Manual 40. Procedimientos técnicos de laboratorio para diagnóstico del Deficit Alfa-1 antitripsina

MANUAL

SEPAR DE PROCEDIMIENTOS

40 PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DEL DÉFICIT DE ALFA-1 ANTITRIPSINA Coordinadores:

Francisco Casas-Maldonado José Luis López-Campos

DE PROCEDIMIENTOS MANUAL SEPAR

40 PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DEL DÉFICIT DE ALFA-1 ANTITRIPSINA

Coordinadores: Francisco Casas-Maldonado José Luis López-Campos

ISBN: 978-84-124841-2-0 Editado y coordinado por RESPIRA-FUNDACIÓN ESPAÑOLA DEL PULMÓN-SEPAR en 2022.

Reservados todos los derechos. Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida ni transmitida en ninguna forma o medio alguno, electrónico o mecánico, incluyendo las fotocopias, grabaciones o cualquier sistema de recuperación de almacenaje de información, sin el permiso escrito del titular del copyright.

DE PROCEDIMIENTOS MANUAL SEPAR

COORDINACIÓN Francisco Casas-Maldonado Servicio de Neumología. Hospital Universitario Clínico San Cecilio. Granada.

Red Española de Déficit de Alfa-1 Antitripsina (REDAAT).

José Luis López-Campos Servicio de Neumología. Hospital Universitario Virgen del Rocío de Sevilla.

Red Española de Déficit de Alfa-1 Antitripsina (REDAAT).

Coordinador del Área de EPOC de SEPAR. CORRESPONDENCIA Francisco Casas-Maldonado, Servicio de Neumología. Hospital Universitario Clínico San Cecilio, Avda. de la Investigación, s/n, 18016 Granada. España. Teléfono: +34636002010.

E-mail: franciscocasas@neumosur.net AUTORES Andrea Arias García Servicio de Bioquímica. Hospital Universitario Vall d’Hebron, Barcelona.

Irene Belmonte Mula Servicio de Bioquímica. Hospital Universitario Vall d’Hebron, Barcelona.

Francisco Casas-Maldonado Servicio de Neumología. Hospital Universitario Clínico San Cecilio, Granada.

Coordinador Foro Iberolatinoamericano REDAAT de SEPAR Francisco Dasi Fernández Fundación investigación Hospital Clínico Universitario de Valencia. Instituto de Investigación Sanitaria INCLIVA. Universidad de Valencia. Facultad de Medicina. Departamento de Fisiología.

Cristina Esquinas López Servicio de Neumología. Hospital Universitario Vall d’Hebron, Barcelona.

Gestora de la Red Española de Déficit de Alfa-1 Antitripsina.

Pablo Gabriel Medina Servicio de Bioquímica. Hospital Universitario Vall d’Hebron, Barcelona

José Luis López-Campos Unidad Médico-Quirúrgica de Enfermedades Respiratorias, Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), Hospital Universitario Virgen del Rocío, Universidad de Sevilla, Sevilla.

Centro de Investigación en Red de Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Madrid.

Coordinador del Área de EPOC de SEPAR. María Magallón Serrano Fundación investigación Hospital Clínico Universitario de Valencia. Instituto de Investigación Sanitaria INCLIVA. Universidad de Valencia. Facultad de Medicina. Departamento de Fisiología.

Beatriz Martínez Delgado Departamento de Genética Molecular. Sección de Genética Humana. Instituto de Investigación en Enfermedades Raras (IIER). Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Madrid.

Nerea Matamala Zamarro Departamento de Genética Molecular. Sección de Genética Humana. Instituto de Investigación en Enfermedades Raras (IIER). Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Madrid.

Marc Miravitlles Fernández Servicio de Neumología. Hospital Universitario Vall d’Hebron, Barcelona. Representante del REDAAT EARCO. Lourdes Osaba Ortiz de Mendibil Responsable del Laboratorio de Diagnóstico Clínico Progenika Biopharma, A Grifols Company.

Francisco Rodríguez Frías Servicio de Bioquímica. Hospital Universitario Vall d’Hebron, Barcelona.

María Torres Durán Servicio de Neumología. Hospital Universitario Álvaro Cunqueiro, Vigo (Pontevedra).

Coordinadora REDAAT de SEPAR.

ÍNDICE 9 INTRODUCCIÓN José Luis López-Campos Francisco Casas-Maldonado María Torres Durán 13

Capítulo 1 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN SÉRICA DE ALFA-1 ANTITRIPSINA Irene Belmonte Mula Andrea Arias García Pablo Gabriel Medina Francisco Rodríguez-Frías 23

Capítulo 2 ESTUDIO DEL FENOTIPO Irene Belmonte Mula Cristina Esquinas López Marc Miravitlles Fernández Francisco Rodríguez-Frías 37

Capítulo 3 ESTUDIO DEL GENOTIPO Beatriz Martínez Delgado Nerea Matamala Zamarro 51

Capítulo 4

ALPHAKIT® QUICKSCREEN José Luis López-Campos

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Capítulo 5

ALPHAID® Y A1AT GENOTYPING Lourdes Osaba Ortiz de Mendibil 65

Capítulo 6 DETERMINACIÓN DEL PERFIL DE CITOQUINAS Y DEL PERFIL OXIDATIVO EN POLIMORFONUCLEARES NEUTRÓFILOS EN EL DÉFICIT DE ALFA-1 ANTITRIPSINA Francisco Dasí Fernández María Magallón Serrano 73

Cuestionario

Introducción

PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNÓSTICO DEL DÉFICIT DE ALFA-1 ANTITRIPSINA José Luis López-Campos Unidad Médico-Quirúrgica de Enfermedades Respiratorias, Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), Hospital Universitario Virgen del Rocío, Universidad de Sevilla.

Centro de Investigación en Red de Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Madrid.

Coordinador del Área EPOC de SEPAR. María Torres Durán Servicio de Neumología. Hospital Universitario Álvaro Cunqueiro, Vigo.

Coordinadora REDAAT de SEPAR. Francisco Casas-Maldonado Servicio de Neumología. Hospital Universitario Clínico San Cecilio, Granada.

Coordinador Foro Iberolatinoamericano REDAAT de SEPAR.

INTRODUCCIÓN El déficit de alfa-1-antitripsina (DAAT) es un trastorno genético autosómico que constituye una de las causas genéticas más frecuentes de enfermedad pulmonar y hepática. Las bajas concentraciones de alfa-1-antitripsina (AAT) predisponen, en sus formas graves, a la aparición de enfisema pulmonar de inicio temprano, que afecta predominantemente a las bases pulmonares. Igualmente, el acúmulo de AAT polimerizada en el hígado conduce a lesiones hepáticas que pueden ser relevantes. A pesar de que se conoce su asociación con la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y la importante carga económica y de salud que conlleva tanto para los pacientes como para el sistema sanitario, el DAAT continúa siendo una enfermedad infradiagnosticada. Además, las diversas opciones existentes para asegurar el abordaje diagnóstico suponen retos importantes a los clínicos, dado que no existe un protocolo de diagnóstico de laboratorio universalmente aceptado.

Habitualmente, el diagnóstico del DAAT se basa en la medición de niveles plasmáticos de AAT mediante nefelometría o turbidimetría. Cuando la concentración de 9

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AAT está por debajo del límite inferior establecido por cada laboratorio, el paso siguiente es realizar un isoelectroenfoque y/o una PCR (polymerase chain reaction) alelo-específica para S y Z, aunque este método no incluye alelos raros y nulos, por lo que el análisis de la secuencia de ADN de los exones codificantes del gen SerpinA1 es la técnica de referencia para el diagnóstico genético del DAAT. En casos excepcionales, puede ser necesario estudiar las secuencias intrónicas y reguladoras del gen. En la Figura 1 se expone el algoritmo diagnóstico del DAAT que actualmente recomienda la Red Española de DAAT (REDAAT), mientras que la Tabla I muestra los candidatos para determinar la concentración sérica de AAT, para que sirvan de apoyo y mejor comprensión de este documento.

Tabla I. Candidatos para determinar la concentración sérica de alfa-1 antitripsina 1. EPOC. 2. Familiares consanguíneos de enfermos con DAAT conocido.

3. Clínica de disnea y tos crónica en muchos miembros de una familia.

4. Hepatopatía de causa desconocida.

5. Ausencia del pico de alfa-1 en el proteínograma.

6. Adultos con bronquiectasias†.

7. Asma del adulto que desarrolla una obstrucción bronquial progresiva o en los que aparecen datos de enfisema pulmonar†.

8. Paniculitis neutrofílica†.

9. Poliangeítis granulomatosa†.

EPOC: enfermedad pulmonar obstructiva crónica; DAAT: déficit de alfa-1 antitripsina. † No se recomienda determinar la concentración sérica de alfa-1 antitripsina de forma sistemática. Esta recomendación podría cambiar si en el futuro se dispone de pruebas de más alta calidad. En adultos con bronquiectasias se recomienda su determinación en aquellos casos en los que se hayan descartado las causas más comunes de éstas. En adultos con asma bronquial se recomienda su determinación en aquellos pacientes que desarrollan una obstrucción bronquial progresiva o en los que aparecen datos de enfisema pulmonar.

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Capítulo 1. Determinación de la concentración sérica de Alfa-1 Antitripsina Introducción

Figura 1. Algoritmo diagnóstico del déficit de alfa-1 antitripsina (1) Estudio del paciente con DAAT y su pareja para evaluar el riesgo en la descendencia.

(2) Determinación por nefelometría. Para otras técnicas, aplique un factor de conversión.

(3) Si existe una alta sospecha clínica de DAAT, determine la concentración de AAT en situación clínica estable.

EPOC: Enfermedad pulmonar obstructiva crónica; AAT: alfa-1 antitripsina; REDAAT: Red española de déficit de alfa-1 antitripsina; PCR: proteína C-reactiva; DAAT: déficit de alfa-1 antitripsina.

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Desde el Área EPOC de la Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica (SEPAR) hemos realizado una importante apuesta por establecer colaboraciones con la REDAAT fomentando el desarrollo de proyectos de investigación e iniciativas docentes sobre esta enfermedad. Fruto de esta iniciativa, presentamos este manual de procedimientos SEPAR, cuyo objetivo es presentar una actualización práctica sobre las técnicas diagnósticas disponibles para el DAAT, así como ayudar al clínico en la puesta en marcha de estos procedimientos diagnósticos.

Los autores de este manual son expertos de reconocido prestigio en el diagnóstico del DAAT que componen un equipo multidisciplinar formado por clínicos e investigadores, expertos en sus diversas áreas de conocimiento y con una demostrada capacidad docente. Este manual detalla cómo llevar a cabo las pruebas y procedimientos relacionados con el diagnóstico del DAAT describiendo paso a paso dichas técnicas e indicando la formación necesaria para su realización y el ámbito dónde realizarlas. Por tanto, el manual permitirá al lector ponerse al día en las técnicas diagnósticas del DAAT con vistas a su puesta en funcionamiento en la práctica clínica real. Como consecuencia, el contenido de este manual es eminentemente técnico y práctico. Así, describe las diferentes metodologías que se deben seguir para una adecuada realización de las diferentes pruebas y expone las dificultades y limitaciones que presentan.

Todos los autores esperamos que este Manual de Procedimientos cumpla su objetivo y sea de utilidad, tanto para quienes no están habituados a las técnicas como para quienes las practican de forma habitual pero aún no han explotado completamente el potencial de los métodos aquí descritos. Es absolutamente necesario que el clínico tenga presente esta enfermedad y sepa abordar su cribado en poblaciones de riesgo y el procedimiento diagnóstico completo como pilares para la identificación de casos y como una oportunidad para ofrecerles un tratamiento con AAT por vía endovenosa desde fases tempranas de la enfermedad. Solo de esta manera, los pacientes con DAAT tendrán acceso al mejor diagnóstico y tratamiento posibles.

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Capítulo 1. Determinación de la concentración sérica de Alfa-1 Antitripsina

Capítulo 1

Determinación de la concentración sérica de Alfa-1 Antitripsina Irene Belmonte Mula Servicio de Bioquímica. Hospital Universitari Vall d’Hebron, Barcelona.

Andrea Arias García Servicio de Bioquímica. Hospital Universitari Vall d’Hebron, Barcelona.

Pablo Gabriel Medina Servicio de Bioquímica. Hospital Universitari Vall d’Hebron, Barcelona.

Francisco Rodríguez-Frías Servicio de Bioquímica. Hospital Universitari Vall d’Hebron, Barcelona.

1. INTRODUCCIÓN 2. FUNDAMENTOS 3. REQUERIMIENTOS 3.1. Espacio físico 3.2. Personal 3.3. Equipamiento 4. PROCEDIMIENTOS 4.1. Recomendaciones previas para la prueba y autorización del paciente 4.2. Metodología para la recogida 4.3. Procesamiento de las muestras 5. INFORME: PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Y SU INTERPRETACIÓN BIBLIOGRAFÍA

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1. INTRODUCCIÓN La determinación de la concentración sérica de AAT constituye la base del diagnóstico del DAAT. Las guías American Thoracic Society/European Respiratory Society (ATS/ERS) recomiendan testar a todos los adultos sintomáticos con obstrucción persistente de las vías aéreas, como EPOC, enfisema o asma con una obstrucción del flujo aéreo no completamente reversible, individuos con enfermedad hepática de etiología desconocida y adultos con paniculitis o vasculitis.1-2 Actualmente, la inmunonefelometría cinética es el método más utilizado, por delante de la técnica de la inmunodifusión radial, utilizada previamente en la cuantificación de esta proteína. La inmunodifusión radial ha sido sustituida por la inmunonefelometría de forma progresiva debido a la mayor precisión y sensibilidad de esta última.3 Otra técnica utilizada para la cuantificación de la AAT es la inmunoturbidimetría, la cual está siendo adaptada en los laboratorios como alternativa a la inmunonefelometría.4-5 Esta técnica, a pesar de ser menos sensible que la inmunonefelometría, presenta ventajas, como mayor rapidez de trabajo, facilidad de automatización y mejor costoefectividad. Esto es debido a que los nefelómetros son equipos únicamente dedicados a la medida de proteínas inmunoquímicas, mientras que los turbidímetros pueden estar incorporados en analizadores de bioquímica rutinarios que permiten el análisis de multitud de pruebas de diagnóstico in vitro. Ambas técnicas se basan en la formación de inmunocomplejos insolubles entre la AAT y los anticuerpos anti-AAT. En la inmunonefelometría se mide la luz dispersada por estos inmunocomplejos, mientras que en la inmunoturbidimetría se mide la luz absorbida por los mismos.

