Revista ALERGOLOGIA Volumul IV, nr.1 2020 by MedicHub

Revista Societății Române de Alergologie și Imunologie Clinică VOL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REFERATE GENERALE

LUCRĂRI ORIGINALE

FOTO: Determinarea IgE specifice prin metoda ImmunoCAP (Phadia 250, din dotarea Centrului OncoGen Timișoara)

DOI:10.26416/Aler.4.1.2020

RUBRICA SPECIALISTULUI

PREZENTĂRI DE CAZ

ABONARE 2020 Publicație creditată cu

10 EMC

Denumire produs

Detalii produs

Suma

Alergologia Digital

4 numere format digital

89 lei

Alergologia Tipărit

4 numere format tipărit

119 lei

Combo 1 Digital

2 reviste format digital

149 lei

Combo 1 Tipărit

2 reviste format tipărit

199 lei

Plată online securizată*

Ordin de plată sau transfer bancar pe coordonatele: MEDICHUB MEDIA SRL, Green Gate, Bd. Tudor Vladimirescu, nr. 22, etaj 11, sector 5,050883, București, OP 69 – CP 197, CUI 16136719, J40/2001/2004. Cont IBAN RO73RNCB0617140595120003,deschis la BCR. *Plată online prin platforma medichub.ro

editorial REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Alergologia moleculară – o nouă paradigmă

Conf. dr. Florin-Dan Popescu

Reclamă ALG 4(1)0101

De la descoperirea imunoglobulinelor E la sfârșitul anilor 1960, testele serologice au devenit o parte integrantă a diagnosticului alergologic, alături de anamneza detaliată și procedurile diagnostice in vivo, precum testele cutanate alergologice și cele de provocare. În ultimele decenii, extractele alergenice au stat la baza metodelor de diagnostic in vitro, dar, din cauza problemelor legate de standardizare, precizia rezultatelor poate lăsa de dorit. Acest deficit este acum acoperit progresiv de noile opțiuni de diagnostic bazate pe metode de biologie moleculară. Datorită progreselor tehnologice rapide din ultimii ani, a devenit posibilă nu numai identificarea și purificarea unui număr tot mai mare de alergene moleculare cu izoformele lor, dar și producerea lor ca alergene recombinate prin tehnici de secvențiere și clonare. Alergologia moleculară a apărut la un moment oportun, în această eră a medicinei de precizie, când sunt necesare instrumente de diagnostic precise, bazate pe cunoașterea detaliată a fenotipului de boală, pentru a oferi pacientului opțiuni de tratament individualizat. Analizele moleculare singleplex și multiplex nu furnizează doar informații detaliate despre profilul de sensibilizare al pacientului, ci și despre posibila reactivitate încrucișată. Ele permit, de asemenea, observarea evoluției longitudinale a profilurilor moleculare complexe de IgE și IgG în studii de cohortă la naștere, esențiale pentru explicarea unor fenomene imunologice complexe. Odată ce acestea sunt înțelese în profunzime, ar putea fi identificate terapii mai eficiente pe termen lung, precum și măsuri profilactice. Acest număr al revistei Alergologia este dedicat alergologiei moleculare, sub coordonarea grupului de lucru specializat din cadrul SRAIC, ai cărui membri sunt prof. dr. Carmen Panaitescu, conf. dr. Florin-Dan Popescu, as. dr. Mariana Vieru și as. dr. Laura Haidar. Colectivul promovează noua direcție de diagnostic de precizie al bolilor alergice, bazat pe componente moleculare, și prezența activă în cadrul activităților desfășurate sub egida SRAIC. Astfel, vom fi prezenți și cu alte materiale de interes în viitoarele ediții ale revistei. Scopul activității noastre ca grup de lucru este să facem cunoscute la nivel național recomandările și progresele EAACI în domeniul alergologiei moleculare și să ne aducem contribuția la dezvoltarea acestei noi direcții moderne în alergologie. Revista Alergologia se dorește o punte între generații, ea rămâne vie și crește prin efortul și dedicarea oamenilor, a celor care o scriu și a celor care o citesc în egală măsură, și este dedicată în primul rând tinerilor specialiști, redactorii săi de mâine. n

Prof. dr. Carmen Panaitescu

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

SUMAR

VOL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

EDITORIAL

3 Alergologia moleculară – o nouă paradigmă Carmen Panaitescu, Florin-Dan Popescu

REFERATE GENERALE

7 Metode de laborator pentru caracterizarea fizico-chimică a alergenelor recombinate ca standarde de referință

Mariana Vieru, Florin-Dan Popescu, Laura Haidar, Carmen Panaitescu

LUCRĂRI ORIGINALE ȘI PROIECTE

10 Alergenele recombinate – metode de producere și

utilitatea în diagnosticul molecular și în imunoterapia alergenică

Maria-Roxana Buzan, Manuela Grijincu, Lauriana-Eunice Zbîrcea, Laura Haidar, Carmen Panaitescu, Kuan-Wei Chen

EDUCAȚIE MEDICALĂ CONTINUĂ

16 Diagnosticul molecular în bolile alergice respiratorii induse de polenuri

Maria-Roxana Buzan, Monica Cotarcă, Lauriana-Eunice Zbîrcea, Paul Tudor Tămaș, Laura Haidar, Michael-Bogdan Mărgineanu, Kuan-Wei Chen, Carmen Panaitescu

30 Diagnosticul molecular în bolile alergice respiratorii induse de alergene perene

Paul Tudor Tamaș, Laura Haidar, Manuela Grijincu, Michael-Bogdan Mărgineanu, Bianca Vulpe, Lauriana-Eunice Zbîrcea, Carmen Panaitescu

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

EDITOR-IN-CHIEF Roxana Silvia BUMBĂCEA (Bucharest) ASSOCIATE EDITOR Cristina VLAICU (Bucharest) EDITORIAL BOARD Ioana AGACHE (Brașov) Corina BACH (Bucharest) Camelia BERGHEA (Bucharest) Corina BOCȘAN (Cluj-Napoca) Carmen BUNU-PANAITESCU (Timișoara) Alexis COCHINO (Bucharest) Diana DELEANU (Cluj-Napoca) Nadia GHERMAN-IONICĂ (Cluj-Napoca) Liviu GHILENCEA (Bucharest) Poliana Mihaela LERU (Bucharest) Mara MIHAI (Bucharest) Adriana MUNTEAN (Cluj-Napoca) Florin-Dan POPESCU (Bucharest) Corina URECHE (Târgu-Mureș) Mariana VIERU (Bucharest) INTERNATIONAL EDITORIAL BOARD Anca CHIRIAC (France) Martin CHURCH (UK) Alina DUMITRU (UK) Omer KALAYACI (Turkey) Todor POPOV (Bulgaria) Nikolaos PAPADOPOULUS (Greece) Carsten SCHMIDT-WEBER (Germany) DTP & PHOTOPROCESSING Radu LEONTE PROOFREADING Rodica CREŢU, Florentin CRISTIAN

RUBRICA SPECIALISTULUI

42 Inhibitorii de N-glicani în metodele de imunoanaliză pentru IgE alergen-specifice serice

COMUNICARE PE SCURT

45 Componente alergenice din alimente declarabile ca surse de alergene în UE disponibile în metodele de imunoanaliză multiplex Florica Popescu, Mariana Vieru, Florin-Dan Popescu, Carmen Panaitescu

PREZENTARE DE CAZ

48 Sindrom de alergie orală în rinita alergică la polen de platan

FOTO: SHUTTERSTOCK

Carmen Saviana Ganea, Mariana Vieru, Florin-Dan Popescu

CEO Simona MELNIC DEPUTY CEO MULTICHANNEL & EVENTS MANAGER Lavinia SIMION EDITORIAL MANAGER Oana NEACȘU SALES MANAGER Mircea TOMESCU ADMINISTRATIVE MANAGER Dana STUPARIU SUBSCRIPTION MANAGER Alina ROȘU abonamente@medichub.ro COMPANY ADDRESS MEDICHUB MEDIA SRL Green Gate Office Building, 22 Tudor Vladimirescu Blvd., th 11 Floor, District 5, 050883, Bucharest, Romania Phone: (031) 425.40.40, Fax: (031) 425.40.41 E-mail: redactia@medichub.ro www.medichub.ro Copyright© 2019 MEDICHUB MEDIA SRL Drepturile de autor pentru articolele și fotografiile publicate aparţin exclusiv MEDICHUB MEDIA SRL. Reproducerea, totală sau parţială, și sub orice formă, tipărită sau electronică, sau distribuţia materialelor publicate se face numai cu acordul scris al Editurii. ISSN 2601-047X ISSN-L 2601-047X Responsabilitatea asupra conţinutului original al materialelor aparţine în întregime autorilor. Persoanele intervievate răspund de conţinutul declaraţiilor lor, iar utilizatorii spaţiului publicitar, de informaţiile incluse în machete.

Reclamă ALG 4(1)0102

Florin-Dan Popescu, Mariana Vieru, Carmen Saviana Ganea, Carmen Panaitescu

Chiesi România – Member of Chiesi Eastern Europe Chiesi România SRL - Str. Venezuela nr.10, sector 1, București, România Tel +40/21 202 36 42 – Fax +40/21 202 36 43, www.chiesi.ro – www.chiesi.com

1. Scichilone et al., J Asthma Allergy 2013; 6:11-21; 2. Muller et al., BMC Pulm Med 2011; 11:40; 3. Allegra et al., Resp Med 2012; 106:205-214; 4. Terzano et Al., Resp Res 2012; 13:112; 5. Calverley et al., Respir Med 2010; 104(12): 1858-1868; 6. Singh et al., BMC Pulm Med 2014; 14:43

011/CR/FOSTER/09-2019

Beclometazonă+Formoterol

Prima și singura combinație fixă cu particule extrafine, care aduce beneficii clinice pacienților cu astm sau BPOC1-6

Acest produs se eliberează pe bază de rețetă PRF. Pentru informații complete de prescriere, vă rugăm să consultați Rezumatul Caracteristicilor Produsului.

