendo. En la actualidad, el esputo, fundamentalmente inducido, está experimentando un auge similar. La experiencia previa con las muestras de esputo generó que su uso se viese rodeado de un gran escepticismo en la comunidad neumológica internacional. La consecuencia fue que el procesado de estas muestras siguió un rigurosísimo proceso de protocolización y validaciones constantes. Probablemente, este hecho junto a los avance en el conocimiento de la patogenia en Neumología y de las nuevas técnicas de la Inmunología contribuyeron a dar una mayor robustez a los resultados obtenidos de estas muestras.

31

FUNDAMENTOS TEÓRICOS Según el diccionario, esputo es el material expulsado por la tos, procedente de los pulmones y expulsado a través de la boca que es la acción de expectorar.

Hay que distinguirlo del expectorado que es el material expulsado con la expectoración que incluye, además del esputo, secreciones nasales y orofaríngeas, principalmente saliva. En el sujeto sano, las secreciones producidas en el pulmón no son expectoradas al exterior sino deglutidas. Algunas enfermedades alteran la producción y eliminación del moco bronquial, sobre todo en las fases de agudización, y entonces el paciente presenta tos productiva. El esputo obtenido sin más ayuda que la propia tos, se denomina esputo espontáneo. El esputo inducido es una muestra de secreción de origen bronquial obtenida de pacientes que no expectoran espontáneamente, y que, por lo tanto, se les induce a producirlo, habitualmente mediante la inhalación de alguna sustancia.

El esputo está compuesto básicamente de agua (95%) y células inmersas en una trama de glicoproteínas (mucinas) y muchas sustancias, incluyendo productos celulares y extracelulares. Todo ello forma un microambiente muy particular que, se supone, refleja lo que sucede a nivel bronquial1. Las células caliciformes producen un tipo de esputo espeso, rico en mucina, el cual queda diluido por una mezcla más serosa de glicoproteínas, sialoproteínas y sulfoproteínas secretadas por las glándulas submucosas. Con el adecuado estímulo inmunológico o inflamatorio, los mastocitos, eosinófilos y células plasmáticas pueden modular las secreciones.

Un volumen indeterminado del esputo se origina en forma de trasudado a partir del suero en los capilares de la mucosa respiratoria, y en condiciones normales parece ser bastante escaso. Sin embargo, en casos de inflamación grave como en una agudización de asma, el líquido de la tráquea puede estar constituido virtualmente en su totalidad por trasudado del suero.

Las propiedades físicas del esputo revelan que las secreciones son viscosas y elásticas, es decir, que poseen parte de las propiedades de los líquidos y de los sólidos. Su consistencia depende principalmente de la estructura molecular de las glicoproteínas (mucinas) y del grado de hidratación. En las vías respiratorias normales existe una doble capa (sol y gel) mucosa con un espesor bastante constante de 7 μm. La capa sol, interna, de 5 μm está situada debajo de un gel de 2 μm de mayor viscoelasticidad y resistencia al desgarramiento. Esta capa de gel es impermeable al agua y contiene inmunoglobulinas que protegen los cilios y el epitelio de lesiones tóxicas2.

A pesar de que se inhalan elevadas cantidades de microorganismos viables, las vías respiratorias bajas se mantienen virtualmente estériles, gracias a dos mecanismos: el mucociliar y el macrófago alveolar. El esputo presenta además una

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actividad antimicrobiana por acción del pH, las lisozimas y las inmunoglobulinas secretoras. Finalmente, los antibióticos administrados por vía sistémica se difunden en las secreciones traqueobronquiales de una forma bastante efectiva, y son importantes al interpretar los resultados de un cultivo de esputo3.

Una vía aérea inflamada altera la composición del esputo de un sujeto sano. La primera utilización moderna del esputo con intención de cuantificar la inflamación en pacientes asmáticos data de 1989 con esputo espontáneo4 y de 1992 con esputo inducido5, aunque la presencia de células inflamatorias en el esputo de estos pacientes fue descrito un siglo antes (Gollast, 1889). Desde entonces su uso se ha ido extendiendo, fundamentalmente en el asma pero también en otras patologías respiratorias como la tos crónica o la EPOC. El estudio del recuento celular en las secreciones bronquiales, a través del esputo inducido, puede ser de gran utilidad en el tratamiento de estos pacientes. El esputo inducido ha demostrado validez y reproducibilidad de los recuentos celulares y algunas sustancias solubles en grado suficiente como para ser usado en la clínica6,7 y, actualmente se conocen sus valores de referencia en sujetos sanos8,9.

INDICACIONES PARA LA TÉCNICA DE INDUCCIÓN DEL ESPUTO •

Asma bronquial de difícil manejo para orientar con precisión el tratamiento y evitar exacerbaciones.

•

Asma estable: define la necesidad de continuar o discontinuar la medicación.

•

Asma ocupacional: herramienta segura y de alta precisión diagnóstica y de seguimiento (utilidad médico-legal).

•

Tos crónica: permite diagnóstico de causa.

•

Diagnóstico de bronco-aspiración.

•

Enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC): define orientación terapéutica.

•

Fumadores asintomáticos: diagnóstico precoz de la EPOC.

•

Alveolitis alérgica extrínseca.

•

Enfermedades inflamatorias del pulmón.

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REQUERIMIENTOS La técnica de inducción del esputo consiste en inhalar un aerosol salino a diferentes concentraciones para así facilitar la obtención del moco para su posterior análisis10. El procedimiento para la inducción del esputo se basa en el método de Hargreave y col.11 que posteriormente fue modificado por Pin y col.5. Finalmente, la ERS editó un documento de consenso12, en el que se basan las recomendaciones de este capítulo.

Personal y cualificación Para la obtención de una muestra de esputo inducido es necesario un alto grado de cooperación por parte del paciente, por ello es recomendable que el personal que lo realice sea un profesional sanitario, especialmente formado y cualificado para tal fin (conocimientos específicos en cuidados respiratorios y función pulmonar). Deberá tener capacidad de comunicación para poder proporcionar la información necesaria y transmitir la confianza y tranquilidad suficiente para que el paciente logre el objetivo. Deberá informarle que se trata de un proceso activo, a veces algo lento y largo. Para ello deberá explicar de forma clara y sencilla los pasos a seguir y adiestrarle en como deberá realizar las maniobras de la tos (aspecto clave del proceso). Estos hechos han demostrado que aumentan su eficacia, con una mínima molestia, y permiten conseguir una muestra válida para su posterior procesado ya que no se trata de cantidad, sino de calidad de la muestra.

Espacio y seguridad Es recomendable realizar todo el proceso de obtención del esputo en una zona tranquila y separada de otros procedimientos, que estará bien ventilada para evitar concentraciones excesivas de solución salina ocasionadas por el uso del nebulizador. Los pacientes acostumbran a preferir realizar las maniobras de tos y expectoración en un espacio privado, a ser posible en una habitación adyacente al espacio donde se ha realizado la nebulización, y donde el personal sanitario que dirige el procedimiento pueda supervisarlas y corregirlas.

Durante el tiempo que duren las maniobras de nebulización y tos, el profesional deberá permanecer alejado como mínimo un metro del paciente.

También es necesaria la accesibilidad inmediata de personal, medico y de enfermería, entrenada para una emergencia respiratoria.

34

Recomendaciones previas para la prueba y autorización del paciente No requiere específicamente preparación previa, pero el paciente deberá estar informado sobre el procedimiento, los objetivos y pormenores de la inducción, posibles efectos secundarios y la duración de la misma.

Se le puede sugerir que en las horas previas a la prueba, si tiene tos, procure no efectuar maniobras productivas, para no perder posibles muestras potenciales.

Los aspectos que pueden influir en la obtención de la muestra de esputo se pueden ver en la Tabla I. Tras la solicitud e información de la prueba, se le pedirá al paciente que firme el consentimiento firmado (Fig. 1, 2, 3, 4 y 5).

Tabla I. Aspectos que pueden influir en la obtención de la muestra de esputo

Selección del paciente (diagnóstico, edad, tabaquismo, capacidad de producir moco…).

Estadio de la enfermedad (estable o agudizado).

Instalaciones y personal.

Tipo de nebulizador.

Concentración de la solución salina y duración.

Conservación y procesado de la muestra.

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Fig. 1. Separación de los corpúsculos más sólidos.

Fig. 3. Cámara Neubauer.

Fig. 2. Parrilla contador citología.

Fig. 4. Separación del sobrenadante.

Fig. 5. Eosinófilos teñidos.

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Equipo y dotación El nebulizador recomendado para realizar las inhalaciones del suero salino es del tipo ultrasónico que se caracteriza porque el aerosol se genera por un transductor piezoélectrico que vibra provocando ondas que al colisionar con el liquido a nebulizar lo fracciona en multitud de partículas, tienen la ventaja de que permiten nebulizar volúmenes más grandes manteniendo un tamaño de partículas similar y controlado.

Hay que tener en cuenta que la concentración y el débito del nebulizador pueden influir en la seguridad, tolerancia y éxito del procedimiento en cuanto a la viabilidad de la muestra de esputo obtenida, en este caso proporcionan un débito aproximado de 1 ml/min, suficiente para obtener una muestra de calidad13,14.

Es recomendable que el tamaño de las partículas proporcionadas por el nebulizador sea de unas 3 μ del DMMA (diámetro de la mediana de la masa aerodinámica), para así alcanzar las vías respiratorias bajas. Los del tipo Jet no acostumbran a tener el suficiente débito ni ofrecen un tamaño de partícula adecuado en la nebulización de solución salina para este procedimiento.

Equipo: •

Nebulizador ultrasónico (De Vilbiss®, Ultra-Neb® 2000, Omron®, NE U07)

•

Un espirómetro y equipo de calibración (estación meteorológica) y jeringa de 3 litros para su calibración diaria.

•

Aunque no es imprescindible, se recomienda disponer de un pulsioxímetro, para monitorizar la saturación de oxigeno si fuera necesario.

•

En la habitación donde se realice el procedimiento se dispondrá de una toma de oxigeno.

•

Equipo o carro de resucitación cardio-respiratoria.

•

Cronómetro o reloj minutero.

•

Nevera para la conservación de la solución salina y de las muestras.

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Fungibles Las concentraciones de suero salino pueden variar entre el 0,9 y 7%, recomendándose para este procedimiento al 3, 4 y 5%15.

Concentraciones que no han evidenciado alteraciones en el recuento celular de las muestras obtenidas16.

•

Solución salina isotónica al 0.9%.

•

Solución salina al 3,4 y 5%.

•

Jeringas de 10 ml.

•

Frascos para la recepción del esputo.

•

Pinza nasal para la espirometría.

•

Inhalador agonista β2-adrenérgico (salbutamol).

•

Guantes sin látex.

•

Vasos desechables y agua para el enjuague bucal.

•

Caja de pañuelos de papel.

•

Hoja de recogida de datos.

PROCEDIMIENTO Y MANIOBRAS Recomendaciones específicas La inhalación de solución salina hipertónica para la inducción del esputo puede provocar broncoconstriccion17 por lo que se recomienda realizar un tratamiento previo con un agonista β2-adrenérgico para prevenirla18. Adicionalmente, una broncoconstricción no es deseable para la inducción del esputo porque puede ocasionar una falta de producción de moco o que este no sea de la calidad suficiente o dificultar su extracción. Habitualmente es suficiente con 200-400 μg de salbutamol (2-4 inhalaciones de un pMDI), dosis que no han mostrado efecto sobre el porcentaje de células inflamatorias del esputo inducido19. Dosis superiores no han mostrado mayor eficacia para prevenir la broncoconstricción inducida por la inhalación de la solución hipertónica, y por el contrario, en caso de desencadenarse, puede ser más intenso o más difícil de revertir.

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Monitorización de la función pulmonar Por seguridad y para prevenir una posible broncoconstricción20 se monitorizará la función pulmonar durante la inducción del esputo. No hay un protocolo estandarizado para ello, pero habitualmente bastara con la realización de espirometría seriada (según las recomendaciones establecidas21 a lo largo de la inducción y de las que se registrara el FEV1).

Durante la inducción el FEV1 se medirá basalmente, a los 10-15 minutos tras la administración del agonista β2-adrenergico y después de cada una de las nebulizaciones. Bastara con una maniobra correcta si no se observan cambios superiores al 10% respecto a los valores obtenidos tras la inhalación del broncodilatador. En pacientes con hipoxia deberá monitorizarse, durante y tras la inducción, la saturación de oxígeno, ya que algunos autores han evidenciado una hiperemia tras la realización del procedimiento22.

Duración de la inhalación de la solución salina Diferentes estudios han demostrado que la duración de la nebulización puede alterar la composición celular y bioquímica de la muestra de esputo23-26, por lo que se debe estandarizar el tiempo de nebulización, que por otro lado no excederá de los 15-20 minutos. El tiempo recomendado son 7 minutos.

No obstante, debe tenerse en cuenta que ante la aparición de síntomas o un descenso del FEV1 superior al 20% respecto al valor post-broncodilatador, se interrumpirá la nebulización.

Técnica de expectoración Se explicará al paciente que se precisa que el esputo proceda de las vías aéreas bajas. Para ello se deben realizar maniobras de tos, carraspeo profundo y progresivo, hasta lograr su obtención. La tos excesivamente forzada, puede provocar efectos adversos como: prurito faríngeo, nauseas y broncoconstricción leve27 sin incrementar su eficacia.

