Manual de Procedimientos SEPAR, 11. by SEPAR

MANUAL SEPAR DE PROCEDIMIENTOS Coordinadores Módulo 11:

Pere Casan

Felip Burgos

11 PRUEBAS PARA EL ESTUDIO DE LA INFLAMACIÓN DE LAS VÍAS AÉREAS SOCIEDAD ESPAÑOLA DE NEUMOLOGIA Y CIRUGIA TORACICA (SEPAR) Actividad acreditada, en base a la encomienda de gestión concedida por los Ministerios de Educación Cultura y Deporte, y de Sanidad y Consumo al Consejo General de Colegios Oficiales de Médicos, con 2,9 créditos, equivalentes a 17 horas lectivas

MANUAL SEPAR DE PROCEDIMIENTOS

11 PRUEBAS PARA EL ESTUDIO DE LA INFLAMACIÓN DE LAS VÍAS AÉREAS

SOCIEDAD ESPAÑOLA DE NEUMOLOGIA Y CIRUGIA TORACICA (SEPAR)

Manual SEPAR de Procedimientos Coordinadores: Pere Casan y Felip Burgos Participantes: Jose Belda Núria Calaf Teresa Feixas Ana M.a Fortuna Jordi Giner Federico P. Gómez Yerón Mercedes González Yolanda Torralba García Montserrat Torrejón

Edición realizada para: Novartis Farmacéutica S.A. Gran Via de les Corts Catalanes, 764 08013 Barcelona

2007 P. Permanyer Mallorca, 310 - 08037 Barcelona Tel.: 93 207 59 20 Fax: 93 457 66 42 E-mail: permanyer@permanyer.com ISBN Obra completa: 84-7989-152-1 ISBN Módulo 11: 978-84-96762-12-1 Dep. Legal: B-21.029-2007 Ref.: 543AB055 Impreso en papel totalmente libre de cloro Impresión: Comgrafic Este papel cumple los requisitos de ANSI/NISO Z39.48-1992 (R 1997) (Papel Permanente) © Copyright 2004. SEPAR Editado y coordinado por Publicaciones Permanyer para Novartis Farmacéutica S.A. Reservados todos los derechos. Ninguna parte de esta publicación puede ser reproducida ni transmitida en ninguna forma o medio alguno, electrónico o mecánico, incluyendo las fotocopias, grabaciones o cualquier sistema de recuperación de almacenaje de información, sin el permiso escrito del titular del copyright.

11.

Pruebas para el estudio de la inflamación de las vías aéreas

Índice 1. Introducción

P. Casan, F. Burgos

2. Procedimiento para la inducción del esputo para el estudio de la inflamación de las vías aéreas

J. Belda, J. Giner, M. Torrejón, P. Casan 2.1. Introducción

2.2. Fundamentos

2.3. Espacio físico

2.4. Equipos y material

2.5. Personal

2.6. Procedimiento

2.7. Seguridad

2.8. Recomendaciones

2.9. Limpieza del equipo

2.10. Procedimiento de recuento celular para las preparaciones de esputo y otras muestras biológicas respiratorias

2.11. Interpretación de los resultados del recuento celular

3. Medición de óxido nítrico en aire espirado

A.M.a Fortuna, N. Calaf, T. Feixas, M. González, P. Casan 3.1. Introducción

3.2. Fundamentos

3.3. Indicaciones, limitaciones, complicaciones y contraindicaciones

3.4. Ámbitos de realización

3.5. Personal: cualificación y preparación

3.6. Equipos

3.7. Procedimiento

3.8. Resultados

4. Condensado exhalado

Y. Torralba García, F.P. Gómez Yerón 4.1. Introducción

4.2. Fundamentos

4.3. Procedimiento

4.4. Personal: cualificación y preparación

4.5. Indicaciones y complicaciones

4.6. Estandarización

4.7. Mantenimiento y limpieza de equipos

4.8. Símbolos y unidades de medida

CUESTIONARIO Preguntas de formación continuada

Test de provocación con metacolina

Introducción

Pere Casan Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Barcelona Felip Burgos Hospital Clínic i Provincial de Barcelona Los procesos inflamatorios de las vías aéreas, especialmente el asma y la EPOC, se diagnostican a partir de los datos que proporcionan los procedimientos fisiológicos clásicos (espirometría, prueba broncodilatadora, pruebas de provocación bronquial, transferencia al CO, gases en sangre arterial, etc.). Y diríamos más, no sólo se diagnostican, sino que con estos mismos procedimientos se efectúa el seguimiento, se establece un pronóstico, se evalúa la respuesta terapéutica, y se toman decisiones relevantes (ingreso, alta clínica, oxigenoterapia, etc.). Sin embargo, se conoce desde hace ya unos años el papel especialmente relevante de la inflamación como base patogénica de estas enfermedades, consideradas clásicamente como «obstructivas». El papel protagonista de las propias células que tapizan el epitelio bronquial, las células de defensa localizadas en su entorno cercano, las células llegadas desde la sangre, junto al enorme caudal de mediadores inflamatorios, señales químicas y mensajes cifrados entre unas y otras células y entre ellas y los diferentes fármacos, han transformado el entramado fisiológico clásico en uno más amplio y general. Todo este complejo mundo de la inflamación bronquial merece ser evaluado de una forma directa, sin necesidad de cuantificar la magnitud de los cambios que por su medio se han producido en las vías aéreas. De esta forma toma cuerpo la creciente aparición de procedimientos que pretenden medir el tipo y la magnitud de la inflamación bronquial en diferentes procesos. De entre todos ellos, unos ya con amplia experiencia clínica y otros aún en fase de evaluación experimental, debemos destacar los que se analizan en esta monografía. El esputo inducido y la cuantificación del tipo y el número de células existentes en este material, la determinación de la concentración de óxido nítrico en el aire espirado y, finalmente, la cuantificación de diferentes sustancias obtenidas de la condensación del aire exhalado son tres magníficos ejemplos que merecen ya ser estandarizados en la práctica neumológica. Esperamos y deseamos que este manual permita el uso más amplio de los procedimientos mencionados. La perfecta conjunción entre los autores, la labor editorial de Publicaciones Permanyer y la colaboración de los Laboratorios Novartis han hecho que nuestra coordinación haya resultado satisfactoria. A todos ellos, muchas gracias.

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2.1.

Procedimiento para la inducción del esputo para el estudio de la inflamación de las vías aéreas Introducción

Jose Belda* Jordi Giner Montserrat Torrejón Pere Casan Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Facultat de Medicina. UAB. Barcelona *Actualmente en Hospital Provincial, Valencia Hasta hace relativamente poco tiempo, el único método para investigar la inflamación de las vías aéreas eran la historia clínica y la fibrobroncoscopia, con sus distintas técnicas como el lavado bronquial o el broncoalveolar, las biopsias y los cepillados bronquiales o la aspiración de secreciones. Desde hace unos años, diferentes autores1-4 han demostrado que los hallazgos inflamatorios en el esputo inducido pueden aportar información relevante para la enfermedad respiratoria y se correlacionan aceptablemente con muestras clásicas como los lavados bronquiales5,6, por lo que el examen del esputo inducido puede ser de gran utilidad al ser un método directo, no invasivo, válido y reproducible que nos sirve, entre otras cosas, para medir la inflamación de las vías aéreas e investigar células y otros marcadores en el examen del esputo, ya sea espontáneo o inducido7. El éxito de la inducción del esputo depende de varios factores8, unos relacionados con las características del paciente (fumador, sano/enfermo, el grado de inflamación de la vía aérea); de aspectos del procedimiento como el débito del nebulizador9, el tamaño de las partículas producidas, la concentración de solución salina, la duración de la inhalación y las indicaciones del técnico; del procesado de la muestra10: la selección del esputo de la saliva11 y la efectividad del procesado posterior12. El procedimiento descrito a continuación13,14 tiene éxito, aproximadamente, en el 80% de los asmáticos estables o pacientes sanos, que no son capaces de producir espontáneamente esputo, y puede llegar a ser del 100% cuando se aplica en asmáticos no controlados, en pacientes sanos con infección respiratoria y en fumadores o ex fumadores15.

Procedimiento para la inducción del esputo

2.2.

Fundamentos

El esputo procedente de las vías aéreas está compuesto de células y diferentes sustancias, intra o extracelulares. El procesado del esputo permite separar el sedimento celular del líquido sobrenadante. En el líquido sobrenadante se pueden determinar sustancias producidas por las mismas células (ECP, MBP, interleucinas y quimiocinas, etc.) así como sus marcadores de activación. En sedimento se puede determinar el recuento total de células no escamosas, la viabilidad celular y el recuento diferencial celular como eosinófilos, neutrófilos, linfocitos, macrófagos. El recuento celular del esputo en personas sanas nos muestra un predominio de macrófagos y de neutrófilos, con muy pocos eosinófilos y linfocitos16. ¿Qué nos puede aportar el examen de esputo inducido en el manejo del paciente asmático?: • Poder diferenciar el tipo de inflamación y sus diferentes causas. Identificar si hay o no eosinófilos en el esputo, orientar hacia el tipo de tratamiento, ya que la eosinofilia responde muy bien al tratamiento corticoideo y a la evitación alergénica. Además, varios estudios han demostrado que la eosinofilia en esputo precede, incluso semanas, a los síntomas y a los cambios funcionales (espirometría)17-19. Pero en el esputo, además de eosinófilos, pueden aparecer incrementos de otras células como los neutrófilos y los linfocitos, que nos orientan hacia otro tipo de inflamación neutrofílica (infección, fumadores…) o linfocítica (sarcoidosis, Chlamidia pneumoniae…)20. • Ajustar dosis de corticoides, puesto que los eosinófilos son muy sensibles a los corticoides, y una dosis adecuada los reducirá a los límites de la normalidad. La eosinofilia persistente en esputo puede ser indicador de que el paciente no cumple bien el tratamiento o que la dosis es insuficiente21,22. • En enfermedad laboral, nos ayudará a llegar al diagnóstico realizando mediciones seriadas durante el trabajo y en los periodos de fiesta o vacaciones23-25. • Puede ser útil para desenmascarar, en algunos pacientes que reciben corticoides y/o β2 de larga duración, una inflamación subyacente, puesto que los β2 mejoran la función pulmonar y los síntomas, pero no reducen la eosinofilia del esputo26. • Valorar si mejora o no la inflamación en esputo en pacientes que siguen tratamiento con antileucotrienos27. • También nos puede ayudar el esputo sobre la existencia de inclusiones específicas en macrófagos (lípidos28, hemosiderina29,30).

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2.3.

Espacio físico

La zona de trabajo debe ser independiente para garantizar la individualidad del paciente, proporcionándole el máximo confort, y estar bien ventilada para evitar concentraciones excesivas ocasionadas por el nebulizador. Por otra parte, el personal que realice la prueba debe permanecer aproximadamente a 1 m de distancia, mientras el paciente realice la nebulización y las posteriores maniobras de toser.

Procedimiento para la inducción del esputo

2.4.

Equipos y material

• Solución salina isotónica (0,9%) e hipertónica (3, 4, 5%). • Jeringas de 10 ml y agujas de transferencia (19 G). • Nebulizador ultrasónico. • Espirómetro. • Inhalador β2-agonista de corta duración y su cámara espaciadora. • Reloj o cronómetro. • Recipientes para recoger el esputo (normalmente frascos de recogida de orina estériles). • Calculadora y hoja de recogida de datos. • Refrigerador o nevera para almacenar las muestras hasta el procesado. • Material de limpieza. • Pinzas nasales. • Agua potable y vaso. • Pañuelos desechables. Para la inducción del esputo los nebulizadores ultrasónicos son los preferidos, ya que proporcionan mayor éxito a pesar, incluso, de utilizar un flujo menor (entre 0,87-2,5 ml/min) que los nebulizadores tipo jet. Se han objetivado importantes diferencias entre los nebulizadores ultrasónicos, y por ello es recomendable que cada grupo seleccione un nebulizador de reconocidas características y procure utilizar siempre el mismo. El nebulizador ideal debería proporcionar un flujo estable de alrededor de 1 ml/min de solución nebulizada con un tamaño de partícula medio (AMMD) de entre 2-5 μm para que la penetración y depósito bronquial sean idóneos. Los nebulizadores más utilizados en la literatura han sido Fisoneb (ahora llamado nebulizador electrónico Medix, comercializado por Clement Clarke International Ltd) y el DeVilbiss Ultra-Neb 99 y el Ultra-Neb 2000, cuyo flujo es regulable. Otras alternativas en nuestro medio incluyen el nebulizador OMRON, PARI, Trudell, etc. Algunas direcciones de interés son: • PARI®. Laboriser (Lepanto, 328. Barcelona. Tel.: 933473408). • OMRON®. Peróxidos Farmacéuticos, SA (Gran Via de les Corts Catalanes, 533, pral. Barcelona. Tel.: 934517878). • DeVilbiss®. Guido Rayos X, SA (Aragó, 485. Barcelona. Tel.: 932455395). De la misma forma, la solución salina hipertónica es más efectiva que la isotónica, pero puede causar broncoconstricción. Ésta se evita con la administración previa de un β2-adrenérgico. En pacientes en los que se utilice una solución salina hipertónica se utilizarán concentraciones crecientes para evitar o controlar su efecto broncoconstrictor. La inducción con un aerosol de solución salina isotónica (0,9%), dada con precaución y periodos de tiempo más cortos, también puede ser segura en pacientes con una exacerbación intensa de asma o con una limitación importante al flujo aéreo.