Para una buena interpretación de la determinación, cada laboratorio debe establecer previamente los valores normales de AAT en muestras procedentes de una población sana, así como los valores de referencia de la concentración de AAT de cada uno de los fenotipos/genotipos mayoritarios del área geográfica donde se realizan los estudios. Los valores normales de AAT (determinados mediante inmunonefelometría) para muestras de suero de personas adultas sanas del laboratorio de referencia del Hospital Vall d’Hebron (Barcelona) están comprendidos entre 116 y 232 mg/dL.6 La concentración sérica de la AAT también puede expresarse en unidades micromolares (μM). Las dos unidades son utilizadas a menudo indistintamente en muchos países de la Europa continental.1 La conversión a μM se realiza multiplicando por 0,1923 la concentración en mg/dL, y para convertir los μM en mg/dL hay que dividir este valor por un factor de conversión de 0,184.7 Una concentración de AAT inferior a 11 μM o 60 mg/dL (medidos por inmunonefelometría) se asocia con un incremento de riesgo 14

Capítulo 1. Determinación de la concentración sérica de Alfa-1 Antitripsina

de desarrollar patologías asociadas al DAAT grave, por lo que esta concentración se considera el valor protector.8 Las manifestaciones clínicas evidentes del DAAT no tienen lugar hasta que las concentraciones de AAT han descendido al 30-40 % de la normalidad. Los valores de AAT inferiores al 35 % de la normalidad indican posibilidad del estado homocigoto PiZZ. En el caso de la inmunoturbidimetría, al ser el método más recientemente utilizado en la cuantificación de la AAT no se han establecido valores de referencia globales, y actualmente cada laboratorio utiliza su propio factor de conversión en el caso de que los valores no sean intercambiables. Este factor de conversión se obtiene comparando los valores obtenidos mediante el método nefelométrico y el método turbidimétrico propio de cada laboratorio. En nuestro laboratorio, se comprobó la intercambiabilidad de los resultados obtenidos en la determinación de AAT entre el método de inmunonefelometría utilizado actualmente (BN II System, Siemens Healthcare Diagnostics) y un método de inmunoturbidimetría (Cobas 8000, Roche Diagnostics). Se procesaron un total de 200 muestras séricas de pacientes con concentraciones de AAT por debajo del límite inferior de la normalidad (116 mg/dL). Como se ha descrito previamente, una de las diferencias entre ambas técnicas es la sensibilidad. En este caso, el método turbidimétrico utilizado presenta un límite inferior de detección (mínima concentración medible de analito que puede distinguirse de cero) de 20 mg/ dL, mientras que el método nefelométrico presenta un límite inferior de detección de aproximadamente 0,23 mg/dL. Por ello, 6 muestras con valores inferiores a 20 mg/dL (medidos por nefelometría) fueron eliminadas del estudio.

El análisis estadístico de los resultados cuantitativos se realizó mediante el test de Passing-Bablok. Los resultados del método de inmunoturbidimetría evaluado fueron sistemáticamente inferiores al actual. Sin embargo, el estudio de correlación concluyó que ambos métodos se podrían considerar intercambiables, ya que el error sistemático del procedimiento de medida era inferior al 4 %. No obstante, en un próximo estudio se debe analizar un mayor número de muestras que cubran todo el rango de posibles valores de AAT, especialmente valores inferiores a 60 mg/dL, así como establecer unos valores de referencia de la concentración sérica de AAT obtenidos mediante inmunoturbidimetría. Por otro lado, se debe tener en cuenta que pacientes con una concentración sérica de AAT inferior a 20 mg/dL no podrán ser correctamente caracterizados mediante esta técnica de inmunoturbidimetría. Por ello, en los casos donde se haya incorporado la inmunoturbidimetría es recomendable tener en cuenta el límite inferior de detección de la técnica y mantener la posibilidad de acceder a la técnica de inmunonefelometría para estudiar los casos más graves de DAAT. 15

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Para la interpretación del resultado de una determinación cuantitativa de la AAT, independientemente del método utilizado, se ha de tener en cuenta que esta proteína es un reactante de fase aguda, por lo que su concentración aumenta en procesos inflamatorios o infecciosos, de manera que se pueden detectar valores normales o altos en pacientes con DAAT moderado. También se han descrito valores elevados de AAT durante el embarazo y después del consumo de anticonceptivos orales. Por ello, el diagnóstico del laboratorio se debe basar en los resultados de la determinación de la concentración sérica de AAT en condiciones basales y de la identificación del fenotipo y/o genotipo.9

2. FUNDAMENTOS La proteína AAT contenida en el suero reacciona inmunoquímicamente con un anticuerpo anti-AAT humana formando inmunocomplejos. Cuando las proporciones de AAT y de anticuerpo en el ensayo son óptimas, los inmunocomplejos producidos son insolubles y precipitan. En el caso de la inmunonefelometría, se hace incidir un rayo de luz de alta intensidad que es dispersado por los inmunocomplejos. La intensidad de la luz dispersada es proporcional a la cantidad de inmunocomplejos. Si la cantidad de anticuerpos permanece constante, la señal será proporcional a la cantidad de AAT presente en la muestra. El resultado se evalúa mediante la comparación con un estándar con una concentración de AAT conocida. Se genera una curva de referencia a partir de la cual se evaluará la señal de luz dispersa y con la que se podrá calcular la concentración de AAT.10 En la inmunoturbidimetría se hace incidir un rayo de luz de alta intensidad sobre la muestra, pero en este caso se mide la luz absorbida por los inmunocomplejos, siendo la intensidad de radiación trasmitida (no absorbida) inversamente proporcional a la cantidad de AAT presente en la muestra.

Como regla general, tanto los métodos nefelométricos como los turbidimétricos deben trabajar en presencia de un exceso de anticuerpos. Si hay un exceso de AAT, aumenta la disolubilidad de los inmunocomplejos, ya que se consumen todos los anticuerpos libres y no se produce la precipitación necesaria para llevar a cabo la técnica.11

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Capítulo 1. Determinación de la concentración sérica de Alfa-1 Antitripsina

3. REQUERIMIENTOS 3.1. ESPACIO FÍSICO Los instrumentos de inmunonefelometría son equipos de grandes dimensiones. La técnica inmunoturbidimétrica puede realizarse en equipos dedicados únicamente a realizar esta técnica o en analizadores de bioquímica modulares de dimensiones muy variables y con diferentes grados de automatización. Ambos tipos de equipos deben estar localizados en el mismo lugar donde se reciben las muestras. Generalmente se sitúan en los laboratorios centrales de un hospital o centro sanitario. El margen de temperatura del espacio debe estar comprendido entre 15 ºC y 32 ºC. 3.2. PERSONAL La técnica debe ser realizada por una persona con una titulación académica de técnico de laboratorio. La extracción de la muestra debe realizarla un enfermero. Los resultados deben ser validados por un facultativo especialista en bioquímica.

3.3. EQUIPAMIENTO Este apartado se centra en las características y especificaciones técnicas del equipo de imnunonefelometría, pues se trata de un equipo específico, a diferencia de los utilizados para la inmunoturbidimetría. Existen diferentes nefelómetros pertenecientes a distintas casas comerciales. Nuestro centro dispone del equipo BN II System (Siemens Healthcare Diagnostics) (Figura 2).

• Componentes del equipo Este instrumento se compone fundamentalmente de: o Analizador: Sus funciones principales son el pipeteo de muestras, la preparación de diluciones, la mezcla e incubación de los componentes y la medición. o Ordenador: Permite insertar los datos de pacientes y seleccionar menús del programa, calcular las curvas de referencia y los resultados de los ensayos, guardar e imprimir los resultados de los ensayos y comunicarlos al ordenador central del laboratorio.

• Sensibilidad del equipo: La sensibilidad analítica de la prueba se establece usando el límite inferior de la curva de referencia, por lo que depende de la concentración de AAT presente en el estándar utilizado para crear la misma. Generalmente, el límite inferior de detección utilizado es de aproximadamente 1 mg/dL, ya que du17

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rante el procesamiento de las muestras se lleva a cabo una dilución de las mismas para garantizar que el anticuerpo anti-AAT se halla en exceso respecto a la cantidad de proteína y que, por lo tanto, no se obtendrán muestras con concentraciones de AAT inferiores a este valor. Sin embargo, en situaciones en que es evidente que la concentración de la proteína será muy baja, como es el caso de los estudios de muestras de sangre seca en papel, el límite de sensibilidad se puede reducir hasta aproximadamente 0,23 mg/dL y no se realiza dilución de las muestras. No todos los sistemas disponibles en el mercado permiten este incremento de sensibilidad, por lo que, de ser necesario, se debe consultar al laboratorio sobre esta posibilidad.

Figura 2. Nefelómetro BN II System (Siemens Healthcare Diagnostics). Figura modificada de https://www.siemens-healthineers.com/plasma-protein/systems/bn-ii-system.

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Capítulo 1. Determinación de la concentración sérica de Alfa-1 Antitripsina

4. PROCEDIMIENTOS 4.1. RECOMENDACIONES PREVIAS PARA LA PRUEBA Y AUTORIZACIÓN DEL PACIENTE Como previamente se ha descrito, la proteína AAT es una proteína de fase aguda.

Por lo tanto, en el momento de la obtención de la muestra debe evitarse que el paciente esté padeciendo un proceso de inflamación, infección o situación en la que la concentración de la proteína se vea alterada. La concentración sérica de AAT es una prueba cuantitativa que no requiere consentimiento informado por parte del paciente, ya que no se trata de una muestra genética.

4.2. METODOLOGÍA PARA LA RECOGIDA El análisis debe efectuarse en muestras de suero, plasma heparinizado o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), lo más frescas posibles (conservadas entre 2 y 8 ºC durante un periodo máximo de 7 días) o congeladas a -20 ºC o -80 ºC. Las muestras congeladas deben almacenarse durante las primeras 24 horas y conservarse hasta un máximo de tres meses, evitando ciclos de congelación-descongelación. La lipemia, la hemólisis o la turbidez que algunas muestras de suero presentan después de la descongelación pueden alterar el análisis, por lo que antes de su utilización deberán ser centrifugadas durante 10 minutos a 15.000 g aproximadamente. Si no fuera así, podrían obtenerse resultados falsamente elevados. También pueden utilizarse muestras de sangre seca en papel, cuyas condiciones de procesamiento y análisis deben consultarse con el laboratorio, ya que debe realizare una adaptación de la curva de referencia utilizada. El volumen mínimo de suero o plasma necesario es de 200 μl.

4.3. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Para obtener una información más detallada sobre el procesamiento de las muestras debe consultarse el manual de instrucciones del nefelómetro, en nuestro caso, el BN II System.10 En la Tabla II se recoge el procesamiento de las muestras para la determinación de la concentración de AAT y se describen los reactivos y los pasos fundamentales.

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

Tabla II. Procesamiento de las muestras para la determinación de la concentración de AAT Reactivos 1. N antisuero para alfa-1-antitripsina humana (Siemens Healthcare Diagnostics).

2. N estándar proteínas SL humano (Siemens Healthcare Diagnostics).

3. N tampón para reacción (Siemens Healthcare Diagnostics).

4. N diluyente (Siemens Healthcare Diagnostics).

5. N/T control proteínas SL/M humano (Siemens Healthcare Diagnostics).

6. Controles Liquicheck Inmunology 1, 2 y 3 (Bio Rad).

7. Control externo establecido por la Sociedad Española de Química Clínica (SEQC).

Pasos fundamentales 1. Preparación de la curva de referencia: Las curvas de referencia se generan por calibración multipunto. Como no existe una relación lineal entre la señal de medición y la concentración de proteínas, se toman varios puntos de medición del N estándar proteínas SL a distintas diluciones de concentración conocida. Las diluciones sucesivas del N estándar de proteína SL utilizando el N diluyente son preparadas automáticamente por el equipo y se pueden generar un mínimo de cinco y un máximo de ocho grados de dilución. Estas diluciones deben utilizarse en un plazo máximo de cuatro horas. La curva de referencia obtenida se guarda en el ordenador y puede ser utilizada mientras los controles, con sus correspondientes valores objetivos, sean reproducidos dentro de su intervalo de confianza. Será necesario generar una nueva curva de referencia si se utiliza un nuevo lote de N antisuero para AAT humana.

2. Controles de calidad a. Internos: Se utilizan el N/T control de proteínas SL/M y los controles Liquicheck Inmunology 1, 2 y 3. Todos los controles presentan una concentración de AAT conocida y deben ser analizados después de establecer cada curva de referencia, cada vez que se utilice un N antisuero nuevo, así como cada vez que se analice una serie de muestras. Los controles deben ser analizados y evaluados igual que las muestras de los pacientes. Si el resultado de un control está fuera del intervalo de confianza, el análisis debe repetirse. Si la repetición confirma la desviación, es necesario establecer una nueva curva de referencia. b. Externos: Como control externo se utiliza el establecido por el Programa de Garantía Externa de la Calidad de la SEQC al que está asociado el departamento de Calidad Analítica de los Laboratorios Clínicos del Hospital Vall d’Hebrón. El control de calidad externo se debe analizar una vez al mes.

3. Creación de la lista de trabajo: En la lista de trabajo se deben incluir las identificaciones de todas las muestras que se vayan a analizar en una misma serie.

4. Medición de las muestras: Las muestras se diluyen automáticamente en una proporción 1:20 con N diluyente y se miden. Los datos se transfieren del analizador al ordenador. Una vez diluidas, las muestras deben analizarse en un plazo máximo de cuatro horas. Si los resultados obtenidos se encuentran fuera del intervalo de medición, el análisis puede repetirse utilizando una dilución mayor o menor de la muestra.

AAT: alfa-1 antitripsina 20

Capítulo 1. Determinación de la concentración sérica de Alfa-1 Antitripsina

5. INFORME: PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Y SU INTERPRETACIÓN Los datos de la medición se transfieren del analizador al sistema informático del laboratorio. Los resultados son reportados automáticamente en g/L o en la unidad elegida por el usuario; en nuestro centro, en mg/dL. Cada laboratorio debería determinar sus propios intervalos de referencia, puesto que los valores pueden variar en función de la población analizada. En el Hospital Vall d’Hebron, el intervalo de referencia está comprendido entre 116 y 232 mg/ dL. Las muestras con valores inferiores a 116 mg/dL serán consideradas deficitarias y deberán ser analizadas siguiendo el algoritmo de diagnóstico del DAAT, siempre teniendo en cuenta la historia clínica del paciente, la sintomatología clínica y otras observaciones.

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

BIBLIOGRAFÍA 1. American Thoracic Society, European Respiratory Society. American Thoracic Society/European Respiratory Society statement: standards for the diagnosis and management of individuals with alpha-1 antitrypsin deficiency. Am J Respir Crit Care Med. 2003;168(7):818-900.

2. Barrecheguren M, Monteagudo M, Simonet P, et al. Diagnosis of alpha-1 antitrypsin deficiency: a population-based study. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2016;11:999.

3. Alexander RL. Comparison of radial immunodiffusion and laser nephelometry for quantitating some serum proteins. Clin Chem. 1980;26(2):314-317.

4. Balduyck M, Chapuis Cellier C, Roche D, et al. Development of a laboratory test on dried blood spots for facilitating early diagnosis of alpha-1-antitrypsin deficiency. Ann Biol Clin (Paris). 72(6):689-704.

5. Denden S, Zorzetto M, Amri F, et al. Screening for Alpha 1 antitrypsin deficiency in Tunisian subjects with obstructive lung disease: a feasibility report. Orphanet J Rare Dis. 2009;4:12.

6. Vidal R, Miravitlles M, Jardí R, et al. Study of the frequency of different phenotypes of alpha-1-antitrypsin in a population of Barcelona. Med Clin (Barc).

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7. http://www.labpedia.net/test/319.

8. Crystal RG. Alpha 1-antitrypsin deficiency, emphysema, and liver disease. Genetic basis and strategies for therapy. J Clin Invest. 1990;85(5):1343-1352.