REZUMATUL CARACTERISTICILOR PRODUSULUI FOSTER 100/6 micrograme pe doză soluţie de inhalat presurizată. Fiecare doză măsurată conţine: dipropionat de beclometazonă 100 micrograme şi fumarat de formoterol dihidrat 6 micrograme. Acesta este echivalentul unei doze (din inhalator) de dipropionat de beclometazonă de 84,6 micrograme şi fumarat de formoterol dihidrat 5,0 micrograme. Pentru lista tuturor excipienţilor, vezi pct. 6.1.Soluţie de inhalat presurizată incoloră spre gălbui. Indicaţii terapeutice ASTM BRONŞIC. Foster este indicat în tratamentul de fond al astmului bronşic atunci când utilizarea unei combinaţii (glucocorticoid inhalator şi agonist beta-2 adrenergic cu durată lungă de acţiune) este adecvată: pacienţi care nu au răspuns corespunzător la tratamentul cu glucocorticoid inhalator şi agonist beta-2 adrenergic cu durată scurtă de acţiune administrat la nevoie sau pacienţi care au răspuns deja corespunzător la tratamentul cu glucocorticoid inhalator şi agonist beta-2 adrenergic cu durată lungă de acţiune. BRONHOPNEUMOPATIA CRONICĂ OBSTRUCTIVĂ (BPOC). Tratamentul simptomatic al pacienților cu BPOC severă (VEMS < 50 % din valoarea normală prezisă) și antecedente de exacerbări repetate la pacienți care prezintă simptome semnificative în pofida terapiei cu bronhodilatatoare cu durată lungă de acțiune. Doze şi mod de administrare. Foster se administrează pe cale inhalatorie. ASTM BRONŞIC. Foster nu este destinat ca tratament de primă intenţie în astmul bronşic. Dozajul componentelor Foster este individual şi trebuie reglat în funcţie de severitatea afecţiunii. Acest lucru trebuie luat în considerare nu numai atunci când se iniţiază tratamentul cu medicamente în combinaţie, dar şi atunci când este ajustată doza. În cazul în care un pacient necesită o altă combinaţie a dozelor, diferită de cea disponibilă în inhalator, trebuie să i se prescrie doze adecvate de beta2-agonişti şi/sau corticosteroizi în inhalatoare diferite. Dipropionatul de beclometazonă din Foster este caracterizat prin distribuţia particulelor extrafine, care determină un efect mai puternic decât formulările cu dipropionat de beclometazonă cu distribuţia unor particule non-extrafine (100 micrograme de dipropionat de beclometazonă extrafină din Foster echivalează cu 250 micrograme de dipropionat de beclometazonă într-o formulare non-extrafină). Prin urmare, doza zilnică totală de dipropionat de beclometazonă administrat din Foster trebuie să fie mai mică decât doza zilnică de dipropionat de beclometazonă administrată dintr-o formulare cu dipropionat de beclometazonă nonextrafină. Aceste aspecte trebuie luate în considerare în momentul în care la un pacient se trece de la dipropionat de beclometazonă non-extrafină la Foster; doza de dipropionat de beclometazonă trebuie să fie mai mică şi va trebui ajustată în funcţie de nevoile individuale ale pacienţilor. Există două abordări terapeutice: A.Terapia de întreţinere: FOSTER se administrează periodic, ca tratament de întreţinere, care se poate asocia, la nevoie cu un bronhodilatator cu durată scurtă de acţiune. B. Terapia de întreţinere şi de ameliorare a simptomelor: FOSTER se administrează periodic, ca tratament de întreţinere, şi, la nevoie, pentru controlul simptomatologiei. A.Terapia de întreţinere: Pacienţii trebuie sfătuiţi să aibă mereu la îndemână un bronhodilatator cu durată scurtă de acţiune pentru a-l utiliza în situaţiile de urgenţă. Dozele recomandate pentru adulţi cu vârsta de 18 ani şi peste: Un puf sau două pufuri de două ori pe zi. Doza maximă zilnică este de 4 pufuri. B.Terapia de întreţinere şi de ameliorare a simptomelor Pacienţii primesc o doză zilnică de întreţinere de FOSTER şi în plus, pot lua FOSTER la nevoie, în funcţie de simptomatologie. Pacienţii trebuie sfătuiţi să aibă mereu la îndemână FOSTER pentru a-l utiliza în situaţiile de urgenţă.Terapia de întreţinere şi de ameliorare a simptomelor cu FOSTER trebuie luată în considerare, în special, în cazul pacienţilor cu: astm bronşic care nu poate fi controlat în mod adecvat şi care necesită frecvent medicaţie de urgenţă; antecedente de exacerbări ale astmului bronşic şi care au necesitat intervenţie medicală. Este necesară monitorizarea atentă a reacţiilor adverse dependente de doză la pacienţii care utilizează un număr mare de doze inhalatorii, la nevoie. Dozele recomandate pentru adulţi cu vârsta de 18 ani şi peste. Doza de întreţinere recomandată este de un puf de două ori pe zi, (administrată una dimineaţa şi una seara). Pacientul trebuie să îşi administreze un puf suplimentar, la nevoie, în funcţie de simptomatologie. Dacă simptomele persistă după câteva minute, trebuie administrat încă un puf. Doza maxima zilnică este de 8 pufuri. Pacienţii care necesită utilizarea zilnică frecventă a inhalatorului pentru situații de urgență sunt sfătuiţi să se adreseze neapărat medicului. Ei trebuie reevaluaţi şi terapia lor de întreţinere trebuie reconsiderată. Dozele recomandate pentru copii şi adolescenţi cu vârsta sub 18 ani: Siguranţa şi eficacitatea pentru Foster la copii şi adolescenţi cu vârsta sub 18 ani nu au fost stabilite încă. Nu există experienţă privind utilizarea Foster la copii cu vârsta sub 12 ani. Există numai date limitate privind utilizarea la copii şi adolescenţi cu vârsta între 12 şi 17 ani. Prin urmare, Foster nu este recomandat la copii şi adolescenţi cu vârsta sub 18 ani până când nu vor fi disponibile date suplimentare. Pacienţii trebuie reevaluaţi periodic de medic, astfel încât doza de Foster să fie optimă şi să fie modificată numai la recomandarea medicului. Doza trebuie stabilită treptat la cea mai mică doză care asigură menţinerea controlului efectiv al simptomelor. Atunci când controlul simptomelor este menţinut cu ajutorul celei mai mici doze recomandate, următorul pas poate include un test de administrare doar a unui corticosteroid cu administrare inhalatorie. Pacienţii trebuie sfătuiţi să utilizeze Foster zilnic chiar şi atunci când sunt asimptomatici. BRONHOPNEUMOPATIA CRONICĂ OBSTRUCTIVĂ (BPOC). Dozele recomandate pentru adulţi cu vârsta de 18 ani şi peste: Două pufuri de două ori pe zi. Pacienţii care nu pot sincroniza inhalarea aerosolilor cu inspirul pot să utilizeze un dispozitiv de tip spacer AeroChamber Plus®. Pacienţii trebuie instruiţi de către medicul curant sau farmacist cum să utilizeze în mod corect inhalatorul şi dispozitivul de tip spacer, iar aceştia trebuie să verifice modul în care pacienţii utilizează dispozitivul pentru a asigura o administrare optimă a medicamentului de inhalat în plămâni. La pacienţii care utilizează AeroChamber Plus® aceasta se poate realiza printr-un inspir continuu, lent şi profund prin dispozitivul de tip spacer, fără nici un decalaj între apăsare şi inhalare. Atenţionări şi precauţii speciale pentru utilizare. Se recomandă ca tratamentul cu Foster să nu fie întrerupt brusc. În cazul în care pacienţii consideră că tratamentul nu este eficace, se recomandă solicitarea de asistenţă medicală. Necesitatea utilizării unor doze mai mari de bronhodilatatoare pentru situaţii “de urgenţă” indică agravarea bolii de bază şi impune reevaluarea tratamentului astmului bronşic. Deteriorarea bruscă şi progresivă a controlului astmului poate pune viaţa pacientului în pericol, iar acesta trebuie supus unei evaluări medicale urgente. Trebuie avută în vedere necesitatea suplimentării tratamentului cu corticosteroizi, pe cale inhalatorie sau orală sau iniţierea tratamentului antibiotic în cazul în care se suspicionează o infecţie.Pacienţii nu trebuie să înceapă tratamentul cu Foster în timpul unei perioade de exacerbare a bolii sau dacă suferă de astm bronşic în stare de agravare sau deteriorare acută. Reacţiile adverse grave datorate astmului bronşic şi exacerbările acestuia pot să apară în timpul tratamentului cu Foster. Pacienţii trebuie informaţi să continue tratamentul, dar să solicite asistenţă medicală în cazul în care simptomele rămân necontrolate sau se agravează după iniţierea tratamentului cu Foster. Similar altor medicamente administrate pe cale inhalatorie, imediat după administrare poate să apară bronhospasm paradoxal cu accentuarea wheezingului şi scurtarea respiraţiei. Aceste simptome trebuie tratate imediat cu un bronhodilatator cu acţiune rapidă. Foster trebuie întrerupt imediat, pacientul trebuie evaluat de medic şi dacă este necesar se instituie un tratament alternativ. Foster nu trebuie utilizat ca tratament de primă intenţie pentru astm bronşic. Pentru tratamentul crizelor de astm bronşic pacienţii trebuie instruiţi să aibă mereu la îndemână bronhodilatatoarele cu durată scurtă de acţiune, fie FOSTER (pentru pacienții care utilizează FOSTER ca terapie de întreţinere şi de ameliorare ) sau un alt bronhodilatator cu durată scurtă de acţiune ( pentru pacienții care utilizează FOSTER doar ca terapie de întreţinere). Pacienţii trebuie sfătuiţi să utilizeze Foster zilnic conform recomandărilor, chiar şi atunci când sunt asimptomatici. Terapia de ameliorare cu FOSTER trebuie iniţiată ca răspuns la simptomatologia astmului bronşic, dar nu în scopul utilizării profilactice, de exemplu înainte de un efort fizic. Pentru aceasta se recomandă utilizarea separată a unui bronhodilatator cu acţiune rapidă. După obţinerea controlului simptomelor de astm bronşic, trebuie să se ia în considerare reducerea treptată a dozei de Foster. Evaluarea periodică a pacienţilor pe parcursul scăderii treptate a dozei este importantă. Trebuie să se utilizeze doza minimă eficace de Foster. Datele privind farmacocinetica după administrarea unei doze unice au demonstrate că utilizarea Foster prin intermediul dispozitivului tip spacer Aerochamber Plus® comparativ cu utilizarea unui inhalator standard, nu creşte expunerea sistemică totală la formoterol şi reduce expunerea sistemică la beclometazonă 17-monopropionat, în timp ce nivelul nemodificat de dipropionat de beclometazonă care ajunge din circulaţia sistemică din plămâni creşte; cu toate acestea, deoarece expunerea sistemică totală la dipropionatul de beclometazonă şi metaboliţii săi active nu se modifică, nu există o creştere a riscului de apariţie a efectelor sistemice în cazul utilizării Foster cu ajutorul dispozitivului Aerochamber Plus®. Este necesară precauţie în cazul trecerii pacienţilor de la un alt tratament la tratamentul cu Foster, în special în cazul în care există orice motiv de suspicionare a afectării funcţiei suprarenalei în urma tratamentului anterior cu corticosteroizi sistemici. Pacienţii transferaţi de la terapia orală la cea inhalatorie cu corticosteroizi pot prezenta în continuare, pentru o perioadă considerabilă de timp, risc de afectare a rezervei corticosuprarenale. Pacienţii care au necesitat tratament cu doze mari de corticosteroizi inhalatori pentru situaţii “de urgenţă”, pot prezenta, de asemenea, acest risc. Această posibilitate de afectare reziduală trebuie avută întotdeauna în vedere în situaţii de urgenţă sau programate pentru care se anticipează că presupun stres şi trebuie luat în considerare tratamentul corespunzător cu corticosteroizi. Gradul insuficienţei suprarenaliene poate necesita sfatul unui specialist înaintea procedurilor programate. Reacţii adverse. Deoarece Foster conţine dipropionat de beclometazonă şi fumarat de formoterol dihidrat, tipul şi severitatea reacţiilor adverse asociate fiecărui component pot fi anticipate. Nu s-au înregistrat cazuri de reacţii adverse suplimentare în urma administrării concomitente a celor două componente. Clasificarea pe aparate, sisteme și organe: Infecții și infestări: Frecvente Faringită, candidoză orală; Mai puțin frecvente - Gripă, infecție micotică la nivelul cavității bucale, candidoză orofaringiană și esofagiană, candidoză vulvovaginală, gastroenterită, sinuzită, rinită, pneumonie*. Tulburări hematologice și limfatice: Mai puțin frecvente – Granulocitopenie; Foarte rare – Trombocitopenie. Tulburări ale sistemului imunitar: Mai puțin frecvente Dermatită alergică; Foarte rare - Reacții de hipersensibilitate, inclusiv eritem, edem la nivelul buzelor, feței, ochilor și faringelui. Tulburări endocrine: Foarte rare - Supresia funcției glandelor suprarenale. Tulburări metabolice și de nutriție: Mai puțin frecvente - Hipokaliemie, hiperglicemie. Tulburări psihice: Mai puțin frecvente – Neliniște; Cu frecvență necunoscută* Hiperactivitate psihomotorie, tulburări de somn, anxietate, depresie, agresivitate, modificări de comportament (mai ales la copii). Tulburări ale sistemului nervos: Frecvente – Cefalee; Mai puțin frecvente - Tremor, amețeli. Tulburări oculare: Foarte rare - Glaucom, cataractă. Tulburări acustice și vestibulare: Mai puțin frecvente – Otosalpingită. Tulburări cardiace: Mai puțin frecvente - Palpitații, prelungirea intervalului QT corectat, modificări ale electrocardiogramei, tahicardie, tahiaritmie, fibrilație atrială*; Rare - Extrasistole ventriculare, angină pectorală. Foarte rare - Fibrilație atrială. Tulburări vasculare: Mai puțin frecvente - Hiperemie, hiperemie facială tranzitorie. Tulburări respiratorii, toracice și mediastinale: Frecvente– Disfonie; Mai puțin frecvente - Tuse, tuse productivă, iritație faringiană, crize de astm bronșic; Rare - Bronhospasm paradoxal; Foarte rare - Dispnee, exacerbarea astmului bronșic. Tulburări gastro- intestinale: Mai puțin frecvente - Diaree, xerostomie, dispepsie, disfagie, senzație de arsură la nivelul buzelor, greață, disgeuzie. Afecțiuni cutanate și ale țesutului subcutanat: Mai puțin frecvente Prurit, erupții cutanate tranzitorii, hiperhidroză, urticarie; Rare - Edem angioneurotic. Tulburări musculo- scheletice și ale țesutului conjunctiv: Mai puțin frecvente - Spasme musculare, mialgie. Mai puțin frecvente - Încetinirea procesului de creștere la copii și adolescenți. Tulburări renale și ale căilor urinare: Rare – Nefrită. Tulburări generale și la nivelul locului de administrare: Foarte rare - Edeme periferice. Investigații diagnostic: Mai puțin frecvente - Creșterea valorii proteinei C reactive, creșterea numărului de trombocite, creșterea valorii acizilor grași liberi în plasmă, creșterea insulinemiei, creșterea valorii corpilor cetonici în sânge, scăderea valorii cortizolului în sânge*; Rare - Creșterea tensiunii arteriale, scăderea tensiunii arteriale; Foarte rare - Scăderea densității osoase. *un caz de pneumonie nu foarte grav a fost raportat de un pacient tratat cu Foster într-un studiu clinic pivit la pacienți cu bronhopneumopatia cronică obstructivă (BPOC). Alte reacții adverse observate cu Foster în studii clinice la pacienți cu bronhopneumopatia cronică obstructivă (BPOC) au fost reducerea nivelului cortizolului în sânge și fibrilație atrială. Lista excipienţilor: Norfluran (HFA 134a), etanol anhidru, acid clorhidric. Precauţii speciale pentru păstrare. Înainte de prima administrare de către pacient: A se păstra la frigider (2-8°C) (timp de maxim 15 luni). După prima administrare: A se păstra la temperaturi sub 25°C (timp de maxim 5 luni). Flaconul conţine un lichid sub presiune. A nu se păstra la temperaturi mai mari de 50°C. A nu se perfora flaconul. Soluţia de inhalat este conţinută într-un flacon presurizat din aluminiu, prevăzut cu valvă dozatoare şi introdus intr-un dispozitiv de administrare din plastic polipropilenic, prevăzut cu piesă bucală şi capac din plastic. Fiecare cutie conţine:1 flacon presurizat ce asigură 180 doze. Este posibil ca nu toate mărimile de ambalaj să fie comercializate. Deţinător APP nr.4092/2011/01-02: Chiesi Pharmaceuticals GmbH Gonzagagasse 16-16, 1010 Viena, Austria. Data revizuirii textului: Iunie 2015. Profesioniştii din domeniul sănătăţii sunt rugaţi să raporteze orice reacţie adversă suspectată prin intermediul sistemului naţional de raportare, ale cărui detalii sunt publicate pe web-site-ul Agenţiei Naţionale a Medicamentului şi a Dispozitivelor Medicale http://www.anm.ro. 011/CR/FOSTER/09-2019