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2.5.

Personal

Para la obtención del esputo se recomienda una enfermera; un técnico, biólogo, o similar para su procesado. Éstos deben tener la suficiente preparación para conseguir una muestra de calidad, en las mejores condiciones posibles, poder realizar un correcto procesado y recuento final.

Procedimiento para la inducción del esputo

2.6.

Procedimiento

• Utilizar la solución salina a las distintas concentraciones a temperatura ambiente. Antes de utilizarla comprobar la fecha de caducidad, que normalmente se reduce a 3 meses, para evitar contaminaciones. • Informar al paciente de la intención de la prueba y de cómo será realizada. Obtener un consentimiento informado. • Usar una hoja de recogida de datos para el esputo inducido. • Realizar una espirometría registrando el FEV1 como parámetro de control. • Administrar al paciente la dosis habitual de agonista β2 de corta duración. • Esperar 10 min y medir de nuevo el FEV1. Usar el mejor FEV1 para calcular cualquier descenso posterior. • Si el FEV1 posbroncodilatador es 1,5 l o menor, no continuar la prueba excepto bajo supervisión médica. Nunca comenzar la prueba si el FEV1 es menor de 1 l. • Explicar al paciente cómo obtener esputo desde sus pulmones por medio de la tos y el carraspeo profundos. • Teniendo en cuenta el débito de flujo del nebulizador seleccionado, colocar una cantidad de solución salina suficiente para que sobre un poco tras 7 min de inhalación (entre 9-25 cc). Conectar el nebulizador siguiendo las instrucciones del fabricante para obtener el flujo deseado (preferible alrededor de 1 ml/min). Conectar el paciente a la boquilla del nebulizador y mantenerlo inhalando el aerosol durante 7 min. No es preciso usar pinzas nasales. La inhalación se parará si aparece tos persistente, tirantez torácica, sibilancias o disnea. Otros efectos secundarios de menor importancia que pueden aparecer son atragantamiento, picor o quemazón faríngeos, etc. • Pedir al paciente que de nuevo se suene la nariz, se enjuague la boca y que intente expectorar esputo que proceda de sus bronquios en el recipiente, evitando la contaminación por secreción posnasal o saliva. • Realizar una nueva espirometría para obtener el FEV1. • Si el FEV1 no disminuye más del 10% repetir los pasos 10-12 con solución salina al 4% durante otros 7 min, y, posteriormente, continuar con la solución al 5%. • Si el FEV1 desciende entre 10-20%, no aumentar la concentración de la solución salina. Repetir los pasos 10-12 con la misma concentración de solución salina hasta hacer 3 series de 7 min (21 min), o el FEV1 descenderá más del 20%.

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• Si el FEV1 desciende más del 20% o apareciesen síntomas preocupantes, parar la prueba y dar tratamiento con un adrenérgico β2. • Procesar el esputo tan rápido como sea posible. Si hay algún retraso, mantenerlo en la nevera y procesarlo antes de 2 h. • Limpiar el nebulizador de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Procedimiento para la inducción del esputo

2.7.

Seguridad

La inhalación de un aerosol de solución salina hipertónica puede causar broncoconstricción31. Esto es evitado con el pretratamiento con salbutamol. Sin embargo, el grado de protección dependerá de varios factores como las características del sujeto, la cantidad de solución inhalada y la cantidad de β2-agonista usada recientemente. La inducción del esputo con solución salina hipertónica en concentraciones crecientes es segura en sujetos con asma leve o moderadamente exacerbada. La inducción con un aerosol de solución salina isotónica (0,9%), dada con precaución y periodos de tiempo más cortos, también puede ser segura en pacientes con una exacerbación grave de asma32 o con una limitación intensa al flujo aéreo33,34.

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2.8.

Recomendaciones

• Si el paciente desea expectorar en cualquier momento del periodo de inhalación, apagar el nebulizador y el reloj e intentar que frene la maniobra para que se enjuague la boca y recogerlo posteriormente. • Si el paciente indica que no tiene ninguna secreción y su tos suena muy seca con las inhalaciones iniciales, sugerirle que realice una respiración profunda y que tosa una o dos veces, entonces continuar con la siguiente inhalación para no cansar al paciente y producirle picor de garganta. A veces, si el paciente no tose espontáneamente al acabar la inhalación, es conveniente dejarle descansar durante 1-2 min y entonces que intente toser de nuevo. • Recordar al paciente que expulse las secreciones de su garganta usando los músculos cervicales y faríngeos. Es importante indicarles que no deglutan el esputo. • Escuchar cómo tose el paciente para asegurarse de que la muestra proviene de los pulmones y no son secreciones posnasales. • Si el primer intento de inducción no tiene éxito, considerar repetirlo otro día.

Procedimiento para la inducción del esputo

2.9.

Limpieza del equipo

Una limpieza y secado cuidadosos son esenciales para un buen mantenimiento higiénico del equipo. Hay que llevarlo a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante del nebulizador. Procurar limpiar todos los elementos con agua corriente y, sobre todo, evitar restos de sal en el aparato, ya que la producción de cal podría dañarlo seriamente. Consiste en desconectar la tubuladura que une al paciente con el nebulizador ultrasónico, así como sacar el reservorio donde se han depositado las sales junto con agua destilada, más las partes de plástico que sujetan el reservorio al nebulizador. Se lavan todas las piezas con una esponja y jabón, aclarándolas con abundante agua. La limpieza asegura que los microorganismos adheridos al material utilizado sean eliminados junto con la materia orgánica. 1. Desinfección El glutaldehído-fenolato ha sido considerado como el desinfectante de alto nivel de referencia a una dilución 1/16, durante 10 min a temperatura ambiente y con una estabilidad de 30 días. También se ha demostrado que es compatible con diferentes tipos de materiales (plásticos, gomas sintéticas de silicona, cristal, aluminio y compuestos de silicona para sellar), siendo especialmente respetuoso con ellos. 2. Procesado del esputo 2.1. Equipo y material • Reactivos. − Agua destilada. − Solución salina de Dulbecco tamponada con fosfatos (PBS). − Metanol (Cat. Ref. 1.06012.0500). Merck Farma y Química, SA (Buenaventura Muñoz, 10 bis. 08018 Barcelona. Tel.: 934850659). − Reactivo Sputolysin® Reagent (solución stock de DTT concentrado 0,9065%) (Cat. Ref. 560000). Calbiochem-Novabiochem Corporation, La Jolla, CA, USA. Distribuido por Merck Farma y Química, SA. Bionova Científica, SL (Abtao, 5, oficina 3. 28007 Madrid. Tel.: 914334545) e Itisa Biomedicina, SA (Edif. Europa, 1-2-1, Ctra. Fuencarral-Alcobendas km 15.700. Alcobendas. 28108 Madrid. Tel.: 916572393). − Tinción de Wright modificada (Wright-Giemsa) o, en su defecto, de MayGrünwald-Giemsa (May-Grünwald modificada). También servirían sus equiva-

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lentes rápidos (tinción rápida de Grifols, Diff-Quick®, etc.). Distribuidos por Merck y Grifols (Grifols, Movaco, SA) (Jesús i Maria, 6. 08022 Barcelona. Tel.: 935710450). − Azul de tripano 0,4% (trypan blue solution 0.4%. Cat. Ref. T-8154). Sigma-Aldrich Química, SA (Apdo. 161. Alcobendas. 28100 Madrid. Tel.: 900101376). • Equipo y otros materiales. − Discos de cultivo de Petri. − Pinzas de punta fina. − Tubos de Eppendorf de 2 ml. − Balanza de precisión. − Mezclador de líquidos para tubos (Vortex® o similar). − Pipetas de Pasteur de 3,5 ml desechables. − Banco mecedor de tubos de sobremesa. − Filtro de nylon con poros de 48 μm. − Embudo de polipropileno (plástico) o cristal de unos 5,5 cm de diámetro. − Tubos cónicos de poliestireno (plástico) de 10 ml. − Cronómetro o reloj de laboratorio. − Hojas absorbentes. − Cámara de recuento de Neubauer (citométro). − Portaobjetos para citología. − Recipientes de citocentrífuga. − Centrifugadora con adaptadores para tubos y posibilidad de cytospins (Hettich), o citocentrifugadora (p. ej. Shandon III). Distribuido entre otros por: Grifols (véase arriba), Pacisa (Pacisa-Giralt) (Diputació, 119-121, 2.a planta. 08015 Barcelona. Tel.: 934513000) o Nirco (Nirco, SA, Polígono Industrial Salvatella) (Avda. Salvatella, 4. Barberà del Vallès. 08210 Barcelona. Tel.: 937180808). − Microscopio óptico (con objetivos de 4×, 10×, 40× y 100× y ocular 10×), preferiblemente de los denominados de contraste de fases. Se basa en las modificaciones de la trayectoria de los rayos de luz, los cuales producen contrastes notables en la preparación que son especialmente útiles para el recuento en fresco con la cámara de Neubauer. − Archivador. • Equipo opcional. − Microscopio óptico invertido (alternativa al de contraste de fases que también resalta las células en fresco) con objetivo de 10× o lupa binocular. 2.2. Procedimiento • Protocolo de procesado para obtener una solución de células sin moco. − Preparar 10 ml de solución de trabajo de DTT añadiendo 9 ml de agua destilada a 1 ml de la solución de stock de DTT (Sputolysin®). Mezclar durante 15 s. Esta solución de trabajo debe ser preparada cada día y desechado el sobrante.

Procedimiento para la inducción del esputo

− Depositar la muestra entera de esputo en el disco de Petri, desde el recipiente de recogida, y anotar la apariencia macroscópica del esputo en la hoja de datos. − Con unas pinzas finas, seleccionar los tapones de esputo que se observen hasta conseguir un peso entre 100-800 mg. En general, recoger todos los tapones que se pueda, pero siempre procurando que no haya contaminación salivar. La técnica es personal, pero consiste en capturar cada tapón del expectorado, y sobre una zona del disco de Petri donde no haya expectorado (seca) se frota la muestra tantas veces como creamos necesario hasta que la muestra esté «libre» de saliva. − En ocasiones, no es fácil distinguir los tapones de moco bronquial de los restos de alimentos u otros productos. Utilizar el microscopio invertido o la lupa binocular para identificar las piezas celulares. − Depositar la muestra seleccionada sobre un tubo de 2 ml (o 10 ml, si pesase más de 250 mg) con tapón (previamente pesado [A]) y pesar el conjunto, anotando el peso (B) en gramos en la hoja de datos. El peso del esputo (C) será la diferencia entre ambos (A – B = C). − Añadir un volumen de solución de trabajo de DTT (en ml) igual a 4 veces el peso del esputo (en gramos) (4 × C = D ml de DTT). − Agitar en el mezclador durante 10-15 s a velocidad media. Si no hay mezclador, agitar manualmente el tubo girándolo e invirtiéndolo. − Aspirar y tirar suavemente con una pipeta de Pasteur desechable de 5-10 veces. Asegurarse visualmente que la muestra está adecuadamente mezclada. Si no lo estuviese, repetir el proceso 5-10 veces más. − Agitar de nuevo en el mezclador durante 10 s a velocidad media. − Tapar el tubo de forma segura y colocarlo en el banco mecedor durante 15 min. − Añadir un volumen de PBS igual al de la solución de trabajo de DTT empleada (D ml de PBS). − Agitar en el mezclador durante 10-15 s a velocidad media. − Filtrar la solución resultante con una pieza de 2 × 2 cm de gasa de nylon de 48 μm (empapar antes levemente el tejido con PBS) que estará depositada sobre el embudo con un nuevo tubo de 2 ml. Otra posibilidad para muestras pequeñas (< 250 mg) es disponer el filtro entre una aguja gruesa y una jeringa de 10 ml, depositar la solución de esputo en el émbolo abierto de la jeringa y colocar el pistón con cuidado. Presionando suavemente, hacer pasar el esputo al tubo de 2 ml a través del filtro y la aguja. • Protocolo para el recuento celular total (TCC) y viabilidad. − Aspirar con una micropipeta una alícuota de 20 μl de la suspensión celular filtrada en el tubo de la citocentrífuga y combinar con 20 μl de una solución al 0,4% de azul de tripano y agitar suavemente. Dejar reposar 2 min.

