國立中山大學生物科學系110普通生物學實驗(一)小組專題報告合集

國立中山大學生物科學系 110 年度普通生物學實驗(一)分組專題

報告集

2022 年 1 月 23 日

目錄 人為調控二氧化碳所造成的酸化作用是否影響多齒新米蝦的成長？ Can anthropogenic CO2-mediated freshwater acidification effect growth of Neocaridina denticulata? 馬峻逸、康凱鈞、彭翊誠、吳逸駿、洪承恩 食物供給對水蚤性比之效應 Effect of food availability on sex ratio of Daphnia 黃岱翔、張庭振、吳舜九、周宛瑩、林育秀 水深與二氧化碳對異葉水蓑衣葉形的效應 The effects of water depth and CO2 on leaf shape of Hygrophila difformis 蔡珈麒、張芷瑜、黃如玫、熊庭、張珮瑜 野生型斑馬魚大膽程度的評估 Assessment of boldness of wildtype zebrafish 陳卉蓁、謝利旋、周慧軒、李致樺 斑馬魚對顏色刺激的關聯性學習 Associative learning of color stimulus in zebrafish 邱諺祺、陳柏元、游順傑、吳承陽、林欣輝

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小花蔓澤蘭入侵台灣假說的檢驗 Testing the Hypotheses of the Invasiveness of Mikania micrantha in Taiwan …………… 陳乙穎、滕仲恩、蔡景翔、張涵崴、董宥弦、潘以翔 銀合歡葉片萃取物對共域原生草本植物幼苗的影響 Effects of leaf extract of Leucaena leucocephala on the sapling of a indigenous sympatric herbal plant 呂誼蓁、曾祺媛、施翰霖、巫子昀、黃仲寧 含羞草葉片觸發運動的可塑性 Plasticity of foliar seismonastic movement in Mimosa pudica 楊子承、楊翔芝、葉懿薰、林芳瑤

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人工夜間光源對兩種酢醬草睡眠運動的影響 Effect of artificial light at night (ALAN) on foliar nyctinasty of two species of Oxalis …………… 林建豪、鍾卓宏、黃莨程、岳庭宇

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支持物之直徑對草本攀緣植物纏繞行為的影響 Effect of support diameter on winding behavior of a herbal Climbing Plant 黃子欣、黃峻緯、唐勗勍、簡友立、蔡佩吟

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人為調控二氧化碳所造成的酸化作用是否影響多齒新米蝦的成長？ Can anthropogenic CO2-mediated freshwater acidification effect growth of Neocaridina denticulata? 馬峻逸、康凱鈞、彭翊誠、吳逸駿、洪承恩 國立中山大學生物科學系

摘要 酸化作用估計會影響甲殼類生物的蛻殼、生長與存活率。由於多齒新米蝦 (Neocaridina denticulata)在生態系統中是重要的能量傳遞者，且酸化作用對甲 殼類有間接的影響。為了研究酸化作用對多齒新米蝦的影響，我們使用水族館購 買的多齒新米蝦於中山大學的溫室進行降酸實驗，通過實驗比較不同的酸鹼環境 下對多齒新米蝦幼體的影響。在實驗 17 天後觀察到在酸性條件下多齒新米蝦的 蛻殼及體型變化均有明顯變化，但存活率並無受到影響。 關 鍵 字 ： 脫 殼 (Moulting) 、 酸 鹼 調 節 (Acid–base regulation) 、 淡 水 生 物 群 (Freshwater biota)、生長增量(Growth increments)、生存能力(Viability)

一、前言 因大氣中的 CO2 濃度增加所導致的酸化作用(acidification)，已經是近幾年學術 界熱門討論的議題，幾年學術界熱門研究的問題，包含捕食(Dodd et al., 2015; Maud et al., 2014)、競爭(Kroeker et al., 2012; McCormick et al., 2013)、行為 (Manríquez et al., 2013; Munday et al., 2009)、生長(Spero et al., 1997; Diaz-Pulido et al., 2011; Chen & Chen, 2003)與存活(Jesus et al., 2018;Beaune et al., 2018; Shirayama & Thornton, 2005)。酸化的原理是大氣中的 CO2 約 30 % ~ 40 %會融入水體中(Millero et al., 1995)形成碳酸，再解離成氫離子與碳酸 氫根離子，使水體當中的 pH 值下降，而現今的研究已經確定了此現象會對生物 造成負面影響，且可能間接地影響到整個生態系統(Psenner, 1994)。 而此現象最常被拿來討論的就是影響水體當中的碳酸根和鈣離子濃度(Feely et al., 2004)，且會直接影響一些生物的生理機能，例如此兩離子是細菌、鈣化藻 類 (Krumbein, 1979) 、 和 甲 殼 類 生 物 (Spero, 1997) 行 生 物 礦 化 作 用 (biomineralization)形成 CaCO3 的重要原料。現今研究也已證實此現象會造成一

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些生物的外殼變薄，甚至外殼直接溶解(Fine & Tchernov, 2007; Bednaršek, 2014)。而酸化作用所造成的影響還遠遠不止如此，有研究指出酸化環境影響軟 體動物的自我翻正(self-righting)的時間，進而降低被捕食的風險(Manríquez et al., 2013)、鈣化藻類與其他肉質藻類的競爭(Kroeker et al., 2012)以及小丑魚幼 體的嗅覺受器(Munday et al., 2009)。 酸化不是只有發生在海洋，在一些淡水水域中也會出現酸化，但是我們對淡水酸 化的理解遠少於海水酸化(Hasler et al., 2016)。淡水酸化其實很早就被拿出來討 論(Schindler, 1997)，只是淡水酸化容易受到陸域生態系、生產者與消費者比例、 降水、水源及地質的影響，十分難以預測(Henio, 2009; Ciais et al., 2013)，然而 現今已經有一些關於淡水酸化的研究，如酸化會影響水蚤尾刺與頸齒的發育，使 牠們更容易被掠食者捕食(Weiss et al., 2018)、鮭魚的嗅覺靈敏性，使他們無法 正常迴游(Ou et al., 2015)和淡水小龍蝦的分布(Beaune et al., 2018)。 由於現今的淡水酸化研究多以魚類為主(Hasler et al., 2018)，而且台灣在這方面 的文獻真的很少，引起了我們的興趣，而我們也想要知道是否可以在人工環境調 控 pH 值下去模擬生物在自然環境受到酸化的影響，我們預測酸化作用最終都會 導致物種生長減緩或死亡。我們認為此研究可以獲得淡水酸化影響台灣在地生物 的重要資訊。

二、材料與方法 (一) 實驗對象 我們這次選用的實驗對象是多齒新米蝦，多齒新米蝦是在東亞地區常見的物種 (Hung et al., 1993)，在生態系統中是重要的能量傳遞者，是一些溪流魚類的食 物，且曾經是作為養殖漁業的餌料，現今則成為觀賞蝦的原品系(Chen, 2006)。 多齒新米蝦也因為可以對有毒物質表現出快且敏感的反應，被用作篩選毒性的動 物模型(Siregar, 2021)。由於牠的體型小、生命周期短還有蛻殼時間短(Mahmoud et al., 2020)，我們認為此物種可以讓我們在較短的實驗時間內看出最明顯的結 果。 (二) 材料來源、飼養及繁殖 多齒新米蝦成體自水族館購買，2021 年在中山大學生科館溫室馴養兩個月，溫

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室溫度控制在攝氏 26 ~ 28 度，pH 值維持在 7.5 ~ 7.7 之間，每天餵食八顆綠色 沉底飼料，定期撈出死蝦、脫殼以及殘存的飼料。飼養過程中出現雌蝦抱卵與釋 幼。最終我們根據 Mahmoud(2020)的研究選用第二階段幼體到第三階段幼體(體 長約在 5 ~ 8 mm)的蝦子來進行實驗。 (三) 實驗流程 我們在 2021 年 12 月 20 日開始進行實驗，先挑選我們要的幼蝦(體長約在 5 ~ 8 mm)總共 40 隻並測量體長，以 20 隻為實驗組 20 隻為對照組放置於兩個塑膠盒 子中。盒子裡放有 pH 值 7.5 的 800 ml 水體及氣泡石，並加上蓋子，以早上五 點到下午五點的光週期照光(圖一)，實驗總共進行了 17 天，每三天餵食一顆綠 色沉底飼料並清理殘存的飼料，最終將實驗組與對照組的蝦子進行體長測量來估 算他們在這段期間的體長增長。 (四) pH 值調控 我們參考了 Huang(2018)和 Chang(2019)的研究得知台灣淡水水域最大的 pH 值 變動幅度為 7.0~8.9，以及參考 IPCC 預測，到 21 世紀末，海水 pH 值平均下 降 0.4 ~ 0.5，去推估我們 pH 值最終要下降到 6.5。pH 值的下降速度則是參考 Hsieh(2021)的實驗，每天下降 0.1 pH。我們調控 pH 值的方式是藉由酸液(150 ml / 0.1 g 降酸劑)，每加 5 ml 使 800 ml 水體下降 0.1 個 pH，但是此降酸方式在降 酸後六個小時後會開始回彈(圖二)，因此我們以每八個小時會去調控一次 pH 值。 (五)、體長測量方法 測量體長的方式是參考 Mahmoud(2020)的方式，將蝦子放在培養皿中，並在培 養皿下放上網格紙去測量體長，但是為了精準，我們將照片輸入 ImageJ 中，以 網格為比例尺，並將測量線從蝦子的額角前端經由背部拉到尾肢末端。頭部會以 兩條線來做測量，而每一個體節都由一條線去做測量，而拉到尾柄的前端後，會 經由一條線直接拉到尾肢末端，如果兩片尾肢分開，會直接選擇後面那一片尾肢 的末端(圖三)，我們經由這種方式來確保就算是不同人去測量，也會出現相同結 果。 (六)、資料分析

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脫殼數是在實驗期間，每日統計實驗組及對照組的總脫殼數。體長變化是通過實 驗前與結束後所測量的體長相減來計算。我們脫殼數是參考 Muralisankar(2021) 的做法，使用 IBM SPSS 軟件 (16.0 版) 進行統計分析。所有統計檢驗均選擇 p 值 0.05 的統計顯著性級別，再採用單因素方差分析 (ANOVA) 輸出實驗組與對 照組的平均數及變異數，再將上述數據輸入鄧肯多極差檢驗 (DMRT) 來判斷兩 種不同 pH 暴露條件下，總脫殼數是否存在顯著差異。而體長增長則是參考 Kurihara(2008)使用 Mann-Whitney 的 U 檢驗 (Mann-Whitney U-test)來檢查 pH 值對實驗開始前與結束後的每隻蝦⼦體長變化是否存在顯著差異。

三、結果 為期 17 天的實驗過程中，一開始在實驗組和對照組實驗盒中測量的平均 pH 值 分別為 7.53 ± 0.1 和 7.51 ± 0.1。在整個 17 天期間，實驗組隨時間線性下降， 每天 pH 值下降 0.1。在實驗 17 天後實驗組和對照組的存活率皆為 100 %。而 在實驗組與對照組處理結束時多齒新米蝦的總脫殼數分別為 25 個及 14 個。在 實驗開始前，實驗組與對照組多齒新米蝦的平均體長分別為 0.7410 cm 和 0.7329 cm，而過了 17 天的實驗後，實驗組與對照組蝦生長後的平均體長分別 為 0.7818 cm 和 0.8529 cm。 進行統計分析後，鄧肯多極差檢驗的統計結果表明，兩組總脫殼數的顯著性 p 值為 0.036 小於 0.05 的統計顯著性級別，因此證明實驗組和對照組實驗後測量 的總脫殼數在酸化影響下有顯著差異。而 Mann-Whitney 的 U 檢驗的結果表明， 兩組蝦的體長變化的 p 值小於 0.00001，因此證明在酸化影響下實驗組和對照組 的體長變化有顯著差異。

四、討論 此次實驗結果表明，長期⽣活在低於正常環境酸鹼值的環境中的多⿒新米蝦的體 長⽣長情形與蛻殼率都會受到嚴重影響，Motoh(1985)研究報告了酸化對淡⽔⽣ 物的⽣理、形態等的潛在影響，酸化作⽤也可能影響世代時間或繁殖，甚⾄是整 個群落。 實驗結果的蝦子死亡率皆為 0，相較於其他研究報告蝦子生存於低 pH 值環境中 死亡率會提升的實驗結果，推測第一個可能為實驗時間與成年多⿒新米蝦的壽命

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相比暴露在低 pH 值環境的時間相對較短，第二個原因是因為多齒新米蝦能夠存 活的環境為 pH 8.0-6.5，而我們最終的降酸只停留在 pH 值 6.5，實驗中的降酸 幅度可能不致於讓多齒新米蝦死亡。 蛻殼差異的實驗結果顯⽰實驗組與對照組脫殼數有顯著的差異，我們推測是因為 ⽔溶液中的碳酸根離⼦跟殼上的鈣離⼦作⽤導致殼發育不完全、⽣長緩慢，進⼀ 步影響到蛻殼率(Collins & Bell, 2004)，Kurihara(2008)在他做的酸化相關實驗中 觀察到，如同我們的實驗一樣蛻殼頻率是上升的。而 Kurihara(2008)將退殼頻率 改變視為內分泌紊亂的結果。 實驗組平均體長增長明顯小於對照組可能是酸性環境造成細胞內部 pH 值下降， 以致於細胞的部分功能與代謝過程受到負面影響，導致⽣長減緩(Roos & Boron, 1981)。在 Appelhans(2012)的研究中發現，淡水甲殼類在酸性環境下長期調節 體腔液 pH 值會影響能量分配，進而導致體細胞生長緩慢。 而我們使用人工方法在短時間內降酸並觀察多齒新米蝦所受到的影響，進而去推 斷淡水甲殼類在酸性環境下受到的影響，並不能完整模擬自然環境下的酸化情況， 如前言所提到的淡水酸化較難被預測，且自然環境下酸化速度較慢，因此較難評 估生物在酸化環境所受到的影響是取決於降酸地的幅度還是降酸的速度，所以我 們認為人為降酸的方法只能用來參考。

五、引用文獻 黃大駿。2018。龍鑾潭與南仁湖重要濕地(國家級)基礎調查計畫。嘉南藥理大學: 1-158。 張德鑫。2019。桃園市河川流域污染整治綜合管理計畫。: 1-390。 Beaune D., Sellier Y., Luquet G., Grandjean F. (2018) Freshwater acidification: an example of an endangered crayfish species sensitive to pH. Hydrobiologia 813(1): 41–50.

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圖一、實驗設施圖。

圖二、pH 回彈幅度折線圖。

圖三、多齒新米蝦體長測量方法。

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食物供給對水蚤性比之效應 Effect of food availability on sex ratio of Daphnia 黃岱翔、張庭振、吳舜九、周宛瑩、林育秀 國立中山大學生物科學系

摘要 水蚤會以獨特的週期性孤雌生殖來應對在惡劣環境壓力下所造成的影響，因此環 境性別決定系統對於水蚤的繁衍扮演著關鍵的因素。水蚤在惡劣環境之下，環境 壓力會誘發水蚤母體產生出青春激素，水蚤母體會受此激素影響並產生出雄性後 代。當水蚤族群開始出現雄性時，部分水蚤個體會從孤雌生殖轉變為有性生殖的 方式繁衍後代，並且藉由有性生殖的方式產出具有保護層的休眠卵以渡過惡劣的 環境。造成惡劣環境壓力的因素有包括：低溫、短日照、擁擠族群密度以及缺乏 食物供給。我們想要確認在不同程度的環境壓力，水蚤族群的性比是否會有差異， 所以我們實驗給予：0.25 ml／day（食物缺少）、0.75 ml／day（食物過多）比 對 0.5 ml／day 的對照組，實驗 5 天後，我們統計每盆水蚤性比的比值並使用 t －test 檢定，檢視出食物量供給的多寡對於水蚤雄性產出的影響是顯著的。 關鍵字：環境性別決定系統（environmental sex determination）（ESD）、孤雌 生殖（parthenogenesis） 、有性生殖（sexual reproduction） 、性別比（sex ratio）、 食物配給（food regime）

壹、前言 性別決定系統（sex determination system）對於大多生物扮演著極其重要的角 色，如植物的雌雄異體（dioecy）或是蚯蚓的雌雄同體（hermaphroditism） ，上 述都具有某種特殊的系統來決定生物的性別與特徵（Beukeboom and Perrin, 2014）。Bachtrog et al.（2014）說明在特定環境，族群性別偏向某一優勢性別 可能會比起性別比例平均更能提升整體族群的生存率。性別決定系統可分為兩大 類：基因性別決定系統（genotypic sex determination, GSD）及環境性別決定 系統（environmental sex determination, ESD）。 其中 ESD 是生物為了適應環境變化所衍生出的機制，如族群雌雄之間對環境的 適應度有差異時，個體會採用 ESD 使族群整體性別更偏向具優勢的性別，以提