referate generale REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Metode de laborator pentru caracterizarea fizico-chimică a alergenelor recombinate ca standarde de referință Laboratory Methods for the Physico-Chemical Characterization of Recombinant Allergens as Reference Standards Mariana Vieru1, Florin-Dan Popescu1, Laura Haidar2,3, Carmen Panaitescu2,3 1. Disciplina de Alergologie Spitalul Clinic “Nicolae Malaxa”, Universitatea de Medicină și Farmacie „Carol Davila” București, 2. UMF "Victor Babeș" Timișoara, Departamentul III Științe Funcționale, Disciplina de Fiziologie, 3. Centrul de terapii genice și celulare în tratamentul cancerului OncoGen – SCJUPB Timișoara Autor corespondent: Mariana Vieru, e-mail: mariana.vieru@umfcd.ro

Primit: 19.02.2020 Acceptat: 03.03.2020

ABSTRACT

REZUMAT

The methods used to quantify the physico-chemical parameters of molecular allergens are multiple. The physico-chemical parameters selected for the evaluation of the quality of natural purified and recombinant allergens include the identity of the primary structure, the secondary structure, the purity and homogeneity. However, there is no single method that can analyze all the important characteristics represented by structural, physico-chemical, immunological properties. Keywords: molecular allergens, physico-chemical characteristics, laboratory methods

Metodele utilizate pentru cuantificarea parametrilor fizicochimici ai alergenelor moleculare sunt multiple. Parametrii fizico-chimici selectați pentru evaluarea calității alergenelor naturale purificate și recombinate includ identitatea structurii primare, structura secundară, puritatea și omogenitatea. Nu există însă o unică metodă care să poată analiza toate caracteristicile importante reprezentate de proprietăți structurale, fizico-chimice, imunologice. Cuvinte-cheie: alergene moleculare, caracteristici fizico-chimice, metode de laborator

Caracterizarea riguroasă prin metode chimice, fizico-chimice și biologice a produselor bioterapeutice produse prin tehnologia ADN recombinat este esențială, conform recomandărilor Organizației Mondiale a Sănătății (World Health Organization, WHO). Metodele proteomice, biochimice și imunochimice de caracterizare a alergenelor recombinate efectuate în faza de dezvolt a re deter m i nă propr iet ăț i le f i zico - ch i m ice, imunochimice, activitatea biologică, puritatea și confirmă calitatea produselor alergenice. Stabilirea unor standarde de referință bine caracterizate bazate pe alergene recombinate și metode de analiză de laborator validate pentru cuantificarea alergenelor moleculare sunt obiective semnificative ale Programului de standardizare biologică al Direcției Europene pentru Calitatea Medicamentelor și a Sănătății (European Directorate for the Quality of Medicines, EDQM) (1-5). Metodele utilizate pentru cuantificarea parametrilor fizico-chimici ai produselor alergenice sunt multiple(6-9). Conform unui proiect important finanțat de Uniunea Europeană, denumit CREATE (Development of Certified Reference Materials for Allergenic Products and Validation ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

of Methods for their Quantification), parametrii fizico-chimici selectați pentru evaluarea calității alergenelor naturale purificate și recombinate includ identitatea structurii primare, structura secundară, puritatea și omogenitatea, iar metodele de laborator pentru caracterizarea fizico-chimică a alergenelor recombinate, inclusiv ca standarde de referință (pentru Bet v 1.0101 și Phl p 5.0109), au fost publicate detaliat și le vom menționa în continuare(3-5,10-12). Nu există însă o metodă unică care să poată analiza toate caracteristicile importante reprezentate de proprietăți structurale, fizico-chimice, imunologice (13,14).

Metode de laborator utilizate pentru a caracteriza identitatea, cantitatea și structura

Alergenele trebuie să prezinte compoziție și secvențe de aminoacizi în acord cu secvențele primare cunoscute (publicate). Investigarea identității proteice pentru alergenele moleculare recombinate se face prin metode bazate pe spectrometrie de masă și analiza aminoacizilor. Analiza greutății moleculare intacte a unei proteine se face prin spectrometrie de masă (mass spectrometry, MS).

referate generale Spectrometria de masă de înaltă rezoluție (high-resolution mass spectrometry, HRMS) este utilizată pentru măsurarea intactă a masei pe diferite platforme care utilizează tehnica cuadrupolului, a trapei orbitale și a trapei ionice. Secvențierea peptidelor (peptide mapping) produse prin digestia enzimatică proteolitică se realizează prin cromatografie nanolichidă cu detecție prin spectrometrie de masă în tandem (nanoscale liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry, NanoLC-MS/MS) ca tehnică principală pentru confirmarea structurii primare proteice (secvența de aminoacizi). Evaluarea cantitativă proteică este cuantificată prin analiza aminoacizilor (amino acid analysis, AAA). Trebuie să existe o corelație excelentă între compoziția (identitatea) aminoacizilor teoretică și cea observată experimental. Metodele de analiză a aminoacizilor includ hidroliza convențională și derivatizare pre-coloană cu fenilizotiocianat (PITC) și separare prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC) sau cu o-ftalaldehidă (OPA) și HPLC în fază inversă (RP-HPLC). Spectroscopia de dicroism circular (circular dichroism, CD) este frecvent utilizată pentru a analiza structura secundară (regiunea spectrală UV îndepărtată). Spectrometrele dedicate măsurării fenomenului de dicroism circular sunt denumite spectropolarimetre. Alergenele recombinate trebuie să aibă structura proteică pliată corespunzător. Dicroismul circular al moleculelor candidate trebuie să prezinte caracteristici spectrale tipice unei proteine pliate cu amplitudini de vârf similare spectrelor de referință. Această metodă nu numai că furnizează informații pur structurale despre alergene, dar poate permite predicții despre activitatea alergenică. Difractometria cu raze X la unghiuri mici (small-angle X-ray scattering, SAXS) poate furniza de asemenea informații utile, deoarece proteinele denaturate pot prezenta alterarea funcției de distribuție a distanței pentru perechi (pair distance distribution function, PDDF).

Metode de laborator utilizate pentru a caracteriza omogenitatea

Alergenele recombinate trebuie să fie omogene în ceea ce privește greutatea moleculară și să fie comparabile cu omologii lor naturali. Electroforeza în gel de poliacrilamidă cu dodecilsulfat de sodiu (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE) sau electroforeza cu focalizare izoelectrică (isoelectric focusing, IEF), cu colorare cu albastru briliant de Coomassie (Coomassie staining), acid periodic Schiff (PAS) sau nitrat de argint (silver staining) separă alergenele moleculare recombinate în cantități de ordinul microgramelor, iar identitatea benzilor vizibile de proteine p oate fi relevată prin metodă imunoblotting cu utilizarea de anticorpi monoclonali specifici alergenelor recombinate și eșantion de seruri de la pacienți alergici. Modificările posttranslaționale, de agregare sau degradare pot produce benzi suplimentare. Metoda care este folosită în mod obișnuit pentru a evalua omogenitatea este cromatografia de filtrare în gel.

Pentru proteinele monomerice, eșantionul trebuie să conțină un vârf (peak) unic de greutate moleculară preconizată. Cromatografia lichidă de înaltă performanță (high-performance liquid chromatography, HPLC) de tip gel-filtrare sau cromatografie de excluziune sterică (size-exclusion chromatography, SEC) este utilizată pentru a evalua omogenitatea în soluție, putând fi detectate forme oligomerice sau monomerice, agregate și produse de degradare. Cromatograma de excludere moleculară monitorizată prin semnal de dispersie a luminii în unghi drept (right-angle light scattering, RALS) este extrem de sensibilă pentru agregatele cu greutate moleculară mare. Greutatea moleculară (kDa) și raza hidrodinamică (nm) pot fi determinate prin combinarea RALS cu indicele de refracție și semnalul de viscozitate. Este posibil să se determine dacă alergenul recombinat constă din > 99,9% molecule monomerice omogene. Microscopia electronică cu tehnică de colorare negativă (negative staining) poate fi utilizată pentru evidențierea prezenței agregatelor de dimensiuni diferite. Difractometria cu raze X la unghiuri mici (small-angle X-ray scattering, SAXS) oferă informații despre statusul agregării moleculelor proteice în soluție. Modificările posttranslaționale și chimice rezultate din procesul de producție prin tehnica de recombinare pot fi detectate și cuantificate prin spectrometria de masă pentru eterogenitate. Comportamentul de agregare și stabilitatea în soluție sunt investigate prin metoda de dispersie dinamică a luminii (dynamic light scattering, DLS), care evaluează agregatele cu greutate moleculară mai mare și polidispersitatea. În plus, poate detecta modificări ale razei hidrodinamice după mai multe săptămâni de depozitare. În studiile de stabilitate conformațională a fost adăugată și spectroscopia în infraroșu cu transformată Fourier (Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR).