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− Llenar la cámara de recuento de Neubauer con 10 μl de esta nueva solución teñida. − Contar todas las células (incluidas las escamosas) presentes en cada cuadro de esquina de 1 × 1 mm y en las cuatro esquinas de la cámara (cada uno de ellos tiene 16 cuadraditos de 0,25 × 0,25 mm). − Clasificar las células como viables (V) o no viables (NV) cuando se realiza el recuento y las células escamosas (CE) independientemente de su viabilidad. La tinción del azul de tripano, también llamada método de exclusión del azul de tripano, colorea aquellas células cuya membrana celular no está intacta, excluyendo (de ahí el nombre) aquellas que están intactas, sanas o viables. Por lo tanto, distingue como células viables aquellas que no tiñen de azul, y como no viables aquellas que sí tiñen de azul. − Anotar el recuento total (E) en la hoja de datos. El recuento celular total (RCT) será el total (E) menos las células escamosas contaminantes (CE) (E – CE = RCT). El porcentaje de células contaminantes será CE/E × 100 = %CE. − Calcular el porcentaje de células viables o viabilidad dividiendo el número de células encontradas viables (V) por el recuento celular total (RCT) de células no escamosas encontradas (viables más no viables) (V/RCT × 100 = %V). • Protocolo de preparación de cytospins y recolección del sobrenadante. − Calcular la concentración de cel/ml de la suspensión celular filtrada y ajustar con PBS para obtener una concentración teórica de alrededor de 1 × 106 cel/ml. Concentración considerada ideal para el recuento celular con cytospins. − Preparar las cytospins en la citocentrífuga añadiendo 60 μl de suspensión celular y centrifugando a aproximadamente 300 g (450 rpm en una Shandon III) durante 6 min. − Dejar la cytospin secarse completamente a temperatura ambiente y teñirla con la tinción que usemos (Wright modificada o May-Grünwald-Giemsa). − Centrifugar el resto de la solución celular en un tubo de Eppendorf a 3.000 rpm (alrededor de 750 g durante 4 min). − Aspirar el sobrenadante respetando el sedimento celular. − Repartir y depositar el sobrenadante en tubos de Eppendorf y almacenarlos a –70 °C hasta análisis. Esta temperatura es ideal para largas conservaciones o sustancias muy sensibles, pero el almacenado a –20 °C por cortos periodos (días, semanas) también es factible. • Protocolo de preparación de extensiones y recolección del sobrenadante. Este procedimiento es alternativo al recomendado con cytospins y está indicado en el caso de carecer de una citocentrífuga. Ha sido probado en nuestro laboratorio con buenos resultados. − Centrifugar la solución celular filtrada en un tubo de Eppendorf a 3.000 rpm (alrededor de 750 g durante 4 min). − Aspirar el sobrenadante respetando el sedimento celular.

Procedimiento para la inducción del esputo

− Repartir y depositar el sobrenadante en tubos de Eppendorf y almacenarlos a –70 °C hasta análisis. Esta temperatura es ideal para largas conservaciones o sustancias muy sensibles, pero el almacenado a –20 °C durante cortos periodos (días, semanas) también es factible. − Reconstituir el sedimento celular con 50 μl de PBS. Aspirar y expulsar varias veces para distribuir bien el sedimento celular. − Preparar las extensiones depositando una o dos gotas de esta suspensión celular sobre un portaobjetos y extender suavemente formando un círculo. − Dejar la extensión secarse completamente a temperatura ambiente y teñirla con la tinción que usemos (Wright modificada o May-Grünwald-Giemsa). Brevemente, la tinción de May-Grünwald-Giemsa se obtiene de la siguiente forma en nuestro laboratorio: el portaobjetos con la extensión o el cytospin se dejan secar bien al aire, se prepara un buffer (Na2HPO4 0,1192 g + KH2PO4 0,0907 g + 10 ml agua), se fija la muestra en metanol durante 3 min, se tiñe en cubeta con el May-Grünwald 5 ml + buffer 5 ml durante 3 min, se lava con agua bidestilada, se tiñe con Giemsa 0,75 ml + buffer 4,25 ml durante 7 min y, finalmente, se lava en agua bidestilada y se deja secar. − Otras tinciones son posibles dependiendo de nuestro interés. Las más usadas son el aceite O rojo para el estudio de las inclusiones lipídicas en los macrófagos, y el azul de Prusia para los hemosiderofágos. Igualmente, las tinciones de inmunocitoquímica son posibles. Para una completa referencia de estos procedimientos es preciso dirigirse a textos especializados.

MANUAL SEPAR DE PROCEDIMIENTOS

2.10.

Procedimiento de recuento celular para las preparaciones de esputo y otras muestras biológicas respiratorias

Hay tres pasos decisivos en el proceso de diagnóstico citopatológico aplicado al esputo (inducido o no) para su aplicación en el seguimiento y control de procesos inflamatorios de vías aéreas: 1) la recolección de una muestra que contenga células representativas de la enfermedad que pretendemos estudiar; 2) la preparación y recuento de dicha muestra de tal forma que no se pierdan células aunque preservando sus características morfológicas para identificarlas, y 3) que se cuantifiquen de la manera más exacta posible. Este tercer punto es de vital importancia para la aplicación clínica de la técnica. La toma de decisiones clínicas (supresión o inicio de un tratamiento corticoideo...) está basado en la comparación de la distribución celular obtenida en el esputo del enfermo, con una distribución celular de referencia obtenida de esputos de sujetos sanos. Por ejemplo, la célula de mayor importancia, el eosinófilo, supone en sujetos normales menos del 2% del total de células inflamatorias presentes en la muestra. Con márgenes tan estrechos debe asegurarse un recuento lo más exacto posible. Esto motiva que el personal encargado esté familiarizado y bien entrenado en el reconocimiento celular. En muchos hospitales, dada la proverbial dificultad de que los anatomopatólogos cuantifiquen una muestra, los hematólogos suelen ser un buen aliado para obtener un recuento fiable, o bien nos ayuden a la formación de nuestro personal. La metodología para realizar este recuento es clásica, y ha sido establecida para su uso con el esputo de la siguiente forma: • Utilizando 40 aumentos (objetivo de 4× y visor de 10×) se realiza una pasada rápida por toda la preparación para identificar las zonas donde haya una distribución homogénea de las células. • El recuento se realiza centrando el microscopio sobre una zona adecuada de la misma (elegida al azar), y desde una de sus esquinas se cuentan todas las células que aparezcan en el campo. Una vez contadas, se cambia a otro campo siguiendo un camino helicoidal (de arriba hacia abajo y desde ahí hacia la derecha, y de nuevo desde abajo hacia arriba y luego a la derecha, etc.). Se continúa hasta cubrir un mínimo de 400 células inflamatorias. Es importante contar al menos 400 células, ya que de otra forma la reproducibilidad de los recuentos se resentiría. • El recuento se realiza a 400 aumentos (objetivo de 40× y visor de 10×) y los porcentajes relativos se obtienen a partir de estas 400 células. No deben incluirse células epiteliales de vías altas. • En el caso de que hayan pocas células se intentará cubrir el mayor número de campos (incluso toda la preparación) posible para asegurarse un mínimo de 100 recuentos.

Procedimiento para la inducción del esputo

2.11.

Interpretación de los resultados del recuento celular

La interpretación del recuento celular debe tener en cuenta la viabilidad celular, el grado de degeneración celular y el grado de contaminación escamosa celular como indicadores de buena calidad, pero se basa en los recuentos total y diferencial de eosinófilos, neutrófilos, basófilos, macrófagos/monocitos, linfocitos y células bronquiales epiteliales. 1. Calidad de la muestra Si la viabilidad celular es baja con un alto grado degeneración celular, el recuento celular total puede ser artificialmente bajo y el recuento diferencial puede ser inexacto. Si la contaminación escamosa es alta, se asume que la cantidad de esputo procedente del tracto respiratorio inferior es baja en la muestra procesada. Cantidades excesivas de contaminación escamosa pueden producir menor fiabilidad en el recuento diferencial celular al dificultar la identificación de otras células por yuxtapo sición (son células muy grandes) y, además, supone una muestra de dudosa representabilidad del tracto respiratorio inferior. La presencia de macrófagos indica que la muestra es del tracto respiratorio inferior y, aunque también pueden observarse monocitos, éstos suelen aparecer en las secreciones del tracto respiratorio superior (secreción nasal) donde no hay macrófagos. Por lo tanto, en las muestras con una proporción excesiva de monocitos (> 10%) debe sospecharse gran contaminación nasal. 2. Valores de referencia y características de ciertos grupos Los valores de referencia para el recuento celular total y diferencial en sujetos sanos pueden consultarse en las tablas I y II. El recuento celular total se incrementa en muchas enfermedades respiratorias como la EPOC, el asma no controlada, fumadores y, particularmente, en las infecciones. El recuento celular total alcanza sus valores máximos en la infección bacteriana. La proporción de neutrófilos es mayor en los fumadores con LCFA que en aquellos que no tienen LCFA, y es la máxima observable cuando presentan exacerbaciones infecciosas. 3. Eosinófilos En sujetos sanos aparecen muy pocos eosinófilos (cercano al 0%). Se consideran anormales valores por encima del 3%. Un aumento de los eosinófilos en el esputo se observa en la bronquitis eosinofílica con o sin las características de asma. La bronquitis eosinofílica sin asma suele asociarse con tos crónica productiva o no, y su

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Recuento celular total y diferencial (absolutos, ×106 cels/g) en esputo

Tabla I

Media (SD)

Recuento celular total Eosinófilos Neutrófilos Macrófagos Linfocitos Células metacromáticas Células bronquiales epiteliales

4,129 0,013 1,962 2,126 0,043 0,000 0,014

(4,814) (0,037) (3,027) (2,027) (0,069) (0,001) (0,037)

Rango normal Media −2 SD

Media +2 SD

−4,599 −0,061 −4,092 −1,928 −0,095 −0,002 −0,06

13,757 0,087 8,016 6,18 0,181 0,002 0,088

Mediana (IQR)

2,400 0,000 0,865 1,644 0,018 0,000 0,006

(3,188) (0,008) (1,959) (1,873) (0,048) (0,000) (0,010)

Percentiles 10

0,672 0,000 0,098 0,296 0,009 0,000 0,000

9,732 0,042 4,860 4,859 0,086 0,001 0,031

(Belda J, et al. Am J Respir Crit Care Med 2000;161[2 Pt 1]:475-8).

Tabla II

Recuento diferencial celular (porcentajes) en esputo

Media (SD)

Eosinófilos Neutrófilos Macrófagos Linfocitos Células metacromáticas Células bronquiales epiteliales

0,4 (0,9) 37,5 (20,1) 58,8 (21,0) 1,0 (1,1) 0,0 (0,04) 1,6 (3,9)

Rango normal Media −2 SD

Media +2 SD

−1,4 −2,7 16,8 −1,2 −0,1 −6,2

2,2 77,7 100,8 3,2 0,1 9,4

(Belda J, et al. Am J Respir Crit Care Med 2000;161[2 Pt 1]:475-8).

Mediana (IQR)

0,0 36,7 60,8 0,5 0,0 0,3

(0,3) (29,5) (28,9) (1,8) (0,0) (1,3)

Percentiles 10

0,00 11,0 33,0 0,01 0,00 0,00

1,1 64,4 86,1 2,6 0,04 4,4

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diagnóstico es imposible sin un recuento de eosinófilos en secreción respiratoria del tracto inferior. Un descenso en el número de eosinófilos también se ha asociado con el efecto beneficioso de añadir corticosteroides, siendo un factor predictivo del éxito del tratamiento23. 4. Neutrófilos Como se ha mencionado, los neutrófilos aparecen aumentados en los fumadores respecto a no fumadores, y en población urbana respecto a la rural. Su valoración se hace considerando el recuento celular total. La presencia de neutrofilias mayores del 60% con RCT superiores a 15 millones/ml indica infección en asmáticos, y si el RCT es superior a 25 millones/ml es muy sugestivo de infección bacteriana, al igual que neutrofilias superiores al 80%. Su valor en la EPOC está menos establecido. 5. Otras células Los linfocitos son difíciles de identificar de forma exacta, por lo que tienden a incluirse entre los macrófagos/monocitos, obteniéndose valores muy bajos. Actualmente, su recuento tiene escasa utilidad práctica, excepto cuando hay un aumento de linfocitos acompañado de un moderado incremento del recuento celular total, y de neutrófilos, que es altamente sugestivo de infección virica. La presencia de abundantes células bronquiales suele verse en las viriasis y en la recuperación de exacerbaciones asmáticas. Su presencia fuera de esas circunstancias es de significado desconocido. El valor del recuento simple de macrófagos no tiene valor clínico reconocido. Sin embargo, el estudio de su inmunofenotipo por citometría de flujo se ha descrito para el estudio de enfermedad intersticial, tuberculosis y otras enfermedades. Igualmente, el análisis de las inclusiones citoplasmáticas de los macrófagos puede aportar información interesante para el estudio de las broncoaspiraciones (inclusiones lipídicas), hemorragias alveolares o fallo cardíaco izquierdo (hemosiderófagos), cuerpos extraños por exposición laboral o viriasis.

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Medición de óxido nítrico en aire espirado

3.1.