Por ello es recomendable que la tos sea progresiva y seguida de un carraspeo posterior. Tras la nebulización se le pedirá al paciente que se limpie la nariz y enjuague la boca para evitar la contaminación de la muestra con secreciones provenientes de las vías aéreas superiores.

Se pedirá al paciente que realice estas maniobras a través de una inspiración máxima y posteriormente un golpe de tos con inclinación del tórax hacia delante,

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utilizando el diafragma, para conseguir una muestra que proceda de los bronquios distales. Se le pedirá que no degluta el esputo producido y que deposite la muestra en un bote estéril, tipo sedimento de orina, para su posterior procesado.

Se debe valorar la calidad y cantidad de la muestra obtenida, antes de dar por concluida la prueba.

El esputo se procesará inmediatamente tras su obtención o tan rápido como sea posible. Si hubiere algún retraso, se mantendrá en la nevera hasta un máximo de dos horas. En el caso de no conseguir la muestra necesaria, no se podrá repetir el proceso de inducción hasta transcurridas 48 horas20.

Higiene, desinfección y control de infecciones La limpieza y desinfección del instrumental que se utiliza para la obtención del esputo inducido es fundamental para garantizar la ausencia de microorganismos capaces de contaminar y generar posibles infecciones.

Es imprescindible seguir las instrucciones publicadas por el fabricante del nebulizador y así poder garantizar el buen estado de conservación de determinadas partes (plásticos, gomas sintéticas, cristal, aluminio...), que por su composición son más sensibles ante determinados productos del proceso de limpieza y esterilización.

A modo de ejemplo práctico, en nuestro servicio se realiza de la siguiente manera: en un espacio con una ventilación adecuada, guantes, esponja y jabón tipo “instrunet”, se limpia el material; luego, en una cubeta de inmersión, se sumerge el material en ácido paracético durante 10 minutos; a continuación, se aclara con agua destilada y, posteriormente, se seca todo el material con aire y se empaqueta.

INTERPRETACION DE RESULTADOS Y LIMITACIONES PRÁCTICAS La monitorización de ciertas variables relacionadas con el proceso inflamatorio (marcadores) es especialmente importante en enfermedades crónicas de curso paroxístico como el asma bronquial o la EPOC. La alternancia de crisis y periodos casi asintomáticos hace que el clínico intente evitar la aparición de nuevas crisis, a partir de datos obtenidos en fase estable. La dificultad viene determinada por el hecho de que en el momento de estabilidad, la expresión de la enfermedad suele ser mínima y todo parece normal. En estas enfermedades, se hace necesario disponer de datos objetivos sobre los procesos patológicos subyacentes.

La teoría dominante en la actualidad sobre la patogenia del asma o la EPOC implica a la inflamación bronquial como el mecanismo principal que produciría directa o indirectamente la aparición de las otras manifestaciones: limitación va-

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riable al flujo aéreo, hiperreactividad bronquial y síntomas. Por lo tanto, si tuviésemos la posibilidad de medir directamente dicha inflamación, al menos en teoría, su monitorización sería el mejor procedimiento para controlar la enfermedad y aplicar el tratamiento adecuado en cada momento. Los métodos no invasivos que se pueden repetir en el tiempo, como el esputo inducido (Algoritmo 1), han abierto el camino a estrategias basadas en marcadores de la inflamación para ajustar el tratamiento de los pacientes asmáticos5. El coste y la complejidad que suelen asociarse a estas técnicas condicionan que su uso no pueda ser indiscriminado.

El esputo es una muestra de secreciones de las vías respiratorias bajas apta para realizar la mayoría de determinaciones conocidas: bioquímicas, inmunológicas, citológicas o microbiológicas. Su utilidad potencial es grande. Su única limitación radica en el tiempo necesario para obtenerlo en condiciones adecuadas cuando el paciente no expectora espontáneamente y en la dificultad de su manejo y de su procesado.

Para superar estas dificultades se ha desarrollado una metodología denominada inducción del esputo. La inducción del esputo permite obtener el máximo rendimiento de estas muestras tan versátiles al mejorar la reproducibilidad de los resultados obtenidos, al tiempo que obtiene muestras válidas en más del 90% de sujetos que no expectoran. Podríamos decir que prácticamente el 10% restante queda limitado casi exclusivamente a personas con patología orofaríngea o incapaces de realizar una expectoración eficaz por la patología subyacente que tienen o por la edad (ancianos o niños menores de 7 años).

A pesar de ser una muestra con tantas posibilidades y expectativas, no se ha generalizado a todos los servicios de respiratorio. Aunque las razones pueden ser múltiples, la piedra angular puede ser el del técnico que realiza la prueba.

Su papel es tan importante que puede afectar tanto las posibilidades de obtener la muestra como la calidad de la misma. Personal no entrenado ni motivado no obtiene muestras válidas de esputo. Esta limitación ya era conocida cuando se obtenían muestras de esputo para el estudio bacteriológico utilizando el esputo espontáneo que el paciente recogía en un frasco estéril pero sin control alguno por parte del personal sanitario. El esputo obtenido de esta forma no era válido en la mayoría de los casos al no cumplirse la premisa fundamental para este tipo de estudios: la muestra debe de ser de las vías bajas y carecer o estar mínimamente contaminada por las secreciones salivares orofaríngeas. En muchos servicios de microbiología siguen rechazándose estas muestras por exceso de contaminación salivar que viene determinada por dos condiciones: la presencia de abundantes células epiteliales escamosas que pertenecen a la orofaringe definida como más de 20 células por campo de 40 aumentos y la ausencia de células inflamatorias que no hay en la orofaringe.

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Algoritmo 1. Método de la recogida de esputo inducido

Realizar espirometría: FEV1

Administrar 2 inh de salbutamol (MDI/cámara)

Esperar 10-15 min. y realizar nueva espirometría: FEV1 de referencia del paciente para control posterior del procedimiento.

Si FEV1 post BD ≥1.5l nebulizar con suero salino hipertónico al 3,4 y 5% a intervalos de 7 min. hasta conseguir la muestra de esputo.

Si FEV1 post BD ≤1.5l nebulizar con suero salino isotónico al 0.9% durante 30 seg. 1 y 5 min. progresivamente, hasta conseguir muestra.

En función del FEV1 y si no se ha conseguido muestra, se nebulizará con suero salino al 3% con intervalos de 30 seg. 1 y 2 min. o al 4 y 5% durante 30 seg.

1, 2 y 4 min. hasta conseguir la muestra.

Control del FEV1 tras cada nebulización, si hay un descenso del 20% o síntomas de intolerancia, se parará la prueba.

Tras la nebulización, indicar al paciente que se limpie la nariz y enjuague la boca.

Solicitar al paciente que a través de la tos y carraspeo profundo inclinándose hacia delante, expectore y deposite la muestra en un bote estéril.

Guardarla en nevera y procesarla antes de 2 horas.

Muestra valida: Si: Alta No: Se citará para otro día.

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Centrándose en el recuento de células inflamatorias como marcador de inflamación, la interpretación de los resultados es sencilla. La utilidad de la identificación de marcadores de inflamación en muestras de esputo inducido para el control del asma ha sido estudiada por algunos autores durante los últimos años. Algunos estudios28-30 han comparado un algoritmo para ajustar el tratamiento basado en las guías clínicas con el ajuste del tratamiento guiado por el número de eosinófilos en esputo. En el algoritmo terapéutico basado en la citología de esputo, las dosis de esteroides se adecuaron al grado de reducción de los eosinófilos en esputo y también se redujeron cuando la eosinofilia era < 3%. Se utilizaron broncodilatadores cuando los síntomas persistían a pesar de la disminución del porcentaje de eosinófilos hasta valores inferiores al indicado previamente. Los resultados fueron consistentes en los tres estudios y demostraban una reducción significativa de las exacerbaciones del asma cuando la enfermedad se manejó utilizando el recuento de eosinófilos en esputo.

En el caso de la tos crónica algunos pacientes responden al tratamiento con esteroides, pero que no presentan hiperrespuesta bronquial. Estos pacientes no sufrían asma, pero fueron tratados con éxito con medicación antiasmática (concretamente, con esteroides inhalados). El análisis citológico de las muestras de esputo inducido permitía identificar un marcado aumento de eosinófilos y la entidad se ha denominado bronquitis eosinofílica sin asma31. Estudios posteriores indicaron que algunos pacientes con asma podían presentar neutrofilias en el esputo. En una proporción considerable de casos, el predominio de neutrófilos en las muestras de esputo de estos individuos con asma podía deberse al tratamiento con esteroides inhalados. Además, parece claro que el predominio de neutrófilos o de eosinófilos en las muestras de esputo inducido de los pacientes con asma no es un hallazgo persistente y que ambos patrones inflamatorios pueden desarrollarse en un mismo paciente en diferentes momentos y situaciones clínicas. Probablemente esto indica que la clasificación del asma en fenotipos eosinofílico, neutrofílico y paucigranulocítico no es realista. No obstante, parece evidente que la identificación de un patrón citológico no eosinofílico en el esputo inducido de un paciente con asma que permanece sintomático a pesar del tratamiento con esteroides permite presuponer que el incremento de las dosis de esteroides probablemente no aportará beneficio alguno para el control del proceso.

En resumen, el esputo inducido es una muestra versátil capaz de dar información muy variada que precisa de una obtención adecuada y un procesado cuidadoso para poder utilizarla.

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BIBLIOGRAFíA 1. Fabbri LM, Durham S, Holgate ST, O’Byrne PM, Postma DS. Assessment of airway inflammation: an overview. Eur Respir J. 1998; 26:6s–8s.

2. Newhouse M, Sanchis J, Bienenstock J. Lung defense mechanisms. N Engl J Med. 1976; 295:990–8.

3. Henry JB. Esputo. In: John Bernard Henry, editor. Diagnóstico y tratamiento clínicos por el Laboratorio. Barcelona: Ediciones Científicas y Técnicas, S.A. Masson-Salvat Medicina. 1996: 521–35.

4. Gibson PG, Girgis-Gabardo A, Morris MM, Mattoli S, Kay JM, Dolovich J, et al. Cellular characteristics of sputum from patients with asthma and chronic bronchitis. Thorax. 1989; 44:693–9.

5. Pin I, Gibson PG, Kolendowicz R, Girgis-Gabardo A, Denburg JA, Hargreave FE, Dolovich J. Use of induced sputum cell counts to investigate airway inflammation in asthma. Thorax. 1992; 47:25–9.

6. Holz O, Kips J, Magnussen H. Update NO sputum methodology. Eur Respir J. 2000; 16:355–9.

7. Jayaram L, Parameswaran K, Sears MR, Hargreave FE. Induced sputum cell counts: their usefulness in clinical practice. Eur Respir J. 2000; 16:150–8.

8. Belda J, Leigh R, Parameswaran K, O’Byrne PM, Sears MR, Hargreave FE. Induced sputum cell counts in healthy adults. Am J Respir Crit Care Med. 2000; 161:475–8.

9. Spanevello A, Confalonieri M, Sulotto F, Romano F, Balzano G, Migliori GB, et al. Induced sputum cellularity. Reference values and distribution in normal volunteers. Am J Respir Crit Care Med. 2000; 162:1172–4.

10. Umeno E, McDonald DM, Nadel JA. Hypertonic saline increases vascular permeability in the rat trachea by producing neurogenic inflammation. J Clin Invest. 1990; 85:1905–8

44

11. Pizzichini E, Pizzichini MM, Efthimiadis A, Evans S, Morris MM, Dolovich J, et al. Indices of airway infl ammation in induced sputum: reproducibility of cell and fl uidphase measurements. Am J Respir Crit Care Med. 1996 Aug; 154(2 Pt 1):308–17.

12. Djukanovic R, Sterk PJ, Fahy JV, Hargreave FE. Standardised methodology of sputum induction and processing. Eur Respir J. 2002; 20 (Suppl. 37):1s-55s.

13. Hunter CJ, Ward R, Woltmann G, Wardlaw AJ, Pavord ID. The safety and success rate of sputum induction using a low output ultrasonic nebuliser. Respir Med. 1999; 93:345–8.

14. Pizzichini MM, Pizzichini E, Clelland L, et al. Sputum in severe exacerbations of asthma: kinetics of infl ammatory indices after prednisone treatment. Am J Respir Crit Care Med. 1997; 155: 1501–8.

15. Bacci E, Cianchetti S, Ruocco L, et al. Comparison between eosinophilic markers in induced sputum and blood in asthmatic patients. Clin Exp Allergy. 1998; 28:1237–43.

16. Popov TA, Pizzichini MM, Pizzichini E, et al. Some technical factors influencing the induction of sputum for cell analysis. Eur Respir J. 1995;8:559–65.

17. Smith CM, Anderson SD. Inhalational challenge using hypertonic saline in asthmatic subjects: a comparison with responses to hyperpnoea, methacholine and water. Eur Respir J. 1990 Feb; 3(2):144-51.

18. Wong HH, Fahy JV. Safety of one method of sputum induction in asthmatic subjects. Am J Respir Crit Care Med. 1997; 156:299–303.

19. Cianchetti S, Bacci E, Ruocco L, et al. Salbutamol pretreatment does not change eosinophil percentage and eosinophilic cationic protein concentration in hypertonic saline-induced sputum in asthmatic subjects, Clin Exp Allergy. 1999; 29:712–18.