9. Vidal R, Blanco I, Casas F, et al. Guidelines for the diagnosis and management of alpha-1 antitrypsin deficiency. Arch Bronconeumol. 2006;42(12):645-659.

10. Siemens Healthcare Diagnostics Products. Sistema BN II - Manual de instrucciones.

11. Marmerpaul D, Hurtubise E. «Nephelometric and turbidimetric immunoassay», en Immunoassay. 1996, p. 363-387.

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Capítulo 2. Estudio del Fenotipo

Capítulo 2

Estudio del Fenotipo Irene Belmonte Mula Servicio de Bioquímica. Hospital Universitari Vall d’Hebron, Barcelona.

Cristina Esquinas López Servicio de Neumología. Hospital Universitari Vall d’Hebron, Barcelona.

Gestora de la Red Española de Déficit de Alfa-1 Antitripsina.

Marc Miravitlles Fernández Servicio de Neumología. Hospital Universitari Vall d’Hebron, Barcelona.

Director del Programa Integrado de Investigación (PII) de EPOC de SEPAR. Representante del REDAAT para EARCO. Francisco Rodríguez-Frías Servicio de Bioquímica. Hospital Universitari Vall d’Hebron, Barcelona.

1. INTRODUCCIÓN 2. FUNDAMENTOS 3. REQUERIMIENTOS 3.1. Espacio físico 3.2. Personal 3.3. Equipamiento (características y especificaciones técnicas) 4. PROCEDIMIENTOS 4.1. Recomendaciones previas para la prueba y autorización del paciente 4.2. Metodología para la recogida 4.3. Procesamiento de las muestras 5. INFORME: PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Y SU INTERPRETACIÓN BIBLIOGRAFÍA

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1. INTRODUCCIÓN El gen SERPINA1, codificante de la proteína AAT, es altamente polimórfico, con alrededor de 125 alelos identificados en la literatura. Estas variantes alélicas se clasifican como normales o deficientes, y estas últimas, a su vez, son subclasificadas como deficientes frecuentes, deficientes «raras» y deficientes nulas, en función de su frecuencia en la población y las concentraciones séricas que expresan.

En 1967, Magne Fagerhol observó que la AAT presentaba una banda polimorfa con varios patrones electroforéticos diferentes, y junto con Laurell propuso denominar al conjunto de variantes electroforéticas de la AAT sistema Pi (protease inhibitor).1 Este patrón electroforético asociado a cada variante alélica de la AAT es lo que se denomina fenotipo.

Las variantes de la AAT se designan utilizando el prefijo Pi seguido de una letra mayúscula del alfabeto, la cual dependerá de la migración electroforética de cada variante. Se tomó como referencia la variante normal y más frecuente en la población y se denominó PiM (protease inhibitor medium), por localizarse en la región central de los geles. Este alelo está presente en más del 95 % de la población caucásica y se caracteriza por presentar concentraciones séricas de AAT normales. Existen diferentes subtipos de esta variante M, denominados M1, M2, M3 y M4, que presentan patrones de migración solo distinguibles con técnicas electroforéticas de alta resolución.2 No existe una necesidad clínica de distinguir estos subtipos, que solo tienen interés antropológico o se utilizan para diferenciar entre variantes que comparten la misma sustitución aminoacídica pero están asociadas a subtipos M diferentes. Por ello, se les designa colectivamente como alelos M. Las variantes de migración más rápida y anódica se denominan con las letras A-L, y las de migración más lenta y catódica, con las letras N-Z.3 Los fenotipos deficientes más frecuentes en nuestra población son los relacionados con los alelos PiS (p.Glu264Val) y PiZ (p.Glu342Lys), y ambas presentan una migración catódica con respecto a la variante M. Actualmente, el método más ampliamente utilizado para la identificación de las variantes proteicas o fenotipos de AAT es el isoelectroenfoque. Esta técnica consiste en la separación electroforética de las proteínas, en función de su punto isoeléctrico, en un gel de agarosa y en un gradiente de pH de 4.2-4.9.2

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Capítulo 2. Estudio del Fenotipo

Cada variante tiene múltiples bandas asociadas con su patrón fenotípico, el cual depende principalmente de la secuencia de aminoácidos y, en menor grado, de la heterogenicidad de las modificaciones de las tres cadenas laterales de hidratos de carbono de la proteína. Estas bandas se denominan con el nombre de la variante seguido del número 2 (la banda más anódica), 4, 6, 7 o 8 (la banda más catódica). Las bandas con una tinción más oscura se denominan bandas mayores (4 y 6), y las de tinción más clara, bandas menores (2,7 y 8). En ocasiones, cuando las concentraciones de AAT son bajas, como es el caso de individuos con la variante PiZ, las bandas menores no se pueden visualizar4 (Figura 3).

Figura 3. Patrón de isoelectroenfoque (IEF) de los fenotipos mayoritarios de alfa-1 antitripsina (AAT). Las diferentes variantes son clasificadas alfabéticamente en función de su migración electroforética. La variante PiM migra en la parte central, las variantes anódicas se designan de la A a la L y las variantes catódicas de la N a la Z. Cada variante tiene múltiples bandas asociadas a su patrón fenotípico. Las bandas 4 y 6 son las bandas mayores y las bandas 2, 7 y 8 las menores.

Para una buena interpretación de los resultados, es necesario conocer los valores de referencia de la concentración sérica de AAT de cada uno de los fenotipos mayoritarios del área geográfica donde se realizan los estudios. Los fenotipos mayoritarios de la AAT son las diferentes combinaciones de las variantes más frecuentes en una población.

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

En nuestro caso: MM, MS, MZ, SS, SZ y ZZ. En la Tabla III se presentan los rangos de valores de AAT de referencia para los 6 fenotipos mayoritarios en nuestra población, obtenidos en un estudio realizado en el Hospital Vall d’Hebron de Barcelona.5 A la tabla original se le han añadido las combinaciones Z-Raro, Raro-Raro, Z-Nulo, RaroNulo y Nulo-Nulo,6 obtenidas de otras fuentes, para establecer comparaciones a título orientativo. En la Tabla IV se presenta un resumen de la migración de las variantes deficientes más frecuentes en la población con respecto a la variante normal PiM.

Tabla III. Fenotipos y sus respectivos rangos de concentraciones séricas de AAT medidas por nefelometría6 Fenotipo

Concentración de AAT (mg/dL)

MM

103-200

MS

100-180

SS

70-105

MZ

66-120

SZ

45-80

ZZ

10-40

Z-Raro / Raro-Raro

10-40

Z-Nulo / Raro-Nulo

10-15

Nulo-Nulo

≈0

AAT: alfa-1 antitripsina.

Tabla IV. Resumen de la migración de las variantes deficientes más frecuentes en la población con respecto a la variante normal PiM Variante

Mutación

Migración con respecto a PiM

PiS

Glu264Val

Catódica

PiZ

Glu342Lys

Catódica

PiI

Arg39Cis

Anódica

PiMmalton

Phe52del

Indistinguible

PiPlowell

Asp256Val

Catódica 26

Capítulo 2. Estudio del Fenotipo

Recientemente, se han publicado trabajos que proponen la cromatografía líquida-espectrometría de masas de alta resolución como alternativa. Esta técnica no requiere la inspección visual para la interpretación de resultados y, por tanto, reduce la posibilidad de error. Sin embargo, los equipos necesarios para esta técnica no están disponibles en muchos laboratorios y todavía no se han caracterizado la mayoría de las variantes de AAT.7-8

2. FUNDAMENTOS El procedimiento para la detección de los fenotipos de la AAT se realiza mediante inmunoelectroforesis en gel de agarosa con un gradiente de pH, seguido de una inmunofijación con un antisuero específico de la AAT. La inmunoelectroforesis consiste en la separación de proteínas en un medio donde existe una diferencia de potencial y un gradiente de pH. La región anódica (+) es ácida y la catódica (-) es alcalina. Entre ambas regiones se establece un gradiente de pH tal que las proteínas que se quieran separar tengan su punto isoeléctrico dentro de ese rango. En el caso de la AAT, se utiliza un gel de agarosa al 0,1 % y un rango de pH comprendido entre 4,2 y 4,9. La electroforesis se realiza durante aproximadamente una hora a 20 °C y aplicando un voltaje de 400 a 1500 voltios.

Las proteínas migran en el gel hasta alcanzar el pH que coincide con su punto isoeléctrico. En este punto presentan carga neta nula y, por tanto, se detienen. Una vez finalizada la migración, el gel se incuba con un antisuero específico de la AAT (contiene anticuerpos anti-AAT) conjugado con peroxidasa. Tras la incubación, se añade el sustrato de la peroxidasa junto con un reactivo que da lugar a un pigmento que permite visualizar el bandeado característico del patrón fenotípico.

3. REQUERIMIENTOS 3.1. ESPACIO FÍSICO El instrumento utilizado para realizar el estudio del fenotipo es compacto y de dimensiones más bien reducidas, por lo que puede integrarse en cualquier tipo de laboratorio.

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

3.2. PERSONAL La técnica debe ser realizada por una persona cualificada con una titulación académica de técnico de laboratorio. Los resultados deben ser validados por un facultativo especialista en bioquímica.

3.3. EQUIPAMIENTO (CARACTERÍSTICAS Y ESPECIFICACIONES TÉCNICAS) El instrumento Hydrasys System y el kit comercial Hydragel 18 AAT-Isofocusing son los más utilizados para la detección cualitativa y caracterización de los diferentes fenotipos de la AAT mediante isoelectroenfoque. Ambos pertenecen a la casa comercial Sebia (Diagnostic Department, Evry, Francia). El instrumento semiautomático Hydrasys System es un sistema que permite un tratamiento secuencial de las diferentes fases de la electroforesis en gel de agarosa: aplicación, migración, inmunofijación, coloración, decoloración y secado. Este instrumento se divide en dos módulos diferenciados: módulo de migración y módulo de tinción. La inmunoeletroforesis presenta varios pasos manuales, por lo que no es posible automatizarlo. El límite de detección de esta determinación es de 5 mg/dL.

4. PROCEDIMIENTOS 4.1. RECOMENDACIONES PREVIAS PARA LA PRUEBA Y AUTORIZACIÓN DEL PACIENTE El estudio del fenotipo de la AAT es una prueba cualitativa que nos da una idea del posible genotipo del paciente sin realizar un estudio del material genético, por lo que no se considera prueba genética y, por tanto, no requiere consentimiento informado por parte del paciente.

4.2. METODOLOGÍA PARA LA RECOGIDA El análisis debe efectuarse en muestras de suero, plasma heparinizado o EDTA, lo más frescas posibles (conservadas entre 2-8 ºC durante un periodo máximo de 7 días) o congeladas a -20 ºC o -80 ºC. Las muestras congeladas deben almacenarse durante las primeras 24 horas y conservarse hasta un máximo de tres meses, evitando ciclos de congelación-descongelación.

El volumen mínimo de suero o plasma necesario es de 10 μl.

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Capítulo 2. Estudio del Fenotipo

En esta determinación, el uso de muestras de sangre desecada en papel es inadecuado, ya que no permite identificar fenotipos pertenecientes a variantes alélicas con concentraciones séricas altamente deficitarias, como es el caso de la variante PiZ.4 4.3. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Para obtener una información más detallada sobre el procesamiento de las muestras se debe consultar el esquema de trabajo del kit comercial Hydragel 18 AAT-Isofocusing. Este kit permite analizar 180 muestras distribuidas en 10 geles de agarosa de 18 tests cada uno. En la Tabla V se describe el procesamiento de las muestras para la determinación del fenotipo, en concreto, se describe el contenido del kit, los reactivos y accesorios no suministrados con el kit y los pasos fundamentales.

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

Tabla V. Procesamiento de las muestras para la determinación del fenotipo, describiendo el contenido del Kit, los reactivos y accesorios no suministrados con el kit y los pasos fundamentales Contenido del Kit 1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

Geles de agarosa Solución de etilén-glicol Soluciones anódica y catódica Esponjas Diluyente de muestras AAT Diluyente del antisuero AAT Solución de lavado AAT .

8. Solución rehidratante 9. Solvente de TTF1 / TTF2 10. Reactivos TTF1 y TTF2 11. Aplicadores 12. Contenedores de tampón 13. Segmentos para el antisuero 14. Papeles de filtro (finos y gruesos)

Reactivos y accesorios no suministrados con el kit 1. Kit de accesorios para Hydrasys AAT Isofocusing (Ref. 1253) 4. Solución de Lavado Hydrasys 2. Antisuero anti-AAT PER (Ref. 4746) (Ref. 4541) 3. Solución decolorante (Ref. 4540) 5. Plantilla dinámica (Ref. 1255)

Pasos fundamentales 1. Preparación de la muestra: Las muestras se diluyen 1:10 con el diluyente de muestras AAT obteniendo un volumen final de 100 μl. Se recomienda no diluir las muestras con concentraciones séricas de AAT < 35% de la normalidad. No diluir los controles si son comerciales.

2. Preparación de las esponjas: Una de las esponjas se impregna con la solución anódica y la otra con la solución catódica. Las esponjas tamponadas funcionan como reservorio de tampón de electroforesis y aseguran el contacto entre el gel y los electrodos que generarán la diferencia de carga entre la parte superior e inferior del gel.

3. Dispensación: Se debe añadir 10 μl de muestra diluida en cada pocillo del aplicador. Este aplicador se coloca en una cámara húmeda durante 5 minutos para favorecer la difusión de las muestras.

4. Preparación de la migración: En el módulo de migración se coloca el gel de agarosa (utilizando la solución de etilén-glicol), las esponjas impregnadas y el aplicador con las muestras.

5. Migración: Se aplica un voltaje de 400 hasta 1500 Voltios durante aproximadamente una hora. Las proteínas de la muestra migrarán en el gel en función de su punto isoeléctrico hasta alcanzar una carga neta nula.

6. Incubación con el antisuero específico de la AAT: Se prepara una dilución del antisuero utilizando el diluyente del antisuero AAT. Una vez finalizada la migración, se extiende el antisuero por toda la superficie del gel de forma uniforme utilizando un aplicador denominado segmento para el antisuero. Este antisuero se unirá únicamente a la proteína AAT presente en la muestra y nos permitirá visualizarla en los pasos posteriores. El antisuero necesita un periodo de incubación de 10 minutos.

7. Rehidratación: Antes de la etapa de visualización, se realiza una serie de lavados del gel de agarosa utilizando la solución rehidratante y papeles de filtro.

8. Incubación con la solución de tetratiofeno (TTF): La solución TTF es el resultado de la combinación del solvente de TTF1/TTF2, los reactivos TTF1 y TTF2 y peróxido de hidrógeno (H2O2). Esta solución permitirá la visualización del bandeado que caracteriza al patrón fenotípico.

9. Secado del gel: Se retira la solución TTF y se procede al secado del gel, el cual estará expuesto a 65 °C durante 3 minutos.

10. Lavado del gel: El gel se transfiere al módulo de tinción donde es lavado con la solución decolorante y la solución de lavado para eliminar el exceso de tinción. Una vez finalizada esta etapa, el gel está listo para su lectura.

11. Control de calidad: Como control de calidad se pueden utilizar muestras de suero previamente genotipadas o controles de genotipo conocido suministrados por la casa comercial (Ref. 4771).