Medición de óxido nítrico en aire espirado Introducción

Ana M.a Fortuna Núria Calaf Teresa Feixas Mercedes González Pere Casan Unidad de Función Pulmonar. Departamento de Neumología. Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Facultat de Medicina. UAB. Barcelona El óxido nítrico (NO) es una molécula cuya historia va unida a un Premio Nobel. En el año 1998, los investigadores R.F. Furchgott, L.J. Ignarro y F. Murad alcanzaron este preciado galardón gracias a sus descubrimientos relacionados con este compuesto. Se trata de un gas incoloro, poco soluble en agua, altamente inestable en el aire, donde se oxida rápidamente, y por cuya razón se clasifica dentro de los radicales libres. El NO no debe confundirse con otros compuestos de oxígeno y nitrógeno (N2O: óxido nitroso; NO2: dióxido de nitrógeno, o N2O2: dióxido de dinitrógeno). El organismo produce una mínima cantidad de NO a partir del metabolismo del aminoácido arginina. Esta sustancia se trata de un potente mediador celular a la vez que un activo agente vasodilatador. La síntesis de NO se produce a partir de la acción de una enzima, la óxido nítrico sintetasa (NOS), de la que se conocen tres variantes, una de ellas inducible, no dependiente del calcio y que se expresa muy débilmente en situación fisiológica. Por el contrario, en determinadas situaciones donde existe un incremento de actividad inflamatoria (endotelial o epitelial), o una acumulación de células sanguíneas (eosinófilos) se produce un aumento de su actividad y la concentración de NO en el medio aumenta. Este hecho convierte a la determinación de la concentración de NO en el aire espirado (FENO) en un potencial marcador de la actividad inflamatoria local. En los últimos años hemos asistido a una amplia proliferación de equipos analizadores de esta concentración de NO, a la vez que se han publicado numerosos trabajos en los que se intenta relacionar este marcador de actividad inflamatoria con

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diferentes aspectos de varias enfermedades respiratorias, especialmente en el asma. Subyace en la mayoría de ellos la necesidad de disponer de marcadores biológicos de las enfermedades que permitan una facilidad diagnóstica (especialmente útil en pediatría), a la vez que una actitud pronóstica y una manera cómoda de regular el tratamiento y aumentar su relación beneficio/riesgo. En las páginas siguientes se presentan aquellos aspectos más determinantes para la perfecta utilización de la [FENO] como marcador de enfermedades respiratorias.

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3.2.

Fundamentos

Tal como se comentaba, el NO es un radical libre que se sintetiza a partir de la L-arginina mediante la enzima NO-sintetasa. Existen tres isoformas de esta enzima: la NO-sintetasa neuronal (NOS1 o nNOS), presente en células neuronales; la NOsintetasa inducible (NOS2 o iNOS), que presenta gran actividad, es inducida por citocinas inflamatorias, macrófagos y endotoxinas y cuya expresión aumenta en diversas enfermedades inflamatorias; por último, la NO-sintetasa endotelial (NOS3 o eNOS), que se expresa sobre todo en las células endoteliales. Las funciones del NO en el organismo son muy diversas, de las que cabe destacar su intervención en procesos inflamatorios y su función como potente vasodilatador endotelial. La producción de NO en la vía aérea sigue un modelo bicompartimental en el que la liberación de NO en la luz bronquial será proporcional a la diferencia entre la concentración de la luz y la concentración de la pared bronquial (ley de Fick) y, por lo tanto, dependerá del flujo de aire y de la capacidad de difusión del NO desde la pared bronquial hacia la luz. A su vez, la difusión dependerá de la concentración de NO en la pared del bronquio. Por lo tanto, la concentración final de NO en la vía aérea será la suma del transporte longitudinal desde la luz alveolar y la concentración del transporte transversal (difusión lateral de NO) de toda la vía aérea1. Hay evidencia científica de la existencia de alteraciones de la concentración de NO en la vía aérea de pacientes con enfermedades respiratorias con componente inflamatorio como el asma. Por ello, en los últimos años se ha desarrollo un método no invasivo para cuantificar la concentración de NO en la vía aérea como un marcador inflamatorio: determinación de NO en el aire espirado. Cuando se realiza una espiración, el óxido nítrico reacciona con el ozono produciéndose NO2, que, al estabilizarse, permite ser medido por quimioluminiscencia, emitiendo una radiación lumínica proporcional a la concentración de NO en el aire espirado. En la determinación de NO en el aire espirado y siguiendo el modelo bicompartimental antes comentado se pueden cuantificar dos concentraciones: la fracción de NO bronquial (FENO) y la concentración de NO del compartimento alveolar (Calv). En este manual se desarrollará la determinación de FENO como marcador de inflamación en pacientes con enfermedad respiratoria inflamatoria (sobre todo asma). La determinación del componente alveolar de NO (Calv) está aún en fase de investigación1.

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3.3.

Indicaciones, limitaciones, complicaciones y contraindicaciones

1. Indicaciones 1.1. El asma se caracteriza por presentar como mecanismo fundamental inflamación crónica de las vías aéreas responsable, en último término, de la hiperrespuesta bronquial y de la obstrucción al flujo aéreo reversible. Diferentes estudios han objetivado la existencia de un aumento de la síntesis de NO en las células epiteliales bronquiales interviniendo en el proceso inflamatorio del asma2. La utilidad de la determinación de FENO en el asma tendría las siguientes indicaciones: • Diagnóstico de asma. Se ha demostrado que la determinación de FENO presenta buena sensibilidad y especificidad en el diagnóstico de asma así como una mayor capacidad diagnóstica que los parámetros habitualmente utilizados, por ejemplo la función pulmonar3. • Detectar inflamación de la vía aérea. La determinación de FENO presenta buena correlación con el esputo inducido con la ventaja de ser más sencillo y menos invasivo que éste4. • Monitorización del tratamiento antiinflamatorio. Los niveles de NO disminuyen después del tratamiento antiinflamatorio con corticoides. La determinación de FENO es útil para valorar la introducción de tratamiento corticoideo, así como la modificación de la dosis y de la duración del mismo según los valores de FENO5,6. • Evaluar la adherencia al tratamiento. En aquellos pacientes en que se sospecha un mal cumplimiento del tratamiento como causa de la ausencia de control de la enfermedad. • Predicción de exacerbaciones. El aumento de la concentración de FENO en una agudización asmática se produce precoz y previamente a la presencia de síntomas y a la alteración de la función pulmonar del paciente, permitiendo el control y tratamiento de la agudización de forma precoz7. 1.2. Diagnóstico diferencial. La determinación de FENO permite descartar el diagnóstico de asma y realizar el diagnóstico de otras enfermedades (pacientes con atopia, tos crónica, etc.). 1.3. Monitorización de otras enfermedades respiratorias (neumopatía intersticial, EPOC, hipertensión arterial pulmonar, etc.). 1.4. Ensayos clínicos farmacológicos. 2. Limitaciones • Falta de comprensión o de colaboración del paciente. • Traqueostomía.

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3. No se han descrito complicaciones ni contraindicaciones 4. Espacio físico Se recomienda un espacio físico amplio para la incorporación del equipo de quimioluminiscencia, que suele presentar grandes dimensiones, las herramientas complementarias necesarias, bombonas de CO2 y de NO y el personal sanitario requerido. Debe ser un espacio individualizado y aislado acústicamente, puesto que el paciente requerirá concentración para controlar a la perfección su flujo espiratorio durante el procedimiento y para que el personal sanitario pueda realizar las indicaciones de forma individual y dirigida al paciente.

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3.4.

Ámbitos de realización

1. Hospital • El ámbito habitual para realizar la determinación de FENO es el hospitalario en el contexto de un servicio de neumología, ya sea el laboratorio de función pulmonar o el hospital de día. • Pediatría y neumología pediátrica. La utilización de la determinación de FENO es muy útil en la edad pediátrica por ser un método rápido, sencillo y factible en niños menores de 12 años, edad en la que la realización de espirometría o pruebas de provocación bronquial presentan dificultad. 2. Ambulatorio y domicilio La incorporación de equipos portátiles y muy sencillos permite la determinación de FENO en el contexto hospitalario agudo (sala de hospitalización, unidad de críticos), ambulatorio (consulta externa) y en el domicilio del paciente.

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3.5.

Personal: cualificación y preparación

• Titulación académica de diplomado de enfermería. • Experiencia en la realización de técnicas de medición de función pulmonar. • Experiencia en calibración de equipos y representación gráfica de señales. • Entrenamiento previo en un centro con experiencia. • Conocimiento de indicaciones y limitaciones de la técnica. • Habilidades comunicativas y experiencia en el trato con enfermos. • Capacidad para solucionar problemas técnicos. • Iniciativa en la toma de decisiones.

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3.6.

Equipos

1. Sensor de quimioluminiscencia8,9 Es el equipo más ampliamente introducido y utilizado en la práctica clínica. Es de grandes dimensiones y de uso hospitalario. Existen diferentes modelos en el mercado (SIR N-6008®, LR 2000 analyser®, NIOX® Aerocrine), sin embargo todos los equipos comparten los requerimientos fundamentales necesarios para la realización de la técnica con diferencias en detalles complementarios (Figs. 1 y 2). 1.1. Componentes del equipo • Analizador de óxido nítrico basado en el principio de quimioluminiscencia. • Tubuladura y pieza bucal para realizar la maniobra de espiración. En los equipos en los que la inspiración previa se realiza desde el aire ambiente (p. ej. SIR N-6008®) se utilizará una boquilla adaptada a la pieza en T espiratoria. En los equipos en los que la inspiración previa se realice desde el interior del equipo (NIOX® Aerocrine), éste cuenta con un filtro incluido en el interior del tubo de espiración, además de un filtro antiviral y antibacteriano individual a través del cual el paciente realiza las maniobras respiratorias. • Instrumentación para la realización de la medición de la presión bucal. • Instrumentación para la restricción del flujo bucal. • Módulo visualizador de biorretroalimentación. • Ordenador que incluye un software visual que facilita al paciente el procedimiento mediante un dibujo, sonido, luces, etc. • Impresora. Se recomienda la impresión de los resultados: valores de FENO, presión bucal, concentración de CO2 espirado, y sus gráficas correspondientes. 1.2. Precisión del equipo y margen de lectura La precisión de la mayoría de los equipos es de ± 1% y el margen de lectura varía entre 0-500 ppb. 1.3. Mantenimiento del equipo Se realizará siguiendo las instrucciones del fabricante. • Limpieza del tubo de espiración. • Comprobación diaria de circuitos. • Los filtros y boquillas que no sean desechables deben lavarse con agua y jabón y luego esterilizarse con métodos químicos.

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• Recambio de filtros. Los filtros PFTE de 5 μ previenen la entrada de bacterias o partículas al equipo y deben sustituirse una vez cada 3 meses. • Carbón activo. Sirve para eliminar el ozono resultante antes de su salida al ambiente. Se recomienda sustituirlo una vez al año. • Bomba. Sustitución de membranas de la bomba cada 2 años. • En los equipos que contengan estabilizadores (DRIERITE) se recomienda el control y recambio cada 15-30 días, según el cambio de coloración del estabilizador (de azul original a rosa). • El depurador de NO se deberá cambiar cada 6 meses. 1.4. Sistemas de calibración La calibración se realizará según las instrucciones del fabricante para cada equipo. • La periodicidad de calibración varía entre los diferentes modelos. Puede ser semanal o quincenal. • Se requerirá una bombona de óxido nítrico de una concentración conocida entre 100-200 ppb. El equipo realiza la calibración generando un histórico de NO para nuestro posterior control de calidad.

Figura 1. Sensor de quimioluminiscencia SIR N-6008.

1.5. Control de calidad • Calibración de NO a «0» antes de cada prueba. • Comprobación diaria de circuitos. • Filtros y controles bacteriológicos. • Prueba personal del laboratorio diaria.

Figura 2. Sensor de quimioluminiscencia NIOX® Aerocrine.

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• Calibración bombona NO cada 2-3 días. • Linealidad del analizador cada 3-4 meses. 2. Sensor electroquímico10 En los últimos años ha aparecido en el mercado un nuevo equipo portátil que permite la medición de FENO ambulatorio y en el domicilio del paciente. Es de pequeñas dimensiones y permite su utilización individual por el mismo paciente (Fig. 3). 2.1. Componentes del equipo • Analizador de óxido nítrico a partir de una reacción electroquímica (a diferencia del resto de equipos que lo hacen mediante quimioluminiscencia). • Es ligero, de pequeñas dimensiones (24 × 13 × 10 cm; 800 g) y portátil. Permite la realización de la maniobra por parte del paciente una vez instruido por el personal sanitario. • Sensor lumínico y acústico para facilitar y asegurar el flujo espiratorio. • La maniobra de inspiración previa a la espiración se realiza desde el interior del equipo. • Requiere un filtro antiviral y antibacteriano mediante el cual se realiza la maniobra. • El resultado aparece de forma digital en un display visible por el paciente (no facilita representación gráfica). • Una tarjeta digital guarda los resultados de las determinaciones del paciente, facilitando así el seguimiento de los valores de FENO. 2.2. Precisión y margen de lectura El equipo tiene una precisión inferior al 3% en determinaciones de menos de 30 ppb e inferior al 10% en valores mayores de 30 ppb. El margen de lectura es entre 5-300 ppb. 2.3. Mantenimiento y calibración Figura 3. Sensor electroquímico portátil NIOX MINO® Aerocrine.