20. Pizzichini E, Pizzichini MMM, Leigh R, Djukanovie R,Sterk PJ. Safety of sputum induction. Eur Respir J. 2002; 20 (Suppl 37):9s-18s 21. Garcia-Rio F, Calle M, Burgos F, Casan P, Del Campo F, Galdiz JB, Giner J, et al. Espirometria SEPAR. Arch Bronconeumol. 2013; 49:388–401.

45

22. Bhowmik A. Seemungal TA, Sapsford RJ, Devalia JL, Wedzicha JA. Comparison of spontaneous and induced sputum for investigation of airway inflammation in chronic obstructive pulmonary disease. Thorax. 1998; 53:953–6.

23. Holz O, Jorres RA, Koschyk S, Speckin P, Welker L,Magnussen H. Changes in sputum composition during sputum induction in healthy and asthmatic subjects. Clin Exp Allergy. 1998; 28:284–92.

24. Gershman NH, Liu H, Wong HH, Liu JT, Fahy JV.Fractional analysis of sequential induced sputum samples during sputum induction: evidence that different lung compartments are sampled at different time points. J Allergy Clin Immunol. 1999; 104:322–8.

25. Cianchetti S, Bacci E, Ruocco L, et al. Salbutamol pretreatment does not change eosinophil percentage and eosinophilic cationic protein concentration in hypertonic saline-induced sputum in asthmatic subjects. Clin Exp Allergy. 1999; 29:712–8.

26. Jatakanon A, Lim S, Chung KF, Barnes PJ. An inhaled steroid improves markers of airway inflammation in patients with mild asthma. Eur Respir J. 1998; 12: 1084–8.

27. Alvarez MJ, Olaguibel JM, Acero S, Lizaso MT, Garcia BE, Tabar AI. Seguridad de la tecnica de induccion del esputo en asmaticos. Rev Esp Alergol Inmunol Clin. 1996; 11:182–3.

28. Green R, Brightling CE, McKenna S, Hargadou B, Parker D, Bradding P, et al. Asthma exacerbations and sputum eosinophil counts: a randomized controlled trial. Lancet. 2002; 360:1715–21.

29. Jayaran I, Pizzichini MM, Cook RJ, Boulet LP, Lemiere C, Pizzichini E, et al. Determining asthma treatment by monitoring sputum cell counts: effect NO exacerbations. Eur Respir J. 2006; 27:483–94.

30. Chlumsky I, Striz I, Terl M, Vondracek J. Strategy aimed at reduction of sputum eosinophils decreases exacerbation rate in patients with asthma. J Int Med Res. 2006; 34:129–39.

31. Gibson PG, Dolovich J, Denburg J, Ramsdale EH, Hargreave FE. Chronic cough: eosinophilic bronchitis without asthma. Lancet. 1989; 1:1346–8.

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Condensado del aire exhalado

DUE Yolanda Torralba García Servicio de Neumología Hospital Clínic. IDIBAPS. Barcelona Dr. Raúl Galera Martínez Dr. Francisco García-Río Servicio de Neumología Hospital Universitario La Paz. IdiPAZ. Madrid Dr. Eduardo López-Collazo Grupo de Inmunidad Innata Hospital Universitario La Paz. IdiPAZ. Madrid

INTRODUCCIÓN Un abordaje integral de los pacientes con asma precisa cada vez más la valoración del componente inflamatorio, por lo que se requieren procedimientos de análisis que resulten sencillos y bien tolerados por el enfermo, para poder ser utilizados de forma rutinaria en la práctica clínica.

El aire exhalado constituye la muestra más accesible para el estudio del aparato respiratorio. Aporta información adicional a otras técnicas como el esputo inducido o el lavado broncoalveolar presentando ventajas sobre éstas como su buena capacidad de repetición, su carácter no invasivo, la ausencia de efectos secundarios y la posibilidad de obtener muestras consecutivas en cortos espacios de tiempo.

En las siguientes páginas se revisan los aspectos metodológicos más relevantes para la obtención y análisis de muestras de condensado del aire exhalado en pacientes con asma.

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FUNDAMENTOS El condensado de aire exhalado (CAE) está compuesto por una fase volátil y otra fase acuosa. La fase volátil está constituida por los gases respiratorios (O2, CO2 y N2, entre otros) y otros compuestos gaseosos como el monóxido de carbono (CO) o el óxido nítrico (NO)1. La fase acuosa está formada en su mayoría por agua (> 99%) y una pequeña cantidad de moléculas en suspensión procedentes del líquido de revestimiento del epitelio de la vía aérea. Algunas de estas moléculas no volátiles diluidas en la fase acuosa constituyen marcadores de estrés oxidativo y de inflamación crónica de las vías aéreas, por lo que tienen un potencial interés en asma2.

Mecanismo de producción y origen Estudios recientes han demostrado que la fase acuosa del CAE proviene en su mayoría de las vías aéreas centrales mientras que se ha comprobado que la mayoría de las moléculas se generan en la vía aérea inferior, como demuestra la presencia de surfactante y proteínas1,3. El mecanismo de producción del CAE no se conoce en su totalidad. Inicialmente se creía que el CAE se formaba debido a que el flujo de aire turbulento en la línea aérea durante la respiración provocaba la aerosolización del fluido de revestimiento de la vía aérea (Fig. 1). Además, se propone que el modelo de estallido de la película de fluido de los bronquiolos también podría contribuir a la generación del CAE3,4. Según este modelo, las paredes de los bronquiolos estarían recubiertas por una fina película de fluido que durante la espiración, debido a la contracción de los bronquiolos, puede llegar a bloquear la luz del bronquiolo completamente en zonas de estrechamiento. Durante el inicio de la inhalación los bronquiolos se reabren quedando las dos capas de líquido unidas por un pequeño puente o burbuja que, al expandirse completamente el bronquiolo, estalla produciendo las gotitas de aerosol que son eliminadas en la siguiente exhalación.

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Fig. 1. Representación esquemática de la formación del condensado del aire exhalado Durante la ventilación, de la superficie del epitelio de las vías aéreas se desprenden gotas del líquido de recubrimiento que son arrastradas por el flujo aéreo. Estas gotas también se desprenden durante los procesos de expansión de las vías aéreas de menor calibre que se producen durante los movimientos respiratorios. Cuando el material exhalado alcanza un condensador, muchas de estas gotas precipitan diluidas en gran cantidad de vapor de agua, constituyendo el condensado del aire exhalado.

Tamaño de partícula El tamaño medio de las partículas presentes en el aire exhalado es de aproximadamente 0,28 µm de diámetro, no encontrándose en él partículas mayores a los 5 µm3,5.

El tamaño de estas partículas varía con el tiempo de espiración, siendo más pequeñas cuando éste se alarga debido al depósito de las partículas mayores por el efecto de la gravedad.

Contribución de la orofaringe El aire exhalado en su salida hacia el exterior pasa por la orofaringe que también contribuye, al menos en parte, a su formación. Actualmente, no es posible averiguar con certeza en qué porcentaje contribuye cada parte del tracto respiratorio.

En algunos estudios realizados comparando la obtención del CAE por boca o directamente del tracto respiratorio inferior por traqueotomía se apreció que las

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concentraciones de ciertas sustancias como el peróxido de hidrógeno o el 8-isoprostano resultaban similares, por los que es posible asumir que se forman en las vías aéreas inferiores6. En cambio, otras sustancias como el amoniaco, se encuentran en mucha mayor cantidad en las muestras obtenidas por la boca, sugiriendo su origen en la orofaringe.

Además de esta contribución, las muestras pueden ser contaminadas por saliva.

Por ello, la mayoría de los dispositivos de recogida del CAE disponen de trampas de saliva. Para saber si una muestra está contaminada, se analizan los niveles de amilasa, que no debe estar presente en muestras procedentes del tracto respiratorio inferior. El fosfato también puede ser otro indicador fiable de contaminación por saliva.

Dilución Debido a que el CAE está compuesto mayoritariamente por agua, las sustancias presentes en él se encuentran muy diluidas3,5,6. Además, la concentración varía de forma significativa desde 1.000 a 50.000 veces. Por ello, es necesario hallar un factor de dilución para estandarizar su análisis. El marcador de dilución ideal sería una sustancia que tenga una concentración conocida y estable en sangre, que difunda a través de las membranas celulares y que no se produzca en la vía aérea ni en los alveolos.

Los tres marcadores de dilución más empleados son la concentración de urea, la concentración de cationes totales (suma de Na+ y K+) y la conductividad del CAE3,5,6. Sin embargo, todavía no se ha definido cuál debería ser el gold standard universalmente aceptado. Para eliminar la necesidad de un marcador de dilución, se ha sugerido el uso de ratios entre diferentes biomarcadores, como el cociente gamma-interferon (IFN-γ)/interleucina(IL)-4, el cociente nitritos/nitratos, el cociente glutation reducida/glutation oxidada o expresar el pH como un cociente ácidos/bases6.

Otro factor a tener en cuenta es la expresión de las concentraciones en función del volumen de CAE obtenido. Al ser este volumen muy variable, algunos autores proponen expresar la concentración de solutos en función del volumen de aire exhalado.

INDICACIONES, CONTRAINDICACIONES Y COMPLICACIONES En la actualidad, el CAE es utilizado únicamente en estudios de investigación debido a los problemas de estandarización de la técnica. Las aplicaciones potenciales del análisis de los biomarcadores presentes en el CAE en pacientes con asma son:

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•

Discriminación entre diferentes fenotipos inflamatorios.

•

Diagnóstico precoz del asma en niños.

•

Estimación de la gravedad de la inflamación de la vía aérea.

•

Monitorización del tratamiento.

•

Detección temprana de agudizaciones de la enfermedad.

•

Monitorización de los efectos de comorbilidades.

•

Valoración del asma ocupacional.

No se han descrito contraindicaciones para este procedimiento. Sin embargo, no es posible llevarlo a cabo en pacientes que no son capaces de respirar a volumen corriente durante un periodo estable, como por ejemplo sucede en enfermos con alteraciones del nivel de conciencia o del patrón respiratorio.

Al ser una prueba sencilla e incruenta, no presenta complicaciones relevantes. El único riesgo de su determinación sería el contagio de infecciones entre pacientes.

Para eliminar este riesgo se propone el uso de boquillas desechables y de válvulas unidireccionales entre la boca y el condensador que no permitan la inhalación desde el mismo.

EQUIPOS Otra fuente de la variabilidad del CAE es el equipo que se use para su recolección. La eficacia de los condensadores va a depender del volumen de aire que pase por el sistema por unidad de tiempo y del gradiente de temperatura entre el aire exhalado y el sistema de obtención de la muestra5.

Los primeros condensadores se construyeron de forma artesanal y estaban compuestos por una boquilla conectada a un tubo de teflón que se introducía en un recipiente con hielo o nitrógeno líquido para enfriarlo y que, a su vez, estaba conectado a un tubo de polipropileno donde se recogía el CAE6.

Actualmente, se dispone de dispositivos comerciales que permiten la recogida del CAE de una forma más sencilla y homogénea entre diversos centros. A continuación, se describen los equipos utilizados más frecuentemente:

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•

ECoScreen I (Cardinal Health, Hoechberg, Alemania, descatalogado). Es un sistema que conduce el aire exhalado a través de un condensador laminar de doble luz de aluminio revestido de teflón reutilizable, conectado a un vial de colección de muestras de polipropileno, insertado en un refrigerador eléctrico que mantiene una temperatura de -20 ± 2 °C. El patrón respiratorio durante la recogida del CAE puede medirse de forma continua con un espirómetro acoplado a una válvula unidireccional (EcoVent) (Fig. 2).

•

ECoScreen II (FILT, Berlín, Alemania). Se trata de una nueva versión que dispone de dos bolsas con superficie de polietileno, lo que permite separar el aire procedente de la boca y las vías respiratorias altas del procedente de las vías respiratorias bajas. El dispositivo incorpora también un espirómetro que mide el volumen espiratorio a lo largo del tiempo de recogida (Fig. 2).

Estos dos modelos son los utilizados más habitualmente en nuestro entorno.

Fig. 2. Dispositivos ECoScreen I y ECoScreen II para la recogida de condensado del aire exhalado.

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•

ANACON (Biostec, Valencia, España). Es un dispositivo diseñado para su conexión a equipos de ventilación mecánica. El condensador se intercala en la rama espiratoria del circuito de ventilación mediante dos adaptadores y dos codos elastoméricos. El aire exhalado es conducido hacia los tubos de condensación que atraviesan el cuerpo del condensador. Una pieza en Y cierra el circuito con el tubo colector del condensado exhalado. Además, el equipo cuenta con un termómetro que permite monitorizar la temperatura de condensación.

•

TurboDECCS (All Service srl, Parma, Italia). Condensador portátil, diseñado para la medición del CAE de forma extrahospitalaria. Se compone de una celda de colección desechable insertada en un sistema de refrigeración eléctrico de tipo Peltier con una válvula que impide la reinhalación.

•

Rtube (Respiratory research, Austin, TX, EEUU). Es el dispositivo con mayor portabilidad debido a su reducido tamaño (Fig. 3). Consiste en una sección con forma de T en la que se encuentran una válvula de no reinhalación y una trampa de saliva, una manga de enfriamiento, que debe guardarse en un congelador antes de la realización de la prueba y que se coloca alrededor de la anterior, y un tubo colector de polipropileno para recoger la muestra.