Metode de laborator utilizate pentru a caracteriza puritatea

Preparatele alergenice trebuie să fie cel puțin 95% pure din punctul de vedere al conținutului proteic. Metoda de elecție pentru puritate este SDS-PAGE în combinație cu colorarea cu argint. Prin SDS-PAGE pot fi detectate proteinele contaminante cu greutate moleculară diferită. Analiza aminoacizilor oferă informații suplimentare despre puritate, deoarece contaminarea cu alte proteine poate modifica conținutul de aminoacizi individuali. Mai mult, la utilizarea MS sau SEC-HPLC, contaminarea cu proteine cu greutate moleculară diferită poate duce la vârfuri (peaks) suplimentare. Trebuie menționat și faptul că SEC-HPLC și alte metode cromatografice, precum cromatografia de imunoafinitate și cromatografia de afinitate cu ioni metalici imobilizați (immobilized metal ion affinity chromatography, IMAC), sunt utilizate ca metode de purificare a alergenelor recombinate. În afara metodelor precizate anterior pentru caracterizarea fizico-chimică a alergenelor recombinate, ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Bibliografie

merită menționate și metodele de caracterizare i munologică (3-5,8,14). Metodele de caracterizare in vitro a activității biologice sunt reprezentate de testele de inhibare a legării IgE (IgE-binding inhibition), de tip inhibiția RAST (radioallergosorbent test inhibition), inhibiția ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) și inhibiția ImmunoCAP FEIA ( fluorescence enzyme immunoassay). Alte metode in vitro de cuantificare a reactivității imune sunt reactivitatea IgE prin analiză imunoblot tip dot-blot și testul de eliberare a histaminei din bazofile cu IgE înlăturate de pe suprafață cu acid lactic (stripped basophil histamine release assay). Integritatea și echivalența epitopilor recombinați cu componentele alergenice moleculare naturale purificate pot fi determinate prin testul de activare a bazofilelor (basophil activation test, BAT) cu cuantificarea expresiei markerului de suprafață CD203c și evaluarea reactivității limfocitelor T alergen-specifice prin teste de proliferare limfocitară cu încorporare de timidină tritiată și rezultate exprimate ca index de stimulare. 1. World Health Organization. WHO Expert Committee on Biological Standardization. World Health Organ Tech Rep Ser. 2014; (987):1-266 2. The European Parliament and Council. Directive 2001/83/EC on the community code relating to medicinal products for human use. Official Journal of the European Communities 2001; L331: 67-128. 3. van Ree R, Chapman MD, Ferreira F, Vieths S, Bryan D, Cromwell O, Villalba M, Durham SR, Becker WM, Aalbers M, André C, Barber D, Cistero Bahima A, Custovic A, Didierlaurent A, Dolman C, Dorpema JW, Di Felice G, Eberhardt F, Fernandez Caldas E, Fernandez Rivas M, Fiebig H, Focke M, Fötisch K, Gadermaier G, Das RG, Gonzalez Mancebo E, Himly M, Kinaciyan T, Knulst AC, Kroon AM, Lepp U, Marco FM, Mari A, Moingeon P, Monsalve R, Neubauer A, Notten S, Ooievaar-de Heer P, Pauli G, Pini C, Purohit A, Quiralte J, Rak S, Raulf-Heimsoth M, San Miguel Moncin MM, Simpson B, Tsay A, Vailes L, Wallner M, Weber B. The CREATE project: development of certified reference materials for allergenic products and validation of methods for their quantification. Allergy. 2008; 63(3): 310-326. 4. Himly M, Nony E, Chabre H, Van Overtvelt L, Neubauer A, van Ree R, Buchheit KH, Vieths S, Moingeon P, Ferreira F. Standardization of allergen products: 1. Detailed characterization of GMP-produced recombinant Bet v 1.0101 as biological reference preparation. Allergy. 2009; 64(7): 1038-45. 5. Himly M, Nandy A, Kahlert H, Thilker M, Steiner M, Briza P, Neubauer A, Klysner S, van Ree R, Buchheit KH, Vieths S, Ferreira F. Standardization of allergen products: 2. Detailed characterization of GMP-produced recombinant Phl p 5.0109 as European Pharmacopoeia reference standard. Allergy. 2016; 71(4): 495-504. 6. WHO Position Paper. Allergen immunotherapy: therapeutic vaccines for allergic diseases. Geneva: January 27-29 1997. Allergy. 1998; 53(44 Suppl): 1-42. 7. Becker WM, Vogel L, Vieths S. Standardization of allergen extracts for immunotherapy. Where do we stand? Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2006; 6(6): 470-475. 8. Popescu FD, Vieru M, Popescu F. Standardizarea preparatelor alergenice pentru imunoterapia sublinguală în alergia la polen de graminee. Journal of Romanian Society of Allergology and Clinical Immunology. 2014; 11(3): 86-91. 9. Schmidt H, Gelhaus C, Nebendahl M, Janssen O, Petersen A. Characterization

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

În final, subliniem importanța datelor EDQM referitoare la caracterizarea și cuantificarea alergenelor recombinate și adoptarea de către Farmacopeea Europeană a metodelor și materialelor de referință pentru cuantificarea alergenelor(2-5,14,15). De exemplu, rBet v 1.0101 și rPhl p 5.0109, produse în condiții de bună practică de fabricație (good manufacturing practice, GMP), sunt extrem de asemănătoare cu omologii lor naturali din punct de vedere fizico-chimic, structural și biologic, de aceea sunt considerate adecvate ca standarde de referință pentru Farmacopeea Europeană(4,5). În afara stabilirii standardelor de referință prezentate, recent este discutată necesitatea validării metodelor ELISA de tip sandwich pentru cuantificarea alergenelor moleculare majore ca metodologie standard pentru Farmacopeea Europeană (16). n Acest articol a fost elaborat în cadrul proiectului INSPIRED (Strategii inovative pentru prevenția, diagnosticul și terapia afecțiunilor respiratorii induse de polenul de ambrozia) cod SMIS 103662. of Phleum pratense pollen extracts by 2-D DIGE and allergen immunoreactivity. Proteomics. 2010; 10(24): 4352-4362. 10. Asam C, Roulias A, Parigiani MA, Haab A, Wallner M, Wolf M, Briza P, Bohle B, Ferreira F, Hauser M. Harmonization of the genetic code effectively enhances the recombinant production of the major birch pollen allergen Bet v 1. Int Arch Allergy Immunol. 2018; 177(2): 116-122. 11. Najafi N, Hofer G, Gattinger P, Smiljkovic D, Blatt K, Selb R, Stoecklinger A, Keller W, Valent P, Niederberger V, Thalhamer J, Valenta R, Flicker S. Fusion proteins consisting of Bet v 1 and Phl p 5 form IgE-reactive aggregates with reduced allergenic activity. Sci Rep. 2019; 9(1):4006. 12. Valenta R, Kraft D. Recombinant allergens: from production and characterization to diagnosis, treatment, and prevention of allergy. Methods. 2004; 32(3): 207-8. 13. Valenta R, Karaulov A, Niederberger V, Zhernov Y, Elisyutina O, Campana R, FockeTejkl M, Curin M, Namazova-Baranova L, Wang JY, Pawankar R, Khaitov M. Allergen extracts for in vivo diagnosis and treatment of allergy: is there a future ? J Allergy Clin Immunol Pract. 2018; 6(6): 1845-1855. 14. Kaul S, Zimmer J, Dehus O, Costanzo A, Daas A, Buchheit KH, Asturias JA, Barber D, Carnés J, Chapman M, Dayan-Kenigsberg J, Döring S, Führer F, Hanschmann KM, Holzhauser T, Ledesma A, Moingeon P, Nony E, Pini C, Plunkett G, Reese G, Sandberg E, Sander I, Strecker D, Valerio C, van Ree R, Vieths S. Standardization of allergen products: 3. Validation of candidate European Pharmacopoeia standard methods for quantification of major birch allergen Bet v 1. Allergy. 2016; 71(10): 1414-24. 15. Bonini S. Regulatory aspects of allergen-specific immunotherapy: Europe sets the scene for a global approach. World Allergy Organ J. 2012; 5(10): 120-123. 16. Kaul S, Zimmer J, Dehus O, Constanzo A, Daas A, Buchheit KH, Asturias J, Arilla MC, Barber D, Bertocchi A, Brunetto B, Carnes JA, Chapman M, Chaudemanche G, Dayan-Kenigsberg J, Döring S, Führer F, Gallego MT, Iacovacci P, Hanschmann KM, Holzhauser T, Hrabina M, Ledesma A, Moingeon P, Nony E, Pini C, Plunkett G, Raulf M, Reese G, Sandberg E, Sander I, Smith B, Strecker D, Valerio C, van Ree R, Weber B, Vieths S. Validation of ELISA methods for quantification of the major birch allergen Bet v 1 (BSP090). Pharmeur Bio Sci Notes. 2017; 2017: 69-87.

lucrări originale și proiecte

Alergenele recombinate – metode de producere și utilitatea în diagnosticul molecular și în imunoterapia alergenică Recombinant Allergens – Production Methods and Use in Molecular Diagnosis and Allergen Immunotherapy Maria-Roxana Buzan1,2, Manuela Grijincu1,2, Lauriana-Eunice Zbîrcea1,2, Laura Haidar1,2, Carmen Panaitescu1,2, Kuan-Wei Chen2 1. UMF „Victor Babeș”, Timișoara, Departmentul III Științe Funcționale, Disciplina Fiziologie 2. Centrul de terapii genice și celulare în tratamentul cancerului OncoGen – SCJUPB Timișoara Autor corespondent: Maria-Roxana Buzan, e-mail: buzan.roxana@yahoo.com

ABSTRACT

REZUMAT

Although allergen extracts show some disadvantages, they are widely used both for in vivo diagnosis and for allergen immunotherapy. One way to overcome allergen extracts’ limitations is to use recombinant allergens. Selection of an appropriate expression system is dependent on the characteristics and intended application of the recombinant protein. The prokaryotic expression system is suitable for allergens that do not require post-translational modifications, however, there are allergens that need to be expressed in eukaryotic cells in order to acquire their biological activity. The use of these recombinant proteins ensures an increased specificity and sensitivity of the diagnosis and safer and more effective immunotherapy. Keywords: recombinant allergens, prokaryotic expression system, eukaryotic expression system, molecular diagnosis, molecular allergen immunotherapy

Extractele alergenice sunt folosite pe scară largă atât în diagnosticul in vivo, cât și în terapia bolilor alergice, deși prezintă multiple dezavantaje. O soluție pentru a evita limitările extractelor este utilizarea de alergene recombinate. Selecția unui sistem de expresie proteică depinde de caracteristicile și aplicațiile proteinei recombinate. Alergenele care nu necesită modificări posttranslaționale pot fi obținute într-un sistem de expresie de tip procariot, dar există și alergene care trebuie exprimate în celule eucariote pentru a-și putea dobândi activitatea biologică. Utilizarea clinică a acestor proteine recombinate duce la creșterea specificității și sensibilității diagnosticului și asigură o imunoterapie mai sigură și mai eficientă. Cuvinte-cheie: alergene recombinate, sistem de expresie proteică de tip procariot, sistem de expresie proteică de tip eucariot, diagnostic molecular, imunoterapia alergenică moleculară

Introducere

Primit: 19.02.2020 Acceptat: 28.02.2020

În prezent diagnosticul in vivo al alergiilor și imunoterapia alergenică se bazează în mare pe extracte alergenice obținute din surse naturale. Deși calitatea acestor extracte a crescut în ultimele decenii prin standardizarea procedurii de obținere, faptul că provin din surse naturale le face foarte eterogene, existând variații în ceea ce privește compoziția și cantitatea de molecule alergenice(1,2). De asemenea, extractele pot fi contaminate cu alergene provenite din alte surse sau pot conține molecule bioactive care pot afecta stabilitatea acestora (enzime proteolitice care pot degrada alergenele)(3,4). Tehnologiile de obținere a alergenelor recombinate pot fi folosite pentru a înlătura neajunsurile extractelor alergenice. În ultimele decenii a fost produsă o mare varietate de alergene recombinate similare ca structură, funcție și răspuns imun cu omoloagele lor naturale, provenite de la plante, mucegaiuri, acarieni, insecte și mamifere, folosind atât sisteme de expresie de tip procariot, cât și de tip eucariot(5,6). Utilizarea clinică a acestor produse ajută la

creșterea specificității și sensibilității diagnosticului(7) și asigură o imunoterapie mai sigură și mai eficientă(8). Primul pas în producerea alergenelor recombinate îl reprezintă obținerea secvenței de nucleotide care codifică proteina de interes. Folosind ARN mesager (ARNm) izolat din sursa alergenică, se sintetizează prin reacția de polimerizare în lanț în timp real (RT-PCR)(9,10) ADN complementar (ADNc), care mai apoi este clonat într-un vector specific sistemului de expresie care urmează să fie folosit. În funcție de complexitatea structurală și funcțională a alergenelor, se pot folosi două sisteme de expresie, de tip bacterian și de tip eucariot. Sistemul de tip bacterian este utilizat cu succes și costuri reduse în cazul proteinelor cu structură simplă, care nu necesită modificări posttranslaționale. Alergenele mai complexe din punct de vedere structural, cu glicozilări și punți disulfidice sunt produse în sisteme de expresie de tip eucariot. Un avantaj al acestui sistem este purificarea simplă, redusă la o singură procedură, cromatografia de afinitate(1). ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Tabelul 1