El mantenimiento es mínimo. No requiere calibración.

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3.7.

Procedimiento

1. Recomendaciones previas • Evitar la toma de tratamiento broncodilatador inhalado y corticoide inhalado y/o sistémico previamente a la medición. En los pacientes que están en tratamiento y la realización de FENO se utiliza para modificar el tratamiento según sus resultados, el paciente realizará el tratamiento habitual y se recogerá el nombre del fármaco, la dosis y la hora. • Realizar la medición al menos 2 h después de la última ingesta. • Evitar la ingesta de alimentos ricos en nitratos (verduras como lechuga y espinacas), así como la ingesta de bebidas estimulantes (café, té, alcohol) en las horas previas a la medición. • Realizar la medición de FENO previamente a la realización de otras pruebas respiratorias como espirometría y esputo inducido. • Evitar la realización de ejercicio físico en la hora previa a la medición. • Recoger en la historia clínica la presencia de un proceso respiratorio infeccioso agudo. 2. Preparación del paciente • Observar las condiciones físicas del paciente para realizar la prueba. • Comprobar que las recomendaciones requeridas se cumplen. • Recoger en la historia clínica antecedentes de enfermedades infecciosas: hepatitis aguda, infección por VIH, tuberculosis pulmonar aguda, etc. • Acomodar al paciente y explicar el procedimiento. 3. Preparación del equipo • El equipo debe estar calibrado y preparado para su utilización. • Recoger en la hoja de datos los datos personales del paciente y la concentración de NO ambiental. • Colocar la boquilla o el filtro en el tubo de la espiración. 4. Determinación de FENO 4.1. Técnica. Hay dos técnicas para la determinación de FENO • Técnica on line: la determinación de FENO se realiza directamente en el aire espirado.

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Figura 4. Realización de determinación de FENO mediante el sensor SIR N-6008.

Figura 5. Realización de determinación de FENO mediante el sensor NIOX® Aerocrine.

• Técnica off line: el aire espirado se almacena y la determinación de FENO se realiza posteriormente. Las dos técnicas están internacionalmente estandarizadas8,9, sin embargo la técnica on line es la utilizada habitualmente en la práctica clínica y, por lo tanto, será la que se desarrolle en este manual. Para más información sobre la determinación mediante la técnica off line se recomiendan las guías internacionales8,9. El proce dimiento de la técnica on line es el siguiente:

Medición de óxido nítrico en aire espirado

• Acomodar al paciente en una silla con la espalda recta. En esta posición se consigue un volumen de espacio muerto inferior a 10 ml, con lo que se garantiza la rápida recogida de muestra respiratoria útil. • Explicar el procedimiento al paciente. • No es necesario utilizar pinza nasal. El equipo realiza una resistencia bucal entre 5-20 cm H2O que asegura el cierre del velo del paladar y evita la contaminación con el óxido nítrico procedente de las fosas nasales. • El paciente realiza una inspiración hasta capacidad pulmonar total. DeFigura 6. Realización de determinación de pendiendo del equipo, la inspiración FENO mediante el sensor portátil se realiza o bien desde el aire amNIOX MINO® Aerocrine. biente (SIR N-6008®) o bien desde el interior del equipo (NIOX® Aerocrine y NIOX MINO® portátil). • Desde capacidad pulmonar total se realiza una espiración a un flujo constante de 50 ml/s durante 10 s. Durante la espiración un marcador visual ofrecido por el software del equipo ayudará al paciente a mantener la espiración al flujo requerido (50 ml/s) (Figs. 4 y 5). • Es necesario realizar tres determinaciones correctas y la determinación de FENO final será el promedio de las tres maniobras aceptables. Una maniobra correcta no debe diferir de la anterior (bien realizada) en ± 2,5 ppb o un 10%. No es conveniente realizar más de seis maniobras. • Con el sensor electroquímico portátil la técnica es la misma, pero sólo requiere una determinación válida. Sus dimensiones y el sensor lumínico sonoro que informa al paciente para que mantenga la espiración constante en el tiempo son sus características diferenciales (Fig. 6). • El análisis de los resultados en algunos equipos es manual (SIR N-6008®) y en otros es automático (NIOX® Aerocrine). 4.2. Errores frecuentes • Imposibilidad por parte del paciente para mantener el flujo a 50 ml/s de forma constante. • Imposibilidad por parte del paciente para mantener la espiración durante 10 s. • Humedad y oclusión del tubo de espiración.

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3.8.

Resultados

1. Expresión La concentración de NO en aire espirado (FENO) se expresa en partes por billón (ppb). 2. Cálculo y representación del resultado • El trazador del sensor desestima el pico inicial de espiración y mide un plateau válido, considerado como aquella meseta estable de al menos 3 s y que presenta un gradiente de variabilidad inferior a 10% (Fig. 7). • El resultado final es el promedio de las tres determinaciones válidas según los criterios mencionados. • El equipo facilita una gráfica que representa el resultado de FENO (ppb) respecto al tiempo (s) (Fig. 7). • El equipo electroquímico portátil sólo requiere una determinación válida. No realiza una representación gráfica del resultado. El equipo facilita mediante un display la determinación de FENO (ppb) única requerida en números digitales y la posibilidad de guardarlo en una tarjeta digital para comparar con las sucesivas determinaciones. 3. Valores de referencia La existencia de múltiples modelos de equipos de determinación de FENO hace necesaria la realización de valores de referencia según los cuales se puedan tomar conclusiones diagnósticas y terapéuticas. El valor de FENO no es definitorio por sí mismo de un diagnóstico o de un tratamiento. Se debe tener en cuenta la historia clínica del paciente en el momento de la realización de la medida y su función pulmonar, y así, en conjunto, tomar conclusiones diagnosticoterapéuticas. La utilidad de la FENO es complementaria. Para ello, se han establecido los siguientes valores de referencia11,12.

Figura 7. Representación gráfica del resultado de FENO.

Medición de óxido nítrico en aire espirado

Tabla I

Valores de referencia de FENO en el diagnóstico de asma (sensor de quimioluminiscencia)

FENO

Adultos. FENO (ppb)

Bajo

Normal Normal-alto

5-20 20-35

Muy alto

> 35

Significado Descarta asma Valorar otros diagnósticos Individuo sano Sugestivo Confirmar con la historia clínica Diagnóstico

Niños (< 12 años) FENO (ppb) <5 5-15 15-25

> 25

3.1. Sensor de quimioluminiscencia • Los valores de referencia establecidos por las recomendaciones internacionales para la concentración de FENO en voluntarios sanos se encuentran en un rango entre 10-20 ppb. El estudio en población española de Calaf N, et al.13 estableció que una concentración de FENO inferior a 20 ppb se encuentra dentro del margen de referencia. • Valores de FENO ≥ 20 ppb: − En el diagnóstico de asma. La tabla I resume la relación entre los valores de FENO y el diagnóstico de asma. − En el control de la enfermedad asmática. En principio, en un paciente asmático en tratamiento corticoideo que presente valores de FENO ≥ 20 ppb se recomienda descartar: – Falta de cumplimiento del tratamiento. – Realización incorrecta del tratamiento. – Sospechar un diagnóstico diferente de asma. – Situación previa a una agudización. – Agudización asmática aguda. – Resistencia a corticoides. Existen varios estudios que intentan establecer valores de FENO según los cuales realizar el control y monitorización del tratamiento de un paciente asmático6,7. Sin embargo, no existe una relación estandarizada entre los valores de FENO y la actitud terapéutica a tomar que se pueda utilizar hoy día en la práctica clínica de forma sistemática.

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Tabla II

Valores de referencia de FENO. Sensor de quimioluminiscencia y sensor electroquímico portátil (NIOX MINO®)14

Sensor de quimioluminiscencia FENO (ppb)

Significado clínico según los valores de FENO

5-20

Valores dentro del margen de 10-35 referencia Individuos sanos Niveles altos: valorar el > 35 diagnóstico de asma; modificación del tratamiento

> 20

Sensor electroquímico portátil FENO (ppb)

NO (ppb)

Lo más importante es establecer valores de referencia en nuestra población, que cumplan los rangos establecidos por los resultados estandarizados y utilizar estos valores en la práctica clínica. Se recomienda: • Realizar el diagnóstico en la primera visita: historia clínica, síntomas, función pulmonar y determinación N-6008: 7 ± 5 ppb de FENO. NIOX-MINO 20 ± 8 ppb 40 • Mediante la realización de FENO en la primera visita se establecerá el valor de FENO de ese paciente previa al 30 tratamiento y se decidirá el tratamiento basándose en el resultado y el contexto clínico (según los valores de 20 referencia establecidos). • Realizar la determinación de FENO 10 en cada visita del paciente. • Realizar una tarjeta de recogida de valores de FENO del paciente y anotar en ella los valores corresponN-6008 NIOX-MINO dientes a la determinación de cada Figura 8. Comparación de los valores de visita. FENO entre el sensor de quimiolu• Modificar el tratamiento de acuerdo miniscencia y el sensor electrocon los valores de FENO y la clínica químico portátil14. del paciente en cada visita.

Medición de óxido nítrico en aire espirado

3.2. Sensor electroquímico portátil La determinación de FENO con el sensor electroquímico portátil presenta valores de FENO superiores y correlacionados con los valores obtenidos con equipos de quimioluminiscencia14. Si se dispone del equipo portátil NIOX MINO® es recomendable utilizar los valores de referencia establecidos recientemente14. • FENO < 35 ppb: individuo sano. • FENO ≥ 35 ppb: valor patológico. Realizar actitud diagnosticoterapéutica comentada anteriormente para el equipo de quimioluminiscencia, pero utilizando 35 ppb en vez de 20 ppb como valor de referencia (Tabla II). • Si se compara con los valores obtenidos con un sensor de quimioluminiscencia se utilizará el factor de corrección: FENO (NIOX MINO®) = 1,5 × 10 (valor de FENO con el sensor de quimioluminiscencia)14 (Fig. 8). 3.3. Factores y enfermedades que modifican la concentración de FENO Existen diferentes factores, fármacos y enfermedades que cursan con alteración en la determinación de FENO y que deben tenerse en cuenta en el momento de interpretar el resultado junto con la historia clínica del paciente (Tablas III y IV).

Tabla III

Factores que modifican la concentración de FENO

Aumento de FENO

Disminución de FENO

Dieta rica en nitratos Fármacos (IECA) Infección viral Rinitis alérgica NO ambiental

Espirometría Ejercicio físico Hábito tabáquico Ingesta de bebidas estimulantes

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Tabla IV

Enfermedades respiratorias que presentan alteraciones de la concentración de FENO

Aumento de FENO

Disminución de FENO

Asma Rinitis alérgica Neumopatía intersticial Cáncer de pulmón Bronquiectasias Tuberculosis pulmonar EPOC (variable)

Discinesia ciliar Fibrosis quística Hipertensión pulmonar EPOC (variable)

Además, existen enfermedades no respiratorias que presentan alteraciones en la síntesis de óxido nítrico y, por lo tanto, la determinación de FENO pudiera presentar valores fuera del rango de de referencia (enfermedades renales [glomerulonefritis crónica, insuficiencia renal crónica], cirrosis hepática y síndrome hepatopulmonar, entre otras). Una de las especialidades médicas donde la determinación de NO espirado tiene mayor interés es en pediatría. Recientemente, Cobos Barroso N, et al.15 han revisado su utilización y proponen su uso como elemento para monitorizar la inflamación de las vías aéreas en niños.

Medición de óxido nítrico en aire espirado

Bibliografía 1. George E, Hogman M, Permutt S, Silkoff PE. Modeling pulmonary nitric oxide exchange. J Appl Physiol 2004;96:831-9. 2. Alving J, Kips JC, Inman L, et al. Future directions. Eur Respir J 2002;20 Suppl 37:51-5. 3. Smith AD, Cowan JO, Filsell S, et al. Comparisons between exhaled nitric oxide measurements and conventional tests. Am J Respir Crit Care Med 2004;169:473-8. 4. Jatakanon A, Sim L, Kharitonov SA, Chung KF, Barnes PJ. Correlation between exhaled nitric oxide, sputum eosinophils, and methacholine responsiveness in patients with mild asthma. Thorax 1998;53:91-5. 5. Smith AD, Cowan JO, Brasset KP, Herbison P, Taylor DR. Use of exhaled nitric oxide measurements to guide treatment in chronic asthma. N Engl J Med 2005;352:2163-73. 6. Pijnenburg MW, Bakker EM, Hop WC, De Jongste JC. Titrating steroids on exhaled nitric oxide in asthmatic children: a randomized controlled trial. Am J Respir Crit Care Med 2005;172:831-6. 7. Smith AD, Cowan JO, Brasset KP, et al. Exhaled nitric oxide: a predictor of steroid response. Am J Respir Crit Care Med 2005;172(4):453-9. 8. American Thoracic Society. Recommendations for standardized procedures for the on line and off line measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med 2005;171:912-30. 9. Kharitonov S, Alving K, Barnes PJ. Exhaled and nasal nitric oxide measurements: recommendations. European Respiratory Society Task Force. Eur Respir J 1997;10:1683-93. 10. Kharitonov S. NIOX-MINO®; a new handheld exhaled NO device. Actas de European Respiratory Society 15th Annual Congress; septiembre 2005; Copenhague. 11. Kharitonov SA, Gonio F, Kelly C, Meah S, Barnes PJ. Reproducibility of exhaled nitric oxide measurements in healthy and asthmatic adults and children. Eur Respir J 2003;21:443-8. 12. Silkoff PE, Carlson M, Bourke T, Katial R, Ogren E, Szefler SJ. The Aerocrine exhaled nitric oxide monitoring system NIOX is cleared by de US Food and Drug Administration for monitoring therapy is asthma. J Allergy Clin Immunol 2004;114(5):1241-56. 13. Calaf N, De Lerma JB, Feixas T, et al. Exhaled nitric oxide: reference values in healthy adults. Arch Bronconeumol 2004;40 Suppl 2:66.