Fig. 3. Dispositivo Rtube para la recogida de condensado del aire exhalado.

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Se han hecho estudios comparativos entre diferentes condensadores, principalmente entre ECoScreen y RTube, que revelan diferencias en la composición del CAE obtenido7 mediante los distintos equipos. Estas diferencias se encuentran en relación con la temperatura de enfriamiento y el material de revestimiento del condensador. Por ello, es imprescindible especificar el condensador con el que se ha realizado la prueba.

PROCEDIMIENTO DE RECOGIDA DE LA MUESTRA Personal, cualificación Para la recogida de la muestra será preciso personal cualificado y entrenado en la realización del procedimiento3,5. Se recomienda contactar con otro centro habituado a la técnica para la correcta realización de la misma. La rentabilidad del procedimiento resulta independiente de la formación académica del operador (técnico, graduado en enfermería o graduado en medicina), siempre que tenga la formación específica para el correcto procesamiento y almacenamiento de la muestra; aunque sería deseable una demostrada habilidad en el trato con pacientes así como la capacidad de resolver problemas técnicos. La persona responsable de la recogida de muestras debe ser consciente de la fragilidad de las mismas. Con esto, quiere recalcarse que si las muestras no son recogidas de forma sistemática, podrían estar alteradas, de manera que el análisis de las mismas sería infructuoso, dando lugar a resultados anómalos o ausencia de los mismos.

Espacio físico El espacio físico deberá ser un lugar confortable, intrahospitalario o extrahospitalario. Aunque también debe considerarse que se han recogido muestras en unidades móviles, siendo procesadas de forma exitosa con resultados adecuados. Los equipos de recogida del CAE necesitan ser colocados en una superficie plana de sobremesa si no son equipos portátiles que se sustentan mediante ruedas y pueden desplazarse de un lugar a otro con relativa facilidad. Como el participante deberá estar “conectado” al equipo durante algunos minutos, será preciso disponer de un espacio tranquilo, relativamente amplio, donde además de los equipos puedan estar dos personas, preferiblemente lejos de un lugar de paso, con temperatura adecuada y confortable y donde se puedan medir las condiciones atmosféricas (temperatura, presión atmosférica y humedad relativa). Dispondremos, además, de un asiento adecuado, donde se pueda permanecer cómodamente con la espalda recta y los pies apoyados en el suelo.

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Recomendaciones previas La obtención del CAE es un procedimiento no invasivo, que puede ser realizado en múltiples contextos y no requiere premedicación alguna3,5. Para la realización de esta prueba, no es necesario estar en ayunas. Por otro lado, es importante tener en cuenta que si al paciente se le van a realizar otras pruebas de función pulmonar (espirometría, difusión, pletismografía, óxido nítrico, test de la marcha o pruebas de esfuerzo, esputo inducido, provocación bronquial con metacolina o manitol), la recogida del CAE se efectuará en primer lugar para mantener intacta la vía aérea superior, de manera que las características de la misma no se vean afectadas por la irritabilidad y la inflamación que pueden desencadenar las pruebas mencionadas. Se recomienda no realizar otras determinaciones (prick test o extracción de sangre venosa o arterial) de forma simultánea a la recogida del CAE, para no alterar el patrón respiratorio durante la obtención de la muestra. Al paciente se le recomendará no fumar dos horas antes de la prueba, no tomar medicación inhalada, no realizar ejercicio intenso y llevar ropa cómoda que no comprima el abdomen ni el cuello. En caso de la toma de medicación o tabaquismo, se registrará en el formulario de recogida de datos.

Preparación del paciente Antes de iniciar la recogida del CAE, se le indicará al paciente que se siente en una silla cómoda y con respaldo. Un aspecto muy importante es el referente a la posibilidad de contaminación del material obtenido con compuestos provenientes de las vías aéreas superiores y especialmente de la cavidad oral. Por ello instaremos al paciente a que se enjuague la boca con agua en varias ocasiones para eliminar posibles restos de comida o bebida que pueden estar en la cavidad oral antes de iniciar la recolección. Asimismo, para evitar la aparición de tos o esputo durante la recolección se recomienda solicitar a los sujetos expectorar y expulsar secreciones nasales o bronquiales antes de comenzar. En caso de llevar dentadura postiza, le instaremos a continuar con ella puesta para mantener la oclusión a la boquilla. Le explicaremos detenidamente la prueba: “Se trata de respirar por la boca de forma tranquila y durante un tiempo aproximado de 15 min. Para ello le ayudaré colocándole una pinza en la nariz para recoger todo el aire que exhala por la boca. La prueba puede ser un poco aburrida y monótona pero es indolora.

Si se cansa puede desconectar la boca unos segundos y continuar la maniobra. Si tiene la necesidad de toser, estornudar, hablar o tragar saliva, debe desconectar la boca del aparato. Es importante que respire tranquilo.”

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Preparación del material Los dispositivos de recogida precisan ser enchufados a la red y encendidos al menos 10 minutos antes de la recolección de las muestras para enfriar todo el circuito y alcanzar la temperatura óptima de condensación. Si se dispone de una centrífuga refrigerada para optimizar la recuperación del CAE que queda retenido en las paredes del sistema condensador, ésta deberá ser encendida y graduada a una temperatura de 4ºC antes del inicio de la prueba3,5. Si se monitoriza el patrón respiratorio mediante un neumotacógrafo, éste deberá ser calibrado según las instrucciones del fabricante.

El montaje y las conexiones de los recolectores y válvulas deberán realizarse de forma minuciosa para evitar que el material condensado se deposite fuera del recipiente recolector.

Se prepararán los accesorios necesarios, incluyendo boquillas (desechables o bien en condiciones óptimas de higiene), pinzas nasales, un vaso de agua para enjuagues y pañuelos desechables.

Para el almacenamiento de la muestra se deberá disponer de una pipeta graduada, puntas de pipeta desechables y tubos de polipropileno de 1 ó 2 mL de capacidad para fraccionar en alícuotas la muestra obtenida.

Para mantener la cadena de frío deberemos disponer de una nevera cerca, y de un congelador de -80ºC. En caso de no estar ubicado cerca del lugar de recolección, dispondremos de una nevera portátil con hielo seco para trasladar las muestras.

Maniobra La recogida del CAE se realiza con el sujeto sentado o semisentado y en condiciones de reposo. Como se ha enfatizado en los apartados anteriores, la recolección del condensado exhalado se realizará antes de cualquier otra prueba respiratoria y nunca simultáneamente. Se recomienda que los sujetos no hayan fumado, ni realizado un esfuerzo físico importante ni haber ingerido comidas importantes en las dos horas previas. En caso de no darse estas circunstancias, debe reflejarse en el formulario de recogida de datos. Antes de comenzar con el procedimiento, el sujeto beberá agua, se enjuagará la boca y expulsará flemas y mucosidades nasales para evitar la contaminación del CAE. Se solicitará a los sujetos que respiren de forma tranquila a través de la boquilla acoplada al equipo condensador utilizando pinzas nasales. Se anotará la hora de inicio de la maniobra.

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El sujeto continuará realizando la maniobra hasta alcanzar un volumen exhalado acumulado de 150-170 litros (medido en la rama espiratoria de la válvula, asumiendo una temperatura de 10ºC) o tras un período de 15-20 minutos.

Es importante estimular al paciente para que mantenga una ventilación estable y a un ritmo pausado (aproximadamente, 6-8 l/min.). Los pacientes con taquipnea prolongada pueden alcanzar de forma rápida los 150 litros de volumen exhalado acumulado (menos de 10 min.), pero el volumen de muestra recogida puede ser muy escaso (inferior a 2 ml). Esto debe tenerse en cuenta para el análisis posterior.

Durante la recogida de la muestra, se indicará al sujeto que puede desconectarse en cualquier momento y la cantidad de veces que desee para sentirse cómodo.

Además, se le comunicará que debe desconectarse de la boquilla siempre que tenga que tragar saliva, toser, estornudar, eructar o hablar. Inmediatamente después continuará con normalidad, hasta alcanzar los ya mencionados 150 litros de volumen espirado acumulativo o transcurridos 15-20 minutos de recolección efectiva.

También se anotará la hora de finalización del acumulado.

Si el equipo utilizado es un ECoScreen y se dispone de una centrífuga refrigerada, la centrifugación del condensador puede incrementar en un 20-30% el volumen del CAE obtenido. Por ello, al finalizar la recogida se procederá de forma inmediata a centrifugar la muestra (5 min., 2000 r.p.m, a 4ºC). Si no es el caso, procederemos rápidamente a alicuotar la muestra, fraccionándola según las indicaciones del protocolo en el número de tubos y con la cantidad de contenido preciso para cada análisis.

Con relativa frecuencia, una parte de la muestra queda congelada dentro del vaso recolector. Si disponemos de la posibilidad de centrifugar la muestra, esta fracción de hielo se descongelará. Pero si carecemos de centrífuga, se recomienda almacenar el condensador en la parte inferior de una nevera durante 5 minutos para, sin romper la cadena de frío, obtener toda la muestra. La muestra total del CAE puede oscilar de los 3 a los 5 ml.

Inmediatamente después, se debe fraccionar la muestra en las alícuotas correspondientes, con la pipeta graduada. Se identificarán los tubos con el número de historia clínica (NHC) o bien el número de identificación asignado al paciente, el número de alícuota y la fecha de recogida.

Se debe recordar que la obtención del CAE no altera las condiciones basales de los sujetos, por lo que los pacientes pueden realizar con normalidad cualquier otra prueba diagnóstica tras la recogida del CAE.

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Recogida de datos Es aconsejable llevar un registro de la actividad en formularios donde se apuntarán datos clínicos del sujeto, las características de la recolección (fecha, parámetros respiratorios, volumen del CAE, etc.), datos de almacenamiento (códigos de numeración, localización en el congelador y temperatura de conservación), así como las incidencias ocurridas. La monitorización del patrón ventilatorio durante la recolección del CAE puede hacerse mediante instrumentos manuales (espirómetro de Wrigth) o electrónicos (EcoVent) conectados a la rama espiratoria de la válvula (ver anexo con un ejemplo de formulario de recogida de muestras de CAE).

Puntos críticos en la recogida del CAE Para minimizar los errores de procedimiento, se deben seguir estrictamente las siguientes recomendaciones previas a la recogida de la muestra, durante la misma o en la fase posterior1,3,5.

Previa a la recolección: •

Realizar la prueba antes de cualquier otro procedimiento funcional respiratorio.

•

Registrar la medicación tomada, dosis y horario.

•

No haber realizado actividad física importante, comida copiosa ni haber fumado dos horas antes (registrar en caso contrario).

•

Enjuagar boca y secreciones nasales y/o bronquiales.

•

Permanecer en reposo.

Durante la recolección: •

Realizar la prueba sentado cómodamente y con pinzas nasales.

•

Instar a respirar de forma tranquila. Estar presente durante la prueba, aunque sea de forma intermitente para controlar estos factores y prevenir incidencias.

•

Es obligatorio desconectarse para toser, tragar saliva, eructar, estornudar, hablar o simplemente descansar.

•

Monitorizar el tiempo total de conexión, así como todos los parámetros respiratorios disponibles. Insistir en mantener una ventilación/minuto de 6-8 l/ min. y una frecuencia respiratoria de 10-15 respiraciones/minuto.

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•

No finalizar la prueba hasta alcanzar 150 litros de volumen espirado acumulado o bien 15-20 min. de recolección efectiva. Si existen dudas, el tiempo será clave para conseguir el volumen de muestra adecuado.

Después de la recolección: •

Ser meticulosos en el mantenimiento de la cadena de frío.

•

Fraccionar la muestra en alícuotas identificadas con los volúmenes necesarios para cada análisis. En caso de no tener claro las determinaciones a realizar, fraccionar la muestra en alícuotas de 0,5 ml, utilizando siempre pipetas milimetradas bien calibradas.

•

Completar el formulario de recogida de datos.

•

Almacenar las muestras en congelador de -80ºC hasta su posterior análisis.

Mantenimiento y limpieza de equipos El mantenimiento de los equipos se realizará de acuerdo a las indicaciones del fabricante. Las partes expuestas al contacto con el paciente así como las fracciones recolectoras de los fluidos (boquillas, codos, condensadores, vasos recolectores…) deben lavarse con agua y jabón neutro y esterilizarse con métodos físicos o químicos. Es importante realizar el aclarado final con agua destilada abundante para evitar la contaminación con solutos, en particular cuando se considere medir la concentración de solutos por conductividad para estimar el grado de dilución. Para evitar contaminación será muy importante que todos los componentes del equipo estén completamente secos antes de su utilización. Cualquier resto acuoso procedente de su limpieza supondría una grave interferencia en análisis posteriores.

Siempre que sea posible, las boquillas y los vasos recolectores serán desechables.

El resto del aparataje se limpiará con un paño húmedo. Si se utiliza un ECoScreen, se ha de tener en cuenta que la acumulación de hielo en la cavidad donde se inserta un condensador lamelar puede dificultar su correcta manipulación pudiendo provocar daños en el equipo, por lo que será preciso mantenerlo limpio y seco después de cada exploración.

PROCESAMIENTO Y ALMACENAMIENTO DE LA MUESTRA Dado que, con la excepción del pH y del peróxido de hidrógeno (H2O2), la mayoría de las determinaciones se realizan de forma diferida, las muestras del CAE deben ser congeladas inmediatamente después de su obtención y almacenadas a -80ºC hasta el momento de su análisis3.