Caracteristicile diferitelor sisteme de expresie proteică. Prezentare educațională cu modificare după Fernandez et al. (1999)(12)

Caracteristici Creștere celulară

E. coli

Drojdii

Celule de insecte

Celule de mamifere

rapidă (30 min)

rapidă (90 min)

lentă (18-24 h)

lentă (24 h)

Complexitatea mediului de creștere

minimă

complexă

Costul mediului de creștere

scăzut

ridicat

Nivelul de expresie

ridicat

scăzut - ridicat

scăzut - moderat

secreție în spațiul periplasmic

secreție în mediu

Expresie extracelulară

Modificări post-translaționale necesită re-împachetare

pot necesita reîmpachetare

împachetare corespunzătoare

Glicozilare N-linkată

fără

bogată în manoză

simplă, fără acid sialic

complexă

Glicozilare O-linkată

Fosforilare

Acetilare

Acilare

Gama-carboxilare

Împachetarea proteinelor

Figura 1. Obținerea alergenelor recombinate în celulele de E. coli. Primul pas este reprezentat de clonarea secvenței de nucleotide în vectorul bacterian (plasmid), urmată de transformarea celulelor de E. coli competente. Acestea vor fi cultivate în mediu de cultură urmând să se inducă sinteza proteică. Vor urma pașii de izolare, purificare și analiză a purității alergenul obținut.

Acest articol analizează și compară diferite sisteme de expresie folosite pentru producerea alergenelor recombinate (tabelul 1), precum și utilizarea acestora în vederea îmbunătățirii diagnosticului și terapiei în bolile alergice.

Sistemul de expresie proteică de tip bacterian

Escherichia coli este una dintre cele mai utilizate gazde bacteriene pentru producerea cu randament ridicat de proteine recombinate. E. coli este un sistem convenabil și versatil de obținere a unei cantități mari de alergen recombinat, datorită ratei rapide de creștere într-un mediu de cultură ieftin și ușor de preparat (figura 1). Cu toate acestea, este un sistem procariot căruia îi lipsește mecanismul celular responsabil de procesele și modificările posttranslaționale, dezavantajul major fiind reprezentat de eșecul unor proteine recombinate de a dobândi structura secundară nativă, activă biologic. Adesea, supraproducția de ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

proteine străine în citoplasma E. coli determină o agregare a acestora, formând incluziuni celulare insolubile, care necesită solubilizare cu agenți chatropici puternici, urmată de o reîmpachetare graduală pentru a deveni active funcțional(13). Un astfel de exemplu îl reprezintă alergenul major din chiparos, Cup a 1.02, care a fost exprimat în E. coli și a necesitat solubilizare și reîmpachetare pentru a redobândi forma reactivă IgE a alergenului(13). Strategiile pentru creșterea calității și randamentului de producere a proteinelor recombinate în celule bacteriene s-au concentrat pe îmbunătățiri genetice, precum construirea unor vectori de expresie mai buni și prin eliminarea genelor codificatoare de proteaze din tulpinile bacteriene. De asemenea, au fost create tulpini bacteriene capabile să faciliteze formarea punților disulfidice. Alergenul Ara h 2, din alune, a fost produs prin expresia într-o tulpină de E. coli modificată, Origami (DE3), care conține în citoplasmă elemente oxidative care permit formarea punților disulfidice(14).

lucrări originale și proiecte Figura 2. Expresia alergenelor recombinate în celule de insecte. Etapele expresiei sunt scrise cu litere îngroșate, iar produșii obținuți după fiecare etapă, cu litere normale. Prezentare educațională cu modificare după https://biotop.boku.ac.at/ Projects/2015/Grabherr2015c. html(25)

Sistemul de expresie procariot continuă să fie prima alegere când vine vorba despre producerea de alergene recombinate, numeroase alergene fiind produse în acest sistem (de exemplu, Ara h 1(15), Bet v 1(16), Fel d 1(17), Cor a 1(18)).

Sistemul de expresie proteică de tip eucariot

Avantajul major al sistemelor de expresie de tip eucariot este reprezentat de capacitatea de a realiza modificări posttranslaționale, precum formarea legăturilor disulfidice, adăugarea de lipide și carbohidrați. Cele mai utilizate sisteme de expresie de tip eucariot sunt drojdiile, celulele de plante, celulele de insecte și celulele de mamifere. Având o rată de înmulțire ridicată și necesități minime, sistemul de expresie în drojdii s-a dovedit util pentru producerea de alergene recombinate. Popularitatea crescută a acestui sistem se datorează procesului simplu și a randamentului ridicat de obținere a proteinelor, precum și capacității de a efectua modificări posttranslați-

onale (formarea de legături disulfidice și glicozilări). Organismul cel mai utilizat este Pichia pastoris, primele alergene exprimate fiind Cyn d 1(19), Alt a 1(20), Mus m 1(21) și Bla g 4 (22). Principalul dezavantaj al sistemului de expresie în drojdii este hiperglicozilarea proteinelor (23), modelele de glicozilare N- sau O-linkată putând fi diferite de cele ale proteinei native(24). Sistemul de expresie în celule de insecte, asociat cu un vector baculovirus, devine tot mai des utilizat în domeniul producerii de alergene recombinate. Acest sistem se bazează pe capacitatea baculovirusului de a infecta celulele de insecte, având o specificitate ridicată în ceea ce privește tipul de gazdă infectată. Procesul de obținere a proteinelor recombinate presupune clonarea genei de interes într-un vector bacterian (plasmid helper), cu care sunt mai apoi transformate celulele de E. coli competente care conțin bacmidul (plasmid care conține baculovirusul fără gena de interes). Secvența de nucleotide care codifică alergenul de interes este apoi inserată în bacmid prin transpoziție, rezultând un bacANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Figura 3. Strategiile posibile pentru imunoterapiile alergenice moleculare. Pe baza identificării secvenței de nucleotide care codifică alergenul de interes se poate determina secvența de aminoacizi, fiind astfel posibilă construirea alergenelor recombinate (echivalente celor naturale de tip sălbatic) și a unor derivate cu activitate alergenică redusă precum hipoalergenele recombinate și peptidele sintetice derivate din alergenele de interes. Prezentare educațională cu modificare după Zhernov et al. (2019)(43)

mid recombinat care va fi utilizat în transfecția celulelor de insecte (figura 2) care vor asambla baculovirusul, continuându-se infecția. Alergenul recombinat este secretat în mediul de cultură de unde urmează a fi izolat și purificat după 36-96 de ore de la infecție. Baculovirusul distruge celulele de insecte, astfel că nu se poate realiza o producție continuă, neîntreruptă. Printre alergenele obținute folosind sistemul cu baculovirus se numără: Api m 2(26), Fel d 1(27), Mal f 1(28). Toate aceste alergene recombinate prezintă o capacitate de legare a IgE și activitate biologică similare cu cele ale proteinelor native. Deoarece necesită echipamente sofisticate și presupune costuri ridicate de producție, cu randament scăzut, sistemul de expresie în celule de mamifere este foarte rar folosit (Per a 1(29)). Pentru expresie se mai pot utiliza și plantele, proteinele putându-se acumula în cantități ridicate în diferite organe ale acestora (s-au obținut Bet v 1 recombinat imunoreactiv și două alergene din latex – Hev b 1 și Hev b 3 –, folosind plante de tutun(30)). Indiferent de sistemul de expresie proteică folosit, alergenele recombinate obținute urmează numeroși pași de purificare cromatografică și, fiind apoi analizate din punctul de vedere al identității, calității, cantității și stabilității, prin metode precum electroforeza, spectrometria de masă, dicroism circular. De asemenea, vor fi comparate cu omoloagele naturale în ceea ce privește activitatea biologică (reactivitate IgE, teste de activare a bazofilelor). În cadrul proiectului INSPIRED (Strategii inovative pentru prevenția, diagnosticul și terapia afecțiunilor respiratorii induse de polenul de ambrozie), echipa de cercetători de la centrul OncoGen, Timișoara, a reușit să producă alergene recombinate din polenul de Ambrosia artemisiifolia. Pentru alergenele mai simple din punct de vedere conformațional (Amb a 8, Amb a 9, Amb a 10) s-a folosit sistemul de expresie de tip procariot, iar pentru cele mai complexe (Amb a 1, Amb a 4, Amb a 6), sistemul de expresie în celule de insecte. De asemenea, pentru ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

câteva alergene (Amb a 3, Amb a 5, Amb a 11, Amb a 12) s-a mers în paralel cu ambele sisteme, pentru a stabili care este cel mai potrivit pentru obținerea unei reactivități IgE comparabile cu cea a omologului natural.

Utilizarea alergenelor recombinate în diagnosticul alergiilor

Deși testele diagnostice care conțin alergene recombinate se utilizează tot mai mult, cele bazate pe extracte naturale continuă să fie utilizate pe scară largă (31). Compoziția unui extract alergenic influențează puternic rezultatele oricărui test bazat pe acel extract. Din extractele disponibile comercial pot să lipsească alergene importante sau compoziția lor alergenică poate varia considerabil de la un lot la altul, ceea ce poate da rezultate fals negative în cazul anumitor pacienți. Aceste variații de concentrație și conținut alergenic au fost demonstrate la soluțiile de testare cutanată prick (skin prick test, SPT) pentru extractul de acarian Dermatophagoides pteronyssinus(32), mucegai Alternaria alternata(33) și alun(34), precum și pentru produsele de imunoterapie alergenică sublinguală (SLIT) pentru acarian(35) și polen de mesteacăn(36). Alergenele recombinate bine caracterizate pot fi folosite ca marker în diagnostic pentru a realiza profilul de sensibilizare al pacienților alergici și pentru a selecta strategiile terapeutice potrivite. Reactivitatea IgE la alergenele cu o reacție încrucișată extrem de ridicată permite identificarea pacienților cu sensibilizare largă sau care sunt expuși riscului de a dezvolta simptome alergice la mai multe surse. Pe de altă parte, alergenele specifice anumitor surse alergenice pot fi folosite pentru a identifica pacienții cu sensibilizare reală (37). Pentru îmbunătățirea calității unor extracte alergenice din latex (38), alun(39) și venin de viespe(40), utilizate în diagnostic, s-a folosit procesul de spiking (adică adăugarea de alergene recombinate). Mai mult decât atât, alergenele recombinate reprezintă o alternativă la alergenele naturale pentru diagnosticul alergiilor, când alergenul natural poate fi izolat doar în cantități mici din sursa inițială (41).

lucrări originale și proiecte Tabelul 2

Mecanismele, avantajele și dezavantajele diferitelor molecule recombinate utilizate în AIT. Prezentare educațională cu modificare după Zhernov et al. (2019)(43)

Molecule

Mecanism

Avantaje

Alergene recombinate de tip sălbatic

Epitopii pentru LB și LT sunt intacți, induc producția de IgG blocant și țintesc LT

Imunogenicitate bună și inducerea de IgG blocant

Peptide sintetice scurte

Peptide derivate din epitopii alergenelor pentru LT, induc toleranță

Fără reacții alergice imediate deoarece nu au reactivitate IgE

Deoarece peptidele sunt foarte scurte nu se induce producția de IgG blocant

AllervaxCAT (1996-1999) – două peptide cu 27 de aminiacizi derivate din Fel d 1 – SCIT46