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14. Fortuna AM, Feixas T, Casan P. Determinación de óxido nítrico en aire espirado (FENO) mediante un equipo portátil (NIOX-MINO® Aerocrine) en población sana. Arch Bronconeumol 2007;43(3):176-9. 15. Cobos Barroso N, Pérez-Yarza EG, Sardón Prado O, Reverté Bover C, Gartner S, Korta Murua J. Óxido nítrico exhalado en niños: un indicador no invasivo de la inflamación de las vías aéreas. Arch Bronconeumol. En prensa 2007.

Condensado exhalado

4.1.

Condensado exhalado

Introducción

Yolanda Torralba García Federico P. Gómez Yerón Servicio de Neumología (ICT). Hospital Clínic de Barcelona - IDIBAPS El estudio de las enfermedades pulmonares inflamatorias mediante biomarcadores representativos de los procesos patológicos subyacentes es un campo de creciente expansión que puede contribuir a una mejor caracterización clínica y patogénica de estas enfermedades y a una adecuada monitorización. Asimismo, el empleo de biomarcadores que puedan obtenerse en un número elevado de sujetos constituye una herramienta de gran utilidad en estudios epidemiológicos. El análisis de los constituyentes del aire exhalado como herramienta no invasiva de diagnóstico y monitorización de enfermedades pulmonares ha avanzado rápidamente en los últimos años. Mediante técnicas de enfriamiento del aire exhalado es posible capturar una fase acuosa, lo que se conoce como condensado exhalado (CE). El CE reflejaría la composición del fluido de revestimiento de las vías aéreas conteniendo numerosos compuestos volátiles y no volátiles endógenos. Múltiples marcadores de inflamación y de estrés oxidativo han sido detectados en pacientes con diferentes enfermedades respiratorias. Procesos como el asma, la EPOC, la fibrosis pulmonar idiopática, las bronquiectasias, la fibrosis quística o la lesión pulmonar aguda han sido investigados empleando el CE como herramienta de evaluación fisiopatológica. La lista de sustancias analizadas incluye eicosanoides (isoprostanos, leucotrienos y prostaglandinas), citocinas, productos de peroxidación lipídica y otros marcadores de estrés oxidativo, aminas vasoactivas y diversos óxidos de nitrógeno, entre otros biomarcadores. En la actualidad, aún quedan por resolver diversos aspectos de estandarización metodológica y de validación de técnicas analíticas de medición. Es necesario completar este proceso para que este método pueda emplearse de forma generalizada en la práctica clínica. Con estas limitaciones en mente, el presente manual pretende describir el estado actual de los conocimientos en este terreno y contribuir a su divulgación.

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4.2.

Fundamentos

1. El «aire» exhalado El «aire» exhalado contiene valiosa información de los procesos fisiológicos y biopatológicos que afectan a las vías aéreas y el parénquima pulmonar, así como de otros procesos de sistemas orgánicos distantes del pulmón. Recientemente, ha emergido un concepto ambicioso que podría denominarse exhalomica para referirse al estudio de biomarcadores exhalados y que hace hincapié en la relevancia de este campo de estudio biomédico. El exhalado está constituido por una fase gaseosa y una fase acuosa. En la fase gaseosa se encuentran los gases fisiológicos (O2, CO2, N2, vapor de agua) así como otros compuestos volátiles endógenos tales como óxido nítrico (NO), monóxido de carbono (CO) o hidrocarburos (etano, pentano), entre muchos otros. La fase acuosa está constituida por una suspensión de diminutas gotas que provienen de la aerosolización del fluido de recubrimiento epitelial. Se considera que la fracción del fluido de revestimiento epitelial contenida en el CE es representativa del microambiente extracelular pulmonar (principalmente las vías aéreas), con sus distintos compuestos y mediadores biológicos. A diferencia de otros métodos de obtención de muestras respiratorias, la recolección del aire exhalado es extremadamente sencilla y segura, puede realizarse de forma repetida y sin que se alteren las condiciones del sujeto1. En la actualidad, el empleo del condensado exhalado como herramienta de investigación de enfermedades respiratorias se extiende rápidamente2. Sin embargo, a pesar de lo promisorio y atractivo de esta metodología, aún persiste un gran número de incertidumbres que no han permitido un uso extensivo de esta metodología que aún se ubica preferentemente en el campo experimental. 2. Mecanismo de producción y origen del condensado exhalado Cuando el aire exhalado, saturado en agua, atraviesa un entorno a bajas temperaturas se produce la condensación del vapor de agua provocando que las pequeñas gotas en suspensión, provenientes de la aerosolización del fluido de revestimiento epitelial que se encuentran en el aire exhalado, incrementen su volumen y precipiten sobre la superficie de un sistema condensador especialmente diseñado. El mecanismo por el cual pequeñas cantidades del fluido de revestimiento epitelial es aerosolizado durante la respiración no es del todo conocido. Se cree que la turbulencia del flujo aéreo en ciertos sectores del árbol traqueobronquial, junto con la apertura súbita de bronquíolos respiratorios y alvéolos durante la inspiración, son los principales

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factores involucrados en este fenómeno1. Sin embargo, dado que el CE se obtiene a través de la boca, no se ha dilucidado con certeza la contribución regional de los diferentes sectores de las vías aéreas (cavidad oral, orofaringe, tráquea, vías aéreas, alvéolos). Los niveles de algunos biomarcadores han sido comparados en muestras obtenidas directamente de la vía aérea inferior a través de traqueotomías con muestras recogidas a través de la boca en los mismos sujetos. La concentración de adenosina y tromboxano B2 y el pH fueron significativamente diferentes entre estas muestras3,4. Resultados semejantes fueron observados con H2O2 y 8-isoprostano3,5-7, sugiriendo que estos mediadores se agregan al CE a nivel de la vía aérea inferior. En contraste, la concentración de amonio es sustancialmente mayor en el CE proveniente de la vía aérea superior, sugiriendo que se origina en la cavidad oral8. El efecto potencial de enfermedades bucodentales (p. ej. periodontitis, gingivitis, etc.) o faríngeas (síndrome de apnea obstructiva del sueño, roncopatías) sobre los constituyentes del CE no han sido aún investigados suficientemente.

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4.3.

Procedimiento

1. Espacio físico Dentro del laboratorio pulmonar, es recomendable un espacio físico relativamente amplio, con una superficie mínima capaz de reunir a dos personas, el equipo condensador y las herramientas accesorias necesarias así como los materiales para el procesamiento inicial de las muestras de CE obtenidas (pipeta, tubos, rotuladores, etc.). La mayor parte de equipos condensadores disponibles se encuentran montados sobre dispositivos de ruedas que permiten su traslado fuera del ámbito del laboratorio pulmonar. Por lo tanto, la obtención del CE puede realizarse en casi cualquier otro entorno hospitalario (salas de hospitalización, sala de cuidados intensivos, consulta ambulatoria, etc.). En estudios epidemiológicos se han incorporado equipos condensadores a unidades sanitarias móviles, lo que ha permitido la obtención de CE en sitios muy remotos y distantes del ámbito hospitalario. La incorporación de equipos portátiles permite obtener CE desde el propio domicilio. 2. Equipos 2.1. Condensadores artesanales Los primeros dispositivos de condensación del exhalado fueron diseñados de forma artesanal, como se muestra en la figura 1. Se emplean serpentinas de un material inerte (teflón) que se introducen en un recipiente que contiene hielo o nitrógeno líquido (N2), y en el extremo distal se coloca un tubo de polipropileno para recoger el CE así obtenido. Al igual que otros sistemas, la eficacia para obtener CE depende de la superficie de contacto (largo del tubo de teflón) y la temperatura de enfriamiento alcanzada. 2.2. Condensadores comerciales En la actualidad pueden encontrarse diversos dispositivos comerciales. Está fuera del alcance de este manual extenderse en detalles técnicos o especificaciones concretas sobre el funcionamiento de estos equipos. Entre los sistemas más populares en nuestro entorno destacamos los equipos EcoScreen® (Fig. 2) y ANACON® (Fig. 3). En ambos casos se trata de un sistema de refrigeración eléctrico, con una cámara refrigerada donde se inserta un dispositivo condensador (teflón o cristal) en cuyo extremo distal se encuentra un tubo plástico donde se deposita el CE.

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El sujeto respira por aquí

Tubo de teflón

Tubo de polipropileno

Condensado

Contenedor de hielo

Hielo o N2 líquido

Figura 1. Esquema de sistema artesano.

Paciente Cámara de enfriamiento Válvula unidireccional

Condensado exhalado

Condensador

Figura 2. Esquema del sistema EcoScreen®.

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Figura 3. Esquema del sistema ANACON®.

Estos equipos disponen de un sistema de válvulas que permite el flujo unidireccional que permite separar el aire inhalado (ambiental) del exhalado, el cual, antes de ser devuelto a la atmósfera, atraviesa el sistema de enfriamiento. La monitorización del patrón ventilatorio durante la recolección del CE puede hacerse mediante instrumentos manuales (espirómetro de Wrigth) o electrónicos (EcoVent®) conectados a la rama expiratoria de la válvula. En la actualidad estos sistemas de monitorización no permiten un registro continuo de la maniobra, por lo que es necesario apuntar manualmente los valores obtenidos cada periodo de tiempo determinado. Entre los dispositivos portátiles cabe mencionar el R-Tube®, que utiliza como

Válvula 0 Válvula 2 Válvula 1

Neumotacógrafo Boquilla

Salida 2 Salida 1

Colector 2 Colector 1

Figura 4. Esquema del sistema EcoScreen II®.

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fuente de enfriamiento un cilindro de aluminio que debe ser precongelado en un frigorífico estándar y el sistema eléctrico EcoScreen Turbo®. Recientemente se ha comercializado el sistema EcoScreen II® (Fig. 4) que incorpora una doble cámara de enfriamiento por donde transcurre el aire exhalado. Esto permitiría la separación del CE proveniente de las vías aéreas superiores del CE proveniente de las vías aéreas inferiores. 3. Recomendaciones previas Debido a su naturaleza no invasiva, la obtención de CE es una metodología que puede ser empleada en múltiples circunstancias y no es necesario ningún tipo de preparación o premedicación. Sin embargo, en el contexto de un estudio en particular puede ser necesario algún tipo de recomendación previa. Un aspecto muy importante es el referente a la posibilidad de contaminación del material obtenido con compuestos provenientes de las vías aéreas superiores, y especialmente de la cavidad oral. Por este motivo, se recomienda realizar un enjuague bucal antes de iniciar la recolección. Asimismo, para evitar la aparición de tos o esputo durante la recolección se recomienda solicitar a los sujetos expectorar y expulsar secreciones nasales y/o bronquiales antes de comenzar. La obtención de CE no altera las condiciones basales de los sujetos, mientras que algunas pruebas pueden alterar la composición del CE. Por este motivo se recomienda realizar la obtención de CE en condiciones basales y antes de otros procedimientos tales como espirometrías o pruebas de ejercicio, y en particular realizarlo siempre antes de obtención de esputo inducido o pruebas de broncoprovocación. De la misma manera, para evitar cambios en el patrón respiratorio debe evitarse la realización de otras exploraciones durante la obtención de CE (p. ej. prick test, gasometría o analítica venosa). Deberán ser registradas las condiciones clínicas, así como la medicación recibida y las dosis y horarios previos a la recolección del CE. 4. Preparación del paciente Dado que en la actualidad se trata de una metodología que se emplea exclusivamente en el marco de la investigación biomédica, la preparación del paciente dependerá del contexto del protocolo de investigación que se lleve a cabo. En términos generales, es aconsejable dar a los sujetos una explicación adecuada de la metodología, el tiempo necesario para completar la recolección, y las instrucciones en caso de alguna molestia o incomodidad. 5. Preparación del material El equipo condensador se conectará a la red eléctrica y se pondrá en funcionamiento el tiempo necesario para que alcance la temperatura óptima de recolección, habitualmente 10-15 min antes de iniciar la recolección.