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El almacenamiento a bajas temperaturas no garantiza la estabilidad de algunos analitos. Por tanto, las determinaciones deben ser realizadas durante el periodo en el que se tenga evidencia que el biomarcador permanecerá estable. En el caso de los cisteinil-leucotrienos, su estabilidad en la muestra del CAE es pobre, recuperándose un 39% de la cantidad basal a los tres meses y un 19% a los seis meses6,8. Por el contrario, el pH parece mantenerse estable durante un periodo más prolongado6,8.

Si se plantea analizar más de un parámetro, las muestras deben ser almacenadas en tubos separados para evitar ciclos de congelación-descongelación que podrían degradar ciertos mediadores, como prostaglandinas, leucotrienos, H2O2, citoquinas y proteínas6. No se recomienda incorporar aditivos a la muestra del CAE, puesto que no mejoran las tasas de detección de proteínas.

Concentración de la muestra Como ya se ha mencionado, las muestras obtenidas tienen una elevada dilución de las partículas no volátiles en la fase vapor de agua condensada del CAE, que además varía intradía e intrasujeto.

Además de los procedimientos propuestos para valorar la dilución, también existen estrategias para aumentar la concentración de la muestra. La más habitual es la liofilización y resuspensión, que ha sido utilizada con éxito para la determinación de citoquinas, proteínas, 8-isoprostano y tirosina5. Se recomienda que la liofilización de 1 ml del CAE sea resuspendida en 50 µl, incrementando así su concentración en 20 veces.

Para la determinación de algunos biomarcadores específicos, también se pueden utilizar otros procedimientos de concentración de la muestra como extracción por inmunoafinidad, extracción en fase sólida o extracción del solvente, pero su aplicación no está suficientemente estandarizada en la práctica convencional8.

BIOMARCADORES EN EL CAE DE PACIENTES CON ASMA En general, las muestras del CAE son recogidas con tres objetivos principales: conocer los mecanismos patológicos de las enfermedades de las vías respiratorias, identificar la composición del fluido de revestimiento de las vías respiratorias y reconocer posibles marcadores específicos de las distintas enfermedades de las vías respiratorias1,5. Todos ellos son aplicables en los enfermos con asma, en los que existe un importante número de biomarcadores que se encuentran alterados en el CAE, se relacionan con diversos aspectos de la enfermedad y evidencian respuesta al tratamiento con corticosteroides1,9.

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Los compuestos volátiles (ácido acético, ácido fórmico, amoniaco) están presentes en concentraciones mucho más altas que los constituyentes no volátiles y, por tanto, son mucho más fáciles de medir. Sin embargo, su interpretación resulta más compleja, puesto que sus niveles dependen de la solubilidad en agua, de los coeficientes de partición gas-líquido, de la temperatura de la fuente de fluido, de la temperatura del condensador, del pH del líquido de revestimiento epitelial y del CAE, así como de la reactividad entre ellos1,8,10.

Los componentes no volátiles, que incluyen moléculas tan pequeñas como el ion sodio (Na+) y tan grandes como las inmunoglobulinas, son los que parecen tener un mayor interés en la valoración de los pacientes con asma. A continuación, se mencionan los biomarcadores más frecuentemente alterados y mejor relacionados con aspectos patogénicos del asma: •

pH. En realidad, no es un marcador específico, sino que refleja el equilibrio ácido-base de los compuestos presentes en el CAE, aunque depende principalmente de los componentes volátiles (CO2, amoniaco, ácidos orgánicos volátiles) y en menor extensión de los no volátiles (bicarbonato, sodio, cloro, potasio, etc.)11. Refleja el pH del líquido que reviste las vías aéreas, alcanzado por el balance entre diferentes sistemas tampón y la producción y liberación de ácidos y bases desde las vías aéreas. No obstante, también puede verse alterado por el reflujo gástrico, la inhalación de gases o humos ácidos o el contenido de amoniaco de la boca11,12. En pacientes con asma, se ha descrito una disminución del pH del CAE durante las agudizaciones, para normalizarse después del tratamiento con corticosteroides. Además, sus niveles han sido relacionados con la inflamación eosinofílica o neutrofílica de las vías aéreas3,11.

•

Peróxido de hidrógeno (H2O2). Producido por la conversión del anión superóxido O2- en H2O2 por la acción de la superóxido dismutasa en células inflamatorias o residentes en las vías aéreas, como eosinófilos, neutrófilos, macrófagos y células epiteliales. En asma, sus niveles se relacionan con la cantidad de eosinófilos en esputo y la hiperrespuesta bronquial, disminuyendo después del tratamiento con corticosteroides3,8,10.

•

Especies reactivas de nitrógeno. Derivadas del óxido nítrico (NO), que es formado a partir de la L-arginina por la enzima NO sintetasa. Entre ellas, destacan los óxidos de nitrógeno (NOx), que incluyen a los nitritos (NO2-) y nitratos (NO3-), y son formas redox de nitrógeno presentes en el líquido que tapiza el epitelio respiratorio. En pacientes con asma, se han descrito valores normales o elevados3. La reacción de NO y aniones superóxido en las vías aéreas lleva a la formación de peroxinitrito, que reacciona con residuos de tirosina de diversas proteínas para formar nitrotirosina. Sus concentra-

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ciones también se encuentran elevadas en pacientes con asma y se relacionan con la fracción exhalada de óxido nítrico (FENO)3,8,10.

•

Metabolitos del ácido araquidónico. El ácido araquidónico es liberado desde las células por la fosfolipasa A y sus metabolitos más destacados son los isoprostanos, leucotrienos y prostanoides. Los isoprostanos se forman por la peroxidación de ácidos grasos catalizada por radicales libres. El 8-isoprostano es un producto prostaglandin-like formado a partir del ácido araquidónico por la acción no enzimática de especies reactivas de oxígeno, con una gran estabilidad, por lo que resulta un buen marcador de estrés oxidativo. Los leucotrienos (LT) son mediadores inflamatorios sintetizados en leucocitos a través de la oxidación del ácido araquidónico por la 5-lipooxigenasa. El LTB4, sintetizado a partir de la LTA4 por la enzima LT4 hidrolasa, es un potente activador de neutrófilos y un mediador proinflamatorio. Los cisteinil-leucotrienos (LTC4, LTD4, LTE4 y LTF4) son liberados de células inflamatorias de las vías aéreas, particularmente de mastocitos y eosinófilos, y desempeñan un papel en la inflamación de la vía aérea que presentan los pacientes con asma8,10. Los prostanoides son una subclase de eicosanoides formados a partir del ácido araquidónico por la acción de las ciclooxigenasas. Pueden ser divididas en tres subgrupos: prostaglandinas (PgD2, PgE2, PgF2α), tromboxanos (TxA2, TxB2) y prostaciclinas. Cada uno de estos grupos está implicado en diversos aspectos de la respuesta inflamatoria del asma. De forma muy esquemática, las prostaglandinas son mediadores inflamatorios y de reacción anafiláctica, los tromboxanos son mediadores de vasoconstricción y la prostaciclina se activa en la fase de resolución de la inflamación2.

•

Citoquinas. Son pequeñas proteínas secretadas por las células residentes o inflamatorias de las vías aéreas. Según su actividad biológica, se clasifican en interleucinas, linfocinas y quimiocinas. En el CAE de pacientes con asma, se han descrito niveles elevados de interleucinas (IL1, IL2, IL4, IL5, IL6, IL8), gamma-interferón y factor de necrosis tumoral (TNF)-α2.

•

Aldehidos y sustancias reactivas con el ácido tiobarbitúrico. Los aldehídos (malondialdehido, 4-hidroxihexanal, 4-hidroxinonenal, hexanal, heptanal y nonanal) son peróxidos lipídicos que reflejan daño inducido por el estrés oxidativo. Por el contrario, el glutation es un antioxidante endógeno que previene el daño celular por especies reactivas de oxígeno y radicales libres.

•

Adenosina. Formada durante la degradación de adenosina trifosfato (ATP), tiene un amplio rango de efectos sobre el sistema respiratorio a través de sus receptores específicos3. De hecho, es uno de los principales mediadores de la hiperrespuesta bronquial a agentes indirectos. Se encuentra elevada en pacientes con asma y atopia.

62

•

Otras moléculas. En el CAE de pacientes con asma, también se ha referido la detección de moléculas de pequeño tamaño (cloro, sodio, potasio, urea y ácidos orgánicos pequeños), metales de transición (hierro, cobre, cinc), proteínas y diversos metabolitos, aunque su significado patogénico es incierto. Por último, en el CAE también pueden recogerse pequeñas cantidades de DNA y de células epiteliales, que son desprendidas del tracto respiratorio inferior8,10.

PROCEDIMIENTOS DE ANÁLISIS Los posibles marcadores determinados en el CAE representan una gran variabilidad, con características bioquímicas diversas (volatilidad, estabilidad, concentración, etc.) (Fig. 4).

Marcadores

Propiedades bioquímicas

Objetivos

Volatilidad

Mecanismos

Concentración

Identificación

Estabilidad

Especificidad

Cinética

Peso molecular

Fig. 4. Esquema de las características de un marcador que deben ser consideradas para la elección del procedimiento de análisis del condensado del aire exhalado.

63

Por este motivo se requiere la utilización de diversos procesos de análisis, equipos y técnicas. En general, puede afirmarse que las determinaciones analíticas más comunes para detectar marcadores en CAE, se agrupan en cinco ensayos generales: pHmetría y análisis de conductividad Constituye la determinación más sencilla y repetible3, que es fácil de llevar a cabo con electrodos de pH o colorantes indicadores. No obstante, es importante tener presente que el pH del CAE resulta inestable por la presencia de CO2 exhalado, que disminuye el pH de la muestra obtenida. Para obtener una determinación estable, se recomienda eliminar el CO2 del CAE mediante el burbujeo de la muestra con un gas libre en CO23,11,12. Aunque no existe un protocolo universalmente aceptado, lo más habitual es burbujear la muestra del CAE con argón, a un flujo de 300 ml/min., hasta que se estabilice el nivel de pH (lo que suele suceder en 2,5-10 minutos). También se ha propuesto estandarizar la muestra con una concentración fija de CO2 (40 mmHg), aunque este último procedimiento no se ha generalizado11.

Una vez eliminado el CO2 de la muestra del CAE, se introduce una sonda de pH convencional y se obtiene una lectura estable. La mayoría de los pHmetros convencionales disponen también de una sonda intercambiable de conductividad, con lo que es posible obtener una lectura de este parámetro inmediatamente después.

El pH del CAE sin presencia de CO2 resulta independiente de la hiperventilación, duración del tiempo de recogida (3-7 minutos), tiempo de almacenamiento de la muestra (hasta dos años), exclusión del amoniaco oral o presencia de broncoespasmo. En sujetos sanos, el pH del CAE sin CO2 oscila entre 7,4 y 8,8. Sus coeficientes de variación intrasujeto, intradía e intrasemana son 3,5 y 4,5%, respectivamente11,12.

Espectrofotometría y espectrofluorimetría La espectrofotometría y espectrofluorimetría son los métodos espectroscópicos ópticos más usados en mediciones analíticas y en investigación científica. En aplicaciones analíticas, el uso de la fluorescencia es dominante en laboratorios clínicos donde inmunoensayos de fluorescencia han reemplazado a los radioinmunoensayos. Hay dos razones principales para el extensivo uso de la espectrometría. La primera es el alto nivel de sensibilidad y el amplio rango dinámico que pueden realizarse. Un gran número de laboratorios han reportado detección de una sola molécula. En segundo lugar, la instrumentación requerida es conveniente y para la mayoría de propósitos puede adquirirse por un costo no muy elevado.

La determinación de H2O2 y del óxido nítrico (NO) se basa en métodos espectrofotométricos. H2O2 también tiene la posibilidad de medirse por espectrofluorimetría o por el uso de un sistema automatizado, biosensor amperométrico9.

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Inmunoensayos Las técnicas inmunoanalíticas poseen una gran sensibilidad y selectividad. La selectividad es una característica imprescindible para estas determinaciones, ya que de esta manera se evitan resultados erróneos (falsos positivos y falsos negativos). Por otra parte, la sensibilidad para la identificación de biomarcadores en muy bajas concentraciones permitirá la detección de alteraciones en sus primeras fases, contribuyendo a la detección precoz de enfermedades. Las técnicas inmunoanalíticas se basan en reacciones antígeno-anticuerpo y/o enzima-sustrato, que permiten estudiar una gran cantidad de moléculas. Las técnicas más habituales y populares en el CAE son: ELISA, EIA, MEIA, siendo el enzimoinmunoanálisis (ELISA) la más utilizada y mejorada con el paso del tiempo3. En estas reacciones se presentan tres elementos constantes (analito, conjugado y sustrato) que, en función de cómo se combinen, generan los distintos tipos de ensayos. Normalmente, la detección de citoquinas de muestras de exhalados se suele realizar por kits de EIA/ELISAS. Sin embargo, debido a la complejidad del número de citoquinas encontradas, es conveniente utilizar un método capaz de analizar una batería de ellas. Uno de ellos es el CBA (del inglés, cytoquine bead assay), que permite analizar y cuantificar hasta un total de 12 citoquinas. La principal desventaja de este método es una menor sensibilidad en comparación con los kits de ELISA10.