Posibila activare a LT reglatoare

Posibile reacții cutanate tardive, deoarece se activează LT

ToleroMune Ragweed (2009 2016) peptide scurte din Amb a 1 – intradermic – Faza II

Imunogenicitate bună și inducerea de IgG blocant

Reacții cutanate tardive și simptome pulmonare din cauza epitopilor pentru LT

AllerT (2012-2018) – peptide lungi suprapuse derivate din Bet v 1 – SCIT – Faza IIb47

Peptide lungi suprapuse

Strategii bazate pe acizi nucleici

Hipoalergene recombinate (fragmente, mozaicuri)

Peptide lungi care conțin toți epitopii lineari ai unui alergen, induc toleranță și IgG blocant

Dezavantaje

Posibilă inducere de toleranță

Fără reacții imediate, pentru că nu mai există structură tridimensională

Exemple

Posibile reacții alergice rBet v 1 (2002-2008) – imediate, epitopii IgE fiind compararea rBet v 1, nBet v 1 intacți și extract de mesteacăn pentru SCIT – faza II completă44 Reacții cutanate tardive datorită epitopilor rPhl p 1, rPhl p 2, rPhl p 5a+b, alergen-specifici pentru LT rPhl p 6 (2002-2014) – amestec de alergene recombinate pentru SCIT – faza III completă45

Aplicabile doar pentru sursele simple de alergene

Vaccinarea cu ADN sau ARN Reducerea riscului de care codifică un alergen efecte adverse sistemice induce un răspuns imun către Potențial pentru abordări limfocitele Th1 terapeutice

ADN se poate integra în genom

Reactivitate IgE redusă datorită structurii secundare modificate, dar cu epitopi LT și LB pentru producerea de IgG și inducerea de toleranță

Reacții cutanate tardive din cauza epitopilor pentru LT

Imunogenicitate bună și inducerea de IgG blocant Posibilă inducerea de toleranță

Studii pe modele animale, puține studii clinice umane

CryJ2-DNA-LAMP (2012 2015) – plasmid cu ADN care codifică alergenul Cry j 2 și poteina membranară asociată lizozomului (LAMP) – Faza I, IB și IC48 Bet v 1-FV (2002-2014) – hipoalergen recombiant Bet v 1 cu structură secundară modificată – SCIT – Faza III completă 49

Reducerea reacțiilor de fază imediată deoarece nu au reactivitate IgE Hipoalergene recombinate de generația a doua (peptide fuzionate cu proteine carrier)

Epitopii LB sunt fuzionați cu proteine carrier virale pentru inducerea de IgG blocant pentru alergen și pentru proteina virală

Imunogenicitate bună și inducerea de IgG blocant

—

BM 32 (2012-2017) – vaccin hipoalergenic compus din patru alergene majore din polenul de graminee și un carrier (PreS) – SCIT Faza IIb completă50

Protecție atât pentru alergie cât și pentru virusul utilizat drept carrier Nu induce reacții IgE

Anticorpi alergen-specifici recombinați

Imunoterapie pasivă cu Eficacitate bună cu efecte anticorpi IgG alergenadverse minime specifici de mare afinitate care sunt în competiție cu IgE

Aplicabil doar pentru sursele cu alergene majore dominante Costisitor

Anti-Fel d 1 IgG4 (2013-2017) – anticorpi umani IgG4 specifici pentru Fel d 1 care blochează legarea acestui alergen de IgE – Doză SC unica - Faza 1b51

Efecte de scurtă durată

Utilizarea alergenelor recombinate în imunoterapia alergenică moleculară

Izolarea primei secvențe codificatoare a unui alergen a deschis drumul dezvoltării diferitelor tipuri de imunoterapii alergenice (AIT) moleculare(42) (figura 3). Printre

acestea se numără alergenele recombinate de tip sălbatic (prezintă toate proprietățile alergenelor naturale); peptidele sintetice care conțin epitopi alergen-specifici pentru limfocitele T (LT) (fără reactivitate IgE); acizi nucleici care codifică alergene; hipoalergene recombinate și sinANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

tetice, cu alergenicitate scăzută și capacitate redusă de legare IgE, dar cu epitopi alergen-specifici pentru LT(43). Imunoterapiile personalizate bazate pe profilul de sensibilizare al fiecărui pacient sunt posibile, în teorie. Cu toate acestea, conform ghidurilor actuale, trebuie dovedită siguranța și eficiența clinică pentru fiecare moleculă separat și pentru posibilele combinații, ceea ce face această abordare imposibilă. De aceea imunoterapiile moleculare ar trebui să conțină un panel de alergene relevante clinic provenite de la sursa de interes. Avantajele și dezavantajele diferitelor molecule recombinate folosite în AIT sunt prezentate în tabelul 2.

Concluzii

Bibliografie

Pentru a determina sistemul optim de expresie a unui anumit alergen trebuie să se țină cont de resursele disponibile, timpul necesar, calificarea personalului din laborator și natura alergenului. Există o experiență vastă în ceea ce privește sistemul de expresie procariot, iar kiturile disponibile pe piață sunt mai variate, mai rapide

1. 1. Chapman MD, Smith AM, Vailes LD, Arruda LK, Dhanaraj V, Pomés A. Recombinant allergens for diagnosis and therapy of allergic disease. J Allergy Clin Immunol. 2000;106(3):409-418. 2. 2. Valenta R, Kraft D. Recombinant allergen molecules: tools to study effector cell activation. Immunol Rev. 2001;179(1):119-127. 3. 3. van der Veen MJ, Mulderb M, Witteman AM, et al. False-positive skin prick test responses to commercially available dog dander extracts caused by contamination with house dust mite (Dermatophagoides pteronyssinus) allergens. J Allergy Clin Immunol. 1996;98(6):1028-1034. 4. 4. Nelson HS, Iklé D, Buchmeier A. Studies of allergen extract stability: the effects of dilution and mixing. J Allergy Clin Immunol. 1996;98(2):382-388. 5. 5. Scheiner O, Kraft D. Basic and practical aspects of recombinant allergens. Allergy. 1995;50(5):384-391. 6. 6. Schmid-Grendelmeier P, Crameri R. Recombinant allergens for skin testing. Int Arch Allergy Immunol. 2001;125(2):96-111. 7. 7. Bousquet J. In vivo and in vitro use of recombinant allergens. Allergy Clin Immunol News. 1994:54-59. 8. 8. Bousquet J, Lockey R, Malling HJ, et al. SPECIAL FEATURES-Allergen Immunotherapy: Therapeutic Vaccines for Allergic Diseases. Ann Allergy Asthma Immunol. 1998;81(5):401-405. 9. 9. Schmidt M, Zargari A, Holt P, et al. The complete cDNA sequence and expression of the first major allergenic protein of Malassezia furfur, Mal f 1. Eur J Biochem. 1997;246(1):181-185. 10. 10. Schmidt M, Walker RB, Hoffman DR, McConnell TJ. Nucleotide sequence of cDNA encoding the fire ant venom protein Sol i II. FEBS Lett. 1993;319(1-2):138-140. 11. 11. Schmidt M, Hoffman DR. Expression systems for production of recombinant allergens. Int Arch Allergy Immunol. 2002;128(4):264-270. 12. 12. Fernandez JM, Hoeffler JP. Gene Expression Systems: Using Nature for the Art of Expression. Elsevier; 1998. 13. 13. Rea G, Iacovacci P, Ferrante P, et al. Refolding of the Cupressus arizonica major pollen allergen Cup a1.02 overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 2004;37(2):419-425. doi:https://doi.org/10.1016/j.pep.2004.06.034 14. 14. Lehmann K, Hoffmann S, Neudecker P, Suhr M, Becker W-M, Rösch P. Highyield expression in Escherichia coli, purification, and characterization of properly folded major peanut allergen Ara h 2. Protein Expr Purif. 2003;31(2):250-259. 15. 15. Kleber-Janke T, Becker W-M. Use of modified BL21 (DE3) Escherichia coli cells for high-level expression of recombinant peanut allergens affected by poor codon usage. Protein Expr Purif. 2000;19(3):419-424. 16. 16. Swoboda I, Jilek A, Ferreira F, et al. Isoforms of Bet v 1, the major birch pollen allergen, analyzed by liquid chromatography, mass spectrometry, and cDNA cloning. J Biol Chem. 1995;270(6):2607-2613. 17. 17. van Ree R, van Leeuwen WA, Bulder I, Bond J, Aalberse RC. Purified natural and recombinant Fel d 1 and cat albumin in in vitro diagnostics for cat allergy. J Allergy Clin Immunol. 1999;104(6):1223-1230. 18. 18. Schenk S, Hoffmann‐Sommergruber K, Breiteneder H, et al. Four recombinant isoforms of Cor a 1, the major allergen of hazel pollen, show different reactivities with allergen‐specific T‐lymphocyte clones. Eur J Biochem. 1994;224(2):717-722. 19. 19. Smith PM, Suphioglu C, Griffith IJ, Theriault K, Knox RB, Singh MB. Cloning and expression in yeast Pichia pastoris of a biologically active form of Cyn d 1, the major allergen of Bermuda grass pollen. J Allergy Clin Immunol. 1996;98(2):331-343. 20. 20. De Vouge MW, Thaker AJ, Curran IH, et al. Isolation and expression of a cDNA clone encoding an Alternaria alternata Alt a 1 subunit. Int Arch Allergy Immunol. 1996;111(4):385-395. doi:10.1159/000237397 21. 21. Ferrari E, Lodi T, Sorbi RT, Tirindelli R, Cavaggioni A, Spisni A. Expression of a lipocalin in Pichia pastoris: secretion, purification and binding activity of a recombinant mouse major urinary protein. FEBS Lett. 1997;401(1):73-77. 22. 22. Vailes LD, Kinter MT, Arruda LK, Chapman MD. High-level expression of cockroach allergen, Bla g 4, in Pichia pastoris. J Allergy Clin Immunol. 1998;101(2):274-

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

și mai puțin costisitoare decât cele pentru sistemele eucariote. Cu toate acestea, prezintă dezavantajul de a nu putea produce modificările posttranslaționale necesare pentru proteinele complexe structural și funcțional. Mai mult, aproape toate alergenele provin din surse eucariote și este de preferat, în cazul în care activitatea biologică a alergenului recombinat depinde de conformația și/sau modificările posttranslaționale, să se utilizeze sistemele eucariote de expresie proteică. Tehnologia proteinelor recombinate permite atât producția nelimitată a alergenului de interes, cât și posibilitatea de a modifica structura și proprietățile intrinseci ale acestuia, devenind o alternativă din ce în ce mai atractivă pentru diagnosticul și imunoterapia bolilor alergice. n Acest articol a fost elaborat în cadrul proiectului INSPIRED (Strategii inovative pentru prevenția, diagnosticul și terapia afecțiunilor respiratorii induse de polenul de ambrozia) cod SMIS 103662.