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高存活率（Bull and Bulmer, 1989）。ESD 的機制與種類目前尚未完全知曉，但 已知鱷魚母體會藉由 TSD（temperature sex determination）來改變後代性別 （Muralidhar and Veller, 2018） 、部分魚類母體會因所處水域環境（如：pH 值、 含氧量）而改變後代性別（Godwin et al., 2003）。但以二分法將性別決定系統 分類（單一 GSD 或單一 ESD）則可能會忽略掉性別決定系統的多樣性，如海龜 就是由 GSD 與 ESD 共同影響的，此外也可能會忽略掉目前尚未發現的性別決 定系統（Uller and Helanterä, 2011）。先前 Trivers and Willard（1973）提出一 理論：某族群在特定環境下個體會選擇與調整某較有利升生存性別的假說，並後 來得到學者研究（Bull, 1981）和實驗觀察（Charnov and Bull, 1977）的支持。 Bull（1981）認為 ESD 為一生物機制：生物在受孕後，母體可能會因生存環境 而直接受影響，甚至母體因此改變後代性別，個體藉由改變後代性別來因應環境 壓力並提升族群存活率。Charnov and Bull（1977）認為 ESD 是生物受天擇影 響下所衍伸出來的產物：因生物個體或其親代無法控制他們生存的環境，所以母 體可使後代偏向存活率較高的性別。由上述實驗可以發現 ESD 機制顯示了「雌 雄對環境適應的差異」。 大多數生物可以透過 GSD 及 ESD 來控制後代的性別，其中蚤狀溞（Daphnia pulex）後代性別的產出是同時受到 GSD 及 ESD 的影響（Ye et al., 2019）。因 D. pulex 會以一獨特的生殖方式來因應環境的變動（Toyota et al., 2015；Eads et al., 2007） ，又因 D. pulex 對環境變動是敏感的，上述兩個特性對於研究 ESD 機 制是非常適合的（Kato et al., 2011）。Banta（1914）實驗發現採集水蚤地點的 環境可說明性週期（sexual cycle）並不是必要的條件，並說明 D. pulex 的繁殖 與性週期並無直接關聯，而是與環境有關。Adrianna（2012）發現在全球暖化 加 劇 的 影 響 下 ， D. pulex 會 接 收 到 魚 類 因 溫 度 升 高 時 所 產 生 出 的 開 洛 蒙 （kairomone），當 D. pulex 母體感知到危險就會產出具有保護層的休眠卵 （ephippium）以提高後代族群的存活率。除此之外，若 D. pulex 母體長時間暴 露於高溫環境下就可能會誘發 D. pulex 母體產下雌雄嵌性（gynandromorph） 性別的水蚤，因此科學家常常使用雌雄嵌性的性特徵來操縱水蚤對性別決定系統 實驗（Mitchell, 2004） 。 Olmtsead and LeBlanc（2002）以實驗證明青春激素（juvenile hormone）及甲 基丁二烯（Methoprene）是造成 D. pulex 後代雄性比例提升的關鍵因素。 Tatarazako et al.（2003）說明 D. pulex 在惡劣環境下，D. pulex 母體會製造青 春激素並暴露於此激素或相近的化學物質（如：甲基丁二烯），母體就會產出比

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一般環境下還更多的雄性個體，但產出的後代個體數量會減少。Toyota et al. （2015）在研究 ESD 對於 D. pulex 的機制，也證實青春激素是 D. pulex 母體 產出雄性後代的重要因素。水蚤雄性後代產出的目的是為後代水蚤可進行有性生 殖（sexual reproduction）並產生出具保護層的休眠卵，這些卵在惡劣環境下仍 可 延 續 後 代 ， 並 且 有 性 生 殖 可 提 供 水 蚤 後 代 個 體 的 基 因 重 組 （ genetic recombination） 、族群的遺傳多樣性（genetic diversity） （Olmestead and LeBlane, 2000）以及可使水蚤後代較能適應變動的環境（Decaestecker et al., 2009； Howard and Lively, 1994），但有性生殖方式相對孤雌生殖（parthenogenesis） 更消耗能量（Korpelainen, 2009），且有性生殖可能會使水蚤的基因型重組而導 致與原先具優勢的基因不一致（Decaestecker et al., 2009） 。在環境壓力相對較 小時，Weismann（1913）發現在攝氏 25～30 度時，水蚤有性生殖會因溫度因 素而完全被抑制，並且提出水蚤孤雌生殖是單獨被外在因素所造就的現象。 Korpelainen（2009）研究環境與水蚤交配系統及性別比例之間的關聯性，他實 驗溫度與水蚤之間的關係，且論文數據顯示出當秋冬季時（溫度降低），雄性水 蚤會明顯增加。Lampert et al.（2012）執行一實驗：他們以光週期作為操縱變 因，並發現在長日照下水蚤通常不會產生雄性水蚤後代；在短日照時，環境則會 誘發水蚤母體產下雄性後代。Berg et al.（2001）則以水蚤族群密度作為操縱變 因，他們發現當水蚤族群超過一定密度時，族群中的雄性水蚤數量就會增加。 Camp et al.（2019）操作一實驗，確認了光週期與溫度會共同促使水蚤產出雄 性之假說：D. pulex 在長日照、16～22°C 下，母體並不會產下雄性後代；在短 日照、所有溫度下，母體則會因溫度的降低，產下數量顯著增加的雄性，且後代 數量會隨溫度的降低而下降。而此趨勢在長日照週期下卻不明顯。Korpelainen （2009）研究發現，當春季溫度較低，此時正值水蚤的繁殖季節，會刺激水蚤 的繁殖方式由孤雌生殖轉變為有性生殖；然而，若在長日照或族群密度較低的環 境之下，上述因素會抵消溫度造成的刺激，導致水蚤進行的繁殖方式仍是孤雌生 殖。外在環境因素會導致水蚤的性別比例不同，甚至是生殖方式改變。Kleiven et al.（1992）經由實驗發現同時控制光週期、限制食物量及族群擁擠度都是誘導 水蚤休眠卵形成之必要因素。水蚤進行單一有性生殖或單一孤雌生殖的方式各有 優缺點，而進行週期性孤雌生殖（cyclical parthenogenesis）就可以囊括上述兩 者生殖方式優點。當環境壓力較小時，水蚤可以以孤雌生殖方式繁衍後代；當環 境壓力較大時，如：擁擠程度提升、光週期減少、周圍溫度降低及可取得食物量 下降時，水蚤就會利用有性生殖的方式產出休眠卵以度過惡劣環境，進而使水蚤 族群的存活率上升。

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根據上述多項實驗，我們歸納出能促使 D. pulex 產下雄性水蚤的外在因素有： 溫度、光週期、族群密度及食物量。我們想要部分重現 Kleiven et al.（1992） 的實驗並推測可攝取的食物多寡是否會影響 D. pulex 族群後代的性比，所以我 們想要以食物量作為操縱變因並確認水蚤是否會因食物的缺乏而刺激 D. pulex 母體產生出雄性水蚤，藉此回應在惡劣環境下，生物個體及族群會藉由改變後代 條件，以提高群體繁殖及存活率的議題。

貳、材料與方法 一、水蚤的鑑識： 我們根據 Rottmann et al.（2013）得知 Daphnia 屬的育雛袋位於雌性的背側且 完全封閉，Moina 屬則是敞開的。我們藉由此判別方式，確認出我們飼養的水蚤 為 Daphnia 屬的水蚤，並作為我們實驗的對象。 二、水蚤的培育： 我們在和商家購買水蚤後，先將水蚤放入 15*12*7 cm 的透明塑膠盒中加入飲用 水至八分滿，並置於 25°C 室溫及光週期 12.5：11.5（光照：黑暗）的環境下飼 養，每日定時餵食水蚤約 6 ml 綠藻水，作為水蚤生長繁殖之營養來源。當水質 開始混濁時（約三至四天），便以細篩網將水蚤濾出，更換盒中飲用水並加入新 的鯉魚飼料，提高水體有機物，且在平日未換水的日子使用滴管將盒底的沉積廢 物及水蚤屍體吸出丟棄，減少水質污染。 三、實驗操作： （1）實驗水蚤給予的環境： 為了避免水蚤因為實驗環境前後變化過大造成大量死亡無法得出實驗數據，我們 先抓出 100 隻水蚤並給予七天的時間來稍微適應惡劣環境，以 25°C 室溫、光週 期 12.5：11.5（光照：黑暗）及每日定時餵食水蚤約 0.5 ml 綠藻水的環境繁殖， 七天後再挑出 75 隻剛出生（體型較小）的水蚤進行實驗。我們實驗在相同光週 期 12.5：11.5（光照：黑暗），相同的溫度 25 °C，實驗三種不同的食物量：於 每日上午 8 點餵食水蚤（A）約 0.25 ml 綠藻水；（B）約 0.5 ml 綠藻水；（C） 約 0.75 ml 綠藻水，共三種環境各五盆，每盆五隻水蚤。且每日會將每盆水補至 300 ml。

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

圖一、本實驗所採用之實驗設施示意圖。 （2）水蚤性別的判別：以解剖顯微鏡放大觀察其特徵 我們將水蚤利用具有輔助格線的細篩網圓盆過篩，瀝除大部分水分以避免水蚤不 斷移動影響觀察，並藉由圓盆的格線使水蚤的計數更加地容易。將瀝除水分的篩 盆及水蚤置於有少量水的培養皿上，避免水蚤死亡。我們根據 Olmstead and LeBlanc（2000）對於水蚤性別的的判別方法，得知於頭囊的部分，雌性有一個 細長的喙，而雄性頭囊的前部扁平；雌性頭囊下方的甲殼邊緣光滑無剛毛，雄性 的甲殼邊緣被修飾並襯有剛毛；雌性的第一觸角很小，而雄性的則較長；雌性在 育雛室的下方有腹突，而雄性則無。 （3）實驗數據的統計與分析：普查判斷水蚤性別並計算性別比值 在 Lampert et al.（2012）實驗中，水蚤數量可能會因隨著實驗的進行而增減， 所以他們進行多次實驗並將多組數據彙整，以「水蚤雄性數量：水蚤總數量」的 比值進行 t－test 檢定。因此我們決定將經培養過的水蚤，以盆為單位，將每隻 水蚤逐隻抓出並觀察雌雄性，計算其雄性與群體的比值，並使食物缺少的組比對 控制組、食物過多的組比對控制組，再以 t－test 檢定算出 p 值，若 p 值小於 0.05 時，代表水蚤雄性生成數量會因食物量的多寡而受影響；反之，若 p 值大於等於 0.05 時，代表水蚤雄性生成數量與食物量的多寡之間的關聯性是不顯著的。

參、結果 我們此次實驗樣本沒有產生出雄性，所以我們使用族群總數量做 t－test 檢定： （一）0.25ml／day、0.5ml／day 的 p 值：0.01688（小於 0.05）； （二）0.5ml／day、0.75ml／day 的 p 值：0.00466（小於 0.05）； （三）0.25ml／day、0.75ml／day 的 p 值：0.97075（大於 0.05）。

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食物缺少組與控制組的 p 值小於 0.05，兩者之間的數據是顯著差異的，所以我 們推測出食物量缺少會導致水蚤的個體數量減少。食物過多組與控制組的 p 值小 於 0.05，兩者之間數據是顯著差異的，與我們預測是不相符的，我們推測出食 物量過多也會導致水蚤的個體數量減少。食物量缺少與食物量過多的 p 值大於 0.05，兩者之間差異是不顯著的，所以我們推測食物量缺少或過多都會影響水蚤 的個體數量。

肆、討論 一、為何沒有產出雄性？ 我們實驗環境的光週期為 12.5：11.5（光照：黑暗）並根據 Kleiven et al.（1992） 的實驗推測是可能因為光週期而導致水蚤判斷不是惡劣環境，導致水蚤沒有產生 出雄性；我們根據 Ye et al.（2019）和 Galimov et al.（2011）的研究得知，水 蚤親代即使在環境壓力極差的刺激下，仍有可能會因為遺傳因素的控制造成雌性 失去產生雄性後代的能力。 二、為何食物量過多會導致水蚤數量減少？ 我們根據 Barbara et al.（2009）的實驗得知：水蚤不僅在食物匱乏的情況下會 感知環境壓力，若當食物量過多時（如自然環境中的優養化湖泊）也會使水蚤減 少繁殖數量。

伍、引用文獻 Adrianna W.F. (2012) The effects of global warming on Daphnia spp. population dynamics: a review. Aquat Ecol 46(1): 37–53.

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陸、附錄 Nutrition Male 0.25ml/day 0 0 0 0 0 0.5ml/day 0 0 1 0 0 0.75ml/day 0 0 0 0 0

Total 67 49 13 4 17 15 71 44 76 43 8 34 33 22 35

Specific ratio 0 0 0 0 0 0 0 0.022727273 0 0 0 0 0 0 0

表一、實驗樣本數據（水蚤雄性數量、總數量及性比）。

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水深與二氧化碳對異葉水蓑衣葉形的效應 The effects of water depth and CO2 on leaf shape of Hygrophila difformis 蔡珈麒、張芷瑜、黃如玫、熊庭、張珮瑜 國立中山大學生物科學系

摘要 表型可塑性即生物響應環境變化而改變行為、外型與生理機制的能力，並且不需 改變其性狀遺傳基礎。表型可塑性存在於許多生物當中，尤其對於不具遷移能力 的植物的重要性更甚於動物。異型葉是植物外型表型可塑性的一種，指同一植株 上產生不同葉形的現象，廣泛出現於不少陸生及水生植物中。其中水生植物的異 形葉與適應淹水有關，水位、水流量與 CO2 濃度等在水陸環境中差異甚大的外 在因子藉由調整植物內部激素來使葉產生能適應異質環境的特徵。本次以異葉水 蓑衣作為實驗對象，比較了前人對於其他異形葉植物的實驗，並通過測量裂葉指 數 DI 值(Dissection Index)來判斷植物的葉形異化程度。實驗共分成三個條件， 以檢驗水位及 CO2 添加與否對於葉形的改變。裂葉指數總共測量三次，而氣孔 密度在最後一次裂葉指數測量後被和陸生葉進行比對。結果顯示水位較淺與有 CO2 添加時，裂葉程度會高於水位深與無 CO2，且 CO2 的影響程度大於水位。 關鍵字：異葉水蓑衣(Hygrophila difformis)、表型可塑性(phenotypic plasticity)、 異形葉(heterophylly)、兩棲植物(amphibious plants)、適應性(adaptability)

一、前言 表型可塑性(phenotypic plasticity)意指生物體在不改變個別基因或特定性狀的遺 傳基礎的情況下回應環境梯度的表型範圍(Schlichting, 1986; West-Eberhard, 2008)。由於這些變化在生物個體的生活史中可能是永久的，例如發育可塑性 (developmental plasticity)；也可能是暫時性的，例如大多數的生化與生理反應 (Pigliucci, 2006)。而在數百萬年的過程中，物種會不斷遇到環境極端變化，通 過快速改變表型來適應環境的能力可能對於生存至關重要(Sultan, 2000)，且了 解表型可塑性能夠預測全球變化條件下物種分佈、群落組成和作物生產力的變化 (Lande, 2009)，因此科學家們對此表現濃厚興趣。

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表型可塑性可由廣泛的生物所展現，例如：翼弧蚤(Daphnia lumholtzi)頭盔與尖 刺的發達程度(Agrawal, 2001)、雌性蚜蟲(Aphidoidea)翅膀的有無(Xue & Leibler, 2018) 、角蜣螂(Onthophagus taurus)的頭角的尺寸大小(Nijhout, 2003)、橡木 (Quercus) 根 在 土 壤 中 的 分 布 (Callaway et al., 2003) ， 以 及 菸 草 (Nicotiana tabacum cv. Petit Havana)莖的長短(Petersen et al., 2011)。植物表型可塑性包 含的範圍很廣(Gratani, 2014)，例如植株高度、分枝數量和節間長度等(Sultan, 2000)。另外，因為具有較佳適應可塑性的物種可能更有機會生存於新的環境中， 所以可塑性被認為在植物應對全球性的變化及在生態系統水平上野生種和入侵 種之間競爭的結果中可能扮演著重要的角色 (Gratani, 2014)。最後，表型可塑 性被認為是植物應對環境因素變異的主要手段之一(Gratani, 2014)，因為無法移 動的生物不能透過遷移來遠離不利於生存的環境(Schlichting, 1986；Li et al., 2021)。 葉子作為植物與周遭環境互動的重要界面，它的功能是捕捉陽光、行光合作用、 交換氣體和感知周圍的環境變化，並且會在環境異質性高的條件下以植物激素來 調節葉子的生長(Li et al., 2021)，包括葉形的改變、氣孔密度的變化，以及葉肉 組織的排列方式。異形葉 (Heterophylly)是一種常見的表型可塑性，意指同一植 株 上 可 產 生 不 同 葉 形 的 現 象 。 它 廣 泛 出 現 於 陸 生 及 水 生 植 物 中 (Etnier et al., 2017) ，例如：桑樹(Morus alba)的波形葉及卵形葉(Tikader & Vijayan, 2017)、 銀杏 (Ginkgo biloba)的短枝葉與長枝葉 (Leigh et al., 2011)，與胡楊(Populus euphratica)的線形和缺刻扇形等。誘導植物形成異形葉的原因相當多元，例如： 光週期、光強度、水深、CO2 濃度、溫度、養分和鹽度等 (Titus & Sullivan, 2001; Bristow, 2011; Horiguchi et al., 2019)。這些影響因子會影響植物的生長機能， 例如：小水毛茛 (Ranunculus aquatilis)若是受到短日照會促進水生葉的生長(Li et al., 2021)和沼澤美人魚草(Proserpinaca palustris) 若是受到短日照會促進沉 水葉的生長 (Li et al., 2021)。植物體內的激素，如吉貝素(GA)( Gazzarrini & McCount, 2001)、細胞分裂素(CK)( Kieber & Schaller, 2014)、生長素( Gazzarrini & McCount, 2001)、乙烯(Gazzarrini & McCount, 2001；Kuwabara,2003 ; Kim et al.,2018；Li et al., 2017；2021)和離層素(ABA) (Gazzarrini & McCount, 2001； Lin et al,2005 ; Kim et al.,2018)都有參與誘導異形葉現象的發生。其中，在多種 水生植物中，乙烯被認為可促進水生葉產生 (Kuwabara,2003 ; Kim et al.,2018) ， 而離層素被認為和陸生葉形成有關 (Lin et al,2005 ; Kim et al.,2018) 。