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Capítulo 2. Estudio del Fenotipo

5. INFORME: PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Y SU INTERPRETACIÓN Los resultados se informan como la combinación de las dos variantes alélicas que se han visualizado en el patrón fenotípico. Los resultados serán validados siempre y cuando el patrón fenotípico de los controles sea el esperado, no haya habido ningún problema que dificulte la lectura y los resultados no presenten dudas con respecto a los datos clínicos y analíticos previos (concentración sérica de AAT, fenotipo previo, historia clínica del paciente, etc.). Su interpretación se realiza mediante la inspección visual del patrón electroforético. La lectura de los resultados puede resultar difícil, por lo que requiere cierta experiencia. Por ello, es recomendable que realicen la interpretación dos personas diferentes y de manera independiente. Para facilitar la identificación de las variantes, se recomienda utilizar controles de las variantes mayoritarias en la población cuyo fenotipo haya sido confirmado mediante el estudio del genotipo o controles comercialmente disponibles.

Como previamente se ha comentado, las variantes deficientes más frecuentes en nuestra población, PiS y PiZ, presentan una migración catódica con respecto a la variante M, siendo la PiZ la variante con una migración más catódica. Esto es debido a su secuencia aminoacídica, que da lugar a una proteína con una carga neta más positiva que la variante PiM y, por tanto, un punto isoeléctrico mayor.

Dentro de las variantes raras, existe una alta frecuencia de las variantes PiI (p.Arg39Cis) y PiMmalton (p.Phe52del), seguidas de la variante PiPlowell (p.Asp256Val).9 La variante PiI causa un déficit moderado, mientras que la variante PiMmalton provoca un déficit similar al alelo Z. La variante PiPlowell causa un déficit intermedio entre las variantes PiI y PiMmalton. En el caso de la variante PiI, presenta una migración ligeramente más anódica que la variante PiM. Su banda 4 (I4) se localiza por encima de la banda 4 de la variante M (M4), y su banda I6, entre las bandas M4 y M6. Esta variante presenta una migración muy similar a la variante F. Su identificación requiere cierta experiencia, por lo que se recomienda confirmarla mediante el estudio del genotipo. La variante PiMmalton presenta un patrón fenotípico indistinguible de la variante normal PiM. A pesar de que la presencia de esta variante se puede intuir, ya que da lugar a concentraciones séricas de AAT claramente inferiores a las esperadas para una variante M, se recomienda confirmarla mediante el estudio del genotipo.10 La variante PiPlowell tiene una migración ligeramente más catódica que la variante PiM. La banda P4 se observa entre las bandas M4 y M6, y la banda P6 es inferior a la banda M6 (Figura 4). Al igual que la variante PiI, se requiere cierta

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

experiencia para detectarla, por lo que es recomendable confirmarla mediante el estudio del genotipo.

Existen algunos casos en que el estudio del fenotipo no permite un diagnóstico correcto. Las variantes nulas se caracterizan por expresar cantidades de AAT prácticamente indetectables, por lo que no podrán ser identificadas mediante esta técnica.11 Tampoco se podrán caracterizar las nuevas variantes y las variantes raras muy poco frecuentes, ya que la escasez de casos publicados imposibilita un adecuado conocimiento de su fenotipo.

Por otro lado, se ha de tener en cuenta que los pacientes con tratamiento de reposición han sido tratados con AAT purificada de plasma de donantes humanos con genotipo MM, por lo que el fenotipo será una combinación del fenotipo del paciente y del donante. De esta forma, un paciente ZZ presentaría un fenotipo MZ. De forma similar, pueden producirse errores cuando se realiza el estudio de fenotipo a individuos que hayan recibido una transfusión sanguínea reciente o un trasplante hepático, ya que el fenotipo del donante también aparecería. Por ejemplo, un paciente previamente caracterizado como ZZ que recibe un trasplante de hígado de un donante MM pasará a tener un fenotipo MM. Sin embargo, si se analiza su genotipo en sangre periférica este seguirá siendo ZZ, pues las células sanguíneas siguen siendo del receptor y, por lo tanto, del genotipo propio del mismo.

En esta determinación, se debe considerar que hay una serie de variantes alélicas poco frecuentes, como PiMmalton (comentada previamente), PiMduarte o PiMheerlen,12 entre otras, que presentan un punto isoeléctrico similar al alelo normal PiM, y por esta razón no pueden ser caracterizadas mediante la determinación del fenotipo (Figura 4).

Como se ha comentado previamente, a cada fenotipo le corresponde un rango determinado de valores de concentración sérica de AAT. Por ello, en los casos en que no haya concordancia entre estas dos determinaciones se debe realizar la caracterización molecular del gen codificante de la AAT o estudio del genotipo.

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Capítulo 2. Estudio del Fenotipo

Figura 4. Fenotipos y sus respectivos valores de concentración sérica de alfa-1 antitripsina (AAT) medidos por nefelometría. Cada carril corresponde a un individuo diferente. En los carriles 1-7 el fenotipo concuerda con la concentración sérica de AAT obtenida. Sin embargo, en los carriles 8 y 9 se observa un patrón fenotípico normal MM algo tenue, pero concentración sérica de AAT deficitaria. Estas muestras fueron caracterizadas como M/Mmalton y M/ QOmattawa6. En los carriles 1,3 6 y 7 se puede observar la diferencia de migración entre las variantes Pi M, Pi S, Pi Z y Pi Plowell.

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

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10. Belmonte I, Montoto L, Miravitlles M, et al. Rapid detection of Mmalton α1-antitrypsin deficiency allele by real-time PCR and melting curves in whole blood,

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Capítulo 2. Estudio del Fenotipo

11. Carroll TP, Connor CAO, Reeves EP, Mcelvaney NG. «Alpha-1 Antitrypsin Deficiency – A Genetic Risk Factor for COPD», en Chronic Obstructive Pulmonary Disease - Current Concepts and Practice. InTech; 2012:179-198.

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

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Capítulo 3. Estudio del Genotipo

Capítulo 3

Estudio del Genotipo Beatriz Martínez Delgado Departamento de Genética Molecular. Sección de Genética Humana.

Instituto de Investigación en Enfermedades Raras (IIER). Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Madrid.

Nerea Matamala Zamarro Departamento de Genética Molecular. Sección de Genética Humana.

Instituto de Investigación en Enfermedades Raras (IIER). Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Madrid.

1. INTRODUCCIÓN 2. FUNDAMENTOS 3. REQUERIMIENTOS 3.1. Espacio físico 3.2. Personal 3.3. Equipamiento (características y especificaciones técnicas) 4. PROCEDIMIENTOS 4.1. Consentimiento informado 4.2. Aislamiento del ADN 4.3. Cuantificación del ADN 4.4. Genotipado de alelos S y Z 4.5. Secuenciación de exones codificantes del gen SERPINA1 5. INFORME: PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Y SU INTERPRETACIÓN 5.1. Resultados genotipado de alelos S y Z 5.2. Resultados secuenciación de exones del gen SERPINA1 BIBLIOGRAFÍA

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

1. INTRODUCCIÓN La AAT humana está codificada por el gen SERPINA1, localizado en la región 14q3132,3 del extremo distal del cromosoma 14. Este gen está constituido por siete exones, tres no codificantes (IA, IB, IC), cuatro que codifican la información para sintetizar la proteína (II, III, IV y V) y seis intrones intercalados.1-2 El gen de la AAT posee dos alelos que se transmiten por herencia mendeliana autosómica y codominante.1 La gran mayoría de genotipos que se encuentran en la práctica clínica resultan de combinaciones entre el alelo normal M y los deficientes más frecuentes en nuestra población, que se denominan S y Z. El genotipo normal PiMM está presente en aproximadamente el 80-95 % de los sujetos y expresa el 100 % de AAT sérica. Los cinco genotipos deficientes, PiMS, PiSS, PiMZ, PiSZ y PiZZ, están presentes en prácticamente el 5-20 % restante de la población, y expresan aproximadamente un 80, 60, 55, 40 y 15% de AAT sérica, respectivamente.3 Existe, además, una gran variedad de alelos deficientes más raros (por ejemplo, Mmalton, Mprocida, etc.) que expresan niveles disminuidos de AAT, en algunos casos similar al alelo Z, y por último los alelos nulos que expresan cantidades indetectables (<1 %).4-5 El genotipado puede distinguir entre los alelos de AAT a nivel del ADN. El enfoque genético inicial y más común en muchos laboratorios se basa en determinar la presencia de los alelos más frecuentes PiS y PiZ mediante pruebas específicas utilizando técnicas de detección aleloespecíficas.6-7 Sin embargo, estos métodos de genotipado rápido pueden ser incompletos y podrían conducir fácilmente a un diagnóstico erróneo, ya que se descartan los alelos más raros y nulos en el establecimiento del genotipo. Por otro lado, está la secuenciación directa del gen SERPINA1, que es el método de referencia para identificar cualquier variante alélica rara asociada al DAAT, así como para caracterizar nuevas variantes. También es el método más apropiado para identificar variantes nulas. Esta determinación requiere un análisis completo de la secuencia de los cuatro exones codificantes del gen, aunque en casos particularmente raros también se deben secuenciar secuencias intrónicas y reguladoras.

2. FUNDAMENTOS Tras la determinación de los niveles de AAT en el suero, es importante saber qué variantes genéticas son las causantes del déficit. El gen de la AAT es un gen muy po38

Capítulo 3. Estudio del Genotipo

limórfico con más de 125 variantes diferentes descritas. La gran mayoría de estas variantes son debidas al cambio de una base en la secuencia del ADN, lo que se traduce en la sustitución de un aminoácido por otro en la proteína. Otras mutaciones suponen pequeñas deleciones e inserciones y cambios en secuencias reguladoras del gen.

3. REQUERIMIENTOS 3.1. ESPACIO FÍSICO Las pruebas de genotipado se llevan a cabo en laboratorios de biología molecular provistos del equipamiento técnico necesario y las medidas de seguridad y protección para la manipulación de muestras biológicas. Es recomendable que en el laboratorio de diagnóstico genético haya dos áreas de trabajo, una dedicada exclusivamente a todos los procesos previos a la realización de PCR (área pre-PCR) y otra a todos los procesos posteriores a la realización de PCR (área post-PCR), pues ayuda a evitar contaminaciones en el proceso de amplificación.

3.2. PERSONAL Las pruebas deben ser realizadas por personal técnicamente cualificado para la realización e interpretación de los resultados. Este procedimiento no comporta riesgo biológico significativo para el personal de laboratorio. En este caso, las medidas de seguridad serán para evitar las contaminaciones con productos de PCR. 3.3. EQUIPAMIENTO (CARACTERÍSTICAS Y ESPECIFICACIONES TÉCNICAS) En la Tabla VI se describe el equipamiento y los materiales para la determinación de los alelos S y Z y del genotipo mediante secuenciación de los exones del gen SERPINA1, así como los primers específicos para la amplificación de los exones codificantes del gen SERPINA1.

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

Tabla VI. Equipamiento y materiales para determinación del genotipo específico de los alelos S y Z y del genotipo mediante secuenciación de los exones del gen SERPINA1 Equipamiento 1. Bata.

2. Guantes de látex o nitrilo.

3. Máquina de hielo.

4. Cabina de seguridad biológica.

5. Congeladores/neveras.

6. Agitador tipo vortex.

7. Bloque térmico.

8. Nanodrop (espectrofotómetro).

9. Microcentrífuga.

10. Termocicladores.

11. Termociclador LightCycler 4.05 (determinación de alelos S y Z).

12. Fuentes de electroforesis.

13. Cubetas de electroforesis.

14. Fotodocumentador de geles.

15. Secuenciador automático (ABI PRISM 377 Applied BioSystems).

16. Micropipetas mecánicas de volúmenes variables: 0,5-2, 2-10, 2-20, 20-100, 20-200 y 200-1000 μl (reservadas para la preparación de alícuotas de ADN y las reacciones de PCR).

17. Tubos tipo eppendorf de 1,5 autoclavados.

18. Puntas de pipeta de 10, 20, 100, 200 y 1000 μl con filtro.

Reactivos 1. Reactivos específicos para la determinación de alelos S y Z: Uno de los métodos más empleados para la detección de alelos S y Z es la utilización de sondas fluorescentes específicas que reconocen estos alelos y la determinación de su presencia o no mediante curvas de melting (desnaturalización). El laboratorio de diagnóstico genético del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) realiza esta determinación mediante el kit comercial LightMix in vitro diagnostics kits Alpha1-Antitrypsin PiS and PiZ (Roche).

2. Reactivos para la secuenciación de los exones del gen: - Primers específicos para cada uno de los exones codificantes analizados: - Taq polimerasa - Buffer 10X - MgCl2 (25 mM) - dNTPs (2’-deoxynucleoside 5’-triphosphate 10 mM) contiene los cuatro nucleótidos (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), cada uno a una concentración de 10 mM, para ser usados en la PCR. - H2O estéril EXON

Secuencia primer Forward (5’-3’)

Secuencia primer Reverse (5’-3’)

Tamaño amplicón (pb)

Exón 2 Exón 3 Exón 4 Exón 5

ACGTGGTGTCAATCCCTGATCACTG CTTCCAAACCTTCACTCACCCCTGGT CACTTGCACTGTGGTGGGTCCCAG GAGCCTTGCTCGAGGCCTGGGATC

TATGGGAACAGCTCAGGCTGG AGGTGTGGGCAGCTTCTTGGTCA TTCTTCCCTACAGATACCAGGG CAGAGAAAACATGGGAGGGATTTACA

764 365 273 372

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Capítulo 3. Estudio del Genotipo

4. PROCEDIMIENTOS 4.1. CONSENTIMIENTO INFORMADO Para cualquier estudio genético, es necesario obtener previamente el consentimiento informado de los pacientes.

4.2. AISLAMIENTO DEL ADN Las fuentes más frecuentes de extracción del ADN en el estudio del DAAT son sangre periférica total (extraída en tubos con anticoagulante EDTA) y sangre seca. En la Tabla VII se describe el procedimiento de extracción de ADN a partir de gota seca y de sangre total. Existen numerosos protocolos de extracción de ADN de sangre. Lo más común es utilizar kits comerciales basados en columnas de sílice. El laboratorio del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) sigue el protocolo de extracción del kit QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen).

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

Tabla VII. Procedimiento de extracción de ADN a partir de gota seca y de sangre total Extracción de ADN a partir de gota seca 1. Cortar 2 discos de las muestras de gota seca de sangre periférica con un sacabocados de 7 mm de diámetro. Se pondrán en un eppendorf de 1.5 ml con unas pinzas. Entre el corte de dos muestras diferentes se realizarán 3 cortes en un papel whattman para limpiar el sacabocados.

2. Preparar en un tubo eppendorf un disco de papel whattman sin muestra como control negativo del corte.

3. Se colocará/n el/los disco/s dentro de un eppendorf de 1.5 ml.

4. Añadir 1 ml de NaCl 10 mM/EDTA 10 mM (solución de lavado) a cada una de las muestras.

5. Incubar en agitación de 15 a 20 minutos a temperatura ambiente (nunca más de 30 min) en un termobloque a 1400 rpm o en un vortex con adaptador para tubos eppendorf.

6. Retirar con pipeta p1000 la solución de lavado.

7. Repetir el lavado.

8. Llegados a este punto la mayoría de pigmento se habrá retirado del disco. De no ser así se podría repetir el lavado siempre y cuando la muestra no sea escasa.