Cromatografía Son los procedimientos más habitualmente empleados para determinar eicosanoides, isoprostanos, prostanoides y leucotrienos. La cromatografía permite la separación de los componentes de una muestra basada en la distribución de los mismos entre dos fases inmiscibles: una estacionaria y otra móvil. La cromatografía se emplea acoplada a un detector fluorimétrico, para identificar moléculas que emiten señal fluorescente, por fluorescencia nativa o inducida por marcaje (derivatización). Entre las ventajas analíticas que posee esta técnica, puede subrayarse su rapidez, sensibilidad y amplio intervalo de linealidad. Los eicosanoides en el CAE se miden por diferentes técnicas, incluyendo inmunoensayos, cromatografía y espectrometría de masas, siendo este último el método de referencia. Los isoprostanos se pueden determinar mediante el uso de GC-MS (cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas). Los prostanoides por RP-HPLC (cromatografía líquida de alta resolución en fase invertida) y GC-MS. Para la determinación de los leucotrienos es recomendable el uso HPLC o LC-MS. La LC-MS (cromatografía liquida acoplada a espectrometría de masas) se considera como el método estándar para la determinación simultánea de diferentes isoprostanos.

Además, la LC-MS es ideal por la simultánea determinación de diversas purinas4,8.

65

Resonancia nuclear magnética Recientemente, la metabonómica se ha introducido en el análisis del CAE (Anexo 1). La metabonómica permite mirar las relaciones genotipo-fenotipo junto con la relación genotipo-ambiente. La metabonómica puede identificar y cuantificar la huella metabólica en los diferentes conjuntos de datos clínicos. La metabonómica basada en NMR (resonancia magnética nuclear) es adecuada para la identificación de metabolitos específicos en CAE, que son potencialmente útiles para la caracterización de huellas metabólicas específicas de pacientes con asma y otras enfermedades respiratorias4,8,9.

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Anexo 1. Ejemplo de formulario para la recogida del CAE

LOGOTIPO DEL CENTRO

ETIQUETA O NOMBRE Y NHC DEL PACIENTE

Fecha: ■ ■ / ■ ■ / ■ ■ ■ ■

NUMID: ■ ■ ■ ■ ■ ■

Tª ambiente:

Humedad:

Presión Barométrica:

Medicación que ha recibido hoy: (NEBULIZADA, INHALADA, VO, dosis y HORARIO)

1 ........................................................

2 ........................................................

3 ........................................................

4 ........................................................

5 ........................................................

6 ........................................................

7 ........................................................

8 ........................................................

Diagnóstico: RECOLECCIÓN Hora de inicio ■ ■ / ■ ■

Hora de finalización ■ ■ / ■ ■

Utilizando el volumen espirado acumulativo registrar los parámetros ventilatorios a los: 10-20 L

50-60 L

Volumen

Código

90-100 L

140-150 L

Vol. espirado acumulado (V) Tiempo (T) Volumen corriente (VT) Ventilación minuto (VE) Frec. respiratoria (BF) ALÍCUOTAS Nº

Biomarcador

1

Ejemplo

2

8-iso: 400 µL

3

H2O2: 200 µL

4

CBA: 2000 µL

1.1.1 Dificultades o incidencias durante la recogida ■ No ■ Si (especificar) ......................................................................................................................................................................... ......................................................................................................................................................................... ......................................................................................................................................................................... .........................................................................................................................................................................

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BIBLIOGRAFíA 1. Hunt J. Exhaled breath condensate – an overview. Immunol Allergy Clin North Am. 2007; 27:587–v.

2. Matsunaga K, Ichikawa T, Yanagisawa S, Akamatsu K, Koarai A, Hirano T. Clinical application of exhaled breath condensate analysis in asthma: prediction of FEV1 improvement by steroid therapy. Respiration. 2009; 78:393–8.

3. Horvath I, Hunt J, Barnes PJ. Exhaled breath condensate: methodological recommendations and unresolved questions. Eur Respir J. 2005; 26:523–48.

4. Ahmadzai H, Huang S, Hettiarachchi R, Lin JL, Thomas PS, Zhang Q. Exhaled breath condensate: a comprehensive update. Clin Chem Lab Med. 2013; 51:1343–61.

5. Torralba García Y, Gómez Yerón FP. Condensado exhalado. En: Casan P, Burgos F, eds. Manual de procedimientos SEPAR 11. Pruebas para el estudio de la inflamación de las vías aéreas. Barcelona, Pernmayer. 2007:47–67.

6. Rosias. Methodological aspects of exhaled breath condensate collection and analysis. J Breath Res. 2012; 6:027102.

7. Hüttmann E-M, Greulich T, Hattesohl A, Schmid S, Noeske S, Herr Ch et al.

Comparison of two devices and two breathing patterns for exhaled breath condensate sampling. PLoS ONE. 2011; 6: e27467.

8. Dodig S, Cepelak I. Exhaled breath condensate - from an analytical point of view. Biochem Med. 2013; 23:281–95.

9. Kazani S, Israel E. Exhaled breath condensates in asthma: diagnostic and therapeutic implications. J Breath Res. 2010; 4:047001.

10. Kuban P, Foret F. Exhaled breath condensate: determination of non-volatile compounds and their potential for clinical diagnosis and monitoring. Anal Chim Acta. 2013; 805:1–18.

68

11. Davis MD, Hunt J. Exhaled breath condensate pH analysis. Immunol Allergy Clin N Am. 2012; 32:377â&#x20AC;&#x201C;86.

12. Lin JL, Bonnichsen MH, Thomas PS. Standardization of exhaled breath condensate: effects of different de-aeration protocols NO pH and H2O2 concentrations. J Breath Res. 2011; 5: 011001.

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TEMPERATURA DEL AIRE EXHALADO

DUE Jordi Giner Donaire Dr. Alfons Torrego Fernández Dr. Vicente Plaza Moral Servicio de Neumología Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona

INTRODUCCIÓN En los últimos años, diferentes autores1-3 han explorado la utilización de la temperatura del aire exhalado (TAE) como marcador de la inflamación y han obtenido buenas correlaciones con otros marcadores tradicionales como la fracción de óxido nítrico exhalado (FeNO), la eosinofilia en esputo y sangre o el FEV11,2,4. Así pues, la medición de la TAE, a falta de mayor número de estudios, podría ser un marcador sencillo, rápido y barato para la medición indirecta de la inflamación bronquial.

Métodos de medición de la TAE En el primer trabajo publicado sobre la TAE, Paredi y col.1 proponen medir el incremento de la temperatura del aire exhalado (iTAE) en una maniobra espiratoria lenta y controlada. Los autores eligen el 63% del aumento total de la temperatura ya que representa dos constantes de tiempo del cambio máximo producido y,

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según sus cálculos, permite una mejor caracterización matemática del aumento de la temperatura del aire exhalado antes de la meseta final (Fig. 1). Estas mediciones de la iTAE se correlacionan con un aumento del flujo sanguíneo bronquial5, lo que confirma la relación entre la iTAE y la inflamación.

Otra forma de calcular la TAE es la propuesta por Piacentini y col.2. Proponen la medición de la temperatura del aire exhalado en una maniobra lenta con un flujo no controlado, identificando la temperatura meseta en la finalización de una maniobra de exhalación (TAEmeseta).

Popov y col.3, por su parte, han diseñado un equipo para la medición de la temperatura meseta del aire exhalado medida tras respirar a volumen circulante (TAEmvc). Este equipo ha sido comercializado recientemente por Delmedica Investments (Singapore) Pte Ltd, con el nombre de X-Halo (Fig. 2). Para obtener la TAEmvc se requiere una respiración a volumen circulante, inspiración nasal del ambiente y espiración en el interior del equipo, que dispone de un sensor de temperatura que indica cuando se alcanza la estabilidad. En la figura 3 se muestra la realización de la técnica, y en la figura 4, una gráfica de la maniobra. Esta medición es actualmente la que mayor número de publicaciones ha producido.

A pesar de las diferencias de metodología empleadas por estos autores y de las discrepancias que entre ellos han surgido4,6, todos ellos, en sus respectivos estudios, evidencian diferencias estadísticamente significativas en las mediciones de la TAE entre asmáticos, de diferentes tipos, y controles sanos, lo cual habilita la medición de la TAE como un potencial marcador de la inflamación bronquial. A pesar de ello, y dado que solamente existe un equipo comercializado y por tanto a disponibilidad de su uso, nos referiremos a la medición de la TAEmvc.

FUNDAMENTO Los procesos inflamatorios se caracterizan por una dilatación vascular en la que intervienen una serie de mediadores de la inflamación como son la histamina, la bradiquinina, los leucotrienos, el factor activador de plaquetas, la prostaglandina E2, la adenosina y el óxido nítrico (NO), que provocan una dilatación vascular bronquial y un aumento del flujo sanguíneo, que se traduce en cambios en la temperatura de las vías aéreas. Así pues, la medición de la TAE se ha mostrado como un marcador sencillo, rápido y barato para la medición indirecta de la inflamación bronquial5.

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Fig. 1. Representaciรณn grรกfica y cรกlculos de la mediciรณn de la iTAE.

Fig. 2. Equipo X-halo breath thermometer.

(Delmedica Investments Singapore Pte Ltd), para la mediciรณn de la TAEmvc.

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Fig. 3. Realizaci贸n de la t茅cnica.

Fig. 4. Representaci贸n gr谩fica de la maniobra de la TAEmvc.

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EQUIPO Y MATERIAL El equipo para la medición de TAEmvc consta de dos componentes principales: un matraz chapado en plata 0,5 L en un cilindro de metal (termo) y un bloque térmico con un sensor de temperatura integrado (Fig. 2). El bloque térmico tiene una alta capacidad térmica y propiedades de conducción de calor. Cuando el aire exhalado llega a la cámara, gracias a un sistema de válvulas, recoge la temperatura de la última porción del aire exhalado que ha permanecido más tiempo en los pulmones. La temperatura en la cámara se evalúa mediante la resistencia de un sensor térmico, las mediciones se realizan de forma continua hasta que no se observan cambios superiores a 0,01ºC durante 20 segundos. El tiempo para alcanzar este equilibrio térmico es de entre 3 y 5 minutos.

PROCEDIMIENTO Para la realización de la prueba, la temperatura ambiente deberá estar entre 20º y 26º. La presencia de hipertermia parece no alterar la medición7.

El individuo debe sostener el dispositivo con las manos, colocando la boquilla (filtro bacteriológico) entre sus labios y respirar tranquilamente: inhalando por la nariz y exhalando en el dispositivo, hasta que el propio equipo indica que se ha llegado a la estabilidad.

A pesar de la ausencia de datos se recomienda la realización de un mínimo de dos maniobras con diferencias entre ellas inferiores a ±5º8. Entre ambas mediciones, para facilitar el retorno a la temperatura ambiente del dispositivo, se puede utilizar aire comprimido.

LIMPIEZA DEL EQUIPO Lavar el equipo con una solución desinfectante, enjuagar con agua, y dejar secar a temperatura ambiente.

INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS La TAEmvc es la que, hasta la fecha, mayor número de publicaciones ha suscitado, dada la facilidad de obtención de su medición gracias a la comercialización del equipo X-Halo. Popov y col.3 encuentran diferencias estadísticamente significativas entre controles sanos (34,84ºC) y asmáticos (35,45ºC, p=0,009). En un estudio posterior9, el mismo grupo, encuentra una disminución estadísticamente significativa en un grupo de pacientes asmáticos tratados con corticosteroides durante 3 semanas, que se correlaciona con el aumento del FEV1 y la disminución

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de la eosinofilia tanto en sangre como en esputo. A pesar de estos resultados, la mayor indicación es el control intraindividual, observándose diferencias de los valores de la TAEmvc entre el estado de control y de exacerbación, así como un descenso tras el tratamiento con corticosteroides en pacientes asmáticos10. La técnica también podría ser válida para pacientes con EPOC y para el control de pacientes en el proceso de deshabituación tabáquica10, aunque se requieren más estudios para poder establecer su validez.

LIMITACIONES DE LA TÉCNICA A pesar de los resultados expuestos la medición de la TAE, en sus diferentes modalidades, tiene una serie de limitaciones que deben tenerse en cuenta. Ninguna de las formas de medición de la TAE (la iTAE, la TAEpico, la TAEmeseta y la TAEmvc) están estandarizadas, lo que limita su aplicación en la clínica diaria, así como la comparación de algunos de los resultados obtenidos, debido a las diferencias metodológicas utilizadas. Para las dos primeras modalidades, además, no existe un equipo comercializado que facilite tanto su realización como sobre todo el cálculo posterior, por lo que requieren de un desarrollo técnico que las simplifique y las pueda acercar a la práctica diaria. La TAEmvc, comercializada desde hace unos años es, hoy por hoy, la de mayor aplicabilidad, aunque, como se ha comentado anteriormente, requiere de una estandarización, que se conseguirá a medida que aparezcan nuevos trabajos que la avalen.

CONCLUSIONES La medición de la TAE, en sus diferentes modalidades, es un procedimiento factible, sencillo y no invasivo como marcador de la inflamación bronquial. Las diferencias observadas entre pacientes, principalmente diagnosticados de asma y controles sanos así lo ratifican y los resultados obtenidos hasta la fecha se correlacionan con otros marcadores de la inflamación habituales en la práctica diaria como son la FeNO, la eosinofília en esputo y sangre, el FEV1 o las pruebas de provocación bronquial. Por tanto, puede ser un complemento, de momento, en la monitorización de la inflamación bronquial, sobre todo en asma, aunque su aplicación también parece posible en otras enfermedades respiratorias que cursan con inflamación bronquial como la EPOC.