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部份兩棲植物(amphibious plants)具有三型葉片：水生葉(submerged leaves)、 陸生葉(terrestrial leaves)與同時具有兩種特徵的中間型葉(intermediate leaves)。 以水蔊菜(Rorippa aquatica)為例，水生葉較薄且窄、氣孔數減少、角質層消失， 及葉綠體集中在葉表層；陸生葉則是除葉綠體分散在葉肉中之外，其他特性都和 水生葉相反(Li. et al., 2019；Bradshaw, 1965)。此外，由於氣體在沉水情況下 的擴散阻力比在陸地上大(Smith & Walker, 1980；Maberly & Madsen, 2002)， 所以有限的 CO2 吸收效率會刺激植物分泌激素以誘導葉形、葉片厚度、氣孔數， 和角質層等構造做出相對應的改變，使兩棲植物能適應水下環境 (Horiguchi et al., 2019) 。 異葉水蓑衣(Hygrophila difformis)是一種典型的兩棲異形葉植物，由於其擁有生 長快速、易於培養、體型適中、變化明顯，且對環境因子特別敏感 (Li et al., 2017; 2020)等優點，所以異葉水蓑衣時常當作研究異形葉的理想實驗對象(Li et al., 2017；2020)。在 Li et al. (2017) 的研究中，他們發現乙烯能夠誘導異葉水蓑衣 生成水生葉，而 Horiguchi et al. (2019) 比較異葉水蓑衣用乙烯和乙烯抑製劑處 理後的陸生葉和沉水葉的光合作用能力，發現乙烯對於異葉水蓑衣以沉水葉來適 應水生環境有重要的作用。 然而，我們發現光合作用所需的 CO2 及淹水產生的水位變化與異形葉之間的關 聯性目前還沒有使用異葉水蓑衣進行實驗。而與 CO2 濃度和水位有關的文獻則 多用其他兩棲植物作為實驗對象，所以本次實驗參考 Titus & Sullivan (2001)和 Bristow (2011)的研究，並以異葉水蓑衣作為實驗對象。在 Bristow (2011)的研究 中，黃水毛茛(Ranunculus flabellaris)和粉綠狐尾藻 (Myriophyllum aquaticum) (原文標記為 Myriophyllum brasiliense)在較高濃度的 CO2 中，呈現沉水葉的形 式，而在 Titus & Sullivan (2001)的文獻中，雜色萍蓬(Nuphar lutea)在較高的水 位中裂葉程度較高，因此我們提出了兩項疑問：「水深對於異葉水蓑衣形態生長 變化的影響」和「CO2 對於異形葉分裂程度的影響」，並比較前面兩項的結果， 提出「水位和 CO2 對異葉水蓑衣葉形分裂程度之影響何者較大？」 。第一個問題 根據 Titus & Sullivan (2001)的文獻結果，我們推測水較淺時異形葉的裂葉程度 會較低，而水較深時異形葉的裂葉程度會較高；第二個問題根據 Titus & Sullivan (2001)以及 Bristow (2011)的研究，我們推測加入 CO2 時異形葉的裂葉程度會 較高，而沒有加入 CO2 時異形葉的裂葉程度會較低；第三個問題根據 Horiguchi (2019) 的 研 究 ， 異 葉 水 蓑 衣 會 透 過 使 用 HCO3 － 來 適 應 水 生 環 境 ， 而 Titus & Sullivan (2001)的研究顯示 CO2 對於水生葉的影響大於水位，因此我們

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推測 CO2 對於裂葉程度的影響會較水深高。本實驗使用水位與 CO2 濃度作為操 控變因，測試水深與 CO2 是否是造成異葉水蓑衣產生不同裂葉程度的原因。

二、材料與方法

圖一、本實驗所採用之實驗設施示意圖。 (一) 植物的獲取與栽培 植物取自水族館，因為我們取得植物時為水生葉，因此本實驗先將其培養成陸生 葉做為對照組，植株以三株為一盆，並使用赤玉土栽培，水位控制在盆栽上緣。 我們將植株培養於室外，且放入數隻斑馬魚(Danio rerio) 在水中以避免登革熱。 培養五週待其成長為陸生葉。 (二) 設施的搭建與準備 使用三缸 60 cm (L) x 30 cm (W) x 45 cm (H)的魚缸靠在一起，由左至右分別為 水深 40 cm、40 cm，與 20 cm。每缸安裝一個內置過濾器。三個魚缸上方安裝 燈具，且以定時器控制光週期為 12/12，並設置加溫棒，溫度控制在 26 度，魚 缸內部加裝過濾器。最左邊的魚缸附加 CO2 供應系統以及 CO2 檢測套組。 (三) 操作流程 我們以水位與 CO2 為操縱變因，水位選擇有 20 cm 和 40 cm， CO2 則是用每秒 泡數來調控濃度，本實驗為兩秒一顆。我們選取由上往下數兩對成熟葉皆為陸生 葉的植株，並剪下靠近下一對葉片的位置，以三株為一盆，將植物編號。每缸放 入二十一株異葉水蓑衣，最終取十二組數據。

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我們使用裂葉指數 DI 值(Dissection Index) 作為葉形異化程度之判斷方式，算法 是葉周長/√葉面積。因為羽狀葉的周長會較大，該值會比卵形葉還要高。 在放入異葉水蓑衣至魚缸前，我們先測量從新葉往下數第二對葉子的其中一片的 葉尖到葉底之距離並拍照(不剪下)(2021/12/13)，以 ImageJ 計算此時葉片周長 及面積並計算 DI 值，經過三週後(2022/1/3)再次測量觀察其裂葉程度，因本實驗 持續時常為四週，因此最終測量為四週後(2022/1/9)。 我們使用兩獨立樣本 t 檢定(t-test)進行統計檢測，將每缸的首次與最終次、第一 缸與第二缸最終次，以及第二缸與第三缸的最終次做比較，得到五組檢定 p 值， 用以探討問題。

三、結果 (一) 水深對於異葉水蓑衣形態生長變化的影響？ 我們以 1/9 測量的數據進行兩獨立樣本 t 檢定(t-test)，得到第二缸的平均值為 5.18，第三缸的平均值為 5.57，而 ptest(T≤t)=0.01 (<0.05)，因此我們可以得知 水位確實會對異葉水蓑衣的裂葉程度造成影響。因為第三缸的 DI 值平均較第二 缸高，因此我們可以得知水深較淺裂葉程度會較高，而水深較深裂葉程度則會較 低。 (二) 有無 CO2 對於異形葉分裂程度的影響 我們以 1/9 第一缸與第二缸的 DI 值進行兩獨立樣本 t 檢定(t-test)，得到第一缸 的平均值為 5.71，第二缸的平均值為 5.18，而 ptest (T ≤ t) =0.0003 (<0.05)， 因此我們可以得知有無 CO2 會對異葉水蓑衣的裂葉程度造成明顯影響。而第一 缸的 DI 值平均較第二缸高，因此我們可以得知有 CO2 時裂葉程度會較高，而無 CO2 時裂葉程度則會較低。 (三) 水位和 CO2 對異葉水蓑衣葉形分裂程度之影響何者較大？ 我們以 1/9 測量的數據進行兩獨立樣本 t 檢定(t-test)，得到 CO2 濃度差異的 ptest(T≤t)=0.0003，而水位差異的 ptest(T≤t)=0.01，兩者皆小於 0.05，但 CO2 濃

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度的 ptest 小於水位差異的 ptest，因此我們可以得知 CO2 對異葉水蓑衣葉形分裂 程度之影響較水位大。

四、 討論 (一) 結果分析 1.

水位：

結果顯示水位對於異形葉的影響與原本的預測相反，在低水位條件中植株裂葉程 度反而較高水位條件明顯，時間、溫度與光照皆有可能導致此結果。 2.

CO2：

我們的結果與預測相符，但可能是因為實驗一開始光照不足及溫度過低造成異葉 水蓑衣的生長速度不如預期，因此雖然統計結果符合我們的預測，然而裂葉程度 卻並未達到我們的預期，外觀上看起來和陸生葉差異不大。 3.

水位與 CO2 之比較：

實驗結果顯示 CO2 對於異葉水蓑衣葉形變化之影響確實較水位大，我們認為是 因為異葉水蓑衣會透過使用 HCO3－來適應水生環境(Horiguchi, 2019)，且本實 驗的水深並未深至影響到光的強度，因此實驗結果與我們的預測相符。 (二) 其他可能影響裂葉實驗的因素 1.

時間：

相較於 Titus & Sullivan (2001)使用一百二十天的時間進行實驗，我們進行實驗 的時間只有二十八天，而植株的葉形改變尚未到達我們的期望，因此造成實驗結 果與預測不同，且 DI 值的變化量也並未如想像中的大。 2.

光：

我們觀察到光強度在 20cm 與 40cm 的清澈水中並不會有太大的差別，但是在 有 CO2 的水缸中，藻類的生長速度大於其他兩缸，擋住異葉水蓑衣應吸收的光 線，以至於異葉水蓑衣的生長狀況不如預期，因此我們猜測是綠藻的數量影響光 強度。 3.

溫度：

異葉水蓑衣原產於東南亞與南亞，屬於溫度較高的氣候，因此溫度保持在 26 度 左右較適合，然而本實驗在實驗期間遇到寒流來襲，但我們並未注意到水溫的變

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化及溫度控制，導致植物在此時生長緩慢，我們認為水溫較低可能會抑制葉的發 育。 4.

水流流速：

為了減少葉片在水流中的阻力，所以水生植物的葉片大多是流線形(Xiaoxia & Nepf, 2020)。而本實驗的水流是靜止的，葉片不需要為了減少水阻而分裂，因 此我們猜測這是裂葉程度不明顯的原因之一。 (三) 其他觀察 1.

莖和根的生長：

我們觀察到第三缸植株的莖較其他兩缸長，第一缸在不定根的發育程度上較其他 兩缸高，而不管是莖還是根的發育皆比葉形變化明顯，我們認為可能是因為可塑 性的類型和程度會因個體性狀和環境條件而異 (Pigliucci, 2006)。 2.

葉片變色：

第一缸的葉片顏色較其他兩缸紅，我們推測可能是由於高 CO2 最會導致上表皮 細胞明顯增大和表皮葉綠體面積減小，所以從外觀上來看呈現綠中帶紅的顏色 (Huang, 2020)。

五、引用文獻 Agrawal, A. A. (2001). Phenotypic Plasticity in the Interactions and Evolution of Species. Science, 294(5541): 321-326.

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附錄 本實驗的原始數據：https://reurl.cc/k7qO8b

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

野生型斑馬魚大膽程度的評估 Assessment of boldness of wildtype zebrafish 陳卉蓁 1、謝利旋 1、周慧軒 1、李致樺 1 1

國立中山大學生物科學系

摘要 動物個性是指隨著時間的變化，不同個體之間的行為差異持續存在，而同個體的 行為則是一致的。而大膽是動物個性的其中一種，是指動物進行風險行為的傾向， 以其對於新環境與新物體的探索方式或接受程度來定義。因個性會造成行為差異， 因此斑馬魚在進行行為學實驗時，可能需先進行個體個性的前測。若沒有事先評 估個體是否有行為穩定性，則不能準確判斷行為的改變是否是因為實驗的操作變 因而導致。20 隻 Danio Rerio(DR)被放置於實驗水族箱，一開始先將隔板置於 3 室之間，使魚隻在適應區適應 3 分鐘，接著錄影開始時將隔板抽離，拍攝 10 分 鐘後利用影片觀察結果。分別記錄 DR 的位置、穿越次數與游泳，最後採常態分 配假設檢定進行統計檢測。每隻魚重複實驗 5 次，每次實驗間隔 2 日，給予魚 隻充分的休息時間。結果發現斑馬魚在上述行為中，多數魚隻在 5 次的實驗中， 行為皆穩定，代表在進行動物行為實驗時，不需要進行評估穩定性的前測。 關鍵字：明暗偏好測驗(Scototaxis test)、照明偏好(Illumination preference)、動 物個性(Animal personality)、大膽(Boldness)、動物行為(Animal behavior)

一、前言 動物個性(personality)的定義為隨著時間的變化，不同個體之間的行為差異持續 存在，而同個體的行為則是一致的(Carter et al., 2013)。人們對動物個性產生興 趣源自於對個體的行為，如攻擊性(aggressive)和膽量(courage)呈正相關。但此 相關性的高低亦受到個體捕食(predation)方法影響，於是解釋物種間個性差異的 過程是性格研究的主要議題(Sih et al., 2015)，亦有學者認為個體差異是源於動 物所經歷的主觀感受，因而受到重視(Mills, 1998)，動物以不同行為應對環境變 異亦為生態學中所關注的重點(Carter et al., 2013)。在動物行為學實驗中，科學 家們兩方討論在實驗中是否需要考慮動物個體行為間的差異，支持方表明，以人 類角度探討每個人的個性均不相同，對同一件事所做出的應對方向亦有所差異， 因此將此概念運用於動物身上，認為在進行行為學實驗時應考慮動物個性所帶來

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

的差異與影響，並對此進行前測(Koski, 2011)；反對方則是認為個性於動物中仍 然存在爭議，性格特質的選擇也只是基於人類對於動物具有個性的猜測，因此認 為個性並不會對最終的結果造成過大的影響。綜上所述，對於動物行為實驗前是 否要做個性的前測之研究仍然有所爭議(Forkosh, 2021)。 過去動物行為研究僅限於與人類個性做對比，如衝動(impulse)、害羞(shy)、好 奇(curious)等單一行為元素，並沒有進一步探討動物於這些行為上對動物本身造 成的影響(Locurto, 2007)，後來隨著對動物行為個體差異之研究持續增長(Sih et al., 2004 ; Carere & Locurto, 2011 ; White et al., 2020)，學界對於動物個體行為 多樣性與其變異的理解更提升了人們對動物的認知，並給予其更好的福利。如利 用動物行為表現推測其身體健康的現象(Ward et al., 2018)、水族館如何以正確 的方式飼養魚隻(Miller et al., 2020)、衡量海豚於野外的行為並滿足海豚於生活 上的需求(Miller et al., 2021)等。實驗亦延伸對人類的益處，如應用在農場動物 的照護上達成經濟效應的提升(Kilgour, 1978)，人類心理疾病的成因如憂鬱症 (depression)、自閉症(autism)與可能的治療方法(Ferster, 1966)。 動物個性的研究目的可分為兩個主要層面，第一為動物個性的生物學，如生理或 遺傳學，第二為動物個性究竟如何形成。這些研究主要聚焦於觀察動物的行為特 徵 (behavioral traits)(Gosling, 2008) ， 如 ： 探 索 (exploration) 、 攻 擊 (aggressiveness)與社交能力(sociability)等(Uchida et al., 2020)。動物個性會影 響動物的日常行為，例如爭奪配偶與食物，或在捕食壓力下覓食和選擇棲息地， 所以動物個性在動物的生存中具有重要的地位 (White et al., 2013) 。根據 Capitanio et al. (1999)，成年雄性恆河猴(Macaca mulatta)的個性與猴免疫缺陷 病毒(simian immunodeficiency virus)的病程(progression)有所關連。此外， Pederson et al. (2005)評估黑猩猩(Pan troglodytes)的個性後，成功預測了黑猩 猩的社交行為(social behavior)。Mather & Anderson (1993)發現即使在相同的實 驗條件下，章魚(Octopus rubescent)普遍存在較大的個體行為差異。Yuen et al.

(2016)對野外和實驗室對非洲條紋小鼠(Rhabdomys pumilio)進行行為特徵的評 估時發現，無論是實驗室與野外的小鼠皆有顯著的個體差異。動物個性研究的增 加有助於在動物行為領域開拓新的研究途徑，例如天擇對於大膽(boldness)、探 索(exploration)、攻擊(aggressiveness)等個性特徵(personality traits)上的影響 (Conrad, 2011) 、 父 母 的 巢 址 選 擇 (nest site selection) 、 營 養 供 應 (nutrient provisioning)、激素轉移(hormone transfer)等親本效應(parental effects)對後代 行為特徵的影響(Reddon, 2012)，以及動物變態(metamorphosis)前後的行為特

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

徵的一致性(Wilson & Krause, 2012)等。 動物個性實驗包含了對許多行為特徵的研究，例如攻擊性(aggressiveness)、社 交能力(sociability)，而「大膽」是動物個性之中，最被廣泛研究的個性(Chapman et al., 2010)。「大膽」意指動物執行風險行為(risky behavior)的傾向，及其對新 環境與新物體的探索方式或接受程度。若動物在新環境中會從事風險行為，例如 靠近新物體，則定義為「大膽」 ，若反之則為「害羞」(shyness)(White et al., 2013)。 「大膽」也與活動力(activity)、空間使用(space using)(Wilson & McLaughlin, 2007)，社交力(sociability)(Ward et al. 2004; van Oers et al. 2005; Webster et al.