9. Dar un spin para extraer al máximo la solución de lavado del disco y retirar la solución con una pipeta P200.

10. Añadir 150 μl de NaOH 50 mM a cada eppendorf.

11. Mezclar con cuidado dando toques con los dedos.

12. Incubar 10 minutos en un termobloque a 99ºC/ 100ºC sin agitación.

13. Dar un spin para extraer al máximo la solución NaOH 50 mM del disco.

14. Añadir 30 μl de Tris-base/HCL 1M pH 7.5 para neutralizar.

15. Mezclar con cuidado dando toques con los dedos.

16. Añadir 420 μl de H2O (grado biología molecular) quedando un volumen total de 600 μl.

17. Mezclar con cuidado dando toques con los dedos.

18. Recoger el sobrenadante y transferir a un eppendorf nuevo de 1.5ml.

Extracción de ADN a partir de sangre total 1. Transferir 3 ml de sangre a un tubo cónico de 15 ml con la ayuda de las pipetas pasteur de plástico y añadir 3 volúmenes del buffer de lisis de eritrocitos (9 ml lisis de eritrocitos por cada 3 ml de sangre). Si no se dispone de 3 ml de sangre periférica se completará con PBS hasta 3 ml. Mezclar bien invirtiendo el tubo. Incubar 10-20 minutos a temperatura ambiente, invirtiendo ocasionalmente.

2. Centrifugar a 400 g durante 10 minutos a temperatura ambiente.

3. Eliminar el sobrenadante por decantación o con ayuda de una pipeta pasteur de plástico. Resuspender el precipitado en 1 ml de PBS con la ayuda de una pipeta pasteur de plástico y pasar a un nuevo tubo eppendorf de 1,5 ml convenientemente rotulado.

4. Centrifugar a 10.000 g durante 1 minuto a temperatura ambiente.

5. Eliminar el sobrenadante con la ayuda de una pipeta y añadir 180 μl de PBS. Resuspender bien con la micropipeta de 200 μl destinada a la extracción de ADN. 6. Calentar el bloque térmico a 56ºC. 7. Añadir 20 μl de QIAGEN proteinasa K (o proteinase K 20 mg/ml). Vortear 5 segundos y centrifugar brevemente.

8. Añadir 200 μl de Buffer AL. Vortear fuerte 15 segundos.

9. Incubar 30 minutos a 56ºC en el bloque térmico con agitación suave (300 rpm). Centrifugar brevemente.

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10. Añadir 200 μl de etanol absoluto a temperatura ambiente. Vortear fuerte 15 segundos. Centrifugar brevemente.

11. Rotular la columna Qiagen con el número de muestra, cargarla con el lisado que puede presentar un aspecto gelatinoso (aproximadamente 600 μl) y centrifugar a 10.000 g 1 minuto. Desechar el eluido y cambiar la columna a un tubo nuevo de 2 ml.

12. Añadir a la columna 500 μl de Buffer AW1. Centrifugar a 10.000 g 1 minuto. Desechar el eluido y cambiar la columna a un tubo nuevo.

13. Añadir 500 μl de Buffer AW2. Centrifugar a 10.000 g 3 minutos. Desechar el eluido y cambiar a un nuevo tubo la columna.

14. Centrifugar a 10.000 g 1 minuto para secar la columna totalmente.

15. Colocar la columna en un tubo de 1,5 ml convenientemente rotulado.

16. Añadir 200 μl de buffer AE. 17. Incubar la columna 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar 10.000 g 1 minuto.

18. Volver a cargar el eluido sobre la misma columna.

Incubar la columna 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar 10.000 g 1 minuto.

Capítulo 3. Estudio del Genotipo

4.3. CUANTIFICACIÓN DEL ADN La concentración del ADN purificado se cuantifica mediante espectrofotometría UV. La concentración de una muestra de ADN puede ser determinada fácilmente mediante la obtención del valor de absorbancia a 260 nm según la siguiente fórmula: ADN (μg/ml) = Absorbancia 260 x 50 x factor de dilución.

El valor de absorbancia a 280 nm nos da una idea de la presencia de proteínas contaminantes en el ADN purificado. Un ADN puro tiene una ratio 260/280 = 1,8- 2,0.

En la actualidad existen varios espectrofotómetros que realizan estos cálculos automáticamente.

La integridad del ADN se determinará mediante electroforesis en gel de agarosa en relación a un patrón de peso molecular. El ADN genómico humano es un ADN de elevado peso molecular. Por lo tanto, un ADN genómico íntegro aparecerá como una banda más o menos compacta de alto peso molecular en un gel de agarosa.

Finalmente, el ADN se diluye con H2O (grado biología molecular) para ser utilizado en los análisis posteriores.

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

4.4. GENOTIPADO DE ALELOS S Y Z El material y procedimiento para los alelos S y Z se describen en la Tabla VIII.

Tabla VIII. Material y procedimiento para la determinación del genotipo para los alelos S y Z Material Sondas y reactivos contenidos en el Kit LightMix in vitro diagnostics kits Alpha1-Antitrypsin PiS and PiZ (Roche)

Procedimiento 1. Tener disponibles los controles positivos (PiS, PiZ) y un control negativo.

2. Preparar la mezcla de reacción con los reactivos del Kit LightMix in vitro diagnostics kits Alpha1-Antitrypsin PiS and PiZ en hielo y en tubos eppendorf opacos de 1.5 ml y seguir las indicaciones del kit. Calcular un tubo más por los errores de pipeteo.

3. Preparar el bloque frío con los adaptadores de los capilares.

4. Preparar las muestras de ADN (dilución de trabajo a 10 ng/μl). Mantener en hielo.

5. Colocar tantos capilares como número de muestras haya.

6. Añadir 8 μl de la mezcla de reacción anteriormente preparada en cada capilar, colocando la punta al fondo del capilar.

7. Añadir 2 μl de ADN (dilución a 10 ng/μl) de cada una de las muestras colocando la punta al fondo del capilar y tapar el capilar con su correspondiente tapón.

8. Dar un pulso a 1.200 rpm a los capilares con sus adaptadores.

9. Comprobar que el mix ha bajado al fondo del capilar.

10. Poner las muestras en el equipo de PCR Lightcycler en las condiciones especificadas por el fabricante.

11. Una vez acabada la reacción analizar según el protocolo de análisis de curvas de Melting del LightCycler.

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Capítulo 3. Estudio del Genotipo

4.5. SECUENCIACIÓN DE EXONES CODIFICANTES DEL GEN SERPINA1 El procedimiento para su secuenciación se describe en la Tabla IX. Tabla IX. Procedimiento para la secuenciación de los exones codificantes del gen SERPINA1 1. Amplificación de cada uno de los exones del gen mediante PCR, según las siguientes las condiciones: Reactivos

Cantidad (μl)

ADN Buffer 10X MgCl2 (25mM) DNTPs (10 mM) Primer F Primer R Taq pol H2O Total

3 2,5 1,5 0,5 0,5 0,5 0,25 11,25 20

2. Además del ADN de las muestras a analizar se pondrá en cada reacción un control negativo (reactivos sin ADN) para controlar posibles contaminaciones.

3. Colocar los tubos en el termociclador y seguir los siguientes programas dependiendo de los exones a secuenciar: Tiempo

Nº Ciclos

EXON 2

EXON 3

EXONES 4-5

10 min.

1

94 ºC

94 ºC

94 ºC

94 ºC

94 ºC

94 ºC

65ºC

62ºC

60ºC

72ºC

72ºC

72ºC

1

72ºC

72ºC

72ºC

1

4ºC

4ºC

4ºC

30˝ 30˝

x 35

30˝ 5 min.

4. Proceder a evaluar los productos de PCR mediante electroforesis en geles de agarosa al 2 % en TBE 1x, junto con un marcador de peso molecular (100 pb ladder).

5. Antes de secuenciar es necesario realizar una purificación enzimática del producto de PCR. Para ello, deberemos tratar el producto de PCR con Exonucleasa I y SAP. El tratamiento con exonucleasa I degrada los primers de PCR residuales mientras que la SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) defosforila los dNTPs restantes. Tras la inactivación por calor de ambas enzimas puede utilizarse el producto de PCR para secuenciación automática.

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

5. INFORME: PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Y SU INTERPRETACIÓN 5.1. RESULTADOS GENOTIPADO DE ALELOS S Y Z El resultado se basa en que si en una muestra está presente una variante genética, esta producirá una variación en la temperatura de melting del producto amplificado. Para el alelo S, se analiza la señal emitida a 530 nm, y para el alelo Z, a 640 nm. Para cada muestra, se analizará la señal de los alelos S y Z. El genotipo será el resultado de la interpretación de ambas.

En la Figura 5 se representa el patrón de curvas de melting para el alelo S (530 nm), y en la Figura 6 se representa el patrón de curvas de melting para el alelo Z (640 nm).

Figura 5. Patrón de curvas de melting para el alelo S (530 nm).

Azul: curva de melting si no está presente el alelo S. Verde: curva de melting si solo está presente el alelo S. Gris: curva de melting con dos picos si está presente el alelo normal y el alelo S. Rojo: control negativo.

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Capítulo 3. Estudio del Genotipo

Figura 6. Patrón de curvas de melting para el alelo Z (640 nm).

Azul: curva de melting si solo está presente el alelo Z. Verde: curva de melting si no está presente el alelo Z. Gris: curva de melting con dos picos si está presente el alelo normal y el alelo Z. Rojo: control negativo.

Control Negativo: La curva del análisis del Control Negativo debe dar un resultado negativo (sin picos). En caso de que se observen uno o varios picos, se ha producido una contaminación, el ensayo no es válido y el procedimiento debe repetirse.

Muestra con genotipo MM tendrá: Un pico en el canal 530 nm, a 50 °C ± 2,5 °C Un pico en canal de 640 nm, a 62 °C ± 2,5 °C Muestra con genotipo MS tendrá: Dos picos en el canal 530 nm, uno a 50 °C ± 2,5 °C y otro a 56 °C ± 2,5 °C Un pico en canal de 640 nm, a 62 °C ± 2,5 °C Muestra con genotipo MZ tendrá: Un pico en el canal 530 nm, a 50 °C ± 2,5 °C Dos picos en el canal 640 nm, uno a 55 °C ± 2,5 °C y otro a 62 °C ± 2,5 °C Muestra con genotipo SZ tendrá: Dos picos en el canal 530 nm, uno a 50 °C ± 2,5 °C y otro a 56 °C ± 2,5 °C Dos picos en el canal 640 nm, uno a 55 °C ± 2,5 °C y otro a 62 °C ± 2,5 °C

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

Muestra con genotipo SS tendrá: Un pico en el canal 530 nm, a 56 °C ± 2,5 °C Un pico en canal de 640 nm, a 62 °C ± 2,5 °C Muestra con genotipo ZZ tendrá: Un pico en el canal 530 nm a 50 °C ± 2,5 °C Un pico en el canal 640 nm a 55 °C ± 2,5 °C 5.2. RESULTADOS SECUENCIACIÓN DE EXONES DEL GEN SERPINA1 El resultado se basa en el análisis de los cromatogramas obtenidos de la secuenciación Sanger de los fragmentos amplificados de cada uno de los exones. Los archivos de secuencia pueden abrirse con distintos programas dependiendo del ordenador.

Estos programas se pueden descargar gratuitamente de los sitios web. Algunos de los más usados son Chromas, BioEdit o Sequence Scanner Software.

Para analizar la secuencia obtenida para cada exón, hay que compararla con la secuencia de referencia del gen SERPINA1 (NM_000295.4). Cualquier variación frente a la secuencia de referencia puede suponer la presencia de una mutación, ya sea una mutación puntual de un nucleótido o bien pequeñas deleciones o inserciones que pueden dar lugar a alelos deficientes de AAT. En la Figura 7 se representa el cromatograma correspondiente, además de la secuencia del exón 5, que muestra un doble pico que indica la presencia de la variante Z en heterocigosis. En la Figura 8 se representa el cromatograma correspondiente a parte de la secuencia del exón 2, que muestra un solapamiento de secuencias producido por una deleción de tres bases que se corresponde con el alelo Mmalton en heterocigosis.

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Capítulo 3. Estudio del Genotipo

Figura 7. Cromatograma correspondiente a parte de la secuencia del exón 5, que muestra un doble pico que indica la presencia de la variante Z en heterocigosis

Figura 8. Cromatograma correspondiente a parte de la secuencia del exón 2, que muestra un solapamiento de secuencias producido por una deleción de tres bases que se corresponde con el alelo Mmalton en heterocigosis

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

BIBLIOGRAFÍA 1. Long GL, Chandra T, Woo SLC, Davie EW, Kurachi K. Complete sequence of the cDNA for human alpha-1-antitrypsin and the gene for the S variant. Biochemistry. 1984;23:4828-4837.

2. Blanco I, Matamala N, Martínez-Delgado B. «Alfa-1 antitripsina: estructura, gen, funciones, herencia y nomenclatura», en Blanco I, Lara B (coord..) Déficit de Alfa1 antitripsina: fisiopatología, enfermedades relacionadas, diagnóstico y tratamiento, 2ª edición. Editorial Respira, SEPAR. Barcelona, 2016;41-74.

3. Blanco I. «Alpha-1 Antitrypsin Gene, Genetic Heritage, Phenotypes, and Genotypes», en Blanco’s Overview of Alpha-1 Antitrypsin Deficiency, Academic Press, 2017, p. 39-49.

4. Brantly M. «Alpha 1-antititrypsin Genotypes and Phenotypes», en Crystal RG (ed.) Alpha1-antitrypsin deficiency, Nueva York, Marcel Dekker, 1996, p. 45-59.

5. Salahuddin P. Genetic variants of alpha1-antitrypsin. CurrProteinPeptSci. 2010; 11:101-117.

6. Von Ahsen N, Oellerich M, Schütz E. Use of two reporter dyes without interference in a single tube rapid-cycle PCR: 1-antitrypsin genotyping by multiplex realtime fluorescence PCR with the LightCycler. Clin Chem. 2000;46:156-161.

7. Braun A, Meyer P, Cleve H, Roscher A. Rapid and simple diagnosis of the two common 1-proteinase inhibitor deficiency alleles Pi*Z and Pi*S by DNA analysis.

Eur J Clin Chem Clin Biochem.1996;34:761-764.

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Capítulo 4. Alphakit® Quickscreen

Capítulo 4

Alphakit® Quickscreen José Luis López-Campos Unidad Médico-Quirúrgica de Enfermedades Respiratorias, Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBIS), Hospital Universitario Virgen del Rocío, Universidad de Sevilla.

Centro de Investigación en Red de Enfermedades Respiratorias (CIBERES), Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Madrid.

1. INTRODUCCIÓN 2. FUNDAMENTOS 3. REQUERIMIENTOS 4. PROCEDIMIENTOS 5. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN BIBLIOGRAFÍA

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

1. INTRODUCCIÓN AlphaKit® QuickScreen (Grifols, Barcelona, España) es una prueba de detección cualitativa inmunocromatográfica in vitro, desarrollada para la detección de proteína Z en sangre completa capilar. El dispositivo se basa en la tecnología de flujo lateral, que consigue resultados entre 15 y 30 minutos, por lo que puede ser usado en el mismo momento de la visita clínica.1 El dispositivo tiene marcado CE.