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BIBLIOGRAFíA 1. Paredi P, Kharitonov SA, Barnes PJ. Faster Rinse of Exhaled Breath Temperature in asthma. Am J Respir, Crit Care Med. 2002; 165(2):181–4.

2. Piacentini GL, Bodini A, Zerman L, Costella S, Zanolla L, Peroni DG, BonerAL Relationship between exhaled air temperature and exhaled nitric oxide in childhood asthma. Eur Respir J. 2002; 20:108–11.

3. Popov TA, Dunev S, Kralimarkova TZ, Kraeva S, DuBuske LM. Evaluation of a simple, pontentially individual device for exhaled breath temperature measurement. Respiratory Medicine. 2007; 101:2044–50.

4. Piacentini GL, Bodini A, Peroni D, Ress M, Costella S, Boner AL. Exhaled air temperature and eosinophil airway inflammation in allergic asthmatic children.

Letter to the editor. JACI. 2004; 114(1):202–4.

5. Paredi P, Kharitonov SA, Barnes PJ. Correlation of exhaled breath temperature with bronchial blood flow in asthma. Respiratory Research 2005, 6:15 6. Paredi P, Kharitonov SA, Barnes PJ. Exhaled breath temperature in asthma.

Eur Respir J. 2003; 23:195–8.

7. Piacentini GL, Peroni DG, Bodini A, Corradi M, Boner AL. Exhaled breath temperature as a marker of airway remodelling in asthma: a preliminary study.

Allergy. 2008 Apr; 63(4):484–5.

8. Giner J, Torrejón M, Belda A, Granel C, Torrego A, Plaza V. Repetitividad de la medición de la temperatura de aire exhalado en sanos y asmáticos. En: 44 Congreso Nacional SEPAR. Oviedo, España. 17-20 junio 2011. Arch Bronconeumol.

2011(Supl.); 47:19.

9. Popov TA, Kralimarkova TZ, Lazarova CT, Tzachev ChT, Dimitrov VD, Gill J. Daily Monitoring of Asthmatics by Means of Individual Devices for Exhaled Breath Temperature Measurement. IEEE Sensors Journal.2009; 10(1) [Digital Object Identifier 10.1109/JSEN.2009.2035664] 10. Paredi P, Caramori G, Cramer D, Ward S, Ciaccia A, Papi A, et al. Slower rise exhaled breath temperature in chronic obstructive pulmonary disease. Eur Respir J. 2003; 21:439–43.

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LA NARIZ ELECTRÓNICA

DUE Jordi Giner Donaire Dr. Oriol Sibila Vidal Dr. Vicente Plaza Moral Servicio de Neumología Hospital de la Sta. Creu i Sant Pau. Barcelona

INTRODUCCIÓN La nariz electrónica (e-nose) es una tecnología emergente no invasiva que detecta componentes volátiles orgánicos (COVs) en la fase gaseosa del aire espirado1. Utiliza una serie de sensores que reaccionan con los diferentes COVs y generan un patrón o “huella olfativa” específica para cada individuo mediante el procesamiento de las señales obtenidas. Estos patrones de COVs correctamente analizados pueden ser usados como biomarcadores no invasivos de distintos procesos bioquímicos que se producen, tanto de forma fisiológica como en distintas enfermedades, de ahí su potencial aplicabilidad, en biomedicina en general y en medicina respiratoria en particular.

El aire espirado contiene una mezcla compleja de compuestos orgánicos volátiles que se derivan de diferentes vías metabólicas e inflamatorias del pulmón1,2. Las huellas olfativas específicas de algunas enfermedades respiratorias se han utilizado con éxito para la detección de diagnóstico de cáncer de pulmón, mesotelioma

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pleural maligno, asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC)3-8. A pesar de ello la e-nose no es un marcador de inflamación directo, ya que entre otros motivos, no es una tecnología cuantitativa, si no que sus resultados son cualitativos, al comparar la huella olfativa incógnita con la esperada en un grupo referencia, en nuestro caso “inflamación sí”, “inflamación no”.

MÉTODO La obtención y análisis de la muestra de aire espirado con la e-nose dependerá en parte de la nariz electrónica que se utilice, en este caso se describe la técnica utilizada con la nariz Cyranose 320® (Smithprotection, Pasadena, CA), que dispone de 32 sensores que experimentan cambios específicos en su resistencia eléctrica al ser expuestos a las partículas volátiles presentes en el aire y que se traducen en un patrón de COVs o “smellprint” característico para cada olor, formado por 32 puntos obtenidos a partir de los resultados de cada sensor. En general podemos dividir el proceso en tres partes: recogida de la muestra, análisis de la muestra y análisis estadístico.

Preparación del individuo para la obtención de la muestra Preferiblemente el individuo a examinar deberá estar en ayunas (un mínimo de 3 horas), para que las posibles ingestas no desvirtúen los COVs presentes. En sujetos fumadores activos debe tenerse en cuenta ya que el tabaco es un potencial factor confusor.

Recogida de la muestra El individuo respira a volumen circulante a través de una válvula de tres vías, a la que se le ha incorporado, en la línea inspiratoria, un filtro biológico NBQ (capaz de eliminar compuestos químicos del aire atmosférico). Tras 3 minutos se le pedirá que realice una inspiración máxima, se conectará la bolsa de Tedlar y se recogerá el aire espirado procedente de una espiración máxima, a la que se intercalará un reservorio de sílice, para eliminar la humedad del aire espirado que podría alterar los sensores de la e-nose (Fig. 1).

Análisis de la muestra Se conecta a la bolsa con el aire problema y una bolsa con aire ambiente, obtenido a través del filtro NBQ, a la nariz electrónica durante 5 minutos, en períodos de 1 minuto. Los cambios en la resistencia eléctrica de sus 32 sensores orgánicos generan un perfil de COVs3-8 (Fig. 2).

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Análisis estadístico El resultado del perfil de COVs es analizado estadísticamente por medio de: 1) análisis de discriminantes5,9,10; 2) regresión logística, para obtener una la representación visual de forma bidimensional y unidimensional, mucho más fácil de interpretar y analizar. A partir de este análisis pueden distinguirse los diferentes grupos (Fig. 3).

Fig. 1. Válvula de tres vías (a); filtro NBQ (b); bolsa de Tedlar (c); reservorio de sílice (d).

Fig. 2. Análisis de la muestra.

Bolsa problema (a); nariz electrónica (b); bolsa con aire ambiente (c).

Fig. 3. Resultado de la comparación de los grupos de individuos: EPOC colonizados ( ▼ ) y EPOC no colonizados ( ◆ )10.

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BIBLIOGRAFĂ­A 1. Moser B, Bodrogi F, Eibl G, et al. Mass spectrometric profile of exhaled breathefield study by PTR-MS. Respir Physiolo Neu-robiol. 2005;145(2e3):295e300.

2. Buszewski B, Kesy M, Ligor T, et al. Human exhaled air analytics: biomarkers of diseases. Biomed Chromatogr. 2007; 21(6):553e66.

3. Dragonieri S, Annema JT, Schot R, et al. An electronic nose in the discrimination of patients with non-small cell lung cancer and COPD. Lung Cancer. 2009; 64(2):166e70.

4. Dragonieri S, van der Schee MP, Massaro T, et al. An electronic nose distinguishes exhaled breath of patients with malignant pleural mesothelioma from controls. Lung Cancer. 2012; 75(3): 326e31.

5. Dragoneri S, Schot R, Mertens BJ, et al. An electronic nose in the discrimination of patients with asthma and controls. J Allergy Clin Inmunol. 2007; 120:856e62.

6. Fens N, Zwinderman AH, van der Schee MP, et al. Exhaled breath profiling enables discrimination of chronic obstructive pulmonary disease and asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2009; 180(11):1076e82.

7. Dragoneri S, Schot R, Mertens BJ, et al. An electronic nose in the discrimination of patients with asthma and controls. J Allergy Clin Inmunol. 2007; 120:856e62.

8. Fens N, Zwinderman AH, van der Schee MP, et al. Exhaled breath profiling enables discrimination of chronic obstructive pulmonary disease and asthma. Am J Respir Crit Care Med. 2009; 180(11):1076e82.

9. Scott SM, James D, Ali Z. Data analysis for electronic nose system. Microchem Acta. 2007; 156:183â&#x20AC;&#x201C;2007.

10. Sibila O, Garcia-Bellmunt L, Giner J, Merino JL, Suarez-Cuartin G, Torrego A, Solanes I, Castillo D, Valera JL, Cosio BG, Plaza V, Agusti A. Identification of airway bacterial colonization by an electronic nose in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Respiratory Medicine (2014). http://dx.doi.org/10.1016/j. rmed.2014.09.008

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preguntas de evaluación

1.- ¿En la prueba de provocación segmentaria de los pacientes asmáticos cual es el perfil celular habitual? a. Mastocitos en respuesta inmediata, neutrófilos a las pocas horas y eosinófilos en la respuesta tardía. b. Neutrófilos en respuesta inmediata y eosinófilos a las pocas horas. c. Neutrófilos en respuesta inmediata, basófilos a las pocas horas y eosinófilos en la respuesta tardía. d. Eosinófilos en respuesta inmediata, mastocitos a las pocas horas y neutrófilos en la respuesta tardía. e. Mastocitos en respuesta inmediata y eosinófilos a las pocas horas.

2.- ¿Cuál es la principal limitación de la prueba de provocación con alérgenos nebulizados? a. No se pueden testar múltiples segmentos bronquiales con diferentes dosis de antígeno. b. Produce cambios medibles en la función pulmonar que no le hace ser una herramienta segura en la investigación. c. Produce mayor broncoconstricción general a pesar de inducir una menor inflamación local. d. Requiere aplicar medidas adicionales diferentes a las que se harían en cualquier paciente asmático al que se le va a realizar una broncoscopia. e. La variabilidad inter e intrasegmento en la respuesta inflamatoria.

3.- ¿Cómo se recomienda la toma de muestras de biopsia en la broncoscopia a un paciente asmático? a. b. c. d. e.

Con el uso de la escopia para acceder a los bronquios más periféricos.

En secuencia proximal a distal para controlar el posible sangrado.

En las bifurcaciones de bronquios segmentarios y subsegmentarios.

En tráquea y bronquios principales.

En secuencia distal a proximal para evitar la contaminación con secreciones mucosas.

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4.- ¿Cuál de estas frases es correcta en relación al cepillado bronquial en las enfermedades inflamatorias pulmonares? a. b. c. d.

Resulta útil para el estudio de células in vivo.

Se debe realizar antes del lavado broncoalveolar (LBA).

La mayoría de las células obtenidas son células cilíndricas ciliadas.

Se intenta evitar el uso de lidocaína tópica para no alterar la viabilidad de las células recuperadas. e. La seguridad de la técnica en pacientes asmáticos es mala; generalmente se describe tos y sangrado.

5.- ¿Cuál es el volumen habitualmente recuperado en el LBA realizado a los pacientes asmáticos? a. b. c. d. e.

30-40% 50-90% 40-60% 20-30% 80-100%

6.- En relación a la prueba de provocación segmentaria ¿Cuál es la afirmación correcta? a. b. c. d. e.

Habitualmente no se titula la dosis de antígeno a administrar.

La metodología para la realización de la prueba no está estandarizada.

Se recoge un LBA a los pocos minutos y a los 30 días.

Se instila la dosis calculada de antígeno en distintos segmentarios.

Se administran alícuotas de 20-50 ml.

7.- ¿ Cuál de éstas afirmaciones es falsa? a. La localización de la unidad de endoscopia respiratoria debe estar próxima al área de hospitalización de Neumologí. b. Las salas de trabajo deben de disponer de toma de oxígeno y 2 tomas de vacío. c. En caso de utilizar como desinfectante glutaraldehido la sala de limpieza del instrumental debe de disponer de sistema de extractor de aire. d. Es recomendable en las salas de trabajo disponer de sistemas de ventilación que produzcan entre 5-6 cambios de aire por hora y presión negativa, para evitar contaminaciones. e. Para el uso de radioscopia es recomendable una sala de protección plomada.

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8.- ¿Cuál es la principal indicación del EBUS en pacientes asmáticos? a. La evaluación de los ganglios mediastínicos. b. La medición de las estructuras vasculares. c. La evaluación de lesiones periféricas más allá de la visión directa del broncoscopio. d. La medición del efecto del tratamiento con la visión directa del broncoscopio. e. La evaluación de la estructura mural bronquial.

9.- ¿Cuál es la capacidad de penetración en la pared de la vía aérea de la sonda ecográfica del EBUS radial? a. b. c. d. e.

Hasta 2 cm.

Hasta 5 cm.

Hasta 8 cm.

Hasta 6 cm.

El EBUS usado para medir la pared de la vía aérea no es radial, sino lineal.