2007) ， 入 侵 性 (invasiveness)(Rehage & Shi, 2004) ， 婚 配 選 擇 (mate selection)(Godin &

Dugatkin, 1996)等行為有關。Ariyomo et al. (2013)認為大

膽個性可能是能夠經由遺傳保留而被保留，故研究大膽個性有助於了解動物的行 為與生存能力。 科學家會以動物的行為作為評估其大膽程度的依據，並認為動物在面臨挑戰時， 主要會有兩種反應，而兩種方式分別代表不同的應對方式 (coping style)。積極 的動物通過攻擊或逃跑對有威脅的情況做出積極反應，這種行為被認為是大膽， 而被動等待危機解除的則被認為是害羞 (Dahlbom et al., 2011)。不同物種必須 以其合適的方式檢測大膽程度(Ribas & Piferrer, 2014)，例如 Chapman et al.(2010)在孔雀魚(Poecilia reticulate)的大膽測試中，以光影模擬天敵，測試孔 雀魚從靜止到恢復行動的時間測定其大膽程度；Wilson et al. (2011)對藍鰓太陽 魚(Lepomis macrochirus)進行的大膽測試則利用了垂釣與撒網不同的捕魚方式 以評估藍鰓太陽魚的大膽程度；在 Dzieweczynski & Crovo (2011)對於三刺棘魚 (Gasterosteus aculeatus)的大膽測試中，是利用陌生環境與覓食行為之間的關 係來評估三刺棘魚的大膽程度；而 Dahlbom et al. (2011)的實驗是製造陌生、空 曠的環境與庇護所，讓斑馬魚自由探索，觀察斑馬魚在庇護所的時間長短以評估 其大膽程度，再以實驗數據評估大膽與社會地位之間是否有正相關，而斑馬魚已 被 證 明 成 群 飼 養 時 會 表 現 出 攻 擊 性 並 發 展 出 明 顯 的 從 屬 關 係 (subordinate relationships)，Dahlbom et al. (2011)的實驗結果顯示大膽的斑馬魚比害羞的斑 馬魚更能成為領導者；Ariyomo & Watt (2012)的實驗則是將斑馬魚放入佈滿細線 的實驗缸中，以穿越細線的次數來評估其大膽程度，越過最多線的魚被認為最大 膽，那些越過最少線的魚被認為是最害羞的，而害羞的魚往往會長時間保持靜止 狀態(frozen)，並潛伏在實驗箱的角落；在 Mustafa & Winberg（2019）的實驗 中，他們設計了一個長方體的實驗缸，並製造出頂部、中間區、底部，利用斑馬

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

魚在各區域的停留時間，去評估牠們的大膽程度，停留在頂部的時間越長，被認 為為越大膽，而停留在底部的時間越長，則被認為越害羞。 我們實驗目的為參考 Magon et al. (2015)的明暗測試，並評估斑馬魚個性之穩定 度。我們利用動物個性中的大膽個性，評估動物個體本身的行為是否穩定，如果 個體行為呈現穩定，則在做動物行為測試時即不需進行有關動物個性的前測；如 果個體行為呈現不穩定，則在做動物行為測試時則需要進行有關動物個性的前測， 將不穩定的個體排除，因為個體個性若不穩定即會直接影響動物行為改變是否與 實驗的操作變因有關。

二、材料與方法 (一) 魚隻來源與飼養 野生型成體斑馬魚從水族館取得 100 隻後群體飼養於約 pH7，水溫 24°C 至 26°C， 100 cm × 80 cm × 60 cm 的水族箱，定時於中午 12 點及下午 5 點餵食人工餌料， 並給予 12 小時的光照(早上 6 點至晚上 6 點)。 (二) 實驗設備 我們利用塑膠隔板與隔板夾將實驗缸分為 3 個區域：明室、適應區，與暗室(圖 一)。我們首先利用燈具設置明室，再利用黑色塑膠板黏貼在魚缸周圍隔絕外界 光線製造暗室。我們於整個實驗缸的背面放置白色塑膠板以利拍攝，並在實驗缸 底部鋪上一層底沙防止反光(圖一)。

圖一、實驗缸設置 (三) 實驗流程

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

我們隨機從 100 cm × 80 cm × 60 cm 的水族箱挑選 25 隻斑馬魚飼養於 25 cm × 25 cm × 25 cm 的水族箱內，並繼續飼養 10 日後再開始進行實驗。實驗缸為 60 cm × 30 cm × 14 cm 的長方體水族箱，25 隻斑馬魚被逐一隨機挑選，並在編號 後放入適應區適應 3 分鐘，將兩隔板同時取出並用手機錄影 10 分鐘。實驗完後 將兩隔板放回。取出魚隻後獨立飼養於 15 cm × 10 cm × 8 cm 的塑膠盒內並編 號。編號方式為依實驗時序，例如：第一隻進入實驗流程的斑馬魚為「A 組 DR01」 ， 第二隻為「A 組 DR02」，依此類推。我們將實驗魚隻分為四大組，一組 5 隻， 共計 20 隻，再加上 5 隻作為備用個體。每組實驗重複 5 次，每組實驗間隔 2 日， 並給予魚隻充分的休息時間 (圖二)。 圖二、魚隻編號與獨立飼養。

(四) 實驗統計與分析 我 們 實 驗 將 統 計 魚 隻 的 位 置 (zone) 、 穿 越 (shuttle) 次 數 、 在 明 室 中 的 游 泳 (swimmimg)時長。 1. 位置(zone)： (1) 定義：將魚缸平分成三等分，暗室為第 1 區，適應區為第 2 區，明室為第 3 區，並定時紀錄。 (2) 操作：從錄影後開始每 30 秒記錄一次該魚所在的區域。若斑馬魚處在兩個 區域之間的話,則藉由前後時段推斷出斑馬魚要去的區域,全部記錄完後計算出 DR 所待區域的平均值。 2. 穿越(shuttle)： (1) 定義：將魚缸利用塑膠隔板與隔板夾作為區域的分隔線，當魚隻通過此 分線

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

則紀錄為 1 次穿越。 (2) 操作：記錄 10 分鐘內 DR 通過分隔線的次數。 3. 游泳(swimming)： (1) 定義：在明室的情況下所展現的優游自在、不疾不徐的泳姿。 (2) 操作：紀錄 10 分鐘內 DR 在明室中游泳的時間總長度。 我們將利用常態分配假設檢定，分析魚隻個體本身在位置、穿越次數、在明室中 的游泳時長的行為元素是否穩定。若常態分配假設檢定的 p 值大於 0.05，則此 行為為穩定。

三、結果 在實驗過程中，因魚隻照顧不當導致 DR18 死亡，故去除其數據。我們利用常態 分配假設檢定法檢定位置、穿越次數及明室中游泳時長。位置僅 DR16 呈現不穩 定(p=0.033<0.05)，所以位置的統計結果為 18：1(穩定：不穩定)；穿越次數全 組數據呈現穩定(p>0.05)，穿越次數的統計結果為 19：0；明室中游泳時長僅 DR05 呈現不穩定(p=0.004<0.05)，明室中游泳時長的統計結果為 18：1。上述 結果與我們預期的相同，除了 DR05 與 DR16 之外，其餘魚隻在 5 次測試當中， 3 種行為元素皆表現穩定。

四、討論 我們透過三組行為元素數據進行統計與分析：位置、穿梭界線的次數、明室中的 游泳時長。於位置的結果中，行為穩定魚隻的數據明顯多於不穩定的魚隻；穿越 次數的結果中，行為穩定魚隻的數據亦明顯多於行為不穩定的魚隻；明室中游泳 時長的結果中，行為穩定魚隻的數據也明顯多於行為不穩定的魚隻。綜上所述， 即使並非所有個體的行為都是穩定，但穩定行為之個體明顯多於不穩定的，因此 我們認為斑馬魚的行為趨向穩定，在進行動物實驗前不需進行評估魚隻個性之前 測。但是實驗器材與實驗設計可能影響魚隻的行為進而影響評估魚隻是否穩定， 不排除改變實驗器材與實驗設計後，魚隻的行為穩定度會改變的可能性。

五、引用文獻 Ariyomo, T. O., Carter, M., & Watt, P. J. (2013). Heritability of boldness and

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Personality traits are consistent when measured in the field and in the laboratory in African striped mice (Rhabdomys pumilio). Behavioral Ecology and Sociobiology, 70(8), 1235-1246.

附錄一：本實驗之原始數據 https://reurl.cc/e68AdQ

附錄二：本實驗之所有影片連結 組別 A 組(DR01~DR05)

https://reurl.cc/l9dAyY

B 組(DR06~DR10)

https://reurl.cc/dX5Ayg

C 組(DR11~DR15)

https://reurl.cc/Opqn5X

D 組(DR16~DR20)

https://reurl.cc/dX5A1g

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

斑馬魚對顏色刺激的關聯性學習 Associative learning of color stimulus in zebrafish 邱諺祺 1、陳柏元 1、游順傑 1、吳承陽 1、林欣輝 2 1

國立中山大學生物科學系

2

高雄市立高雄高級中學

摘要 關聯性學習是理解人類和動物行為的關鍵，在許多的脊椎動物上都已經發現有聯 想學習的證據。在斑馬魚的認知研究中，常會以視覺刺激作為評估的工具，也已 經證實了斑馬魚對於顏色及形狀具有一定的辨識能力。而獎勵學習常是進行行為 學研究時的一種手段，因為當環境中的線索被賦予獎勵後，有助於動物決定追求 那些目標及如何追求目標。在我們的實驗中，我們會將斑馬魚分成四組，分別為 沒放置紅色塑膠片且沒投放飼料的對照組 ( 縮寫為 WN )，以及沒放置紅色塑 膠片且投放飼料 ( 縮寫為 WY )、放置紅色塑膠片且沒投放飼料 ( 縮寫為 RN ) 與放置紅色塑膠片且投放飼料 ( 縮寫為 RY ) 的三組實驗組。最後將實驗結果 分成兩兩進行數據比對，分別為 WN 與 WY、RN 與 RY、RN 與 WN、WN 與 RY、RY 與 WY ，並以兩獨立樣本 t 檢定檢測實驗數據。我們的實驗結果顯示 斑馬魚能夠藉由食物建立獎勵機制，且透過紅色塑膠片所產生的視覺刺激並不會 影響斑馬魚的行為。 關鍵字：關聯性學習 (associative learning)、條件制約 (conditioned reflex)、獎 勵機制 (reward)、顏色刺激 (color stimulus)、視覺刺激 (visual stimulus)

一、前言 關聯性學習 (associative learning) 是一種被稱為條件制約 (conditioned reflex) 的學習方式，其被定義為獲得和鞏固特定感官刺激的發生與隨後結果之間關係的 能力 (Ruhl et al., 2015)，同時也是理解人類和動物行為的關鍵，也是一個活躍 且有爭議的領域 (Wasserman & Miller, 1997)。根據 Jerison & Macphail (1984) 發現不僅在哺乳動物中，在其他主要的脊椎動物分類群：魚類、兩棲動物、爬行 動物和鳥類皆發現了聯想學習的證據。而關聯性學習值得研究有兩個重要原因。 首先，作為一個行為現象，它在動物和人類中都發揮著重要作用行為。例如，它

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是一種機制讓動物適應緊急的重要事件 (Hollis, 1982；Hollis, 1997)，而在人類 中更涉及異常行為，例如藥物濫用 (Siegel, 1989) 和焦慮症 (Bouton et al., 2001)。其次提供了一個有價值的研究關於動物和人類如何學會將兩個事件聯繫 起來的方法。「如果我們真的想了解動物的心智，我們既不能忽視聯想學習，也 不能假設它至高無上。我們需要實驗，然後是更多的實驗來發現大自然何時將工 作交給了關聯性學習，以及她何時設計了一種新的超級認知工具來支持行為適應」 (Heyes, 2012)。 研究斑馬魚複雜認知能力時，常會以視覺刺激 (visual stimulus) 作為評估工具 (Gatto et al., 2020) 。一般而言視覺刺激會有兩種方式呈現，分別是形狀及顏色， 在 Gatto et al. (2020) 研究中，便有對這兩種視覺刺激進行探究，其結果發現當 形狀不夠大時，斑馬魚是無法學習辨識形狀，但當形狀夠大時，便能辨識形狀差 異 (Gatto et al., 2020) ，而當視覺刺激是顏色時，斑馬魚能夠有效學習分辨不 同顏色 (Gatto et al., 2020) ，顏色辨別準確率高達百分之七十五 (Gatto et al., 2020)，然而相對於孔雀魚百分之百的準確率而言，研究認為可能是訓練期長度 不夠所造成 (Gatto et al., 2020) ，但由於斑馬魚本身具有先天的顏色偏好 (Avdesh et al., 2010)，斑馬魚對於紅色的偏好更高於綠色 (Avdesh et al., 2010) ，因此也可能影響辨別的準確率。而在進行顏色辨別實驗時，是以食物獎 勵機制為手段去操作 (Gatto et al., 2020) 。 獎勵機制經常是進行行為學研究時的一個手段 (Ostlund & Marshall, 2021)，因 為當環境中的線索被賦予獎勵後，有助於動物決定追求哪些目標以及如何追求目 標 (Ostlund & Marshall, 2021)。巴夫洛夫工具性轉移 (Pavlovian-instrumental transfer, PIT) 是對線索誘發動機的重要分析 (Ostlund & Marshall, 2021)，PIT 效應反應該線索的動機特性，且 PIT 有個重要特徵是，具有較大獎勵預測值的線 索並非工具性行為的有效動機因素 (Ostlund & Marshall, 2021)，但這特徵與現 行的理論不吻合。現行的理論假設線索所產生的動機因素是直接由其所提供的獎 勵預測值所定義 (McClure et al., 2003； Dayan & Balleine, 2002 )。線索的獎 勵預測值被假設涉及兩個系統 (Sarter & Phillips, 2018) ，分別是動機系統 (motivational system) 和認知控制系統 (cognitive system)，動機系統允許線索 觸 發 對 獎 勵 的 尋 求 衝 動 ， 而 認 知 控 制 系 統 則 是 透 過 獎 勵 期 望 (reward expectancy) 等訊息來調節動機系統，較高的獎勵期望能夠促進認知控制系統， 抑制動機系統，這使得動物對獎勵的尋求 (seeking) 降低，而對獎勵的檢索 (retrieval) 則上升，能減少動物行為失控 (Ostlund & Marshall, 2021)。因此，

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當在行為學研究中使用獎勵機制時，若提供較高獎勵期望的線索時，能夠使動物 具較穩定之行為，能更有效的執行研究。 Sison & Gerlai (2010) 使用斑馬魚進行關聯性學習與空間學習的分析，其結果表 明透過關聯性學習與空間學習的訓練，能夠使斑馬魚的學習能力上升。 Yang et al. (2018) 透過自動化的設備去檢驗訓練間隔與老化對於斑馬魚學習能力的影 響，其結果顯示不連續的訓練間隔對斑馬魚的學習有正向影響。根據 Norton & Bally-Cuif (2010) 的說明，斑馬魚作為模式生物的普遍適用性，以及其幼魚在行 為遺傳和神經解剖學分析中的應用，已在其他地方進行了全面的描述。成年斑馬 魚雖然比幼魚更難操縱，但其表現出完整的成熟行為，使他們在行為遺傳學上能 提供更多貢獻，且獎勵行為也是當中較為突出的領域。「斑馬魚的簡單性和系統 複雜性可能使該物種成為分析聯想學習機制的絕佳工具」(Gerlai, 2011)。我們根 據 Sison & Gerlai (2010) 實驗方法建立斑馬魚對紅色塑膠片的關聯學習，且根 據 Yang et al. (2018) 藉由斑馬魚為表層魚類的習性設計下方隔板留空的水箱， 以及間隔訓練的優點，達到聯想學習解決問題的目的。我們想要檢測在讓斑馬魚 建立對顏色刺激的關聯性學習實驗中，我們若加入食物獎勵是否會增強斑馬魚的 學習能力。我們所要檢驗的預測是斑馬魚是否能透過食物來建立獎勵機制？斑馬 魚透過紅色塑膠片所產生的視覺刺激是否會影響行為？斑馬魚透過紅色塑膠片 所產生的視覺刺激與食物獎勵機制同時存在時，斑馬魚是否產生聯想學習？斑馬 魚透過紅色塑膠片所產生的視覺刺激與食物獎勵機制同時存在時，與單純由食物 獎勵機制相比，兩者對聯想學習是否具有相同影響程度？斑馬魚透過紅色塑膠片 所產生的視覺刺激與食物獎勵機制同時存在時，與單純由紅色塑膠片所產生的視 覺刺激相比，兩者對聯想學習是否具有相同影響程度？

二、材料與方法： (一)魚隻馴養： 先在用於飼養斑馬魚的水中加入水質穩定劑，其中水質穩定劑與飼養用的水比值 為五千分之一，接著將水分裝於四十個透明塑膠盒內，再將四十隻斑馬魚分別安 置於塑膠盒內，並在各個塑膠盒中獨立飼養斑馬魚。飼養期間需要定時幫斑馬魚 換水。 (二)操作前準備：

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我們使用 1 個長 55 cm x 寬 25 cm x 高 25 cm 的水箱並在中間分隔成兩個 區域，分別是右邊長 30 cm x 寬 25 cm x 高 25 cm 與左邊長 25 cm x 寬 25 cm x 25 cm 並利用透明壓克力格板隔開，且在底部留下 5 cm 的空間讓斑馬魚 能穿過，在透明壓克力隔板旁加裝白色塑膠隔板，並以細繩連接，使塑膠板能以 拉繫繩的方式向上拉起隔板。在兩個區域各放置周長 15 cm 高 2 cm 的透明餵 食環。

圖一、本實驗所採用之實驗設施示意圖。

(三)操作流程： 1. 前測：將飼養空間用白色隔板與布隔開，設置早上六點到晚上六點的定時器， 並挑選 二十個塑膠盒，將塑膠盒裝 八分滿的水，檢測塑膠盒功能是否正常，置 換功能異常的塑膠盒，放入被挑選出來的斑馬魚進行飼養。每天透過蓋子上的開 孔進行餵食，一次一粒，一天三次。 2. 適應：在兩側壁上都設置餵食環，在兩側投食於餵食環內。第一天讓魚在魚 缸中自魚缸由移動一小時，第二天半小時，第三天五分鐘。第一天整批，第二天 減半，三天單獨一隻進行。每日一次，連續三日，共三次。 3. 訓練：在進行訓練前，會先將魚禁食二十四小時，並且將魚分成四組，每組 會有十條魚，分別是 WY 組、WN 組、RY 組、RN 組，依組別名稱加數字一 到十幫斑馬魚編號 (如 WY01)。在訓練當天會以每一次操作一條魚，每次進行 五分鐘，讓魚輪流受訓練，連續進行兩天的訓練。 以下是四個組別及四組在操作時各自的配置：