280. 23. 23. Bobrowicz P, Davidson RC, Li H, et al. Engineering of an artificial glycosylation pathway blocked in core oligosaccharide assembly in the yeast Pichia pastoris: production of complex humanized glycoproteins with terminal galactose. Glycobiology. 2004;14(9):757-766. 24. 24. Cereghino JL, Cregg JM. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. FEMS Microbiol Rev. 2000;24(1):45-66. 25. 25. https://biotop.boku.ac.at/Projects/2015/Grabherr2015c.html. 26. 26. Soldatova LN, Crameri R, Gmachl M, et al. Superior biologic activity of the recombinant bee venom allergen hyaluronidase expressed in baculovirusinfected insect cells as compared with Escherichia coli. J Allergy Clin Immunol. 1998;101(5):691-698. 27. 27. Guyre P, Goldstein J, Wu Z, Sun A. Recombinant cat allergen, Fel dI, expressed in baculovirus for diagnosis and treatment of cat allergy. November 2002. 28. 28. Zargari A, Schmidt M, Lundberg M, Scheynius A, Whitley P. Immunologic characterization of natural and recombinant Mal f 1 yeast allergen. J Allergy Clin Immunol. 1999;103(5):877-884. 29. 29. Wu CH, Lee MF, Wang NM. Expression of the American cockroach Per a 1 allergen in mammalian cells. Allergy. 2000;55(12):1179-1183. 30. 30. Breiteneder H, Krebitz M, Wiedermann U, et al. Rapid production of recombinant allergens in Nicotiana benthamiana and their impact on diagnosis and therapy. Int Arch Allergy Immunol. 2001;124(1-3):48-50. 31. 31. Tscheppe A, Breiteneder H. Recombinant Allergens in Structural Biology, Diagnosis, and Immunotherapy. Int Arch Allergy Immunol. 2017;172(4):187-202. doi:10.1159/000464104 32. 32. Casset A, Mari A, Purohit A, et al. Varying allergen composition and content affects the in vivo allergenic activity of commercial Dermatophagoides pteronyssinus extracts. Int Arch Allergy Immunol. 2012;159(3):253-262. 33. 33. Kespohl S, Maryska S, Zahradnik E, Sander I, Brüning T, Raulf‐Heimsoth M. Biochemical and immunological analysis of mould skin prick test solution: current status of standardization. Clin Exp Allergy. 2013;43(11):1286-1296. 34. 34. Akkerdaas JH, Wensing M, Knulst AC, Aalberse RC, Hefle SL. In vitro and in vivo characterization of hazelnut skin prick test extracts. Arb aus dem Paul-EhrlichInstitut (Bundesamt fur Sera und Impfstoffe) zu Frankfurt aM. 2003;(94):87-95. 35. 35. van Ree R. Indoor allergens: relevance of major allergen measurements and standardization. J Allergy Clin Immunol. 2007;119(2):270-277. 36. 36. Moreno Benítez F, Espinazo Romeu M, Letrán Camacho A, Mas S, García‐Cózar FJ, Tabar AI. Variation in allergen content in sublingual allergen immunotherapy with house dust mites. Allergy. 2015;70(11):1413-1420. 37. 37. Kazemi-Shirazi L, Niederberger V, Linhart B, Lidholm J, Kraft D, Valenta R. Recombinant Marker Allergens: Diagnostic Gatekeepers for the Treatment of Allergy. Int Arch Allergy Immunol. 2002;127(4):259-268. doi:10.1159/000057742 38. 38. Lundberg M, Chen Z, Rihs H, Wrangsjö K. Recombinant spiked allergen extract. Allergy. 2001;56(8):794-795. 39. 39. Andersson K, Ballmer‐Weber BK, Cistero‐Bahima A, et al. Enhancement of hazelnut extract for IgE testing by recombinant allergen spiking. Allergy. 2007;62(8):897-904. 40. 40. Yoshida N, Hirata H, Watanabe M, et al. Improved sensitivity to venom speciﬁc-immunoglobulin E by spiking with the allergen component in Japanese patients suspected of Hymenoptera venom allergy. Allergol Int. 2015;64(3):248-252. 41. 41. Mas S, Boissy P, Monsalve RI, et al. A recombinant Sal k 1 isoform as an alternative to the polymorphic allergen from Salsola kali pollen for allergy diagnosis. Int Arch Allergy Immunol. 2015;167(2):83-93. 42. 42. Valenta R, Ferreira F, Focke-Tejkl M, et al. From allergen genes to allergy vaccines. Annu Rev Immunol. 2009;28:211-241. 43. 43. Zhernov Y, Curin M, Khaitov M, Karaulov A, Valenta R. Recombinant allergens for immunotherapy: state of the art. Curr Opin Allergy Clin Immunol. 2019;19(4):402-414.

educaţie medicală continuă

Diagnosticul molecular în bolile alergice respiratorii induse de polenuri Molecular Diagnostics in Allergic Respiratory Diseases Induced by Pollens Maria-Roxana Buzan1,2, Monica Cotarcă1,2, Lauriana-Eunice Zbîrcea1,2, Paul Tămaș1,2, Laura Haidar1,2, Michael-Bogdan Mărgineanu2, Kuan-Wei Chen2, Carmen Panaitescu1,2 1. UMF „Victor Babeș” Timișoara, Departamentul III Științe Funcționale, Disciplina Fiziologie 2. Centrul de terapii genice și celulare în tratamentul cancerului OncoGen – SCJUPB Timișoara Autor corespondent: Carmen Panaitescu, e-mail: cbunu@umft.ro

ABSTRACT

REZUMAT

Allergology undergoes a transition towards molecular-based diagnosis using single molecular allergen components, which becomes integrated in clinical practice globally, complementing or replacing in some cases the diagnosis based on allergen extracts. This article showcases the main seasonal aeroallergens (tree pollen, grass pollen, weeds pollen) and their molecular allergenic components, that can be individually assessed by in vitro methods for molecular diagnosis. In addition, a series of advantages conferred by this approach are discussed, including: increased analytical sensitivity, improved risk assessment of the sensitizing allergen, distinction between primary and crossreactive sensitization and selection of the appropriate allergen immunotherapy. Keywords: seasonal allergens, molecular diagnostics, specific IgE, cross-reactivity

Alergologia se află într-o perioadă de tranziție în care diagnosticul bazat pe componente alergenice moleculare este integrat tot mai mult în practica clinică la nivel global, completând sau înlocuind în unele cazuri pe cel bazat pe extracte din surse alergenice. În acest articol sunt prezentate principalele aeroalergene sezoniere (polenul de arbori, de graminee și de buruieni) și componentele moleculare alergenice care pot fi evaluate individual prin metode in vitro pentru diagnostic molecular. De asemenea, sunt discutate o serie de avantaje conferite de această abordare, cu referire la: sensibilitatea analitică crescută, evaluarea riscului indus de alergenul sensibilizant, diferențierea dintre sensibilizarea primară și cea prin reacție încrucișată și selectarea imunoterapiei alergenice adecvate. Cuvinte-cheie: alergene sezoniere, diagnostic molecular, IgE specific, reactivitate încrucișată

Introducere – de ce molecular?

Primit: 13.02.2020 Acceptat: 21.02.2020

Datorită progreselor în biochimie și în biologia moleculară, în ultimii 30 de ani s-au identificat cele mai importante alergene care induc reacții imunologice mediate prin imunoglobuline E (IgE) specifice. A apărut astfel o dimensiune moleculară a diagnosticului și terapiei în bolile alergice, care completează și/sau înlocuiește metodele anterioare. Alergologia moleculară reprezintă o abordare inovatoare a diagnosticului în alergiile respiratorii, prin care componente alergenice moleculare se utilizează pentru detectarea IgE specifice. Aceste componente sunt fie proteine înalt purificate, care au fost izolate din surse alergenice naturale, fie produse ca proteine recombinate prin tehnici de inginerie moleculară. Diagnosticul molecular se bazează pe evaluarea răspunsului imun IgE-specific la aceste componente alergenice, care pot fi analizate individual (singleplex) sau în diferite combinații (multiplex). Metodele de diagnostic molecular pot identifica precis cauzele alergiilor, facilitând astfel evaluarea riscurilor și deciziile terapeutice.

Utilitatea clinică

Prin diagnosticul molecular se evaluează răspunsul imun mediat IgE al pacientului față de anumite molecule alergenice, ceea ce oferă informații suplimentare despre procesul alergic. Diagnosticul molecular indică prezența unui răspuns imun specific față de alergene individuale, oferind o rezoluție mai fină comparativ cu testarea bazată pe extracte din surse alergenice. Totodată, diagnosticul molecular permite: evaluarea riscului indus de sensibilizare, util în special în alergiile alimentare, dar și în alergiile induse de aeroalergene (eventual ingerate sau absorbite la nivel cutanat); evidențierea reactivității încrucișate între surse alergenice din diferite specii și prin aceasta permite elucidarea unor manifestări clinice aparent neînrudite (de exemplu, sindroame polen-alimente, în care un pacient sensibilizat la un aeroalergen are și manifestări digestive la ingestia unor alimente); selectarea imunoterapiei alergenice (AIT – allergen immunotherapy) adecvate, în mod individualizat, utilă în special în cazul aeroalergenelor cu potențial de reactivitate încrucișată (polenul de arbori, graminee, buruieni). ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Figura 1. Alergene care pot da reactivitate încrucișată. CCD: Determinanți carbohidrați cross-reactivi; nsLTP: Proteine de transfer lipidic nonspecific; TLP: Proteină taumatină-like. Prezentare educațională cu modificare după Luengo și Cardona (2014)(6)

Reactivitatea încrucișată explicată molecular

Reactivitatea încrucișată (cross-reactivitatea) este definită la nivel molecular ca procesul prin care proteine (sau domenii proteice) din alergenul sensibilizant și proteine omoloage din alte surse de alergene se leagă de anticorpii IgE specifici față de alergenul sensibilizant(1). Pentru a induce reactivitate încrucișată, proteinele omoloage trebuie să aibă un grad înalt de identitate de structură primară (în general de peste 70%)(2,3) și terțiară, precum și epitopi comuni recunoscuți de anticorpii IgE(1). Din punct de vedere clinic, un pacient care a dezvoltat reacție alergică la un anumit alergen nu devine neapărat alergic la toate moleculele cu potențial de reactivitate încrucișată(4). Sursele alergenice conțin mai multe componente proteice care pot să inducă reacții IgE specifice. Fiecare pacient este sensibilizat la un set diferit de componente proteice, iar în multe cazuri nu se cunoaște relevanța clinică a componentelor care determină reactivitatea încrucișată(1,4). Prezența IgE specifice pentru un alergen care determină reactivitate încrucișată nu implică întotdeauna simptome clinice. Simptomele clinice sunt induse de mediatorii eliberați de mastocite și bazofile în funcție de valența (numărul de epitopi care determină reacții încrucișate) și afinitatea alergenului față de IgE fixate pe receptorii de mare afinitate (FcεRI)(4,5). Fenomenul de cross-reactivitate se datorează unor epitopi de pe alergene diferite cu înaltă omologie structurală. Deoarece un alergen prezintă mai mulți epitopi față de care un pacient poate dezvolta sau nu răspuns IgE specific, din punct de vedere molecular rezultă mai multe patternuri de sensibilizare. Astfel, pacienți sensibilizați la același alergen pot reacționa la seturi diferite de alergene cross-reactive. Informațiile privind reactivitatea încrucișată sunt utile în diagnosticul alergologic de precizie, în evaluarea siguranței și a eficacității imunoterapiei alergenice și în evaluarea riscurilor față de alimentele introduse în dietă(3). ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

Spre deosebire de reactivitatea încrucișată, cosensibilizarea se definește prin prezența IgE specifice față de epitopi proveniți din surse alergenice diferite și care nu este obligatoriu să prezinte similaritate de structură(2). În acest articol sunt prezentate principalele aeroalergene sezoniere (polenul de arbori, de graminee și de buruieni) și componentele moleculare alergenice majore caracteristice lor (cu o prevalență ridicată de sensibilizare de peste 50%). De asemenea, sunt evidențiate componente moleculare alergenice implicate în procesul de reactivitate încrucișată, care pot fi evaluate individual prin tehnici de diagnostic molecular. Am ales această abordare, deoarece în cazul polenurilor, este important de subliniat că de multe ori sezonul polinic al unui tip de plante anemofile se suprapune cu al altor tipuri de plante, astfel încât este dificil de stabilit clinic care este aeroalergenul sensibilizant, iar în aceste cazuri diagnosticul molecular are o utilitate deosebită.

1. Alergia la polenul de arbori

Spre deosebire de plantele ierboase, arborii aparțin unui număr considerabil de familii botanice și adesea unor ordine diferite, astfel că alergenele din polenul arborilor prezintă o reactivitate încrucișată mai scăzută. Arborii/ arbuștii producători de polen cu potențial alergenic aparțin ordinelor Fagales (arin, fag, mesteacăn, alun, stejar), Lamiales (frasin, lemn-câinesc, măslin, liliac), Pinales (chiparos, cedru japonez, ienupăr) și Proteales (platan, paltinul de munte). Distribuția geografică a speciilor de plante alergenice conturează profilurile de sensibilizare ale pacienților ca o consecință a expunerii diferite, în funcție de regiune, la tipurile de polen local(7-14). Structural, polenul arborilor conține majoritar polcalcine, profiline și molecule CCD. Aceste proteine pot genera la un moment dat reacție încrucișată la extractele din polenuri.