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Si se utiliza monitorización ventilatoria mediante neumotacógrafo, éste deberá ser calibrado según las instrucciones del fabricante. Se prepararán los materiales y accesorios necesarios, que incluyen boquillas (desechables o bien en condiciones óptimas de higiene), pinzas nasales, un vaso de agua para enjuagues, pañuelos desechables, asiento cómodo. Para el almacenamiento de la muestra se deberá tener disponible una pipeta graduada, puntas de pipeta desechables y tubos para separar alícuotas que se escogerán de acuerdo con las necesidades del estudio. Habitualmente, se emplean tubos de polipropileno de 1-2 ml de capacidad. De forma opcional se puede utilizar una centrífuga refrigerada para optimizar la recuperación del CE que queda retenido en las paredes del sistema condensador. En el caso del equipo EcoScreen® la centrifugación del condensador puede incrementar 20-30% el volumen de CE obtenido. Es aconsejable llevar un registro de la actividad en formularios o dietarios donde se apuntarán datos clínicos del sujeto, las características de la recolección (fecha, parámetros respiratorios, volumen de CE, etc.) y los datos de almacenamiento (códigos de numeración, localización en el congelador y temperatura de conservación (habitualmente –80°). 6. Maniobra de recolección La recolección del CE se realiza con el sujeto sentado o semisentado (cabecera a 45-60°) y en condiciones de reposo. En la medida de lo posible, la recolección del condensado exhalado se realizará antes de cualquier otra prueba respiratoria (incluso antes de la espirometría). Se recomienda que los sujetos no hayan realizado un esfuerzo físico importante ni haber ingerido comidas importantes en las 2 h previas. Se solicita a los sujetos que respiren de forma tranquila a través de la válvula adosada al equipo condensador y empleando pinzas nasales. Se indicará que continúen con la recolección hasta alcanzar un volumen exhalado acumulado de 150 l (medido en la rama espiratoria de la válvula, asumiendo una temperatura de 10 °C) o tras un periodo de 15-20 min. Empleando un equipo EcoScreen®, se estima que se obtendrán aproximadamente 3 ml de CE siguiendo las recomendaciones previas. Es importante estimular al paciente en mantener una ventilación/minuto estable y a un ritmo reposado (aprox. 6-8 l/min). Antes de comenzar con el procedimiento es importante que el sujeto beba agua y expulse flemas y mucosidades nasales para evitar la contaminación del CE. Durante la recolección, se indicará al sujeto que puede desconectarse en cualquier momento y la cantidad de veces que desee para sentirse confortable. Además, se indicará que es obligatorio que se desconecte de la boquilla siempre que tenga que tragar saliva, toser, estornudar, eructar o hablar.

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Inmediatamente después continuará con normalidad, hasta alcanzar los 150 l de volumen espirado acumulativo o transcurridos 15-20 min de recolección efectiva. 7. Puntos clave

Tabla I

Puntos clave

Antes de la recolección

Durante la recolección

Realizar antes de cualquier otra prueba respiratoria Apuntar la medicación habitual y la hora de la última administración

Sentado cómodamente Colocar pinzas nasales Respirar tranquilo a volumen corriente evitando toser, hiperventilar o suspirar

Después de la recolección

Mantener estrictamente la cadena de frío Colocar el CE en alícuotas siguiendo estrictamente los volúmenes requeridos utilizando una pipeta bien calibrada No haber realizado un Desconectarse cuantas veces Completar el formulario esfuerzo físico ni comidas quiera para toser, tragar importantes en las 2 h previas saliva, eructar, estornudar, (no excluyente) hablar, etc. No haber fumado en las 2 h Monitorizar tiempo total (T), Identificar las alícuotas previas (no excluyente) volumen total (V), volumen corriente (VT), ventilación/ minuto (VE) y frecuencia. respiratoria (FR) Limpiar flemas nasales y Insistir en mantener: Almacenar las alícuotas a expectorar. Enjuagar la boca VE ~ 6-8 l/min −80°C y beber agua FR ~ 10-15 resp/min Iniciar la recolección tras Continuar hasta alcanzar varios minutos de reposo 150 l de volumen espirado (10-20 min) acumulativo medido en la rama espiratoria o 15-20 min de recolección efectiva Evitar en todo momento la posibilidad de contaminación por productos del propio sujeto o del responsable de la recolección (saliva, expectorado, etc.) o de otras fuentes externas

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8. Formulario Ejemplo de formulario de obtención de condensado exhalado:

Tabla II

Formulario

Fecha: / /

NUMID:

Temperatura ambiente:

Humedad:

PB:

Medicación que ha recibido hoy:

1 2 3 4

5 6 7 8

............................................. ............................................. ............................................. .............................................

Diagnóstico: Recolección Hora de inicio / Hora de finalización / Utilizando el volumen espirado acumulativo registrar los parámetros ventilatorios a los: 10-20 l

50-60 l

90-100 l

140-150 l

Volumen espirado acumulado (V) Tiempo (T) Volumen corriente (VT) Ventilación/minuto (VE) Frecuencia respiratoria (BF) Alícuotas N.o Biomarcador 1 CBA: 2.000 µl 2 8-isoprostano: 400 µl 3 H2O2: 200 µl

Volumen

Código

4 3.1.1 Dificultades o incidencias durante la recogida ® No ® Sí (especificar) ............................................................................ ............................................................................ ............................................................................ ............................................................................ ............................................................................

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4.4.

Personal: cualificación y preparación

Cualificación académica de Diplomado de Enfermería o Técnico de Laboratorio. Habilidad en el trato con enfermos. Conocimientos en manipulación de materiales biológicos. Responsabilidad, hábito de toma de decisiones, capacidad de resolver problemas técnicos. Mínimo de 6 meses de entrenamiento en un centro reconocido.

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4.5.

Indicaciones y complicaciones

1. Indicaciones En la actualidad el uso de esta metodología se halla restringido al ámbito de la investigación clínica o epidemiológica. Se emplea fundamentalmente para la evaluación de biomarcadores representativos del proceso inflamatorio o el estrés oxidativo que afectan a las vías aéreas o inferiores o el parénquima pulmonar. Evaluación del compromiso inflamatorio o el estrés oxidativo que afectan a las vías aéreas superiores. Eventualmente podría emplearse para valorar el impacto respiratorio de las enfermedades de otros órganos o sistemas (enfermedad cardíaca, renal, hepática, neuromuscular, etc.) aunque los conocimientos actuales en este terreno son muy limitados. Valorar la respuesta terapéutica frente a diferentes fármacos o en ensayos clínicos farmacológicos. 2. Contraindicaciones Al tratarse de una metodología completamente no invasiva e incruenta no se han descrito contraindicaciones. Sin embargo, el uso de esta metodología no es aconsejable en situaciones de alteraciones de la conciencia o de incapacidad de mantener una respiración tranquila. 3. Complicaciones No se han descrito complicaciones en relación con esta metodología.

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4.6.

Estandarización

Es de suma trascendencia que todos los procedimientos relacionados con la obtención y el análisis de biomarcadores en el condensado exhalado se encuentren muy bien estandarizados, de manera de reducir las potenciales fuentes de variabilidad y contribuir a una correcta interpretación de los resultados. A continuación se describen los puntos clave de la estandarización. 1. Generalidades Recomendaciones

Análisis razonado y comentarios

Estandarización de la obtención de muestras, almacenamiento y análisis

Es altamente recomendado seguir un procedimiento muy bien estandarizado y uniforme durante todo el proceso de recolección, almacenamiento y análisis del CE. Se recomienda identificar los potenciales elementos de confusión para poder controlarlos. Si usamos diferentes dispositivos dentro de un mismo estudio, debería efectuarse una evaluación comparativa para asegurar que diferencias de temperatura, colectores, método de limpieza de equipos, recolección de saliva, duración de recolección y otras características no provoca diferencias en los niveles de biomarcadores

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2. Estandarización de la recolección: aspectos esenciales

Recomendaciones

Análisis razonado y comentarios

Metodología: debe estar bien detallada y protocolizada

Debe ser lo suficientemente detallada como para poder asegurar que la técnica es reproducible En las condiciones actuales del conocimiento estos detalles son necesarios para ayudar a determinar qué factores pueden incidir de forma relevante para cada uno de los biomarcadores analizados. La mayoría de la información para los dispositivos comerciales está fácilmente disponible Esta información permitirá incrementar el conocimiento de los materiales óptimos para la determinación de los diferentes biomarcadores. Los biomarcadores pueden mostrar diferente tolerancia y estabilidad a los materiales de que están compuestos los condensadores. Los materiales en sí mismos, o los productos que se utilizan para su limpieza, pueden contaminar la muestra. Es conveniente que esto sea investigado para cada biomarcador Sigue siendo confuso para muchos biomarcadores cuál es la temperatura óptima de su recolección. Se presume que la recolección en frío es mejor para los mediadores más inestables, aunque, por otra parte, esto no ha sido demostrado fehacientemente y no es necesariamente correcto. La temperatura de recolección debe ser registrada al inicio de la misma La contaminación masiva por saliva, ciertamente, es muy infrecuente. Algunos sujetos presentan una salivación profusa. Una forma clara de prevenir esta contaminación de la muestra es un sistema de recolección que impida la mezcla de fluidos El volumen de la muestra, la ventilación/ minuto y la duración de la recolección son tres valores interrelacionados que deben estar bien estandarizados y registrados.

Equipo: debe indicarse claramente el equipo utilizado para la recolección, incluyendo nombre, modelo, fabricante y especificar las modificaciones. El equipo debe venir acompañado de un manual detallado que permita la correcta utilización del mismo Materiales: El protocolo debe detallar los materiales utilizados, en particular los que estarán en contacto directo con el CE

Temperatura: especificar la temperatura de funcionamiento del equipo y el rango

Trampa de saliva: recomendado

Duración del muestreo: la duración de la recolección debe ser registrada

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(Continuacuón) Recomendaciones

Pinzas nasales: probablemente deban ser empleadas durante la recolección del CE

Contaminación: probar todos los materiales que entran en contacto con el CE y contar con los controles necesarios en cada sitio en que se realice la recolección del CE

Almacenamiento: a menos que se demuestre innecesario, almacenar las muestras a la menor temperatura posible Estabilidad: la estabilidad de un biomarcador en una muestra almacenada de CE debería ser conocida. Pueden realizarse pruebas específicas o considerar datos en publicacio nes que reflejan la estabilidad de los marcadores específicos

Análisis razonado y comentarios El volumen de la muestra es difícil de medir durante la recolección en la mayoría de sistemas. La ventilación/minuto durante la recolección puede ser fácilmente medida, así como la duración de la recolección. Si bien se cree que la concentración de la mayoría de los biomarcadores es independiente de estos tres valores, es preciso que la posible influencia de estos factores sea establecido para un estudio/marcador en particular Existen dos razones para la utilización de pinzas nasales: la primera es minimizar la cantidad de fluidos nasales que penetren en la muestra durante la inhalación; la segunda es mantener todo el aire exhalado en la boca y no en la nariz. La contaminación nasal es notablemente diferente que para el NO exhalado, en el cual ocurre durante maniobras de exhalación única. La principal razón para no usar la pinza nasal es la incomodidad Los óxidos de nitrógeno (NOx) son contaminantes habituales de superficie en los laboratorios, y es necesario mantener rigurosos métodos para evitar la contaminación del equipo de recolección, pipetas o tubos de almacenamiento. Algunos tubos generan pérdidas de NOx, por lo que es recomendable el análisis tan pronto como sea posible después de la recolección. El pH o la concentración de solutos (conductividad) del CE pueden alterarse por contaminación. Debe evaluarse y evitarse las posibles vías de contaminación Esto parece una precaución razonable, pues es probable que la congelación no altere los niveles en los biomarcadores en CE La pérdida de biomarcadores por sobrepasar el tiempo de almacenamiento o incluso un breve retraso pueden ocasionar errores del tipo II, y puede ser una causa de las amplias gamas de valores observados para un biomarcador entre publicaciones

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3. Estandarización del análisis: aspectos esenciales

Recomendaciones

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Estabilización de los marcadores: esto puede ser realizado siempre que sea posible

Añadir una proteína libre de biomarcador a una muestra de CE puede incrementar la concentración o disminuir la pérdida de un biomarcador inestable. También puede permitir retrasar el análisis. Debe determinarse el mejor sistema para cada biomarcador de forma independiente La sensibilidad y la especificidad de los métodos analíticos son de suma importancia cuando hablamos del CE. Se considera que probablemente la mayor parte de la variabilidad objetivada entre los estudios está basada en las dificultades con los análisis Esta es una precaución razonable, ya que existen muchos marcadores que no son estables. Sin embargo, esta precaución debe equilibrarse con la necesidad de mantener la factibilidad del diseño del estudio. De todas formas, el efecto del tiempo de almacenamiento (tiempo que pasa hasta su análisis) sobre el biomarcador de interés debe ser determinado La mayoría de los sistemas de análisis empleados no han sido diseñados para su uso en CE. El CE es un fluido muy diluido, pobre en proteínas y tampones (buffers) Los inmunoanálisis de CE pobre en proteínas pueden conducir a falsos valores elevados. Esto puede ser el resultado de inadecuado desbloqueo del inmunoanálisis debido al grado de dilución y acidez potencial del CE. Pruebas agregando de forma exógena pequeñas cantidades del biomarcador en el CE pueden ser útiles para asegurar la funcionalidad del análisis. Debe considerarse realizar curvas patrón en un medio acuoso en lugar proteico. También puede considerarse la adición de proteína al CE. La concentración de las muestras de CE mediante liofilización y resuspensión a proporciones ≤ 1/10 del volumen inicial puede ser útil para analizar biomarcadores en el rango de confianza de los inmunoanálisis