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(1)沒投放飼料且不擺放紅色塑膠片組 (WN)：在水箱中的兩個空間皆不投放飼料， 右側空間不擺放紅色塑膠片。 (2)有投放飼料且擺放紅色塑膠片組 (RY)：在水箱中的右側空間皆投放飼料，並 且在右側空間擺放紅色塑膠片。 (3)有投放飼料且不擺放紅色塑膠片組 (WY)：在水箱中的右側空間皆投放飼料， 右側空間不擺放紅色塑膠片。 (4)沒投放飼料且擺放紅色塑膠片組 (RN)：在水箱中的兩個空間皆不投放飼料， 並且在右側空間擺放紅色塑膠片。 4. 試驗：在魚缸右側放置紅色塑膠版，分成提供餌食與不提供兩組，每次操作 一條魚，每次五分鐘。架設好手機並開始錄影後，紀錄魚待在右側空間佔總時長 的百分比。 (四) 擬回應問題與統計策略： 本實驗擬回答以下五個問題，並以兩獨立樣本 t 檢定 (t-test)。 1.斑馬魚是否能透過食物建立獎勵機制？ 2.斑馬魚透過紅色塑膠片所產生的視覺刺激是否會影響學習行為？ 3.斑馬魚透過紅色塑膠片所產生的視覺刺激與食物獎勵機制同時存在時，斑馬魚 是否產生聯想學習？ 4.斑馬魚透過紅色塑膠片所產生的視覺刺激與食物獎勵機制同時存在時，與僅有 食物獎勵機制相比，兩者對學習能力是否具有相同影響程度？ 5.斑馬魚透過紅色塑膠片所產生的視覺刺激與食物獎勵機制同時存在時，與僅有 紅色塑膠片所產生的視覺刺激相比，兩者對學習能力是否具有相同影響程度？

三、結果 將斑馬魚從單獨飼養的塑膠盒移動至實驗用的水箱，除了少數個體會待在預備空 間不動以外，大部分的個體會積極的探索空間，並可以觀察到探索空間的斑馬魚 對水箱不具有恐懼的現象。在透過 WN 與 WY 的試驗進行結果比較，結果兩者 之間具有顯著的差異 (t=2.545, df=18, p<0.05)，所以透過食物的刺激可以建立 起斑馬魚的獎勵機制，原因可能是因為只有在飼料環內具有餌食，所以斑馬魚會 花更多的時間去找食物。接著我們比對了 WN 與 RN 的數據，結果顯示紅色塑 膠片造成的視覺刺激並不會顯著的影響斑馬魚的行為 (t=-0.807, df=17, p>0.40)，

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代表實驗可以以紅色作為與食物進行聯想關係的因子。然而與預想的不同是將 RY 與 WN 進行比較，結果顯示紅色視覺刺激與食物獎勵機制同時存在時並沒有 顯著的產生關聯 (t=1.373, df=18, p>0.10)，以及將 RY 與 WY 進行分析，結果 顯示不具顯著差異 (t=3.439, df=18, p<0.005)，意即在有食物的獎勵機制條件下， 無論是否有無紅色的視覺刺激，兩者的學習效果皆相同。所以在進行完實驗以後， 顏色並不會刺激斑馬魚的聯想學習，且在進行 RY 與 RN 的數據比對，顯示在都 有紅色塑膠片的情況下，有或無飼料對學習能力的影響並沒有顯著的差異 (t=0.593, df=17, p>0.50)，因此關聯性學習與顏色的刺激沒有辦法產生連結。

四、討論 我們在挑選這批斑馬魚當作實驗對象時，因為為隨機挑選，所以無法確定被挑選 的斑馬魚過去是否有受過類似於我們的環境或實驗，抑或是否有相關的經驗，本 實驗主要是探討斑馬魚的關聯性學習，若我們挑選之斑馬魚在先前有相關的經驗 存在，則會影響實驗之學習效果。此外在 Avdesh et al., (2010) 的研究中，他 們檢測了斑馬魚對顏色的偏好，結果顯示斑馬魚的確會對某些顏色有偏好的行為 產生，例如斑馬魚對紅色的偏好高於對綠色的偏好，而在我們的實驗中並沒有事 前去做斑馬魚是否對做實驗用之紅色及白色有無明顯的偏好行為，同時我們也無 法消除斑馬魚間的個體差異，也無法判斷每一隻斑馬魚是否對實驗用之紅色有相 同程度上的偏好，以上都是有可能造成我們的實驗結果跟預測不相符的原因。 在 Sison & Gerlai (2010) 的研究顯示斑馬魚的確能夠藉由獎勵機制來達到良好 的表現，同時斑馬魚可記住單一視覺線索與食物獎勵的關係，實驗結果也說明斑 馬魚能在學習聯想取得良好的表現，且結果不太可能是聯想以外的因素造成的， 這個研究結果與我們原先預測的內容相同，但經過我們的實驗操作後，得出的結 果顯示斑馬魚的確能夠透過食物建立獎勵機制，且能夠達到良好的學習行為，但 透過紅色塑膠片產生的視覺刺激並無法影響斑馬魚的行為，這和我們原本的預測 內容不相符。在 Sison & Gerlai (2010) 的實驗迷宮為一個十字型的迷宮，在建 立視覺刺激時，第一天將十字形迷宮的四端都放置食物與紅色塑膠板，第二天將 其中三端置放食物與紅色塑膠版，第三天將其中兩端放置食物與紅色塑膠版，目 的在減小將斑馬魚至於測試環境中相關可能影響之壓力，並加強食物與視覺刺激 間的關聯性。而在我們實驗中，迷宮設計為兩空間的迷宮，且建立視覺刺激的方 式分為有放置紅色塑膠片及無放置紅色塑膠片，並無加強食物與視覺刺激間的關 聯性之步驟，這有可能是造成我們的實驗結果跟預想不同的原因。

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另外斑馬魚在嗅覺刺激 ( Braubach et al., 2009) 、空間條件刺激 (Eddins et al., 2008) 、主動迴避條件刺激 ( Xu et al., 2007) 的研究中都顯示斑馬魚能在學習 上有良好的表現，或許在之後得實驗中可以進一步的探討斑馬魚在藉由獎勵機制 與這些不同的刺激下，是否能夠達到良好的關聯性學習。

五、引用文獻 Avdesh, A., Martin-Iverson, M. T., Mondal, A., Chen, M., Verdile, G., & Martin, R. N. (2010). Natural Color Preference in the Zebrafish (Danio rerio), Proceeding of Measuring Behavior. 24-27.

Bouton, M. E., Mineka, S., & Barlow, D. H. (2001). A modern learning theory perspective on the etiology of panic disorder, Psychological review. 108(1), 4-32.

Braubach, O. R., Wood, H. D., Gadbois, S., Fine, A., & Croll, R. P. (2009). Olfactory conditioning in the zebrafish (Danio rerio), Behavioural Brain Research. 198(1), 190-198.

Dayan, P., & Balleine, B. W. (2002). Reward, Motivation, and Reinforcement Learning, Neuron. 36(2), 285-298.

Eddins, D., Petro, A., Williams, P., Cerutti, D. T., & Levin, E. D. (2008). Nicotine effects on learning in zebrafish: the role of dopaminergic systems, Psychopharmacology. 202(1-3), 103-109.

Gerlai, R. (2011). Associative Learning in Zebrafish (Danio rerio), The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, Part B. 101, 249-270.

Gatto, E., Lucon-Xiccato, T., Bisazza, A., Manabe, K., & Dadda, M. (2020). The devil is in the detail: zebrafish learn to discriminate visual stimuli only if salient, Behavioural Processes. 179, 104215-104222 Hollis, K. L. (1982). Pavlovian Conditioning of Signal-Centered Action Patterns and Autonomic Behavior: A Biological Analysis of Function, Advances in the Study of Behavior. 12, 1-64.

Hollis, K. L. (1997). Contemporary Research on Pavlovian Conditioning: A “New” Functional Analysis, American Psychologist. 52, 956-965.

Heyes, C. (2012). Simple Minds: A Qualified Defence of Associative Learning, Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 367(1603), 2695-2703.

Jerison, H. J., & Macphail, E. M. (1984). Brain and Intelligence in Vertebrates, The American Journal of Psychology. 97(1), 138-141.

McClure, S. M., Daw, N. D., & Read Montague, P. (2003). A computational substrate for incentive salience. Trends in Neurosciences, 26(8), 423-428.

Norton, W., & Bally-Cuif, L. (2010). Adult Zebrafish as a Model Organism for Behavioural Genetics, BMC Neuroscience.

11(1), 90. https://doi.org/10.1186/1471-2202-11-90 Ostlund, S. B., & Marshall, A. T. (2021). Probing the Role of Reward Expectancy in Pavlovian-instrumental Transfer, Current Opinion in Behavioral Sciences. 41, 106-113.

Ruhl, T., Moesbauer, K., Oellers, N., & Emde, V. D. G. (2015). The Endocannabinoid System and Associative Learning and Memory in Zebrafish, Behavioural Brain Research. 290, 61-69.

Siegel, S. (1989). Pharmacological conditioning and drug effects, In: Goudie, A. J. &Emmett-Oglesby, M. W., Psychoactive drugs: Tolerance and sensitization (pp.

115-180).

Sison, M., & Gerlai, R. (2010). Associative Learning in Zebrafish in the Plus Maze, Behavioural Brain Research. 207(1), 99-104.

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Sarter, M., & Phillips, K. B. (2018). The neuroscience of cognitive-motivational styles: Sign- and goal-trackers as animal models, Behavioral Neuroscience. 132(1), 1-12.

Wasserman, E. A., & Miller, R. R., (1997). What’s Elementary about Associative Learning? Annual Review of Psychology. 48(1), 573-607.

Xu, X., Scott-Scheiern, T., Kempker, L., & Simons, K. (2007). Active avoidance conditioning in zebrafish (Danio rerio), Neurobiology of Learning and Memory. 87(1), 72-77.

Yang, P., Kajiwara, R., Tonoki, A., & Itoh, M. (2018). Successive and discrete spaced conditioning in active avoidance learning in young and aged zebrafish, Neuroscience Research. 130, 1-7.

六、附錄 附錄一、本實驗之原始數據 附錄二、本實驗之影片

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小花蔓澤蘭入侵台灣假說的檢驗 Testing the Hypotheses of the Invasiveness of Mikania micrantha in Taiwan 陳乙穎、滕仲恩、蔡景翔、張涵崴、董宥弦、潘以翔 國立中山大學生物科學系

摘要 小花蔓澤蘭為一種強勢入侵種，在台灣所入侵的範圍相當廣泛，其對於台灣的經 濟及民生會造成一定程度的傷害。本次研究主題探討各項入侵性假說，是否可以 適用小花蔓澤蘭在台灣的生長情形，並驗證該假說。首先盤點各種入侵性假說， 並挑出有關小花蔓澤蘭的假說，再篩選出適合台灣的入侵性假說，並決定使用天 敵逃離假說以及固有優勢假說，透過資料分析以及測量五種葉片的建造成本，驗 證上述兩種假說。實驗結果為小花蔓澤蘭在原生地中南美洲的天敵數量有十幾種， 比在台灣的 5 種天敵相對多；而小花蔓澤蘭的比葉面積比大部分的植物大，只有 比盒果藤小。最後得知小花蔓澤蘭在台灣的天敵比原生地少，與天敵逃離假說相 符；而比葉面積大代表小花蔓澤蘭比大部分植物的建造成本小，與固有優勢假說 相符，透過上述的資料分析與實驗操作，可知天敵逃離假說與固有優勢假說的確 能檢測小花蔓澤蘭在台灣的入侵情形。 關鍵字：建造成本（constucture cost） 、比葉面積（specific leaf area） 、乾重（dry weight）、固有優勢（inherent superiority）、天敵釋放（enemy release）

一、前言 原生植物是指在本土演化及由周邊地區自然擴散而來的植物。凡受人類活動影響 而帶入者都是外來植物，而外來植物主要經由三個階段引進（introduction） 、野 化（naturalized）及擴散 ( spread ) 從而入侵當地。外來植物對經濟、健康、 環境、生物多樣性等各層面，均引起可觀之損失及衝擊（Pyšek et al., 1995； Randall, 1996；Luken & Thieret, 1997）。地理障礙之隔離是物種演化之重要因 素，人類不斷增加之活動及大規模有意或無意之引種，破壞了這種生物隔離；放 眼全世界來說，入侵種對生態系及生物多樣性之衝擊程度可與棲地之喪失及破壞 相當。入侵植物在台灣所造成之損失，目前沒有全數的統計。每年政府及民間化 費之防治經費數以百萬元計，如果以類似之方式去處理其他高危害性之外來植物，

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所估算之損失金額應極為可觀。入侵植物中，很多可直接或間接引起人類與其他 動物之病變或傷害，會產生眼睛癢、打噴嚏、流鼻水等症狀。 表一、入侵假說

透過表一可以把入侵假說大致分成三個部分，(一)探討入侵種有哪些優於原生種 之特徵，讓該物種得以入侵當地的假說:固有優勢假說、繁殖壓力假說以及新武 器假說，(二)探討入侵種為何能傳播以及入侵當地原因的假說:空餘生態位假說、 干擾假說，(三)探討入侵種傳播到當地改變了什麼條件以增強其入侵性的假說: 逃離天敵、競爭能力增強、氮分配進化、雜交、本土病原體、壓力梯度；另外可 以觀察到雜交入侵假說近期才發表出來，可能原因為 DNA 分析屬於近期才較為 成熟的技術，所以該假說比較晚才能被驗證。 小花蔓澤蘭為多年生攀緣藤本植物，其為中美洲與南美洲的原生物種。小花蔓澤 蘭能夠攀上其他植物之樹冠層盤繞拉扯並遮住大部分陽光，使被覆蓋住的植物吸 收不到陽光而死亡，造成植被、生態及物種多樣性的嚴重侵害。所到之處幾乎沒 有植物可以倖免，灌木叢枯死、闊葉林枯死，就連有些喬木也不能倖免於難。同 時小花蔓澤蘭對於自然植被、人工林地、園林綠地、果園及農場等綠地的生態環 境也造成了極大的危害。目前除了離島之外，臺灣本島各縣市均有發生小花蔓澤 蘭危害，總危害面積曾達 56,848 公頃，最高危害高度為 2000 公尺。政府現階 主要採取人力剷除來進行防治，並持續研究生物防治之可行性及效益研究，唯其 防治效果仍待觀察。小花蔓澤蘭除入侵農地、公私有林地、原住民保留地及國有 財產地外，也入侵居家社區公園、水庫、河川流域兩岸、休耕地、山坡地、校園、 生態保護區等。除了經濟上的損失外，小花蔓澤蘭也易引起花粉熱等公衛問題， 對於人體可謂一種外來威脅。 小花蔓澤蘭在台灣也有被提出假說的驗證，科學家主要以固有優勢假說為依據，

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調查區域屏東科技大學西緣自北向南 12 公里範圍，寬約 4.5 公里，以及屏科大 以南的三個區域，包括：低海拔山區、丘陵以及沿海地區，並統計該地區的物種 多樣性，還有分析其土壤含有物質，最後得知小花蔓澤蘭茂盛之處， 該地之物種多樣性不高；反之，物種多樣性豐富之處，找不太到小花蔓澤蘭的蹤 跡。科學家發現大多數小花蔓澤蘭生長茂盛之地區，其他植物以草本植物居多， 說明這種外來物種對開放植被有較高的適應程度（Maja et al., 2008） 。另有科學 家以天敵逃離假說為依據，調查小花蔓澤蘭國外與國內的天敵，並透過翻系各種 天敵的特性，來達到生物防治的目的 ( Chen et al., 2003 )。還有科學家以繁殖 壓力假說為依據，比較原生蔓澤蘭比較兩者種子的發芽率、不同光照對種子萌發 的影響、比較生長發育情形，並測量蔓長、葉片數、葉面積、乾重。 得知相同環境下，小花蔓澤蘭相對蔓澤蘭有更高的繁殖力，葉片生長速率更快， 使其葉表面積增加，有更好的光合作用效率 ( Hsu & Chiang, 2003 )。也有科學 家以繁殖壓力假說為依據，了解到每平方公尺可有十七萬個種子( Chen & Hsiao, 2003 )。 根據目前所得到的文獻顯示，有台灣小花蔓澤蘭入侵假說之檢驗有不少人提過， 包括干擾假說以及固有優勢假說，然而有些假說尚未被驗證或者沒有被驗證完善， 所以我們打算利用數據分析、實驗操作，檢驗天敵逃離假說以及固有優勢假說， 透過上述方法，提供假說的科學證據，並確認小花蔓澤蘭的入侵與立足台灣之可 能原因。

二、材料與方法 (一) 盤點現存假說：透過文獻的閱讀，以及資料的蒐集，盤點出各種入侵性假 說。 (二) 篩選要檢驗的假說：假說篩選的條件為要先經由前人提出（表一） ，再來則 是符合台灣地區現象（曾在台灣被提起） （表二） ，並且不受到材料、時間及場地 限制。

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表一、前人提出的小花蔓澤蘭假說

表二、曾在台灣被提起的假說

(三) 假說檢驗： 1.天敵逃離假說 (1)需要的資料 需要原生地（中南美洲）、入侵地（台灣）小花蔓澤蘭的天敵數量了解對小花蔓 澤蘭潛在的影響。食性和食用部位則用於分析該天敵對小花蔓澤蘭的危害。 (2)資料來源 Natural History Museum（HOSTS：a Database of the World’s Lepidopteran Hostplants）、行政院農業委員會林務局委託研究計劃。 (3)天敵資料 表三是各地區小花蔓澤蘭的天敵資訊。

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表三、各地區天敵詳細資訊

2.固有優勢假說 (1)比較物種 與小花蔓澤蘭共域以及生態區位相似之物種，選出以下五種藤本類植物進行比較: 盒 果 藤 ( Operculina turpethum ) 、 扛 香 藤 ( Mallotus repandus ) 、 盤 龍 木 ( Malaisia scandens ) 、 毛 西 番 蓮 ( Passiflora foetida ) 、 三 角 葉 西 番 蓮 ( Passiflora suberosa ) (2)實驗操作與數據 分別用美工刀割下六種植物 4 平方公分的面積各四塊（除了盤龍木葉子狹長切成 1 x 4 cm 外，其餘皆切成 2 x 2 cm），並烘乾 72 小時至幾乎無水分，秤量各片 葉子的乾重（表四），再用面積( mm2 ) 除以乾重 ( mg )，得到比葉面積 ( mm2mg−1 )。 (3)預測與分析 使用 t 檢定來分析小花蔓澤蘭的比葉面積是否與其他物種有顯著差異（P 值小於 0.05）。比葉面積越大，代表建造成本越低，因為小花蔓澤蘭為強勢入侵物種， 所以預測小花蔓澤蘭的比葉面積會比其他物種大。