2. FUNDAMENTOS El kit contiene dos variantes de un anticuerpo monoclonal contra la proteína Z-AAT. Un anticuerpo detector etiquetado con oro y un anticuerpo de captura que está inmovilizado en la superficie de la tira de prueba. La muestra de sangre, junto con el tampón, libera el anticuerpo detector fuera de su matriz. Si la muestra examinada contiene la proteína Z-AAT, el anticuerpo detector forma un complejo con la proteína Z. Este complejo se mueve a lo largo de la tira reactiva por acción capilar. En dicha tira, en la posición marcada como «Z-AAT» se localiza el anticuerpo de captura que se une al complejo formado que se visualizará como una banda roja, que será más intensa cuanto mayor sea la concentración de Z-AAT. Si la muestra no contiene Z-AAT, no se podrá formar el complejo y, por lo tanto, no aparecerá ninguna banda en dicha posición. El exceso de anticuerpos marcados con oro se une en la banda de control (Figura 9), lo que indica que la cromatografía funcionó correctamente.

Figura 9. AlphaKit® QuickScreen

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Capítulo 4. Alphakit® Quickscreen

3. REQUERIMIENTOS La prueba está diseñada para uso exclusivo de profesionales de la salud cualificados.

Todo el material que contiene el kit es de un solo uso. Cada unidad contiene 1 casete de test, 1 lanceta estéril, 2 pipetas de 30 μL y 1 botella con cuentagotas con el tampón que contiene 0,1 % ProClin® 300. Además, es necesario disponer de un desinfectante y un cronómetro o temporizador para medir el tiempo, no incluidos en el kit.

Este dispositivo tiene fecha de caducidad (impresa en el envase). El principal requerimiento del dispositivo es que debe conservarse en frío, entre 2 y 8 ºC, pero se utiliza a temperatura ambiente. No es necesario esperar un tiempo mínimo a temperatura ambiente para usarlo, pero una vez está fuera del frigorífico debe utilizarse antes de 8 horas.

4. PROCEDIMIENTOS El procedimiento es bastante sencillo. Tras desinfectar el dedo y punzarlo con la lanceta, se toma la muestra de sangre con la pipeta, que se deposita en la ventana marcada con la letra S (Figura 9). La pipeta se llenará ella misma automáticamente por fuerzas capilares, por lo que no se deberá apretar el tubo mientras se está tomando la muestra. La segunda pipeta es de recambio para posibles incidentes. Para expulsar la muestra, se debe alinear la punta del tubo con el lugar de aplicación y apretar el bulbo de la pipeta. Después de esperar 1-2 min, se aplican 3 gotas de tampón en la misma ventana. Pasados 15 minutos, podremos leer el resultado del test bajo una luz brillante. Se debe evitar presionar sobre el casete durante el tiempo de espera.

Los resultados solo pueden ser evaluados entre 15 y 30 minutos después de que el tampón de ensayo haya sido aplicado.

5. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN Después de realizar el test, siempre debe aparecer una banda roja a la altura del control. Además, si la muestra contiene la proteína Z, en la ventana de resultado aparecerá una segunda banda roja (banda Z-AAT). La señal Z-AAT será positiva para todos los portadores del alelo Z, independientemente de si el sujeto es heterocigoto u homocigoto para este gen. Dependiendo de la concentración de Z-AAT dentro de la muestra, la intensidad de la banda en la posición «Z-AAT» puede variar, pero esta banda suele ser más tenue que la de control. Un resultado negativo excluiría 53

Manual de Procedimientos SEPAR 40

la presencia de la proteína Z. Un resultado positivo indicaría la presencia de esta proteína y obligaría a genotipar al sujeto. El AlphaKit® QuickScreenno no determina el genotipo de AAT, ni tampoco detecta otras proteínas AAT anormales o ausentes.

Los pacientes en tratamiento de reemplazo con AAT pueden dar falsos resultados. El test debe repetirse utilizando otro dispositivo si no aparece la banda de control o si después de 15 minutos hay manchas visibles en la ventana de visualización.

El perfil diagnóstico ha sido estudiado recientemente.2 La evaluación de la capacidad de la prueba para detectar la proteína Z presentó: especificidad del 97,8 %, sensibilidad del 73,8 %, valor predictivo negativo del 98,9 % y valor predictivo positivo del 58,5 %. El valor predictivo positivo indica claramente que es absolutamente obligatorio realizar pruebas adicionales (genotipado/fenotipado) para confirmar un resultado positivo. Por otro lado, todos los falsos negativos (n = 11) eran muestras de Pi*MZ heterocigotas, pero estos falsos negativos aumentaban en poblaciones de alto riesgo de padecer el DAAT. Los autores concluyen que el dispositivo puede usarse como una herramienta adecuada para excluir DAAT en atención primaria y en la población con EPOC en general, excepto en pacientes con una alta probabilidad a priori de DAAT. A pesar de que este dispositivo permite un análisis rápido en el punto de atención al paciente, debe evaluarse su posición real dentro de un algoritmo de diagnóstico como herramienta de cribado, ya que los resultados positivos necesitan confirmación, y también los negativos en caso de alta probabilidad pre-test. En cualquier caso, este dispositivo supone una gran oportunidad para aumentar la conciencia del DAAT. En la Tabla X se indican los supuestos en los que se aconseja el uso del Alphakit Quickscreen®.

Tabla X. Escenarios para el uso del Alphakit Quickscreen® Baja probabilidad

Alta probabilidad

Alphakit Quickscreen® negativo

Descarta la presencia de la proteína Z, pero cabe la posibilidad de que sea un MZ y se escape, por lo que hay que hacer genotipado.

Descarta la enfermedad.

Cabe la posibilidad de que sea una variante rara, por lo que habría que hacer el genotipado igualmente.

Alphakit Quickscreen® positivo

Confirma la presencia de proteína Z y hay que hacer el genotipado.

Confirma la presencia de proteína Z y hay que hacer el genotipado.

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Capítulo 4. Alphakit® Quickscreen

BIBLIOGRAFÍA 1. Yetisen AK, Akram MS, Lowe CR. Paper-based microfluidic point-of-care diagnostic devices. Lab Chip. 2013;13:2210-2251.

2. Greulich T, Rodriguez-Frias F, Belmonte I, Klemmer A, Vogelmeier CF, Miravitlles M. Real world evaluation of a novel lateral flow assay (AlphaKit(R) QuickScreen) for the detection of alpha-1-antitrypsin deficiency. Respir Res. 2018;19:151.

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

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Capítulo 5. AlphaID® y A1AT Genotyping

Capítulo 5

AlphaID® y A1AT Genotyping Lourdes Osaba Ortiz de Mendibil Responsable del Laboratorio de Diagnóstico Clínico de Progenika Biopharma, una empresa de Grifols.

1. INTRODUCCIÓN 2. FUNDAMENTOS 3. REQUERIMIENTOS 4. PROCEDIMIENTOS 4.1. Consentimiento informado 4.2. Obtención del ADN 4.3. Remisión de las muestras genéticas 4.4. Procesamiento de las muestras 4.5. Ampliación del análisis mediante secuenciación 5. INFORME: PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Y SU INTERPRETACIÓN BIBLIOGRAFÍA

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

1. INTRODUCCIÓN Buena parte de las técnicas utilizadas hasta ahora para el diagnóstico del DAAT se basan en la identificación de la proteína en sangre. Sin embargo, en los últimos años se ha extendido el análisis molecular como método para la identificación de variantes genéticas que originen una proteína deficiente o incluso nula y que expliquen el origen de la patología.

La práctica clínica más habitual se centra en la identificación de la variante Z.1 Sin embargo, el cada vez mayor conocimiento molecular de la enfermedad y la continua descripción de nuevas variantes hacen especialmente interesante extender el análisis al mayor número posible de variantes genéticas. El análisis extendido resulta indispensable para identificar variantes poco frecuentes. Una de las principales ventajas de la identificación genética es que, puesto que el genotipo no varía, es suficiente realizarla una vez en la vida.

El avance y el desarrollo de las técnicas de análisis genético han hecho que sea relativamente fácil utilizarlas e interpretar sus resultados. Asimismo, la introducción de métodos no invasivos para la toma de la muestra extiende cada vez más su uso en diferentes especialidades médicas. En este capítulo se describe el test A1AT Genotyping, ensayo desarrollado por Progenika Biopharma, una empresa de Grifols.

2. FUNDAMENTOS El kit A1AT Genotyping es un test de diagnóstico in vitro cualitativo, basado en PCR e hibridación, que utiliza la tecnología xMAP de Luminexy y permite la detección e identificación simultánea de 14 variantes alélicas en SERPINA1 (Tabla XI), gen codificante de la AAT.

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Capítulo 5. AlphaID® y A1AT Genotyping

Tabla XI. Variantes alélicas detectadas con el A1AT Genotyping Test Variante Ref Seq: NM_00112770.1

Alelos asociados*

Actividad predicha de la proteína

c.187C>T

PI* I

Reducida (leve)

c.194T>C

PI* M procida

Reducida (grave)

c.226_228delTTC

PI* M malton, PI* M palermo, PI* M nichinan

Reducida (grave)

c.230C>T

PI* S iiyama

Reducida (grave)

c.552delC

PI* Q0 granite falls

Ninguna (ausencia de proteína)

c.646+1G>T

PI* Q0 west

Ninguna (ausencia de proteína)

c.721A>T

PI* Q0 bellingham

Ninguna (ausencia de proteína)

c.739C>T

PI* F

Reducida (leve)I

c.839A>T

PI* P lowell, PI* P duarte, PI* Q0 cardiff, PI* Y barcelona

Reducida (leve)

c.863A>T

PI* S

Reducida (leve)

c.1096G>A

PI* Z

Reducida (grave)

c.1130dupT

PI* Q0 mattawa, PI* Q0 ourem

Ninguna (ausencia de proteína)

c.1158dupC

PI* Q0 clayton, PI* Q0 saarbruecken

Ninguna (ausencia de proteína)

c.1178C>T

PI* M heerlen

Reducida (grave)

* NOTA: Resaltado en negrita el alelo asociado más frecuente.

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

3. REQUERIMIENTOS El A1AT Genotyping Test se realiza con el equipamiento mínimo de un laboratorio de biología molecular. Para la reacción de amplificación del ADN, se utiliza un termociclador, mientras que para la detección de fluorescencia se requiere un equipo Luminex® 200.

El personal de laboratorio puede llevar a cabo el ensayo tras un entrenamiento teórico-práctico de 2-3 días. Aunque no se requiere una formación previa en técnicas de biología molecular, se recomienda una destreza básica en el manejo de equipamiento de laboratorio (micropipetas, termobloque, termociclador, etc.).

Los principales equipos utilizados son: • Termociclador Veriti 96w o VeritiPro 96w (Life Technologies) para las reacciones de amplificación, marcaje e hibridación del ADN. El Veriti 384w también puede ser utilizado para la reacción de amplificación, siendo especialmente conveniente cuando el número de muestras es elevado.

• Citómetro de flujo Luminex® 200 para la detección de las señales de fluorescencia y el software asociado xPONENT (3.1o 4.3) (Luminex).

4. PROCEDIMIENTOS 4.1. CONSENTIMIENTO INFORMADO En todos los casos, una vez informado de las características de la prueba, su finalidad, posibles riesgos, así como las condiciones de uso de los datos obtenidos y de la muestra recogida, el paciente firma un consentimiento informado para la realización de la prueba y la custodia tanto de los datos obtenidos como de la muestra.

4.2. OBTENCIÓN DEL ADN La prueba es poco invasiva, solo requiere una mínima cantidad de sangre o saliva.

Para la obtención de la gota de sangre, es suficiente un pequeño pinchazo en el dedo y recoger la sangre en papel Whatman 903 o Perkin Elmer 226. La posibilidad de obtener ADN a partir de saliva convierte la prueba en no invasiva, siendo sumamente fácil y conveniente para el paciente. La toma de muestra de saliva la realiza un médico o un enfermero, aunque, dada la sencillez de la toma, incluso la podría llevar a cabo el propio paciente sin supervisión siguiendo unas sencillas instrucciones.

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Capítulo 5. AlphaID® y A1AT Genotyping

4.3. REMISIÓN DE LAS MUESTRAS GENÉTICAS En estos momentos, Grifols ofrece el servicio de diagnóstico del DAAT mediante A1AT Genotyping Test enviando las muestras genéticas por correo postal en un sobre prefranqueado, proporcionado por REDAAT/Grifols, al laboratorio de Diagnóstico Clínico de Progenika Biopharma (Derio, Bizkaia).2 4.4. PROCESAMIENTO DE LAS MUESTRAS Se realiza en un laboratorio de biología molecular. El ADN extraído es amplificado y biotinilado mediante una PCR multiplex, y los productos de PCR son desnaturalizados e hibridados a sondas de oligonucleótidos unidas a partículas codificadas por color. El ADN hibridado es marcado con un fluoróforo y la señal resultante es detectada en un equipo Luminex® 200. Los datos crudos obtenidos son procesados con el software específico A1AT Genotyping Test Analysis Software con el fin de obtener el informe de resultados. El algoritmo del A1AT Genotyping Test Analysis Software convierte las variantes alélicas genotípicas en los alelos asociados.

4.5. AMPLIACIÓN DEL ANÁLISIS MEDIANTE SECUENCIACIÓN Cuando el genotipo de la muestra no permite explicar la clínica del paciente en relación al DAAT, se procede a la secuenciación completa del gen SERPINA1 mediante NGS (Next Generation Sequencing) utilizando la tecnología de Illumina®.

El protocolo consiste en la preparación de una biblioteca de secuenciación de amplicones que cubra tanto los exones codificantes como los no codificantes, lo que cubre un total de 1824 pb a lo largo del gen SERPINA1. Se incluyen un mínimo de 30 pb en las zonas flanqueantes a los exones. El análisis de los datos de secuenciación permite detectar tanto sustituciones como InDels (inserciones y deleciones).

5. INFORME: PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Y SU INTERPRETACIÓN Una vez procesada la muestra y analizados los resultados de genotipado, se emite un informe de resultados en el que se indican los genotipos de la muestra para cada una de las 14 variantes analizadas y el resultado final de la muestra.

En el caso de que la muestra no presente ninguna de las variantes, el genotipo de la muestra es M/M y en el informe aparece como «variante no detectada».

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

En el caso de que la muestra presente alguna de las 14 variantes analizadas, se indica como «Presencia de uno o más alelos relacionados con el DAAT» y se recomienda la consulta con el especialista.

En el caso de no detectarse ninguna de las 14 variantes analizadas en el ensayo para una muestra que presente niveles de AAT inferiores a 60 mg/dL, se procede automáticamente a la secuenciación del gen completo de SERPINA1, con el fin de identificar alguna variante fuera de las 14 que pudiese explicar el fenotipo observado.2

Figura 10. Dispositivos para la recogida de muestra de saliva mediante el dispositivo AlphaID® (A) o gota de sangre desecada (B)

(B) (A)

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Capítulo 5. AlphaID® y A1AT Genotyping

BIBLIOGRAFÍA 1. Blanco I, Lara B. Déficit de alfa-1 antitripsina: fisiopatología, enfermedades relacionadas, diagnóstico y tratamiento. 2ª edición, 2016, SEPAR, ISBN: 978-84-9448768-2.