10.- En relación a la alveoloscopia o microscopia láser confocal ¿cuál es la respuesta falsa? a. Se coloca una finísima sonda semi-flexible que llega hasta los conductos alveolares. b. Existe una estandarización de la técnica para evaluar las diferencias regionales que se pueden dar en enfermedades pulmonares difusas. c. Permite obtener en tiempo real y en 3 dimensiones imágenes de los conductos alveolares d. En el futuro es esperable su aplicación en el diagnóstico de enfermedades pulmonares sobre todo en estadios precoces. e. Consigue evaluar en vivo las vías respiratorias y en particular el acino pulmonar.

11.- La medición de la FENO es útil para: a. b. c. d. e.

Predecir la respuesta a esteroides.

Ajustar la dosis de medicación del paciente.

Determinar el grado de control del asma.

Predecir el riesgo futuro de exacerbaciones.

Predecir el deterioro funcional.

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12.- La FENO refleja, con mayor o menor sensibilidad: a. b. c. d. e.

La hiperreactividad bronquial.

La presencia de una obstrucción reversible.

Una infección activa.

La neutrofilia bronquial.

La eosinofilia de la inflamación bronquial.

13.- Son todas características de los equipos de quimioluminiscencia, excepto: a. b. c. d. e.

Costosos.

Portables.

Precisan un mantenimiento periódico.

Muy alta fiabilidad.

Calibración frecuente.

14.- Son todas características de los equipos electroquímicos, excepto: a. b. c. d. e.

Portátiles.

Más baratos que los de quimioluminiscencia.

Necesitan menos mantenimiento que los de quimioluminiscencia.

Precisan una calibración diaria.

Pueden ser utilizados online.

15.- Son todos inconvenientes de la medición offline de FENO, excepto: a. Posibles contaminaciones con gases no procedentes de la vía aérea. b. Error inducido por el almacenamiento de la muestra. c. Mayor complicación para la retroalimentación y evaluación instantánea de la muestra. d. Dependencia de los tiempos de respuesta del analizador. e. Posible pérdida de la muestra.

16.- Todos estos factores pueden afectar a la medición de FENO elevando su valor, excepto: a. Posibles contaminaciones con gases no procedentes de la vía aérea. b. Error inducido por el almacenamiento de la muestra. c. Mayor complicación para la retroalimentación y evaluación instantánea de la muestra. d. Dependencia de los tiempos de respuesta del analizador. e. Posible pérdida de la muestra.

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17.- No se debe hacer en una medición de FENO online: a. b. c. d. e.

Explicar la técnica al paciente.

Colocar una pinza nasal.

Pedir al paciente que realice una espiración máxima.

Hacer posteriormente una inspiración hasta TLC. Hacer un máximo de 6 maniobras.

18.- La maniobra de espiración en la que se mide la FENO online: a. b. c. d. e.

Se hace a un flujo variable.

Se hace contra una presión positiva de 30 cmH2O. Entre dos maniobras debe haber un tiempo de espera mínimo de 1 min.

Se hace a un flujo constante de 100 ml/seg.

Se precisan al menos dos maniobras con una diferencia menor del 10%.

19.- Una vez realizada la maniobra (tantas veces como sea adecuado), se procede al cálculo del valor de la FENO. A este respecto es falso: a. La gráfica presenta una primera fase de lavado seguida de una meseta que normalmente es reproducible y plana. b. En ocasiones se aprecia un pico entre la fase de lavado y meseta, que se ignora. c. La meseta debe tener una duración mínima de 3 segundos. d. La diferencia entre el punto inicial y final de la meseta no debe superar el 10%. e. El valor de FENO que finalmente se recoge es el más elevado de las diferentes maniobras.

20.- Con respecto a la interpretación de los resultados de la FENO: a. Los valores obtenidos deben ser contrastados con valores de referencia. b. La ATS coloca el punto de corte de normalidad en 50 ppb. c. Los resultados obtenidos por un analizador electroquímico son superponibles a los calculados con otro diferente. d. No se debe dar valor a maniobras de duración inferior a 12 segundos. e. Se puede calcular el componente alveolar de la FENO. Es muy útil para decidir posibles tratamientos biológicos en pacientes con asma grave.

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21.- La técnica de inducción del esputo inducido consiste en: a. b. c. d. e.

Inhalar un aerosol salino a diferentes concentraciones.

Inhalar un aerosol salino con una concentración fija.

Realizar maniobras respiratorias hasta conseguirlo.

Realizar la prueba cuando se está agudizado.

Solo se puede realizar en pacientes no colaboradores.

22.- En un paciente asmático el examen del esputo inducido facilita: a. b. c. d. e.

Diferenciar el fenotipo de inflamación.

Ajustar las dosis del tratamiento con corticoides.

Valorar la presencia de reflujo gastroesofágico.

Información complementaria sobre el cumplimiento terapéutico.

Todas las anteriores son ciertas.

23.- El nebulizador recomendado para la obtención del esputo inducido es: a. b. c. d. e.

Tipo Venturi.

Ultrasónico.

Tipo Jet. Nebulizador a chorro.

De partículas gruesas.

24.- Para realizar el proceso de obtención del esputo: a. b. c. d. e.

Puede realizarse en cualquier despacho disponible.

Se puede compartir el espacio, con cualquier otra prueba.

Es recomendable la privacidad y con una buena ventilación.

Mejor realizarlo en despachos interiores.

Es imprescindible disponer de un ordenador.

25.- Preparación del paciente para la prueba: a. No requiere preparación previa, pero si informar del procedimiento, objetivo, posibles efectos secundarios y duración de la misma. b. Imprescindible que esté 24 h sin la medicación habitual. c. Estar en ayunas de 12 h como mínimo. d. Hacer ejercicios respiratorios previos. e. Mejor no informar al paciente sobre las maniobras a realizar

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26.- Aspectos a tener en cuenta previos al procedimiento: a. b. c. d. e.

Ninguno en especial.

No importa como se encuentre el paciente, ya que es sencillo.

Deberá monitorizarse la función pulmonar.

Se administrará previo a la nebulización 200-400 μg de salbutamol.

Las respuestas c y d son ciertas.

27.- La monitorización de la función pulmonar durante el procedimiento es: a. b. c. d. e.

Fundamental para el seguimiento de la prueba.

Hay que valorar el posible descenso del FEV1.

Realizar mediciones tras las diferentes nebulizaciones.

Actuar ante la presencia de descensos del FEV1 entre el 10 y 20%.

Todas las respuestas anteriores son ciertas.

28.- Las muestras de esputo inducido deben proceder de: a. b. c. d. e.

Es imprescindible que procedan de vías aéreas bajas.

Si hay muestra suficiente no importa.

Pueden ser de vías altas y bajas.

Las vías superiores ofrecen más información.

Es necesario que sean muestras de vías altas.

29.- La técnica de expectoración debe ser: a. b. c. d.

Cada paciente realizará la técnica como pueda.

Maniobras forzadas de tos intensa y seguida.

Forzar la musculatura del cuello para lograr conseguir la muestra.

Inspiración máxima, golpe de tos con inclinación del tórax hacia delante y carraspeo posterior. e. Mejor coger el aire rápido por la nariz 30.- La desinfección del material utilizado es: a. b. c. d. e.

Como todo es desechable no precisa ningún cuidado.

Es fundamental para garantizar la ausencia de microorganismos.

Es imposible que los nebulizadores se puedan contaminar.

Mejor realizar el procedimiento a última hora.

Es suficiente lavar con agua y jabón neutro.

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31.- ¿Cuál de los siguientes no es un componente habitual del condensado del aire exhalado (CAE)? a. b. c. d. e.

Monóxido de carbono. Óxido nítrico.

Epitelio alveolar.

Agua.

Moléculas en suspensión procedentes del líquido de revestimiento del epitelio de la vía aérea.

32.- La fase acuosa del CAE proviene mayoritariamente de las vías aéreas centrales, ¿y las moléculas en suspensión? a. b. c. d. e.

De las vías aéreas centrales.

De las vías aéreas más distales.

De la hipofaringe.

De la orofaringe.

De la rinofaringe.

33.- ¿Cuál es el tamaño medio de las partículas presentes en el CAE? a. b. c. d. e.

20 µm.

10-15 µm.

5-10 µm.

0,1-5 µm. <0,1 µm.

34.- ¿Qué parámetro sirve para identificar las muestras de CAE contaminadas por saliva? a. b. c. d. e.

Amilasa.

Lipasa.

8-isoprostano.

Peróxido de hidrógeno. Óxido nítrico.

35.- Por término medio, ¿cuál es el nivel de dilución de las sustancias presentes en el CAE? a. b. c. d. e.

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< 100 veces.

100-250 veces.

250-500 veces.

500-1.000 veces.

1.000-50,000 veces.

36.- ¿Cuál de los siguientes es un marcador de dilución empleado frecuentemente en el CAE? a. b. c. d. e.

Aniones totales. pH. Albúmina.

Urea.

Creatinina.

37.- ¿Cuál de los siguientes equipos comerciales no debería considerar para la recogida del CAE? a. b. c. d. e.

EcoScreen.

Precipex.

ANACON. TurboDECCS. Rtube.

38.- De las siguientes recomendaciones previas para la recogida del CAE, ¿cuál es la correcta? a. b. c. d. e.

Se requiere premedicar al paciente para evitar un broncoespasmo.

El paciente debe estar en ayunas.

El CAE se recogerá antes de realizar una espirometría.

No se recomendará la supresión del tabaco en las horas previas.

El paciente debe permanecer al menos 45 minutos en reposo antes de recoger la muestra.

39.- ¿Cuándo se puede considerar finalizar la recogida del CAE? a. b. c. d. e.

Tras un periodo de 10 minutos.

Tras un periodo de 30 minutos.

El volumen exhalado acumulado alcanza los 100 litros.

El volumen exhalado acumulado es de 150-170 litros.

Tras un periodo de 15-20 minutos y siempre y cuando el volumen exhalado acumulado sea de 150-170 litros.

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40.- ¿Cuáles son los parámetros ventilatorios óptimos para la recogida del CAE? a. b. c. d.

Ventilación minuto de 6-8 l/min.

Ventilación minuto de 10-12 l/min.

Frecuencia respiratoria de 10-15 respiraciones/minuto.

Ventilación minuto de 6-8 l/min y frecuencia respiratoria mayor de 15 respiraciones/minuto. e. Ventilación minuto de 6-8 l/min y frecuencia respiratoria de 10-15 respiraciones/minuto.

41.- ¿Por qué la TAE puede ser un marcador de la inflamación? a. b. c. d.

La temperatura es muy sensible a los cambios fisiológicos.

Uno de los signos de la inflamación es el aumento de la temperatura.

La temperatura aumenta con las exacerbaciones del asma o la EPOC. La temperatura no tiene por qué cambiar en las enfermedades respiratorias. e. Ninguna es cierta.

42.- ¿A qué es debido el aumento de temperatura en los procesos inflamatorios? a. b. c. d. e.

A una dilatación vascular bronquial.

A un aumento del flujo sanguíneo.

A una liberación de histamina.

A la liberación de mediadores de la inflamación.

Todas las anteriores son ciertas.

43.- ¿La medición de la TAE puede verse artefactuada por la temperatura corporal? a. b. c. d. e.

Sí Solo en caso de temperaturas corporales extremas No está estudiado.

No parece que influya en la medición de la TAE. No hay datos sobre la influencia de la temperatura corporal en la TAE.

44.- ¿Cuál de las siguientes es la mayor limitación de la medición de la TAE? a. b. c. d. e.

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Falta de estandarización.

Falta de equipos comercializados para su medición.

Pocos estudios que avalen la prueba. a, b y c son ciertos.

No se conocen limitaciones.

45.- ¿A qué aspectos es sensible la medición de la TAE? a. b. c. d. e.

A la temperatura ambiental.

Al tipo de TAE que se utilice.

A la temperatura corporal del paciente.

A la hora del día en que se realice la prueba.

A la administración de corticoides.

46.- ¿Cómo podemos definir la nariz electrónica? a. Tecnología emergente no invasiva que detecta enfermedades presentes en el aire espirado. b. Equipo para cuantificar COVs en la fase gaseosa del aire espirado. c. Tecnología no invasiva para diagnosticar enfermedades respiratorias. d. Tecnología emergente no invasiva que detecta componentes volátiles orgánicos (COVs) en la fase gaseosa del aire espirado. e. Ninguna de las anteriores es cierta.

47.- La “huella olfativa” es: a. b. c. d. e.

Específica para cada individuo.

Especifica de las distintas enfermedades.

Dependiente del equipo con el que se mide.

No tiene relación con las enfermedades. a y b son ciertas.

48.- Los resultados obtenidos con la nariz electrónica: a. b. c. d.

Son resultados cuantitativos.

Son resultados cualitativos.

Son un marcador de inflamación directo.

Son un marcador de inflamación solo en el caso de enfermedades respiratorias. e. Ninguna de las anteriores es cierta.

49.- El tabaco, en la utilización de la nariz electrónica, es: a. Un elemento confusor. b. No tiene ninguna influencia sobre las mediciones con la nariz electrónica. c. Puede ayudar en el diagnóstico de las enfermedades respiratorias. d. Solo en los pacientes exfumadores puede alterar los resultados. e. Ninguna de las anteriores es cierta.

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50.- El resultado del análisis de una muestra de aire espirado se obtiene por: a. b. c. d. e.

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Cambios en las resistencias eléctricas de los sensores.

Análisis de discriminantes.

Por una regresión logística.

Todas las anteriores son ciertas.

Ninguna de las anteriores es cierta.

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Solicitada la acreditaci贸n al CCDCPS

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