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

三、結果 (一) 統計整理表三後，發現千里達裡小花蔓澤蘭的天敵數量是最多的，但是其 中的八個天敵裡，只有兩種為專食性，這表示我們千里達的天敵，幾乎都不是以 小花蔓澤蘭為主食的昆蟲。台灣也是類似的情況，幾乎都是廣食性的昆蟲，專食 性天敵只有一個。其餘原生地，像是哥倫比亞、哥斯大黎加，還有墨西哥南部至 巴西南部，相反地，是專食性天敵比較多（表五）。 表五、各地區小花蔓澤蘭天敵數量資訊

(二) 表六為計算後各葉片的比葉面積數據結果。小花蔓澤蘭與五種物種比較之 P 值均遠小於 0.05（表七） ，由此可知其與五種物種之比葉面積有顯著差距，並且 比小花蔓澤蘭的葉面積僅小於盒果藤，但是大於其它四種植物（表八）。 表四、植物葉片乾種。 物種 小花蔓澤蘭

乾重(g) 0.0105

0.0117

0.0122

0.0113

盒果藤

0.0097

0.0101

0.0095

0.0097

毛西番蓮

0.018

0.0189

0.0199

0.0194

三角葉西番蓮

0.0255

0.0197

0.0259

0.0199

盤龍木

0.0381

0.0293

0.0346

0.0266

扛香藤

0.0398

0.0373

0.0376

0.0228

小花蔓澤蘭

比葉面積( mm2˙mg−1) 38.095 34.188

32.787

35.398

盒果藤

41.237

39.604

42.105

41.237

毛西番蓮

22.222

21.164

20.1

20.618

三角葉西番蓮

15.686

20.305

15.444

20.101

盤龍木

10.499

13.652

11.56

15.038

扛香藤

10.05

10.724

10.639

17.544

表六、各種植物比葉面積數據。 物種

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

表七、小花蔓澤蘭與比較物種的比葉面積 t 檢定 P 值 比較物種 P值

盒果藤 0.003034

毛西番蓮 2.49E-05

三角葉西番蓮 6.39E-05

盤龍木 6.14E-06

扛香藤 3.59E-05

表八、各種植物平均比葉面積（左至右為大到小） 物種 平均比葉面積 ( mm2˙mg−1)

盒果藤 41.026

小花蔓澤蘭 35.088

毛西番蓮 20.997

三角葉西番蓮 17.582

盤龍木 12.442

扛香藤 11.635

四、討論 (一) 台灣跟千里達的天敵，都是吃多種部位，而其餘的原生地，天敵只單吃葉 而已，對於小花蔓澤蘭造成的危害（減少光合作用）可能在原生地產生較大影響。 廣食性的天敵，通常對於小花蔓澤蘭的影響較小，而專食性天敵則相反，若專食 性天敵的數量較少，代表該地的小花蔓澤蘭可能較不受天敵所控制。 (二) 雖然實驗結果與預測小花蔓澤蘭比葉面積為最大不相符，但是對於盒果藤 以外四個物種符合預期，所以建造成本這項比較數值，僅不能證明解釋小花蔓澤 蘭競爭性強於盒果藤。依照中山大學生科館四樓外的環境，盒果藤的生長狀況明 顯比小花蔓澤蘭優勢，表示盒果藤的生長速度不亞於小花蔓澤蘭。

五、引用文獻 王均琍、汪慈慧、陳滄海、陳仁昭與趙永椿。2003。小花蔓澤蘭之生物防治。小花蔓澤 蘭危害與管理研討會專刊，79–96。 陳阿興與蕭祺暉。2003。小花蔓澤蘭防治與管理。小花蔓澤蘭危害與管理研討會專刊， 69–77。 徐玲明與蔣慕琰。2003。小花蔓澤蘭與蔓澤蘭發芽及營養生長之比較。植物保護學會會 刊，45: 321–328。 Blossey, B., & Notzold, R. (1995). Evolution of Increased Competitive Ability in Invasive Nonindigenous Plants: A Hypothesis. The Journal of Ecology, 83(5), 887.

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

銀合歡葉片萃取物對共域原生草本植物幼苗的影響 Effects of leaf extract of Leucaena leucocephala on the sapling of a indigenous sympatric herbal plant 呂誼蓁 1、曾祺媛 1、施翰霖 1、巫子昀 1、黃仲寧 1 1

國立中山大學生物科學系

摘要 相剋作用是植物釋放化學物質影響鄰近植物的現象，植物可透過釋放相剋物質直 接或間接影響其周遭的植物群落，進而發生生態系統的變化。而相剋作用是植物 入侵的機制之一，入侵植物藉由在環境中佔領導地位。銀合歡以相剋作用嚴重入 侵墾丁國家公園，其相剋物質-含羞草鹼會抑制其他植物之生長。而無論國內外 對於含羞草鹼影響植物之研究的受試植物都是農作物。因此我們想探討含羞草鹼 對於台灣原生植物之影響。實驗材料使用葉下珠，分別以 20ppm、40ppm、60ppm 之含羞草鹼受測。發現植株高度和新芽長度都有抑制作用符合我們預期結果，而 新葉總量則是有促使其生長的情況。 關鍵字：銀合歡(Leucaena leucocephala)、相剋作用(allelopathy)、含羞草素 (mimosine)、入侵種(invasive species)、生物檢定(bioassay)

一、前言 在自然界中，植物物種間的消長有兩種機制，一是植物競爭作用(competition)， 一是植物相剋作用(allelopathy)。Molisch 在 1937 年時將植物釋放化學物質影響 鄰近植物的現象正式命名為相剋作用。相剋作用被認為是一種供體-受體現象 (donor–receiver phenomenon)，植物藉此獲得競爭優勢，勝出周遭植物並帶來 自己生長上的優勢及種群的改變(Mallik, 2008)。Whittaker ＆ Feeny (1971)指 出植物透過釋放相剋物質直接或間接影響根際微生物的活性來影響其周遭的植 物群落，進而發生生態系統的變化(Wardle et al., 1997)。後來更有研究以相剋作 用分析外來植物入侵的生態機制(Bais et al., 2003)。而相剋作用在入侵生物學中 的新武器假說(the novel weapon hypothesis)是潛在特徵武器的一部份。 相剋作用是植物入侵的機制之一，多數入侵植物能藉由相剋作用改變生態環境並 在環境中佔領導地位，除了透過影響植物生理，還能改變影響土壤微生物產生營

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

養化學物質、抑制其他植物與土壤微生物的共生關係(菌根、固氮菌等)(Başaran, 2021)。有研究透過主要以國際自然保護聯盟的全球植物入侵者名單製作入侵種 植物數據庫，並分析其中具相剋作用的比例為 51.4%的高發生率，表明相剋作 用是入侵種的普遍特徵(Kalisz et al., 2021)。而相剋物質的釋出量容易和競爭壓 力有關，在高競爭壓力下，周圍植物也更容易受到植物釋放的毒素影響(Reigosa et al., 2010)。 銀合歡(Leucaena leucocephala)普遍被認為是強勢入侵種，會影響附近植物及 競爭其他植物生長(鍾 & 呂,2009)。面積高達 17731 公頃的墾丁國家公園就遭 受銀合歡嚴重入侵，在 2002 年有研究指出在墾丁國家公園中調查的 11905 公頃 中，有 75.76%的範圍遭到銀合歡入侵，甚至其中有 11.8 形成優勢社會(呂&陳, 2002)。更有研究在 2006 年以衛星影像繪製銀合歡於墾丁國家公園入侵之分布 圖，供管理單位長期監測，了解銀合歡入侵擴散之發展趨勢(Chung & Lu, 2006)。 銀合歡為了爭取生存空間而對其他植物具有排斥性，也就是相剋作用，從整個植 株到種子都具有毒性-含羞草鹼(mimosine)，而含羞草鹼會對於細胞的 DNA 複製 有抑制作用，尤其在 G1 晚期和 S 期有特別顯著(Gilbert et al., 1995)。當作用在 植物上時會抑制下胚軸或胚根的生長(Wilson & Bell, 1978)。 含羞草鹼在 50ppm 和 100ppm 濃度下會對水稻種子萌發造成影響(Prasad & Subhashini,1994)。而有實驗以銀合歡葉之萃取物澆灌紅豆、向日葵及高粱以銀 合歡葉之萃取物，高粱種子的萌發受到明顯抑制(Suresh & Vinaya Rai, 1987)。 而台灣也有與含羞草鹼相關的研究，含水的含羞草鹼溶液在 20ppm 濃度下顯著 抑制萵苣(Chou & Kuo, 1986)，且小白菜和黃荊的發芽、子葉展開、胚莖及胚根 會明顯受含羞草鹼溶液抑制(呂 & 陳, 2002)。許多研究證明銀合歡所含的含羞 草鹼會對植物生長有負面影響。然而含羞草鹼不完全都是造成負面影響，作用在 甲 藻 (Dinoflagellata) 上 細 胞 數 量 會 顯 著 增 加 ， 產 生 正 面 的 影 響 (Yeung et al.,2002)。 銀合歡對於作物之相剋作用的研究眾多，但研究卻都以農作物來作為受試體，然 而銀合歡的生長環境並不在農作物旁，不僅和現實中銀合歡造成的生態破壞沒有 太大關聯性，且使用原生共域植物做為受試體的研究也很少。因此，我們想了解 銀合歡對台灣原生植物的相剋作用，並設計實驗探討銀合歡的含羞草鹼是否會對 原生植物造成正面或負面的影響，以及四種不同濃度的含羞草鹼，對原生植物生 長影響的差異。

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

二、材料與方法 （一）植物培養 本次實驗對象為五蕊油柑(Phyllanthus tenellus)。由於草本生長速度快且為野外 普遍常見的植株生長環境會與銀合歡接觸到。在校園中移植五蕊柑待其長新葉呈 穩定狀態後開始做實驗。 （二）溶液配置 而選用中山大學校園內的銀合歡嫩葉，將其嫩葉烘乾量測乾重後，將乾燥葉片磨 成粉狀，進行分裝並配置含羞草鹼溶液。放置 24 小時，待其發揮 97%含羞草 鹼。並配置不同濃度的含羞草鹼水(0 ppm、20 ppm、40 ppm、 60 ppm)。 （三）實驗操作 分別澆灌不同濃度的含羞草鹼水(0 ppm、 20 ppm、 40 ppm、 60 ppm)進行培 養，每一組各觀察 10 株 ( 圖一 ) 。每天加入 15cc 水溶液，使土壤保持濕潤。 日照時長約略 10 小時半。本實驗將每四天測量一次葉子增加數量、植株長度、 新葉長度。

三、結果 因實驗組數多組以 T-test 做統計錯誤機率會提高。因此採用 Analysis of ANOVA 進行檢定。而在事後比較部分本實驗已設定有控制組，因此採 Dunnett’s test 進 行分析。 （一）前提數據是否通過常態分布 在植株高差 ( 圖二 ) 、總新葉量 ( 圖三 ) 、鎖定新芽長 ( 圖四 ) 的三個項目 中，實驗組與控制組數據在 Shapiro-Wilk 的顯著性皆大於 0.05，代表數據為常 態分布可開始進行統計分析。 ( 二 ) 設立統計學假說 虛無假設 H0 : 控制組長得比實驗組好 對立假設 H1 : 控制組長的比實驗組差

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

顯著水準 α 設為 0.05，機率值 p 值必須要小於 0.05 才能推翻虛無假設、接受對 立假設。 ( 三 ) 數據分析 在植株高生長部分 ( 圖五 ) 20 ppm、 40 ppm、 60 ppm 對比 control 組，p 值 皆大於 0.05。代表虛無假說成立，在比較植株高生長情形中，控制組皆比實驗 組加入各濃度的植株長的好。在總新葉增加量部分 ( 圖六 ) 20 ppm、 40 ppm、 60 ppm 對比 control 組，p 值皆小於 0.05。代表接受對立假設，在總新葉量生長 情形中，控制組皆比實驗組加入各濃度的植株長的差。在鎖定新葉長生長部分 ( 圖七 ) 20 ppm、 40 ppm、 60 ppm 對比 control 組，p 值皆大於 0.05。代表 虛無假說成立，在鎖定新葉長生長情形中，控制組皆比實驗組加入各濃度的植株 長的好。

四、討論 此次實驗結果顯示，有加含羞草鹼的葉下珠確實在植物高差與鎖定新葉長有抑制 的效果，與前言所提到的呂 & 陳(2002)和 Chou & Kuo(1986)所做的實驗結果相 符。 在生長總新葉量實驗組皆長得比控制組好，我們推論可能是控制組原先找尋的植 株在植株年齡比實驗組來的高，導致在總新葉量的部分無法如較年幼的植株長的 多，在總新葉量的數據跟鎖定新葉長及植株高差有相反的結果。 在 Uddin et al.(2020)的研究中，燈心草(Juncus pallidus)在經歷強烈的相剋作用 之後，對於相剋物質展現了更高的抵抗性。而 Callaway et al.(2005)指出當入侵 植物所釋放出的相剋物質雖然會對生態造成無法逆轉的變化，但在地植物卻可能 藉由抗性進化而提供自身一定程度的生物抗性。因此我們推論葉下珠在受到含羞 草鹼影響後，總增加新葉量反而較控制組高的原因可能是因為葉下珠在之前的世 代曾受過含羞草鹼的作用而產生生物抗性。 從實驗結果得知，雖然在植株高度和新葉長有明顯的抑制效果，但如前言所提的 論文中(Yeung et al., 2002)，含羞草鹼對於甲藻的細胞數量會顯著增加，從此推 斷含羞草鹼並不是在所有生長方面都是負面影響。

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

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附錄

圖一、實驗裝置

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

圖二、植株高度差

圖三、 總新葉量

圖四、鎖定新芽長

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

圖五、植株高度差

圖六 、總新葉量

圖七 、鎖定新葉長

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

含羞草葉片觸發運動的可塑性 Plasticity of foliar seismonastic movement in Mimosa pudica 楊子承 1、楊翔芝 1、葉懿薰 1、林芳瑤 1 1

國立中山大學生物科學系

摘要 植物可以根據環境而做出改變，這個現象稱為可塑性。我們將回顧科學家對植物 行為所做實驗以及對植物行為解讀的文獻，其中 Gagliano 等人的實驗和對含羞 草葉片運動的解讀備受爭議，因此本次實驗將重現 Gagliano 等人在 2014 年的 實驗，實驗中使用 16 株含羞草進行下降測試，接著將含羞草放置於震動裝置上 震動，之後分別將含羞草分成 2 組放置 7 天與 14 天後，再進行最後一次下降， 對比葉片閉合前後的寬度，以及測試葉片會不會受連續無害刺激影響而減少其閉 合程度，此次實驗目的是為了重現部分 Gagliano 等人的實驗，並討論科學家對 此議題解讀的差異。本次實驗將採計葉片寬度，其中連續下降所測量的葉片寬度 使用 SPSS 的單因子相依變異數分析(Repeated-measures ANOVA)，而對比震 動後下降及放置 7 天與 14 天下降的葉片寬度使用雙樣本 t 檢定(t-test)，從結果 可以發現含羞草葉片再連續下降後並沒有減少其閉合程度，放置 7 天的含羞草有 表現出學習行為，而放置 14 天的含羞草並沒有表現出學習行為，此結果和 Gagliano et al. 在 2014 年的實驗結果不同。 關鍵字：可塑性(plasticity)、觸發運動(seismonastic movement)、葉片(blade)、 反捕食反應(Anti-predator responses)、敏感植物(sensitive plant)

一、前言 植物行為被定義為對於事件的快速生理及型態反應(Karban, 2008)，是主動、有 目的而且有意的(Trewavas, 2009)。植物具有一系列顯著的生態重要特徵，從形 態和生理學的不同方面到解剖學、發育和繁殖時間、育種系統和後代發育模式， 都是可塑性的，可塑性包括環境限制和適應性調整，例如功能性狀可塑性、發育 可塑性、生活史可塑性，以及跨代可塑性，當植物遇到對生長和生理不可避免的 影響，會做出調整和改變去適應新的環境(Sultan, 2000)。植物的學習行為是從 行為中推斷出來，沒有包括因為發育、疲勞、適應或晝夜節律等因素而產生的行