2. Lopez-Campos JL, Casas-Maldonado F, Torres-Duran M, et al. Results of a Diagnostic Procedure Based on Multiplex Technology on Dried Blood Spots and Buccal Swabs for Subjects With Suspected Alpha1 Antitrypsin Deficiency. Arch Bronconeumol (Engl Ed). 2021;57(1):42-50. doi: 10.1016/j.arbres.2020.04.014.

Epub 2020 Jul 14. PMID: 32680720.

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Manual de Procedimientos SEPAR 40

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Capítulo 6. Determinación del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo en polimorfonucleares neutrófilos en el déficit de alfa-1 antitripsina

Capítulo 6

Determinación del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo en polimorfonucleares neutrófilos en el déficit de alfa-1 antitripsina Francisco Dasí Fernández Fundación investigación Hospital Clínico Valencia. Instituto de Investigación Sanitaria INCLIVA. Universidad de Valencia. Facultad de Medicina. Departamento de Fisiología,Valencia.

María Magallón Serrano Fundación investigación Hospital Clínico Valencia. Instituto de Investigación Sanitaria INCLIVA. Universidad de Valencia. Facultad de Medicina. Departamento de Fisiología, Valencia.

1. INTRODUCCIÓN 2. FUNDAMENTOS 3. REQUERIMIENTOS 3.1. Espacio físico 3.2. Personal 3.3. Equipamiento (características y especificaciones técnicas) 4. PROCEDIMIENTOS 4.1. Obtención de la muestra 4.2. Aislamiento de los PMNN 4.3. Determinación del perfil de citoquinas en PMNN 4.4. Determinación del perfil oxidativo 5. INFORME: PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Y SU INTERPRETACIÓN 6. FINANCIACIÓN BIBLIOGRAFÍA

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1. INTRODUCCIÓN Diversos estudios han demostrado la importancia de los polimorfonucleares neutrófilos (PMNN) en la fisiopatología de numerosas enfermedades del aparato respiratorio, incluida la EPOC1 y el DAAT,2-3 y de la determinación del perfil de citoquinas y perfil oxidativo en estas células.

2. FUNDAMENTOS El siguiente procedimiento permitirá determinar el perfil de citoquinas y el perfil oxidativo en polimorfonucleares neutrófilos (PMNN), aislados de sangre total mediante un método inmunomagnético. Este método de aislamiento de los PMNN es rápido e implica una manipulación mínima de la muestra de sangre, con lo que se reduce su posible activación. La determinación en los PMNN del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo se realizará midiendo la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y del nitrógeno (RNS), la presencia de glutatión reducido (GSH) y de marcadores de daño oxidativo.

3. REQUERIMIENTOS 3.1. ESPACIO FÍSICO Los instrumentos utilizados para realizar el estudio del perfil oxidativo y el perfil de citoquinas requieren un espacio amplio para un uso adecuado de los aparatos debido a sus grandes dimensiones.

3.2. PERSONAL La extracción de la muestra será realizada por un enfermero, mientras que el procedimiento técnico debe ser realizado por una persona cualificada con una titulación académica de técnico de laboratorio.

3.3. EQUIPAMIENTO (CARACTERÍSTICAS Y ESPECIFICACIONES TÉCNICAS) La determinación de la expresión génica a nivel de mRNA se lleva a cabo mediante RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR). Para ello, se realiza una transcripción inversa en el termociclador ProFlexTM PCR System (Applied BiosystemsTM). Posteriormente, se utilizará el instrumento QuantStudioTM 5 Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM) para realizar la qRT-PCR. 66

Capítulo 6. Determinación del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo en polimorfonucleares neutrófilos en el déficit de alfa-1 antitripsina

La determinación de la actividad enzimática de los principales sistemas enzimáticos antioxidantes celulares se realiza mediante kits ELISA, los cuales requieren el uso de un lector de absorbancia de placas, el SPECTRAmax PLUS (Molecular Devices).

La determinación de la generación de ROS y RNS y la presencia de GSH, así como del daño oxidativo producido en los lípidos y en las proteínas, se determina mediante citometría de flujo.4 El citómetro de flujo utilizado es el LSR Fortessa X-20 (Becton Dickinson).

4. PROCEDIMIENTOS 4.1. OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Se recogen 3 tubos de 3 ml de sangre total anticoagulada con K2EDTA para el posterior aislamiento de los PMNN. Es recomendable, para el correcto aislamiento, utilizar sangre total fresca (procesar inmediatamente después de la extracción). Además, se requiere la presencia de EDTA, por lo que, en caso de utilizar un anticoagulante distinto de este, deberá añadirse EDTA a la muestra de sangre a una concentración final de 1 mM. 4.2. AISLAMIENTO DE LOS PMNN Los PMNN se aíslan utilizando el kit EasySep Direct Human Neutrophil Isolation (STEMCELL Technologies; 19666). Una vez aislados, la determinación de la pureza de los PMNN se realiza mediante citometría de flujo (LSR Fortessa X-20) utilizando un anticuerpo monoclonal anti-CD16b, que marca específicamente este tipo celular.

4.3. DETERMINACIÓN DEL PERFIL DE CITOQUINAS EN PMNN Se realiza utilizando el kit Cytokine Human Magnetic 30-Plex Panel for LuminexTM Platform (InvitrogenTM; LHC6003M) siguiendo las instrucciones recomendadas por el fabricante.

4.4. DETERMINACIÓN DEL PERFIL OXIDATIVO 4.4.1. DETERMINACIÓN DE LA GENERACIÓN DE ROS Y RNS La generación de anión superóxido (O2-), peróxido de hidrógeno (H2O2), peroxinitritos (ONOO-) y óxido nítrico (NO) se determina mediante citometría de flujo (LSR Fortessa X-20) utilizando para ello las sondas fluorescentes Dihidroetidina (HE) 67

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(InvitrogenTM D11347), Diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceína (H2DCFDA) (InvitrogenTM D399), Dihidrorodamina 123 (DHR-123) (InvitrogenTM D632) y 4-amino-5-metilamino-2’,7’-difluorofluoresceína diacetato (DAF-FM) (InvitrogenTM D23841) respectivamente.

4.4.2. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE TIOLES REDUCIDOS Se realiza mediante citometría de flujo (LSR Fortessa X-20) utilizando la sonda monoclorobimano (mBCI) (InvitrogenTM; M1381MP).

4.4.3. DETERMINACIÓN DEL DAÑO OXIDATIVO EN LOS LÍPIDOS MEDIANTE LA MEDICIÓN DEL COCIENTE DE LÍPIDOS OXIDADOS Y REDUCIDOS Se determina mediante citometría de flujo (LSR Fortessa X-20) utilizando la sonda fluorescente BODIPY 665/676 (InvitrogenTM; B3932).

4.4.4. DETERMINACIÓN DEL DAÑO OXIDATIVO EN LAS PROTEÍNAS MEDIANTE LA MEDICIÓN DE LAS PROTEÍNAS CARBONILADAS Los niveles de proteínas carboniladas se miden mediante citometría de flujo (LSR Fortessa X-20), utilizando la sonda fluorescente fluoresceína 5-tiosemicarbacida (FTC) (Sigma; 76863-28-0). En la Tabla XII se describe un resumen de los protocolos de citometría de flujo.

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Capítulo 6. Determinación del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo en polimorfonucleares neutrófilos en el déficit de alfa-1 antitripsina

Tabla XII. Resumen de los protocolos de citometría de flujo Sonda

Medida

Concentración final

Tiempo de incubación

Temperatura de incubación

HE

O2-

3,15 μg/ml

20 min

37°C

H2DCFDA

H2O2

3,15 μg/ml

20 min

37°C

DHR-123

ONOO-

250 ng/ml

20 min

37°C

DAF-FM

NO

1,25 μM

20 min

37°C

mBCI

GSH

0,016 nM

20 min

37°C

BODIPY

Ratio lípidos oxidados/reducidos

1 μM

20 min

37°C

FTC

Carbonilación de proteínas

1 μM

20 min

37°C

HE: Dihidroetidina; O2-: superóxido; H2DCFDA: Diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceína; H2O2: Peróxido de hidrógeno; DHR-123: Dihidrorodamina 123; ONOO-: peroxinitritos; DAF-FM: 4-amino-5-metilamino-2’,7’-difluorofluoresceína diacetato; NO: óxido nítrico; mBCI: sonda monoclorobimano; GSH: glutatión reducido; BODIPY: sonda fluorescente BODIPY 665/676; FTC: fluoresceína 5-tiosemicarbacida.

4.4.5. DETERMINACIÓN DE LOS NIVELES DE EXPRESIÓN A NIVEL DE MRNA DE LOS ENZIMAS IMPLICADOS EN EL METABOLISMO DEL GLUTATIÓN Y DE LOS PRINCIPALES SISTEMAS ENZIMÁTICOS ANTIOXIDANTES CELULARES Se evalúa la expresión de la γ-GCS (gamma glutamil-cisteina sintetasa), CAT (Catalasa); GPx (Glutatión peroxidasa), GR (Glutatión reductasa), MnSOD (Manganeso superóxido dismutasa) y Cu/ZnSOD (Cobre/Zinc superóxido dismutasa) mediante qRT-PCR. • La extracción de ARN se realiza con el kit NucleoSpin RNA (Macherey-Nagel; 740955.50) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante.

• La transcripción inversa de los ARN aislados se realiza usando el kit High-Capacity RNA-to-cDNA (Applied Biosystems™; 4387406) para obtener los ADNc de cada gen de interés, siguiendo las recomendaciones del fabricante.

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• Los niveles de expresión génica de cada gen se determinan mediante qRT-PCR, utilizando primers y sondas TaqMan específicos para cada uno de ellos. Cada muestra se analiza por triplicado, y la expresión de cada mRNA se determinará por el método 2-ΔΔCt.5 4.4.6. DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE LOS PRINCIPALES SISTEMAS ENZIMÁTICOS ANTIOXIDANTES CELULARES, TALES COMO GPX (GLUTATIÓN PEROXIDASA), GRD (GLUTATIÓN REDUCTASA), MNSOD (MANGANESO SUPERÓXIDO DISMUTASA) Y CU/ZNSOD (COBRE/ZINC SUPERÓXIDO DISMUTASA).

Utilizaremos kits ELISA de la empresa Cayman siguiendo en cada caso las recomendaciones de la empresa fabricante.

5. INFORME: PRESENTACIÓN DE RESULTADOS Y SU INTERPRETACIÓN Los resultados obtenidos mediante citometría de flujo, como son la generación de ROSy RNS, los niveles de tioles reducidos y el daño oxidativo en los lípidos y las proteínas, se expresan en unidades arbitrarias de fluorescencia (UAF) para cada una de las sondas utilizadas.

Los niveles de expresión a nivel de mRNA de los sistemas enzimáticos antioxidantes celulares se determinan mediante método 2-ΔΔCt, que consiste en comparar los niveles de expresión de cada gen de interés con un gen de referencia. La actividad enzimática de los sistemas enzimáticos antioxidantes se expresa en U/ml para cada enzima. Finalmente, se realiza un estudio comparativo entre el perfil oxidativo y la producción de citoquinas entre los pacientes con DAAT y un grupo control formado por voluntarios sanos, mediante el análisis estadístico. Se observan las diferencias en las distintas determinaciones mediante el análisis de la varianza utilizando como variable independiente la presencia o la no presencia de DAAT y como variables dependientes los distintos parámetros medidos. La comparación entre grupos se realiza mediante la t-Student y ANOVA en aquellos casos en que la variable siga una distribución normal o mediante el test de Mann-Whitney U en los casos en que la variable siga una distribución distinta de la normal. Las diferencias se consideran estadísticamente significativas cuando p < 0,05.

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Capítulo 6. Determinación del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo en polimorfonucleares neutrófilos en el déficit de alfa-1 antitripsina

6. FINANCIACIÓN Este trabajo ha sido financiado con ayudas de la Sociedad Valenciana de Neumología de 2017, el proyecto de investigación financiado por el ISCIII PI17/01250 y el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER).

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BIBLIOGRAFÍA 1. Jasper AE, McIver WJ, Sapey E, Walton GM. Understanding the role of neutrophils in chronic inflammatory airway disease. F1000Res. 2019;8:F1000 Faculty Rev-557. doi: 10.12688/f1000research.18411.1. PMID: 31069060; PMCID: PMC6489989.

2. Sapey E. Neutrophil Modulation in Alpha-1 Antitrypsin Deficiency. Chronic ObstrPulm Dis. 2020 Jul;7(3):247-259. doi: 10.15326/jcopdf.7.3.2019.0164. PMID: 32697897; PMCID: PMC7857711.

3. Magallón M, Carrión AE, Bañuls L, et al. Oxidative Stress and Endoplasmic Reticulum Stress in Rare Respiratory Diseases. J Clin Med. 2021;10(6):1268. doi: 10.3390/jcm10061268. PMID: 33803835; PMCID: PMC8003245.

4. Reula A, Pellicer D, Castillo S, et al. New Laboratory Protocol to Determine the Oxidative Stress Profile of Human Nasal Epithelial Cells Using Flow Cytometry.

J Clin Med. 2021;10(6):1172. doi: 10.3390/jcm10061172. PMID: 33799667; PMCID: PMC7998408.

5. Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 2001;25(4):4028. doi: 10.1006/meth.2001.1262. PMID: 11846609.

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Cuestionario

CUESTIONARIO A. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN SÉRICA DE ALFA-1 ANTITRIPSINA B. ESTUDIO DEL FENOTIPO C. ESTUDIO DEL GENOTIPO D. ALPHAKIT® QUICKSCREEN E. ALPHAID® Y A1AT GENOTYPING F. DETERMINACIÓN DEL PERFIL DE CITOQUINAS Y DEL PERFIL OXIDATIVO EN POLIMORFONUCLEARES NEUTRÓFILOS EN EL DÉFICIT DE ALFA-1 ANTITRIPSINA

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A. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN SÉRICA DE ALFA-1 ANTITRIPSINA 1. ¿Cuál es el valor mínimo en mg/dl (siempre referido a los datos de nuestro centro) medido por nefelometría para considerar que un paciente presenta DAAT? a) 130 b) 60 c) 116 d) 232 e) 35 2. ¿Qué concentración en mg/dl se considera el valor mínimo de «protección»? a) 11 b) 35 c) 60 d) 116 e) 20 3. Para medir la concentración sérica de AAT mediante inmunonefelometría, se mide la luz ___________ por los inmunocomplejos formados entre la AAT y los anticuerpos anti-AAT. a) Trasmitida b) Dispersada c) Absorbida d) No absorbida e) Emitida 4. El diagnóstico de laboratorio del DAAT se basa en: a) La concentración sérica de AAT b) El fenotipo c) El genotipo d) La concentración sérica de AAT, fenotipo y/o genotipo e) La clínica del paciente

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Cuestionario

5. ¿Qué ventaja presenta la inmunonefelometría frente a la inmunoturbidimetría? a) Costoefectividad b) Automatización c) Sensibilidad d) Rapidez e) Especificidad

B. ESTUDIO DEL FENOTIPO 1. Las variantes de la alfa-1 antitripsina (AAT) se clasifican en normales o deficientes (frecuentes, raras y nulas) en función de su: a) Secuencia de ADN b) Concentración sérica c) Frecuencia en la población d) Concentración sérica y frecuencia en la población e) Migración electroforética 2. Las variantes alélicas de la AAT (PiM, PiS, PiZ, etc.) se designan en función de su: a) Secuencia de ADN b) Migración electroforética c) Carga d) Frecuencia en la población e) Concentración sérica 3. Los fenotipos deficientes más frecuentes en nuestra población son los relacionados con los alelos: a) PiM y PiS b) PiM y PiZ c) PiMmalton y PiZ d) PiS y PiZ e) PiF y nulos

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4. El estudio del fenotipo no permite un diagnóstico correcto en el caso de: a) Variantes deficientes frecuentes b) Variantes nulas c) Variantes nuevas d) b) y c) son correctas e) a) y c) son correctas 5. El isoelectroenfoque consiste en la separación de proteínas en función de su: a) Secuencia de ADN b) Punto isoeléctrico c) Solubilidad d) Concentración sérica e) Carga

C. ESTUDIO DEL GENOTIPO 1. En relación con la alfa-1 antitripsina (AAT), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es falsa? a) La AAT humana está codificada por el gen SERPINA1, localizado en la región 14q31-32,3 del extremo distal del cromosoma 14. b) Este gen está constituido por siete exones, tres no codificantes (IA, IB, IC), cuatro que codifican la información para sintetizar la proteína (II, III, IV y V), y seis intrones intercalados. c) El gen de la AAT posee dos alelos que se transmiten por herencia mendeliana autosómica y codominante. d) Los cinco genotipos deficientes, PiMS, PiSS, PiMZ, PiSZ y PiZZ, están presentes en prácticamente el 5-20 % restante de la población y expresan aproximadamente un 80, 60, 55, 40 y 15% de AAT sérica, respectivamente. e) Existe una gran variedad de alelos deficientes más raros (por ej., Mmalton, Mprocida, etc.) que expresan niveles disminuidos de AAT, en algunos casos similares al alelo S.