Análisis: en todos los casos se deben utilizar sistemas de análisis suficientemente sensibles y específicos

Momento de análisis: los análisis deben ser realizados lo más pronto posible para evitar la pérdida de biomarcadores o contaminación con agentes exógenos

Validación: los sistemas de análisis deben probar su utilidad en el CE

Inmunoanálisis: debe asegurarse que no se produzcan uniones inespecíficas y que se han realizado los controles adecuados en todos los casos

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(Continuacuón) Recomendaciones

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Óxidos de nitrógeno: no se debe usar el término óxido de nitrógeno (NOx) sin especificar con exactitud lo que se está midiendo

Muchos trabajos que analizan NOx no son específicos para un componente. Los análisis pueden ser para nitritos, nitratos, nitrosothioles, nitrotiroxina, NO y otros óxidos mayores del nitrógeno. El análisis por quimioluminiscencia, después de reducción por varios métodos, proporciona suficiente sensibilidad para la mayor parte del NOx en CE no concentrado. Los tests por espectrometría son menos sensibles, y NOx están frecuentemente en los límites de detectabilidad, especialmente los nitritos y los nitrosothioles. Conocer la contaminación de las superficies del laboratorio es muy importante El análisis del pH en el CE ha sido analizado tanto en muestras no desaireadas como desaireadas. La medición del pH en muestras desaireadas es probablemente el método mejor validado. Seguramente, «desaireado» es un término poco apropiado; el mejor término sería «gas estandarizado», pero la completa sustitución del CO2 por el gas estandarizado no queda suficientemente claro. El pH medido en el CE «gas estandarizado» no es una medida directa del pH del fluido de revestimiento de las vías aéreas, pero al parecer refleja la captura de ácidos volatilizados. El CO2 no es más volátil en fluidos con pH bajo y, por lo tanto, no interesa su contenido en el CE cuando se intenta identificar la acidificación de las vías aéreas. El pH del CE se verá sustancialmente afectado por el contenido de CO2 si no es extraído. Muchos investigadores consideran que el CO2 constituye una sustancial interferencia. Otros no lo consideran relevante y creen que el proceso de desaireación es innecesario Muchos análisis mediante espectrometría identifican biomarcadores a niveles cercanos a su límite de detección. A niveles cercanos a los límites de detección, en general, existe

pH: debe especificarse si se ha desaireado la muestra de CE o, en caso contrario, debe especificarse el tiempo transcurrido desde la recolección hasta la medición

Espectrometría y otros análisis: asegurar suficientes controles y que los análisis estén en el rango

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(Continuacuón) Recomendaciones

Análisis razonado y comentarios una alta variabilidad. En realidad, la variabilidad en los resultados analíticos en las muestras de CE depende más del sistema de análisis que de las variaciones en aspectos de recolección

Dilución: hay que tomar con prudencia las conclusiones de la presencia de compuestos no volátiles en ausencia de un factor de corrección por el grado de dilución

Nuevos biomarcadores: considerar de forma escéptica la sensibilidad y especificidad de los sistemas de medición de nuevos biomarcadores. Determinar la posibilidad de contaminación

Las sustancias no volátiles provienen de partículas aerosolizadas del fluido de revestimiento de las vías aéreas, o de modificaciones químicas que transforman una molécula volátil en una no volátil. Considerando que el fluido de revestimiento de las vías aéreas contenido en el CE se encuentra diluido en vapor de agua, hay que tener en cuenta un factor de dilución para determinar con seguridad la concentración absoluta en las vías aéreas. Se ha propuesto expresar los resultados de un biomarcador en proporción al contenido de proteína, urea o conductividad. Si bien la utilidad de estos factores de corrección de la dilución son prometedores, aún no han sido aplicados de forma extensiva. El análisis de componentes volátiles no se encontraría tan afectado por el grado de dilución. Hay que considerar la posibilidad de que un marcador volátil (como el NO) reaccione con la solución y se convierta en un no volátil (nitrato) En todos los casos, cuidadosas investigaciones científicas deben ser emprendidas para los nuevos (y los viejos) biomarcadores identificados en CE

(Adaptado de: Eur Respir J 2005;26:523-48).

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4.7.

Mantenimiento y limpieza de equipos

1. Mantenimiento Se realizará de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 2. Limpieza Las partes expuestas a la respiración del paciente deben poder lavarse con agua y jabón y esterilizarse con métodos físicos o químicos. Es importante realizar un aclarado final con agua destilada de todos los componentes que están en contacto con el CE para evitar la contaminación con solutos, en particular cuando se considere medir la concentración de solutos por conductividad para estimar el grado de dilución. A ser posible, las boquillas serán desechables. Los codos, boquillas de plástico, condensadores y recipientes de recolección deberán lavarse con agua y jabón neutro. El aclarado debe realizarse con agua destilada abundante. Para evitar contaminación será muy importante que todos los componentes del equipo estén completamente secos antes de su utilización. Cualquier resto acuoso procedente de su limpieza supondría una grave interferencia en análisis posteriores. La parte del aparato más pesada se limpiará con un trapo húmedo, utilizándose jabón sólo si fuera preciso. Se ha de tener en cuenta que la acumulación de hielo en la cavidad donde se inserta el condensador lamelar (Ecovent®) puede dificultar la correcta manipulación de los componentes del mismo, pudiendo provocar daños en el equipo, por lo que será preciso mantenerlo limpio y seco después de cada exploración.

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4.8.

Símbolos y unidades de medida

El consenso internacional en lengua inglesa recomienda el uso del término exhaled breath condensate (EBC). Dado que partículas provenientes de las vías aéreas del exhalado pueden analizarse mediante otras técnicas, el término EBC se refiere exclusivamente a las muestras obtenidas mediante enfriamiento del exhalado. En lengua castellana, se han empleado términos como «condensado del aire exhalado» (CAE) o «condensado del exhalado respiratorio» (CER), entre otros. Los autores del presente manual de procedimientos preferimos el término «condensado exhalado» (CE) por su mayor simplicidad.

Condensado exhalado

BibliografĂa 1. Horvath I, Hunt J, Barnes PJ, et al. Exhaled breath condensate: methodological recommendations and unresolved questions. Eur Respir J 2005;26:523-48. 2. Hunt J. Exhaled breath condensate: an evolving tool for noninvasive evaluation of lung disease. J Allergy Clin Immunol 2002;110:28-34. 3. Vaughan J, Ngamtrakulpanit L, Pajewski TN, et al. Exhaled breath condensate pH is a robust and reproducible assay of airway acidity. Eur Respir J 2003;22:889-94. 4. Vass G, Huszar E, Barat E, et al. Comparison of nasal and oral inhalation during exhaled breath condensate collection. Am J Respir Crit Care Med 2003;167:850-5. 5. Carpenter CT, Price PV, Christman BW. Exhaled breath condensate isoprostanes are elevated in patients with acute lung injury or ARDS. Chest 1998;114:1653-9. 6. Montuschi P, Corradi M, Ciabattoni G, Nightingale J, Kharitonov SA, Barnes PJ. Increased 8-isoprostane, a marker of oxidative stress, in exhaled condensate of asthma patients. Am J Respir Crit Care Med 1999;160:216-20. 7. Kietzmann D, Kahl R, Muller M, Burchardi H, Kettler D. Hydrogen peroxide in expired breath condensate of patients with acute respiratory failure and with ARDS. Intensive Care Med 1993;19:78-81. 8. Effros RM, Hoagland KW, Bosbous M, et al. Dilution of respiratory solutes in exhaled condensates. Am J Respir Crit Care Med 2002;165:663-9.

Preguntas de formación continuada

CUESTIONARIO

1. ¿En cuál de las siguientes observaciones ha demostrado mayor utilidad la determinación del NO en el aire espirado? a. Diagnóstico de asma. b. Evaluar el cumplimiento terapéutico en el asma. c. Diagnóstico diferencial entre asma y EPOC. d. Monitorización de la evolución de la fibrosis pulmonar. e. Marcar la gravedad de la inflamación bronquial. 2. Los sensores más habitualmente utilizados para determinar la concentración de NO en el aire espirado son del tipo: a. Espectrotelemetría. b. Electroquímicos. c. Quimioluminiscencia. d. Difracción de rayos γ. e. Solución en ClNa. 3. El flujo del aire espirado para determinar la concentración de NO debe ser de: a. < 1 ml/s. b. 10 ml/s. c. 20 ml/s. d. 40 ml/s. e. 50 ml/s. 4. La concentración de NO en el aire espirado se expresa en: a. mg/ml. b. ng. c. Partes por millón (ppm). d. Partes por billón (ppb). e. Unidades γ. 5. Los equipos portátiles para determinar el NO espirado (sensores electroquímicos) requieren realizar ....... determinaciones para comprobar su correcta medición: a. 1. b. 2. c. 3. d. 4. e. 5. 6. En un paciente asmático, el examen del esputo inducido nos permite: a. Diferenciar el tipo de inflamación. b. Ajustar la dosis de corticoides.

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c. Valorar la existencia de reflujo esofágico. d. Todas las anteriores. e. Ninguna de las anteriores. 7. ¿Cuál es el tipo de nebulizador «ideal» para realizar el procedimiento de obtención de esputo? a. Ultrasónico. b. Tipo jet. c. Tipo Venturi. d. Con bombona de oxígeno. e. De fina gota. 8. Una de las siguientes expresiones no es adecuada para el recuento celular del esputo inducido. ¿Cuál? a. Contar todas las células presentes en cada cuadro. b. Clasificar las células en «viables» o «no viables». c. Restar las células escamosas contaminantes. d. Establecer las proporciones celulares en función de las células totales. e. Presentar datos aproximados. 9. La interpretación de los resultados del recuento celular en el esputo inducido requiere tener en cuenta: a. La viabilidad celular. b. El grado de degeneración celular. c. El grado de contaminación por células escamosas. d. Un recuento adecuado. e. Todos los anteriores. 10. ¿Cómo debemos indicarle al paciente que respire para obtener una buena muestra (cantidad/calidad)? a. Cualquier paciente en 20 min produce una buena muestra. b. Tiene que conseguir un gran volumen (> 180 l, respirando rápido y profundo). c. Respiraciones superficiales y rápidas para obtener sólo una muestra representativa de las vías aéreas altas. d. Le indicaremos que respire de forma tranquila, manteniendo una ventilación/minuto estable y a un ritmo entre 6-8 l/min. 11. ¿Cómo debe prepararse al paciente para la prueba? a. No necesita ninguna preparación ya que la prueba es muy sencilla. b. Debe recomendarse que se lave los dientes antes de la visita y enjuagarse la boca con suero salino isotónico para no contaminar la muestra. c. El sujeto debe hacer gárgaras con agua, expulsar flemas, sonarse la nariz, y beber un poco de agua. d. Debe tragar saliva, toser y estornudar (si precisa) y hablar todo lo que tenga que decir hasta el final de la prueba. 12. ¿Cuál sería la primera prueba a realizar por un paciente en la misma jornada: espirometría, 6 min de marcha o CE? a. La prueba de 6 min de marcha, porque, depende de los metros recorridos, procederemos o no a realizar el CE (por debajo de 200 m está contraindicado).

" Preguntas de auto-evaluación

b. El CE, para no irritar la vía aérea y mantenerla «intacta» para la prueba. c. Da lo mismo, lo importante es que el paciente descanse entre prueba y prueba. d. La espirometría, para saber el grado de gravedad del paciente y qué enfermedad tiene, y así utilizar la muestra para analizar sólo los marcadores más útiles. 13. ¿Dónde conservaremos la muestra una vez obtenida? a. Generalmente la repartiremos en alícuotas de polipropileno de aproximadamente 1 ml y la guardaremos rápidamente en un congelador de –80 °C hasta el momento de su análisis. b. La podemos conservar en nevera 4-8 °C repartida en tubos de polipropileno de 1 ml hasta su posterior análisis. c. Por norma, se podrá guardar a temperatura ambiente, y únicamente la muestra de los pacientes asmáticos se guardará en nevera para conservar el nivel de 8-isoprostano. d. La llevaremos, dentro de las siguientes 24 h, al laboratorio de referencia para su análisis inmediato, dentro del recipiente recolector del equipo, tapado con biofilm preservado de la luz.

" Para obtener la acreditación deben enviar el cuestionario contestado a la siguiente dirección: Provenza, 108 bjos. 2.a 08029 Barcelona - España Tel.: 934 878 565 Fax: 934 107 120 E-mail: fmc@separ.es

SOCIEDAD ESPAÑOLA DE NEUMOLOGIA Y CIRUGIA TORACICA (SEPAR) Provenza, 108, bjos. 2.a 080029 Barcelona – España Tel.: 934 878 565 Fax: 934 878 509 E-mail: ssepar@separ.es