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為變化(Amador-Vargas et al., 2014)。植物為了在環境中生存，除了向性、膨壓 運動外，還會表現出許多各自不同的行為，雖然植物無法像動物一樣能自由走動， 但演化出的構造、表現出的行為，能讓植物更好地適應環境(Huey et al., 2002)。 含羞草的葉部運動包括睡眠運動及觸發運動，當含羞草受到外界刺激時會引發觸 發運動，使葉子快速摺疊、葉柄迅速下降且刺會更明顯，被廣泛認為可以降低被 捕食風險，也能降低其能見度，進而達到抵禦植食性動物的效果(Applewhite, 1972; Reed-Guy et al., 2017)。Pfeffer(1873) 發現含羞草葉子對重複的機械刺 激敏感性降低。若在植物適應水滴後再用手觸碰葉子，即便葉子不再回應水的刺 激，但還是會回應手指觸碰刺激，發現植物是可以區分刺激的 (Holmes & Gruenberg, 1965)。Amador-Vargas et al. 在 2014 年重複試驗不同程度刺激對 含羞草葉片的影響，遭受反覆溫和刺激的葉片會降低葉片摺疊反應，類似於習慣 過程，此實驗證實溫和刺激並沒有耗盡摺疊機制，破壞性刺激對含羞草仍有影響。 Gagliano et al. (2014) 執行了一個實驗，使含羞草跌落，觀察含羞草受到重力 影響而觸發其葉子的閉合反應，記錄葉子在下降後有多少葉子重新打開，並對比 干擾前後葉子打開的寬度，接著將含羞草震動作為新刺激，檢測葉子是否因為疲 憊而影響下降的測試，結果顯示葉子重開比例和之前一樣，這個結果可以排除長 期下降測試使含羞草疲憊而無法閉合的說法。接著將含羞草分成 2 組比較測試含 羞草是否有學習記憶，放置較短天數的含羞草在下降時沒有完全關閉，這種短時 間反應排除葉子快速重新學習的可能性，而放置較長天數的含羞草葉子打開程度 比之前多，表示含羞草對過往訓練仍有記憶，能識別跟概括所學的刺激。 Gagliano et al. 在 2014 年提出的論文受到其他科學家的質疑，Gagliano et al. 將實驗結果解讀為含羞草是有意識且能夠學習的，Gagliano 在 2017 年更進一步 表示含羞草是能夠避免不合理能量消耗的，Gagliano 表示含羞草閉合行為的減 少是因為它能夠分辨不同的刺激，對於無害的刺激不會耗費能量去關閉葉子。 Biegler 在 2018 年表示 Gagliano et al. 在 2014 年的實驗省略區分習慣和疲勞 的測試，也沒有符合 Rankin et al. 的實驗需要跟從 Rankin

et al. (2009)提出的概念，Biegler 認為 Gagliano et al. 的學習定義去執行，Rankin et al. 在 2009

年提到不同的刺激導致對原始刺激反應的遞減，他們表示去習慣是對原始反應的 增加，而不是對去習慣反應的增加，Biegler 提出的觀點只是他的假設，沒有相 關實驗、數據去支持他的論點，而 Amador-Vargas et al. 在 2014 年證明了含羞 草不是受疲勞影響，因為 Amador-Vargas et al. 的實驗在破壞性刺激時，測試 是否會受疲勞影響前幾次的閉合，結果含羞草一受到刺激後馬上閉合，證明不是

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因疲勞。 Gagliano 等人對於含羞草葉片可塑性現象的解讀受到許多爭議，在此之前鮮少 有科學家提出 Gagliano 等人的想法，許多科學家認為 Galiano 等人過度解讀含 羞草葉片的行為，因此我們想更進一步的了解這個議題。為了探討其他科學家和 Gagliano 等人解讀上的不同，將部分重現 Gagliano 等人的研究並討論各派說 法差異，達到此研究的目的，因為時間的限制，我們將習慣訓練後的放置天數改 成 7 天和 14 天。我們推測含羞草受到連續無害的刺激後，含羞草能夠分別出不 同的刺激，所以不會再因無害的刺激而閉合。

二、材料與方法 (一) 含羞草種植： 為了使 2-3 公分的含羞草長大到可以做實驗的高度，我們使用隔水加熱的方法， 將加溫器設定為 32℃，光週期設定為 12 個小時光照，待其長到 6-8 公分。每兩 天澆水一次，讓含羞草保持濕度。 (二) 實驗流程： 挑選生長良好並已達 6-8 公分高的含羞草作實驗對象。隨機分成兩組，分別為將 會放置 7 天的 A 組和放置 14 天的 B 組作對照組。兩組含羞草會於第一天一起進 行下降訓練，0 分鐘代表第一次下降，其後時間分別為 10 分鐘、1 小時、2 小時、 4 小時、6 小時。6 小時後的下降結束後會馬上進行震動測試，然後等待葉子都 完全打開後做最後一次下降，馬上測量其閉合葉寬。每段時間的下降訓練會下降 10 次，總共 80 次。 (三) 實驗設計： 含羞草放置於塑膠盆(48.5 cm x 38.5 cm x 12.5cm)，進行 15 公分的下降。用手 將盆栽離地 15 公分，不施加任何外力使盆栽自由落下。實驗位置會於大於塑膠 盆面積的泥土上，作為下降的緩衝。震動測試會使用機器 Thermolyne Maxi Mix II Vortex Mixer，速度 250r.p.m，時間為 5 秒。 (四) 數據收集：

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實驗會採用 4 組數據，分別是在完全沒受到刺激前量度葉片的最大葉寛，受到下 降刺激後葉片的最大葉寛，以及放置 7 天後和 14 天後受下降刺激葉片的最大葉 寬，每株會隨機挑選 3 片葉子作數據收集。

圖一、欲測量含羞草葉片之最大寬度

三、結果 本次實驗使用 SPSS 的單因子相依變異數分析(Repeated-measures ANOVA)， 變異數小於 0.05，來檢定含羞草葉片在受到連續相同刺激後會不會減少葉片閉 合程度，由數據可以得知，含羞草的葉片並沒有因為連續性下降而減少閉合程度， 此結果顯示含羞草的葉片是不具有可塑性的。

圖二、SPSS 單因子相依變異數分析統計折線圖

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使用 t-test 雙尾檢定，變異數小於 0.05 並剔除離群值，統計含羞草的學習行為， A 組實驗結果得到 0.001227 是為不穩定，和最初數據對比呈現不均質，是有學 習行為，B 組實驗結果得到 0.14987 是為穩定，含最初數據差不多，是沒有學習 行為。

四、討論 此次實驗的數據結果顯示與 Gagliano et al. 的不完全相同。由統計分析得知含 羞草葉片不會因為多次的連續刺激而減少葉片的閉合程度，我們推測結果會和 Gagliano et al. 的結果不同是因為光週期的因素，我們的進行實驗季節與 Gagliano et al. 不同，冬季日照時常較短，雖有架設植物燈維持日照 12 小時， 但我們認為植物的生理時鐘是沒有辦法短時間被改變的，所以在進行 6 小時習慣 訓練時，已經接近含羞草睡眠運動的時間，所以含羞草的葉片才會表現出明顯的 閉合情形。在下降過程中葉子依然會快速閉合，對比震動後與放置 7 天葉子的閉 合情形，兩者之間差異不穩定，葉子閉合大小有改變，而震動後與放置 14 天葉 子的則是兩者之間差異穩定，是沒有甚麼改變的。 Taiz(2019) 表示 Gagliano 擴大了她的假設，將意識包括在內，她聲稱意識是學 習能力的組成部分，也就是通過形成聯想來學習的能力包括發現、辨別的能力並 根據動態的內部價值體係對線索進行分類，即使 Gagliano 關於植物表現出聯想 學習的提議被證明是正確的，它不是意味著植物具有意識、感覺和意向性，為此 存在沒有真正的證據。而植物生物技術專家 Devang Mehta 等批評者指出，將 智能或意識歸因於植物是不必要的將它們擬人化，而智能並不等同於意識(Livni, 2018)。因此我們也認為是 Gagliano

et al. 過度解釋葉片觸發運動的行為，此

議題也還待驗證。

五、引用文獻 Abramson, C. I. & Chicas-Mosier, A. M. (2016). Learning in Plants: Lessons from Mimosa pudica. Frontiers in Psychology, 7: 417.

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附錄 1、本實驗之原始數據 https://reurl.cc/akrA09

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人工夜間光源對兩種酢醬草睡眠運動的影響 Effect of Artificial Light at Night on Foliar Nyctinasty of two Species of Oxalis 林建豪、鍾卓宏、黃莨程、岳庭宇 國立中山大學生物科學系

摘要 光是所有生物體滿足其能量需求的重要因素，除此之外，光的另一個重要功能是 作為信號調節劑以及植物的生長和發育功能。而 ALAN(artificial light at night)是 晚上出現的人造燈光，為光污染的源頭。因為都市化和人類活動發展，夜間環境 中產生了大量多餘的光並造成人為污染。睡眠運動(nyctinasty)是一種在夜間發 生的植物行為，在白天，植物的葉片處於水平位置，以優化它們捕獲陽光進行光 合作用的能力。晚上，葉片所呈現的位置，基本上都是垂直的。 為了得知人工夜間光源對兩種酢醬草睡眠運動的影響，我們的實驗利用植物在睡 眠運動時葉的角度達到最大或最小所需的時間從而判斷其是否受光害影響。我們 分析兩款園藝種 Oxalis triangularis 和野生 Oxalis corniculata，發現前者因其特 性，其睡眠運動並未有太大的影響，而後者則被明顯地受影響。這可以說明光害 的確可以影響睡眠運動，但受影響的程度很大可能和植物其特性有所關聯。 關鍵字：光污染(light pollution)、 酢醬草(Oxalis)、葉部睡眠(foliar nyctinasty)、 光週期(photoperiod)、晝夜節律(circadian rhythm)

一、前言 光作為提供植物生長時的能量和信號來源的非生物因子。陽光是這個星球上的主 要能量來源，其中藍綠藻和光合自營生物通過吸收這些光並轉化為能量來源如澱 粉、蔗糖等有機化合物作為食物儲備。而植物作為生產者，有著滿足異營生物 (heterotrophs)能量需求的角色。由此可見，光是所有生物體滿足其能量需求的 重要因素。光的另一個重要功能是作為信號調節劑以及植物的生長和發育功能。 例如：光形態發生(photomorphogenesis)、向光性(phototropism)、晝夜節律 (circadian rhythm)和許多重要過程都在光的控制下。光強度、持續時間和波長等 光的特性會影響包括植物在內的生物。而 ALAN(artificial light at night)是晚上出

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現的人造燈光，為光污染的源頭。出現該狀況的原因可能是因為城市規劃問題和 人類活動所造成。因為都市化和人類活動發展，夜間環境中產生了大量多餘的光 並造成人為污染。 ALAN 會影響微環境的特性，例如光、土壤生物學、濕度、生物群落及包括植物 在內的生物體之間的相互作用。而且植物大多是晝夜節律，並有許多的代謝過程， 都在明暗時期的控制之下進行，因此光害會影響植物在光或晝夜循環下的過程和 功能，可能會對生態系統和生物多樣性造成影響(Sodani et al.,2021)，但 ALAN 的出現可能不只有壞處，Benedikt et al. (2021)曾表明 ALAN 或許能夠令不太廣 泛歸化植物的傳播增加。研究顯示，雖然廣泛歸化植物在不同的環境下擁有更高 的生物量，但它們不太利用 ALAN 所提供的光源。由此可見，在增加 ALAN 的 情況下，可能會令不太廣泛歸化植物的傳播增加，但無可否認的是，ALAN 依然 對大多數植物有著顯著的負面影響。由於多數入侵性植物為長日照植物，所以了 解 ALAN 對植物的影響可能對於入侵性植物的研究有幫助。 睡眠運動(nyctinasty)是一種在夜間發生的植物行為，在白天，植物的葉片處於 水平位置，以優化它們捕獲陽光進 h 行光合作用的能力。晚上，葉片所呈現的位 置，基本上都是垂直的。 葉柄是負責夜間葉運動的器官，在白天光線充足時， 水分多，根壓也高，葉片就自然展開，夜晚則剛好相反。此行為減少植物夜間的 蒸散作用；樹葉中礦物質的進出和對葉子支撐組織的需求，甚至可以防止真菌病 原體的生長。Nakanishi et al. (2005)的實驗表明過 O.corrmbosa 的睡眠運動會 受到光週期的變化所影響，而越近緣的物種都有睡眠運動(Matt,1988)，但並不 代表近緣的物種擁有相似的光反應，同時現有的實驗對同屬植物之間的睡眠運動 的研究尚淺，因此仍有相當大的探索空間。 鑑於 Nakanishi et al.(2005)的實驗與我們的實驗目的相同，因此我們選擇部份重 現他們的研究，並藉此實驗的操作瞭解光污染對植物睡眠運動的影響。根據過去 的實驗(Nakanishi et al.,2005)顯示，不同光週期酢漿草其閉合所需時間雖相同， 但黑暗期較長之葉片在移除光照後的前期閉合速度較黑暗期較短之葉片快速，在 後期接近閉合臨界角度時兩者閉合的速度會逐漸一致，因此我們推測本次實驗結 果會與此相似，過去的實驗使用的測量方式為計算處於睡眠運動時小葉的莖與主 葉脈的角度(Nakanishi et al.,2005)，我們的實驗則是利用植物在睡眠運動時葉的 角度達到最大或最小所需的時間從而判斷其是否受光害影響，而我們的實驗會使 用 Oxalis corniculata 和 Oxalis triangularis 作實驗對象進而判斷睡眠運動的反應，

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主要原因為 Benedikt et al. (2021)提到某些分布範圍不廣的外來植物可能受惠於 ALAN，所以透過比較兩種 Oxalis 對 ALAN 的反應，檢驗它們是否擁有同樣現象。

二、材料與方法 (一)實驗材料： 以 Oxalis corniculata 以及 Oxalis triangularis 作為實驗對象，Oxalis corniculata 之種源分別為生科系館頂樓溫室外之野生植株，Oxalis triangularis 則為人工繁 殖之園藝種。 再準備 24 個直徑 2.5 公分 x 高 5.7 公分的瓶子,以及紙巾若干張。 (二)操作前準備： 以計時器將植物盆栽放置於燈下定時十二小時光週期種植約一星期，將葉柄長度 大於 2 公分 Oxalis 的 corniculata，及葉柄長度大於 6 公分的 Oxalis triangularis 以美工刀割下再立即以紙巾將莖固定並插入裝有水的瓶中。 (三) 操作流程與注意事項: 取一葉柄為一單位，準備插有 Oxalis corniculata 及 Oxalis triangularis 瓶子各四 單位置於定時之植物燈下分別以十二、十六、二十四小時之光週期照射並用量角 器測量每單位之三片小葉葉片每十分鐘之下降角度(葉柄跟葉片主脈之間的夾 角)。

圖 1、本實驗所採用之實驗示意圖。

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圖二、測量角度的方式，將量角器緊靠葉柄，並以葉脈為基準測量角度 (四)數據分析: 使用二因子變異數分析比較同品種酢漿草在三個不同光周期以及兩種酢漿草在 同個光週期下的下降角度是否具關聯性。 (1)試問不同光週期但同品種酢漿草是否會影響酢漿草下降角度 虛無假說：不同光週期但同品種酢漿草不會影響同種酢漿草下降角度。 對立假說：不同光週期會影響同種酢漿草下降角度。 (2)試問同光週期但不同品種酢漿草是否會影響酢漿草下降角度 虛無假說：不同種酢漿草不會影響下降角度。 對立假說：不同種酢漿草會影響下降角度。 如果 p 值小於 0.05 則拒絕虛無假說，大於則無法拒絕虛無假說。 (五)本實驗擬回答以下問題: 1. 同種 Oxalis 在不同光週期下一小時內閉合的速率是否有差異？

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三、結果 透過二因子變異數分析數據得知，酢醬草 12、16、24 光週期 p 值在一小時內 0-60 分鐘的時段下皆為<0.001 小於 0.05，而品種 p 值除了最初的是 0.006 之外 其餘也都是<0.001 小於 0.05，這表示無論是光週期和品種皆對葉片睡眠的角度 有顯著影響。 (1)不同光週期對 O. triangularis 的影響 Oxalis triangularis 的葉片角度在 12 小時與 16 小時光照組別的檢定 p 值為 0.069， 其值大於 0.05 顯示其數據關聯性不大，證實虛無假說，因此在 12 小時和 16 小 時光照下該品種的葉片睡眠運動並無明顯差異，在 12 小時與 24 小時光照組別 的檢定 p 值為 0.0018，其值小於 0.05 顯示其數據具差異性並拒絕虛無假說，因 此在 12 小時和 24 小時光照下該品種的葉片睡眠運動具有明顯差異（圖三）。

圖三、在不同光週期下 O. triangularis 角度的變化。表內使用角度的平均值制成。 (2)不同光週期對 O. corniculata 的影響 O. corniculata 的葉片角度在 12 小時與 16 小時光照組別的檢定 p 值為 0.672， 其值大於 0.05 顯示其數據關聯性不大，證實虛無假說，因此在 12 小時和 16 小 時光照下該品種的葉片睡眠運動並無明顯差異，在 12 小時與 24 小時光照組別 的檢定 p 值為 0.018，其值小於 0.05 顯示其數據具差異性並拒絕虛無假說，因 此在 12 小時和 24 小時光照下該品種的葉片睡眠運動具有明顯差異（圖四）。

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圖四、在不同光週期下 O. corniculata 角度的變化。表內使用角度的平均值制成。

四、討論 (1)資料分析 結果表明 O. triangularis 在 12 小時和 16 小時的光週期的情況下，所表現的睡眠 運動反應差異不大，不論是葉下降的速度或是角度，兩個實驗裝置所顯示的數據 相似。而 O. corniculata 的數據則顯示了在 12 小時和 16 小時光週期的情況下， O. corniculata 在後者的情況下更快完成睡眠運動。在 24 小時的光週期下，兩種 Oxalis 的起始角度都無法達到最大，而下降速率也明顯異於其他光週期的實驗組 別。O.triangularis 在 12 小時光週期的實驗中，於 40 分的時候已經完全關閉， 而 16 小時光週期則是直到實驗結束葉子都還沒完全關閉，此現象反映光週期的 改變也會影響睡眠運動的時間，有趣的是 12 小時和 16 小時的光週期的結果雖 然不同，但在實驗的前半，兩者下降的速率相同，而後來 16 小時的速率持續下 降，令結果差距拉大。可惜的是我們的數據並沒有辦法解釋這現象，期望未來能 為這現象給予一個解釋。O.corniculata 在 12 小時和 16 小時光週期實驗中，兩 個時間所顯示的數據差異甚大，16 小時下降的速率比 12 小時的高。證明 O.corniculata 對光週期的變化比較敏感。 (2)使用 24 小時光週期的目的 使用 24 小時的光週期是為了模擬植物在受到 ALAN 影響的時候會連續不斷地受 到光照。24 小時的 O.triangularis 雖然能夠回復成葉子正常關閉的角度，但它並 不能張開到最大角度。這可能會令植物在白天無法透過增加與陽光接觸的表面面