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Cuestionario

2. En relación con las técnicas de genotipado de la alfa-1 antitripsina (AAT), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es falsa? a) En muchos laboratorios, el enfoque genético inicial se basa en la detección de los alelos más frecuentes PiS y PiZ mediante técnicas aleloespecíficas. b) Los métodos de genotipado rápido de alelos S y Z pueden ser incompletos y conducir a un diagnóstico erróneo, ya que se descartan los alelos más raros y nulos. c) La secuenciación del gen SERPINA1 es el método de referencia para identificar cualquier variante alélica rara asociada al DAAT, así como para caracterizar nuevas variantes. d) La secuenciación del gen SERPINA1 requiere un análisis de la secuencia de los dos exones codificantes del gen, aunque en casos particularmente raros también se deben secuenciar secuencias intrónicas y reguladoras. e) La secuenciación del gen SERPINA1 es el método de referencia para identificar variantes nulas.

3. En relación con el estudio del genotipo de la alfa-1 antitripsina (AAT), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es falsa? a) Para cualquier estudio genético, es necesario obtener previamente el consentimiento informado de los pacientes. b) Para analizar la secuencia obtenida para cada exón, hay que compararla con la secuencia de referencia del gen SERPINA 4. c) Cualquier variación frente a la secuencia de referencia puede suponer la presencia de una mutación, sea una mutación puntual de un nucleótido, pequeñas deleciones o inserciones que pueden dar lugar a alelos deficientes de AAT. d) Los archivos de secuencia pueden abrirse con distintos programas que se pueden descargar gratuitamente de los sitios web. e) El resultado de la secuenciación de exones del gen SERPINA1 se basa en el análisis de los cromatogramas obtenidos de la secuenciación Sanger de los fragmentos amplificados de cada uno de los exones.

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4. En relación con el estudio del genotipo de la alfa-1 antitripsina (AAT), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es falsa? a) Las fuentes más frecuentes de extracción del ADN en el estudio del DAAT son sangre periférica total (extraída en tubos con anticoagulante EDTA) o gota de sangre seca. b) La concentración del ADN purificado se cuantifica mediante espectrofotometría UV. c) La integridad del ADN se determinará mediante electroforesis en gel de agarosa en relación con un patrón de peso molecular. d) El ADN genómico humano es un ADN de bajo peso molecular. e) Un ADN genómico íntegro aparecerá como una banda más o menos compacta de alto peso molecular en un gel de agarosa.

5. En relación con la presentación de resultados y la interpretación del estudio del genotipo de la alfa-1 antitripsina (AAT), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es falsa? a) El resultado del genotipado de los alelos S y Z se basa en que si en una muestra está presente una variante genética, esta producirá una variación en la temperatura de melting del producto amplificado. b) Para el alelo S, se analiza la señal emitida a 530 nm, y para el alelo Z, a 640 nm. c) Para cada muestra se analizará la señal de los alelos S y Z. El genotipo será el resultado de la interpretación de ambas. d) El estudio de los alelos S y Z requiere un análisis del control negativo, que debe ser negativo (sin picos). e) Para cada muestra, se analizará la señal de los alelos S, Z y F. El genotipo será el resultado de la interpretación de todos.

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Cuestionario

D. ALPHAKIT® QUICKSCREEN 1. En relación con el AlphaKit® QuickScreen (Grifols, Barcelona, España), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es falsa? a) Es una prueba de detección cuantitativa b) Es una prueba de inmunocromatográfica in vitro c) Detecta la proteína Z d) Consigue resultados en 15-30 minutos e) El dispositivo tiene marca de la Comunidad Europea 2. En relación con el AlphaKit® QuickScreen (Grifols, Barcelona, España), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es correcta? a) El kit contiene anticuerpos monoclonales contra las proteínas S y Z. b) El kit contiene un anticuerpo detector etiquetado con plata y un anticuerpo de captura que está inmovilizado en la superficie de la tira de prueba. La muestra de sangre, junto con el tampón, libera el anticuerpo detector dentro de su matriz. c) Si la muestra examinada contiene la proteína S-AAT, el anticuerpo detector forma un complejo con la proteína S. d) El kit contiene dos variantes de un anticuerpo monoclonal contra la proteína Z. e) El exceso de anticuerpos marcados con plata se une en la banda de control, lo que indica que la cromatografía funcionó correctamente.

3. En relación con los requerimientos del AlphaKit® QuickScreen (Grifols, Barcelona, España), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es falsa? a) La prueba está diseñada para uso exclusivo por profesionales de la salud cualificados. b) El kit es reutilizable. c) Cada unidad contiene 1 casete de test, 1 lanceta estéril, 2 pipetas de 30 μL y 1 botella con cuentagotas con el tampón que contiene 0,1 % ProClin® 300. Además, es necesario disponer de un desinfectante y un cronómetro o temporizador para medir el tiempo, no incluidos en el kit. d) Este dispositivo tiene fecha de caducidad. e) El principal requerimiento del dispositivo es que debe conservarse en frío, entre 2 y 8 ºC, pero se utiliza a temperatura ambiente. No es necesario esperar un tiempo mínimo a temperatura ambiente para usarlo, pero una vez está fuera del frigorífico debe utilizarse antes de 8 horas.

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4. En relación con el procedimiento del AlphaKit® QuickScreen (Grifols, Barcelona, España), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es falsa? a) Tras desinfectar el dedo y punzarlo con la lanceta, se toma la muestra de sangre con la pipeta que se deposita en la ventana marcada con la letra S. b) La pipeta se llenará ella misma automáticamente por fuerzas capilares, por lo que no se deberá apretar el tubo mientras se está tomando la muestra. c) Para expulsar la muestra, se debe alinear la punta del tubo con el lugar de aplicación y apretar el bulbo de la pipeta. d) Pasados 15 minutos, se aplican 3 gotas de tampón en la misma ventana y podremos leer el resultado del test bajo una luz brillante. e) Los resultados solo pueden ser evaluados entre 15 y 30 minutos después de que el tampón de ensayo haya sido aplicado.

5. En relación con la interpretación del AlphaKit® QuickScreen (Grifols, Barcelona, España), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es falsa? a) Después de realizar el test, siempre debe aparecer una banda roja a la altura del control. b) Si la muestra contiene la proteína Z, en la ventana de resultado aparecerá una segunda banda roja (banda Z-AAT). La señal Z-AAT será positiva para todos los portadores del alelo Z, independientemente de si el sujeto es heterocigoto u homocigoto para este gen. c) Si la muestra contiene la proteína S, en la ventana de resultado aparecerá una segunda banda roja (banda S-AAT). La señal S-AAT será positiva para todos los portadores del alelo S, independientemente de si el sujeto es heterocigoto u homocigoto para este gen. d) Los pacientes en tratamiento de reposición con AAT por vía intravenosa pueden dar falsos resultados. e) El test debe repetirse utilizando otro dispositivo si no aparece la banda de control o si después de 15 minutos hay manchas visibles en la ventana de visualización.

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Cuestionario

E. ALPHAID® Y A1AT GENOTYPING 1. El kit A1AT Genotyping permite detectar de forma simultánea: a) Las variantes Z y S b) Todas las variantes descritas relacionadas con el DAAT c) 17 variantes relacionadas con el DAAT d) 14 variantes relacionadas con el DAAT e) Variantes relacionadas con el DAAT identificadas en España 2. El equipamiento necesario para el procesamiento de muestras con el kit A1AT Genotyping incluye: a) Termociclador b) Secuenciador c) Luminex 200 d) Equipo de visualización de geles de agarosa e) a) y c) son correctas 3. El test A1AT Genotyping puede utilizarse en muestras de: a) Saliva y sangre b) Sangre y suero c) Suero y piel d) Pelo y piel e) Todas son correctas 4. El método de secuenciación del gen SERPINA1 llevado a cabo en el laboratorio de Diagnóstico Clínico de Progenika Biopharma analiza: a) Exones codificantes b) Exones no codificantes c) Las secuencias flanqueantes a los exones d) a) y b) son correctas e) Todas son correctas

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5. Tras la realización del ensayo con el test A1AT Genotyping, se procederá a la secuenciación del gen completo de SERPINA1 si: a) Se detecta una variante en homocigosis b) No se detecta ninguna variante o se detecta una variante en heterocigosis y el paciente presenta niveles de AAT ≤ 60 mg/dL c) El paciente presenta niveles de AAT ≤ 60 mg/dL, independientemente del genotipo d) No se detecta ninguna variante, independientemente de los niveles e) El clínico lo solicita

F. DETERMINACIÓN DEL PERFIL DE CITOQUINAS Y DEL PERFIL OXIDATIVO EN POLIMORFONUCLEARES NEUTRÓFILOS EN EL DÉFICIT DE ALFA-1 ANTITRIPSINA 1. En relación con la enfermedad pulmonar obstructiva crónica, el déficit de alfa-1 antitripsina (DAAT) para la determinación del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo en el déficit de alfa-1 antitripsina (DAAT), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es correcta? a) Los PMNN no son importantes en la fisiopatología de la EPOC y del DAAT. b) Los eosinófilos y basófilos son células diana para determinar el perfil de citoquinas y estrés oxidativo en el DAAT. c) Diversos estudios han demostrado la importancia de la determinación del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo en los polimorfonucleares neutrófilos (PMNN). d) El estrés oxidativo no se puede medir. e) b) y c) son correctas.

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Cuestionario

2. En relación con el procedimiento para la determinación en polimorfonucleares neutrófilos (PMNN) del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo en el déficit de alfa-1 antitripsina (DAAT), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es falsa? a) Los PMNN son aislados de sangre total mediante un método inmunomagnético. b) La manipulación de la muestra de sangres es mínima, por lo que se reduce el riesgo de activación de los PMNN. c) La determinación en los PMNN del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo se realizará midiendo la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) y del nitrógeno (RNS). d) La determinación en los PMNN del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo se realizará midiendo la presencia de glutatión reducido (GSH) y marcadores de daño oxidativo. e) La determinación en los PMNN del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo se realizará midiendo la ausencia de glutatión reducido (GSH) y marcadores de daño oxidativo.

3. En relación con los requerimientos para la determinación en polimorfonucleares neutrófilos (PMNN) del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo en el déficit de alfa-1 antitripsina (DAAT), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es correcta? a) La extracción de la muestra será realizada por el personal de enfermería y el procedimiento técnico debe ser realizado por una persona cualificada con una titulación académica de técnico de laboratorio. b) La determinación de la expresión génica a nivel de mRNA se lleva a cabo mediante RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR). c) La determinación de la actividad enzimática de los principales sistemas enzimáticos antioxidantes celulares se realiza mediante kits ELISA. d) La determinación de la generación de ROS y RNS y la presencia de GSH, así como del daño oxidativo producido en los lípidos y en las proteínas, se determina mediante citometría de flujo. e) Todas las respuestas son correctas.

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4. En relación con el procedimiento para la determinación en polimorfonucleares neutrófilos (PMNN) del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo en el déficit de alfa-1 antitripsina (DAAT), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es correcta? a) Es recomendable, para el correcto aislamiento de los PMNN, utilizar sangre total fresca (procesar inmediatamente después de la extracción). b) Una vez aislados los PMNN, la determinación de la pureza de los PMNN se realiza mediante citometría de flujo. c) La determinación del perfil oxidativo se realiza mediante citometría de flujo. d) La determinación de la actividad enzimática de los principales sistemas enzimáticos antioxidantes se realiza mediante técnica ELISA. e) Todas las respuestas son correctas.

5. En relación con la presentación de resultados y la interpretación del perfil de citoquinas y del perfil oxidativo en polimorfonucleares neutrófilos (PMNN) en el déficit de alfa-1 antitripsina (DAAT), ¿cuál de las siguientes afirmaciones es falsa? a) Los resultados obtenidos mediante citometría de flujo, como son la generación de ROS y RNS, se expresan en unidades arbitrarias de fluorescencia (UAF) para cada una de las sondas utilizadas. b) Los niveles de tioles reducidos y el daño oxidativo en los lípidos y las proteínas se expresan en unidades arbitrarias de fluorescencia (UAF) para cada una de las sondas utilizadas. c) La actividad enzimática de los sistemas enzimáticos antioxidantes se expresa en U/ml para cada enzima. d) Los resultados del estudio se comparan con un grupo control ZZ. e) Todas las respuestas son falsas.

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Abreviaturas Cuestionario

ABREVIATURAS AAT: Alfa-1 Antitripsina ATS: American Thoracic Society DAAT: Déficit de Alfa-1 Antitripsina DAF-FM: 4-amino-5-metilamino-2’,7’-difluorofluoresceína diacetato DHR-123: Dihidrorodamina 123 EDTA: ácido etilendiaminotetraacético EPOC: Enfermedad Pulmonar Obstructiva Crónica ERS: European Respiratory Society GSH: glutatión reducido H2DCFDA: Diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceína H2O2: Peróxido de hidrógeno HE: Dihidroetidina NO: óxido nítrico O2-: superóxido ONOO-: peroxinitritos PCR: polymerase chain reaction Pi: Protease inhibitor PiM: Protease inhibitor médium PMNN: polimorfonucleares neutrófilos qRT-PCR: cuantitativa a tiempo real RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction) REDAAT: Red Española de Déficit de Alfa-1 Antitripsina RNS: especies reactivas del nitrógeno ROS: especies reactivas del oxígeno RT-PCR: Reverse transcription polymerase chain reaction SEPAR: Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica SEQC: Sociedad Española de Química Clínica μM: Micromolar

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Cuestionario

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