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積，影響光合作用的效率。同時，它睡眠運動的效率也會變慢，根據 Minorsky(2018)的三營養假說，FN 構成了對夜間食草動物的間接植物防禦。 FN 可以通過促進夜間捕食者殺死食草動物，或阻礙食草動物的覓食行為間接阻止食 草動物。 如果食草動物在夜食性物種中覓食的時間較少，那麼它們可能會在非 夜食性競爭者中花費更多時間。O.triangularis 可能因為 ALAN 的出現無法透過 睡眠運動減少被捕食的機會。O.corniculata 不論是開展或者閉合的角度都與正 常狀態有明顯的差別，可能與上述 O.triangularis 所受的影響一樣。 (3)影響兩種酢漿草光敏感度的因素 另外 O.triangularis 是一種花青素較高的酢醬草，結果顯示在不同光週期的底下， O.triangularis 的睡眠運動並沒有太大變化，而 O. corniculata 則相對產生較大的 變化。此結果證明花青素含量高代表對高光害環境的承受力比較好，對於光週期 的變化也較不敏感，令睡眠運動的反應並無太大變化。同時證明了園藝種酢醬草 因其延遲晝夜節律而使酢醬草在不同的光週期下變化不大。相反野生酢醬草對光 週期的變化敏感，延遲晝夜節律會令睡眠運動更快完成。這可能反映了延遲光週 期可能對野生植物有益。 (4)生物節律的定義 此外，生物節律(biology rhythm)須滿足三項條件才能算為晝夜節律(circadian rhythm)，包括內源性自由運行的 24 小時週期、能夠通過環境信號重置並同步為 24 小時週期和表現出溫度補償。(Jay et al., 2004)，然而 Christa (1971)理論和 實驗結果表明，睡眠運動可能不會為任何植物提供顯著的霜凍保護。再者，它並 不是超晝夜節律(Ultradian rhythm)或紅外線節律(Infradian rhythm)。因此，它仍 被歸類為另一的晝夜節律(Diurnal rhythm)，在比較時也應以同類的反應作比 較。

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附錄 1、本實驗之原始數據 https://reurl.cc/yQnq8a

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

支持物之直徑對草本攀緣植物纏繞行為的影響 Effect of Support Diameter on Winding Behavior of a Herbal Climbing Plant 黃子欣 1、黃峻緯 1、唐勗勍 1、簡友立 1、蔡佩吟 1 1

國立中山大學生物科學系

摘要 在 Darwin(1865)發表了他對於爬藤植物對附著機制的研究論文後，爬藤類植物 漸漸引起了科學界的關注，雖然直到 20 世紀末對於爬藤植物的研究才開始蓬勃 發展，但爬藤植物一直以來在生物多樣性不可被忽視的影響，使得如今爬藤植物 的研究一直是植物學家們的關注點。我們挑選了被歸類在纏繞植物的豇豆 (Vigna unguiculata)進行研究，嘗試重現 Hu et al.(2017)的文獻中對於豇豆的研 究，改變供給的攀附物之直徑，觀察其生長模式所受到的影響，並參考 Scher et al. (2001)得出的曲率與支持物直徑的關係，與 Hu et al.(2017)文獻中豇豆生長曲 率不改變的現象進行印證與探討。 關鍵字：藤本植物(Climbing Plants)、纏繞行為(Winding Behavior) 、直徑 (radius) 、支持物(Support)、豇豆屬(Vigna)

一、前言 自 Darwin(1865)發表了他對於爬藤植物對附著機制的研究論文後，爬藤類植物 漸漸引起了科學界的關注，如在那之後不久 Schenck(1892)發表的論文記錄了許 多對於爬藤植物的特殊構造的解剖樣態，然而從那之後爬藤植物的研究一直發展 緩慢，而如今我們對於爬藤植物的生物學、演化、生態的知識大多始於 20 世紀 80 年代後(Isnard & Silk, 2009)，如藤本植物在螺旋生長的樣態下的生長速率 (Silk, 1989)、牽牛花的木質化(lignification)與纏繞力的測定 (Scher et al. 2001)、 藤本植物的生態及它在森林中的作用(Schnitzer & Bongers 2002)、攀爬習慣對 植物演化的影響(Gianoli , 2004)等。而 Schnitzer & Bongers (2002) 的論文中也 有提到藤本植物是熱帶森林的重要組成之一，藤本植物在森林的多樣性中甚至可 能高達了 40%之多，而 Rahayu et al.(2017)的文獻也表明藤本植物是森林中動 物的一大食物來源，同時也是鳥類築巢的重要材料之一，因此了解藤本植物在森 林中扮演的角色、它是透過何種方式來進行生長，而成為在森林中如此重要的一

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

員等對於藤本植物的探索，是對於了解森林生態十分重要的一環。 在爬藤植物的分類上，Darwin(1865)在他的論文中將它分為五個種類，分別是纏 繞植物(twining climbers)、葉攀緣植物(leaf climbers)、卷鬚攀緣植物(tendril climbers)、根攀緣植物(root climbers)、鉤藤植物(hook climbers)。雖然在後來 的研究下發現各種爬藤植物在大小、形式和系統發育起源上都有很大的不同 (Isnard & Silk, 2009)，但當前研究大多延續使用 Darwin(1865) 的分類方法，並 繼續加以詳細分類。而除了透過不同構造進行攀爬的區別外，攀緣植物的環繞行 為 在 不 同 的 環 境 下 ， 所 產 生 的 不 同 環 繞 (circumnutation) 行 為 與 向 觸 性 (thigmotropism)的共同作用，對於纏繞行為而言也是十分重要一環。環繞行為 Darwin(1880) 在他的論文中宣稱其是為一種植物的普遍行為，並且含括所有的 其 他 種 類 的 運 動 ， 如 睡 眠 運 動 (nyctinastic movement) 、 向 地 運 動 (tropic movement)等，並且 Darwin(1880) 的論文也報導了纏繞植物在發育早期成長到 一定高度後，會開始進行大幅度的環繞行為，而此一行為在 Agostinelli et al.(2021) 的論文中，被推測為彈力及支撐力與 Johnsson et al.(1999) 提出的雙 震盪器模型 (two-oscillator model) 之共同作用下而產生的行為，使攀藤植物能 在生長初期有更高的機率能尋找到攀附物，而 Kitazawa et al.(2005) 在文獻中 對垂枝型

(weeping) 牽 牛 花

(Ipomoea nil) 的 研 究 ， 可 在 側 面 補 充

Darwin(1880) 論文所宣稱的論點，因垂枝型牽牛花的內胚層(Endoderm)分化異 常，會同時導致環繞及纏繞行為皆消失，可知環繞即使並非纏繞的必要行為，其 兩者觸發的機制及關係都是為相當密切的，然而在 Kitazawa et al.(2005)文獻有 提到垂枝型牽牛花向觸生長(thigmomorphogenesis)的行為是正常的，但卻無法 進行纏繞行為，這也與 Reinhold et al.(1972) 在論文中提到的多數藤蔓和其他爬 藤植物是因接觸支持物導致生長素分布不均，使其纏繞物體而攀爬生長的論點出 現部分衝突，而 Kitazawa et al.(2005) 在文獻中推測可能為向觸生長在爬藤植 物的纏繞行為中並非重要的因素，或是爬藤植物的芽尖(bud tip)有產生專門的觸 摸反應(touch-response)。 而除了爬藤植物的攀爬構造、莖支撐力、向觸生長等爬藤植物自身的性質外，支 持物所導致的環境變化，及支持物本身的特性對於爬藤植物的影響同樣是十分巨 大的，如龜背竹 (Monstera gigantea) 向目標生長是由於感知到宿主樹的陰影、 番 薯 (Ipomea hederacea) 生長路徑則是會優先朝向特定的有色結構攀爬 (Fiorello, 2020)，而在支持物本身的特性上 Carsten et al.(2002) 的文獻中有提 到，支持物的薄厚、光滑程度等支持物本身的屬性，也會影響爬藤類植物攀爬，

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支持物過粗或過細會導致爬藤植物的攀附困難，但在 putz (1984) 的研究中有指 出，由於根攀類及黏性攀爬類的爬藤植物的特殊構造，支持物的粗細並不會顯著 影響攀爬成功率。而在光滑程度上，表面摩擦力(friction)越小，會導致爬藤植物 的附著成功率越小(Carsten et al. 2002)，並導致爬藤植物所能透過支持物支撐 之自體重量減小，容易導致整體滑落(Silk, 2005)。 在 Scher et al.(2001) 的文獻顯示，在分別測量不同直徑圓桿纏繞藤蔓的數值的 情況下，細圓桿上纏繞的藤蔓莖曲率會相較於粗圓桿的曲率大，同時纏繞負載 (單位長度的法向力) 也同樣較大。Hu et al.(2017) 的研究中，他採用四種具纏 繞行為的植物進行對支持物直徑的研究，分別為三裂葉薯(Ipomoea triloba)、牽 牛 花 (Ipomoea nil) 、 小 花 蔓 澤 蘭 (Mikania micrantha) 以 及 豇 豆 (Vigna unguiculata)，隨著支持物的直徑增加，三裂葉薯、牽牛花和小花蔓澤蘭的莖曲 率都有明顯的減少，而豇豆的曲率則仍維持在一固定的範圍。隨著支持物變粗， 三裂葉薯、小花蔓澤蘭和豇豆的攀爬成功率也有明顯的下降，而牽牛花卻只在到 達一定的粗度後才開始有攀爬失敗的狀況發生。 由前文所述之支持物及爬藤植物自身屬性對於攀爬行為的影響，我們可以得知攀 藤植物在進行攀附行為時的影響是十分複雜的，因此若要進行單個因素的測試， 需要保證各個因素皆相同，然而這卻是困難的，因若需要測驗單一因素是否對所 有性質相近的藤本植物皆會有同樣影響的情況下，藤本植物常常會因如前文所述 之環繞強度、支撐力，或是對不同光譜(spectrum)的光的傾向性(tendency)的細 微不同，而產生意料之外的纏繞結果，如我們在 Hu et al.(2017)的研究中發現， 在他的實驗中豇豆纏繞的曲率並未隨著支持物直徑加粗而增大，而是幾乎維持一 個定值，然而在它對三裂葉薯、牽牛花、小花蔓澤蘭進行實驗時，卻又符合 Scher et al.(2001) 的文獻所述的曲率會隨支持物直徑加粗而增大，這個發現使我們好 奇，並打算重現該實驗，並改變 Hu et al.(2017)的研究中對於種植地的設置，由 有遮雨設施的田地，改為室內盆植，並控制光週期以減少光的干擾，以及不對 PVC 管進行打磨以減少過多摩擦力的干擾，而我們預期豇豆的曲率應也會隨支 持物直徑加粗而增大，可能是由於環境、植物本身或支持物的因素而導致豇豆與 其餘植物出現不同，重現過後我們將會對我們的實驗結果與 Hu et al.(2017)的研 究的結果來進行比對，並針對兩者的異同處進行探究並找出可能原因。

二、材料與方法

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

(一) 植物的選擇與栽培 在植物的選擇的方面，我們種植了蔦蘿(Ipomoea quamoclit)、槭葉蔦蘿(Ipomoea sloteri)、豇豆(Vigna unguiculata)、豌豆(Pisum sativum)、香豌豆(Lathyrus odoratus)，而後藉由發芽率來選擇要種植何種植物，發芽率分別是：62.5%、 64%、95%、33.3%、0%、0%。由此得知，豇豆的發芽率最高，所以我們選擇 豇豆當作我們實驗用的植物。 將豇豆種子可以直接播種在 3x3 的盆栽使幼苗生長，播種數為 70 顆，盆栽內部 鋪上培養土，幼苗生長前期，保持土壤適當濕潤，不要讓土完全乾燥。發芽後， 將生長較好的 18 顆幼苗移植到外徑 30.5cm x 20.5cm x 10.5cm ; 內徑 28cm x 16.8cm x 10.2cm 的大盆栽，盆栽內以等距分別插入 4 分、6 分、1 吋，高 60 公分的 PVC 管供豇豆纏繞，使用燈泡作為照明，燈泡的位置設置在盆栽的中間 上方距土面 45 公分處，並利用計時器控制，14 小時照光 10 小時黑夜。 (二) 實驗設施

圖 1、本實驗所採用隻實驗設施示意圖。 PVC 管與照明的配置：將三個盆栽依長軸排成一列，並將 PVC 管以固定間格插 入盆內，排列方式採取相同樣的 PVC 管不相鄰。在每個盆栽上方各架設一 30W 日光燈泡作為照明，定時每日 5:00~19:00 光照，其餘時間黑暗。 (三) 統計策略 實驗結束後，測量所有節間的高度差 ( H )、長度 ( L ) 和攀附物直徑 ( D )計算 曲率 β=2( L2 - H2 )/( L2 D )若出現未貼緊攀附物的情況產生，紀錄單位節間的發

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生次數，並測量在同一平面上映射出多少長度，紀錄，並以此計算出纏繞的直徑， 以此取代 D 值。計算上升角度 α=arcsin ( H / L )比較結果得知攀附物直徑對豇 豆的影響。

三、結果 (一)數據樣態 實驗結果得到豇豆對 4 分、6 分和 1 吋 PVC 管的攀爬率為 66.7%、50%和 16.7%， 但卻有一株 1 吋組的豇豆選擇纏繞 4 分 PVC 管，儘管管上已有豇豆攀附。 豇豆的攀爬曲率平均為 2.07x10⁻⁴、5.9x10⁻⁴和 1.36x10⁻³豇豆對 4 分、6 分和 1 吋 PVC 管的攀爬上升角平均為 47.94°、54.63°和 50.03°（詳見附錄二、三）。 (二)檢測結果 實驗結果表明隨著 PVC 管的直徑變大，豇豆的攀爬成功率有變少的趨勢，且有 一定的選擇性，會偏好直徑較小的支持物攀爬。其餘沒有攀爬的豇豆可能的原因 可能歸究於發育不良無法攀爬或是矮小時因木質化較完整還不需要支撐。 數據表明豇豆攀爬的節間曲率隨 PVC 管的直徑變大而上升，且各組間有顯著差 異。而往上攀爬的角度在各組間沒有顯著差異，也沒有明顯的正反相關性。

四、討論 Hu et al.(2017)的實驗結果表明隨著支持物直徑的增加，纏繞莖的攀爬成功率下 降，雖然因為受限於場地限制和生長情況不佳導致樣本數太少，我們也得出了相 似的結果，我們所獲得的結果，是與 Hu et al.(2017) 所得出的豇豆曲率變化是 不同的，而是與 Scher et al.(2001) 所總結的曲率會隨支持物直徑加粗而增大相 同。我們認為這個結果有兩種可能一是由於豇豆的支持力可能較高，受支持物的 影響較其餘植物小，因植物的支持力同種間皆相近，固使 Hu et al.(2017) 得出 了與我們的結果不同的情況，第二則是由於 Hu et al.(2017)使用了經過打磨的 PVC 管，這可能會使得豇豆的莖獲得了大量的摩擦力，使得豇豆在 Hu et al.(2017) 研究中所選用的直徑下不會因摩擦力的因素而需改變曲率。而我們認為我們檢測 結果可以提供我們豇豆對於攀附物的選擇的一些概念，首先豇豆對於直徑越大的 管攀附成功率越低的原因我們認為與 Scher et al.(2001)所提出的正向力的增加 有關係，在直徑越粗的情況下，植物所面對支持物所產生的正向力越大，而使攀

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

爬造成困難，而在支持物表面較為粗糙或是植物自身的支持力較強的情況下，便 可能可以使植物攀附在範圍更大的支持物上，而使攀覆成功率更高。而上升角度 沒有明顯的相異的部分，這代表了攀藤植物在單位莖長度下，上升的高度是沒有 太大差別的，而這也是為何攀藤植物在更大的直徑上曲率會更大的主因，也就是 說攀藤植物向上生長的傾向與支持物直徑是沒有直接關聯性的。而攀藤植物寧願 放棄攀爬不符合要求的支持物(這體現在於隨攀附物直徑上升，攀爬成功率下降)， 以及寧願放棄減緩高度上升(這體現在了曲率上升以及角度不變)增加符合要求 的支持物範圍，而我們認為這很可能代表著攀藤植物在物種發生的環境中對於快 速生長至一定高度是十分重要的，若採穩定、成功率高的緩慢生長方式很可能會 造成死亡或是生長不良後果，如 González-Teube & Gianol (2007)所提到的昆蟲 啃食及陽光不足的影響，而發展出了如此的生長策略，而攀藤植物是如何感知這 些影響的，以及這些行為具有普適性嗎?而這些也是待我們更進一步的進行了解 的。

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110 年度普通生物學實驗(一)專題報告

附錄一、分別測量三種不同管徑上所攀附之豇豆之詳細數據 (D)直徑(m) (L)長度(m) (H)高度(m) (β)曲率(m-1)

(α)上升角(度)

4 分-1

0.013

0.224

0.194

3.26 * 10-4

60.005

4 分-2

0.013

0.107

0.073

1.60 * 10-4

43.192

4 分-3

0.013

0.181

0.15

2.67 * 10-4

55.968

4 分-4

0.013

0.065

0.035

7.8 * 10-5

32.579

6 分-1

0.020

0.230

0.195

5.95 * 10-4

57.976

6 分-2

0.020

0.235

0.192

7.34 * 10-4

54.788

6 分-3

0.020

0.167

0.13

4.40 * 10-4

51.118

1 吋-1

0.0254

0.30

0.265

1.00 * 10-3

62.047

1 吋-2

0.0254

0.248

0.165

1.74 * 10-3

41.707

1 吋-3

0.0254

0.235

0.17

1.34 * 10-3

46.336

附錄二、三種不同管徑所攀附之豇豆之曲率平均值及變異數值 尺寸

個數

總和

平均

變異數

4分

4

0.000829946

0.0002074865

1.22285E-08

6分

3

0.001769

0.00058966

2.17599E-08

1吋

3

0.0040832532

0.0013610844

1.36144E-07

附錄三、三種不同管徑所攀附之豇豆之角度平均值及變異數值 尺寸

個數

總和

平均

變異數

4分

4

191.744

47.936

156.172256

6分

3

163.882

54.62733

11.7774013

1吋

3

150.09

50.03

113.663127

79