Polenul de mesteacăn european (Betula verrucosa) Mesteacănul argintiu european (Betula verrucosa, sin. Betula pendula) este una dintre speciile cele mai importan-

educaţie medicală continuă Figura 2. Reactivitate încrucișată IgE între alergenul major Bet v 1 (la ora 12 a diagramei) și alergenele înrudite din polenul arborilor ordinului Fagales și cu fructele cărnoase și uscate, nuci și legume. Reactivitatea încrucișată bidirecțională este reprezentată prin săgeți roșii duble și cea unidirecțională, prin săgeți verzi. Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(21)

te din familia Betulaceae a ordinului Fagales și reprezintă una dintre principalele cauze ale alergiei la polenul de arbori. Alte specii de arbori/arbuști din familia Betulaceae cu potențial alergenic reprezentativ în Europa sunt mesteacănul pufos (Betula pubescens, sin. Betula alba), arinul sau aninul negru (Alnus glutinosa) și alunul (Corylus avellana). Perioada de înflorire a mesteacănului începe la sfârșitul lunii martie în Europa de Vest, la începutul lunii aprilie în Europa Centrală și de Est și la sfârșitul lunii aprilie până la sfârșitul lunii mai în nordul Europei. După un interval de 1-3 săptămâni de la debutul sezonului polinic, cantități mari de polen sunt eliberate în atmosferă. Durata sezonului de polenizare la mesteacăn depinde de condițiile meteorologice și variază între 2 și 8 săptămâni(15). Componentele moleculare alergenice din polenul de mesteacăn sunt(16): Bet v 1 (din familia PR-10) este alergenul major, care induce reacție IgE-mediată la peste 90% dintre pacienții alergici la acest polen. Reacția pozitivă la Bet v 1 indică faptul că sensibilizarea primară este la polenul de mesteacăn. Totodată, pacienții cu reacție pozitivă la Bet v 1 sunt buni candidați pentru AIT. Mai mult, ei pot prezenta sindromul de alergie orală indus de ingestia de diverse fructe, nuci și legume care conțin alergene din familia PR-10, datorată reacției încrucișate între componentele alergenice înrudite. Cele mai cunoscute alergene alimentare din familia PR-10 înrudite cu Bet v 1 sunt cele din măr (Mal d 1), piersică (Pru p 1), caisă (Pru ar 1), cireșe (Pru av 1), căpșune (Fra a 1) și pere (Pyr c 1), precum și din alune (Cor a 1), țelină (Api g 1), morcov (Dau c 1), soia (Gly m 4), arahide (Ara h 8) și kiwi (Act d 8) (figura 2). Aceste molecule reacționează încrucișat cu Bet v 1 datorită gradului ridicat de similitudine între secvențele lor de aminoacizi, având o structură terțiară extrem de similară(17). Sindromul de alergie orală

apare la peste 50% dintre pacienții cu alergie la polen de mesteacăn, cel mai frecvent fiind indus de consumul de mere(18). Alimentele menționate sunt deseori tolerate când sunt gătite, deoarece alergenele din familia PR-10 sunt labile termic(8,9,12,19). Bet v 2 (profilină), Bet v 4 (polcalcină), Bet v 6 (izoflavon-reductază like) sunt alergene minore și cu o mare capacitate de inducere a reacției încrucișate. Pot să nu fie disponibile în cantitate suficientă în extractele de polen pentru AIT. Pacienții cu reacție pozitivă la Bet v 2 și Bet v 6 pot prezenta sindromul de alergie orală. Pacienții cu reacție pozitivă doar la Bet v 2 și Bet v 4 nu sunt buni candidați pentru AIT. În lipsa reacției la Bet v 1, trebuie identificat alergenul care a provocat sensibilizarea primară. Majoritatea pacienților alergici la polenul de mesteacăn sunt sensibilizați și reacționează la mai multe tipuri de polen, fie datorită sensibilizării primare multiple, fie datorită reactivității încrucișate între diferite alergene (figura 2). Mesteacănul este strâns înrudit cu multe specii de arbori (arinul, alunul, fagul și stejarul) (18,20) . Ca urmare a acestei relații, pacienții sensibilizați la Bet v 1 pot reacționa și la polenuri din speciile înrudite (arin, alun, fag și stejar). Relevanța clinică a identificării IgE specifice pentru moleculele alergenice din polenul de mesteacăn constă în: Certificarea sensibilizării primare la mesteacăn (Bet v 1). Diferențierea dintre sensibilizarea primară (Bet v 1) și reactivitatea încrucișată (Bet v 2, Bet v 4, Bet v 6). Explicarea sindromului de alergie orală la pacienții alergici la polenul de mesteacăn prin corelarea cu alimentele care conțin componente alergenice înrudite cu alergenele Bet v 1, Bet v 2, Bet v 6. ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Măslinul și frasinul sunt specii strâns înrudite botanic, din familia Oleaceae, care prezintă un grad înalt de reactivitate încrucișată. Polenul de măslin este un factor declanșator important al alergiei sezoniere din arealul mediteraneean. Componentele moleculare alergenice din polenul de măslin sunt: Ole e 1 – alergenul major, care induce reacția la peste 70% dintre pacienții alergici la acest polen. Reacția pozitivă la Ole e 1 indică faptul că sensibilizarea primară este la polenul de măslin. Pacienții alergici la polenul de măslin cu reacție pozitivă la Ole e 1 sunt buni candidați pentru AIT. Ole e 7 (LTP) și Ole e 9 (1,3-beta glucanaza) sunt alergenele minore. Frasinul european (Fraxinus excelsior) este o specie comună în majoritatea Europei, dar, cu toate acestea, polenul frasinului este rar considerat o cauză a polinozei, pentru că înflorește concomitent cu mesteacănul. Fra e 1 este alergenul major din polenul de frasin și prezintă reactivitate încrucișată cu Ole e 1, astfel că Ole e 1 poate fi utilizat ca marker indirect al sensibilizării la polenul de frasin(17). Componentele alergenice din familiile Oleaceae și ordinul Fagales sunt prezentate în tabelul 2.

sempervirens), și America de Nord, chiparosul de Arizona (Cupressus arizonica). Cedrii sunt de asemenea membri ai familiei Cupressaceae și prezintă reactivitate încrucișată IgE-mediată. În Japonia este răspândit cedrul japonez (Cryptomeria japonica). Chiparoșii înfloresc iarna și pot cauza alergia polinică în acest anotimp. Alergia la chiparos pe timpul iernii este adesea trecută cu vederea și este similară simptomatic cu alergia perenă la praful de casă. Cea mai importantă manifestare clinică este cea de rinită, iar conjunctivita poate avea forme severe. Componentele moleculare alergenice din polenul de chiparos sunt: Cup a 1 (pectat-liaza) – alergen major, este un marker specific pentru sensibilizarea primară la polenul de Cupressaceae. Cup a 1 prezintă o similaritate foarte apropiată cu alergenul major al chiparosului mediteraneean (Cup s 1), cedrul de munte (Jun a 1), chiparosul japonez (Cha o 1) și cedrul japonez (Cry j 1), datorită căruia există un înalt grad de reactivitate încrucișată între speciile menționate (23,24). Cup a 2 (poligalacturonaza), Cup a 3 (taumatina) și Cup a 4 (polcalcina) – alergene majore reprezentative pentru Cupressus arizonica. Componentele alergenice ale polenurilor din familia Cupressaceae sunt prezentate în tabelul 4. Reactivitatea încrucișată în afara genealogiei familiilor botanice datorată panalergenelor poate conduce la o eroare de diagnostic privitor la sensibilitatea primară. Alergologia moleculară oferă acum oportunitatea de a stabili dacă sensibilizarea la un alergen este autentică sau este datorată unei reactivități încrucișate. Pentru cele mai importante familii genealogice, alergenele markeri primari au fost identificate (figura 3). Dacă testarea la acestea este negativă, doar panalergenele fiind responsabile de reactivitatea IgE, atunci relevanța clinică a sensibilizării este incertă, iar AIT nu este justificată(25).

Polenul de platan (Platanus acerifolia)

2. Alergia la polenul de graminee

Recomandarea corectă a AIT, candidații cei mai potriviți fiind pacienții sensibilizați la Bet v 1, cei care vor beneficia cel mai probabil în urma imunoterapiei alergenice prin ameliorarea simptomelor. La pacienții sensibilizați la alergenele minore din polenul de mesteacăn, eficiența AIT va fi mai redusă (18,22). Componentele alergenice ale polenurilor din cele două familii principale Betulaceae și Fagaceae sunt prezentate în tabelul 1.

Polenul de măslin (Olea europaea) și frasin european (Fraxinus excelsior)

Platanul hibrid comun (Platanus acerifolia, sin. Platanus vulgaris) aparține familiei Platanaceae. Componentele moleculare alergenice din polenul de platan sunt: Pla a 1 (inhibitor de invertază) – alergenul major, care induce sensibilizare la 90% dintre pacienții alergici la acest polen. Pla a 1 este un marker specific pentru diferențierea între sensibilizarea primară la polenul platanului și o reactivitate încrucișată. Reacția pozitivă la Pla a 1 indică faptul că sensibilizarea primară este la platan. Pacienții alergici la polenul de platan cu reacție pozitivă la Pla a 1 sunt buni candidați pentru AIT. Pla a 3 (nsLTP) prezintă reacții încrucișate cu alte alergene din familia LTP din fructe. Pla a 3 are o similaritate de 50% a secvenței peptidice cu alergenul Pru p 3 din piersică(9). Componentele alergenice ale polenurilor plantelor din familia Platanaceae sunt prezentate în tabelul 3.

Polenul de chiparos (familia Cupressaceae)

Chiparoșii sunt arbori ornamentali comuni răspândiți în sudul Europei, chiparosul mediteraneean (Cupressus ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

Alergia la polenul de graminee (familia Poaceae) este frecvent întâlnită la nivel mondial, în unele regiuni până la 40% dintre pacienții atopici prezintă sensibilizare la polenul acestor plante(11,27,28). În zonele cu climat temperat, plantele erbacee ale subfamiliei Pooideae, din care fac parte și timoftica (Phleum pratense), golomățul (Dactylis glomerata), iarba de gazon sau zâzania (Lolium perenne), viţelarul (Anthoxanthum odoratum) și firuța (Poa pratensis), sunt cele mai comune surse de polen. Există un grad ridicat de reactivitate încrucișată între polenurile gramineelor din această subfamilie. Sezonul de polenizare al gramineelor se suprapune parțial cu cel al buruienilor Asteraceae (pelinariță, iarba pârloagelor) în majoritatea Europei și cu polenul arborilor (măslin, platan) în sudul Europei(29). În zonele temperate calde/subtropicale este important și polenul de graminee din subfamiliile Chloridoideae – pir gros (Cynodon dactylon) – și Panicoideae – costrei (Sorghum halepense). Alergenele din polenurile de graminee sunt grupate pe baza structurii lor proteice și a funcțiilor lor în 11 grupuri. Grupurile 1 și 5 conțin alergene majore cu aler-

educaţie medicală continuă Tabelul 1

Componentele alergenice din cele două familii principale Betulaceae și Fagaceae, ordinul Fagales. Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(21)

genicitate ridicată și un procent de sensibilizare de peste 90%, respectiv 65-85% (30) (figura 4). În timp ce grupul 5 de alergene este specific subfamiliei Pooideae, grupul 1 este reprezentat în polenul tuturor plantelor din familia Poaceae. Panalergenele care fac parte din grupul 12 (profiline) și grupul 7 (polcalcinele) prezintă

reactivitate încrucișată cu alte profiline, respectiv polcalcine, din polenul de arbori și buruieni (tabelul 5). Componentele moleculare alergenice din polenul de graminee sunt: Phl p 1 (beta-expansine) sau alte alergene din polenul de graminee care aparțin grupului 1, precum Cyn d 1 din ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Tabelul 2

Componentele alergenice din familia Oleaceae. Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(21)

Tabelul 3

Componentele alergenice din familia Platanaceae. Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(21)

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

educaţie medicală continuă Tabelul 4

Componentele alergenice din familia Cupressaceae. Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(21)

Figura 3. Reactivitate încrucișată între alergenele majore. Săgețile drepte reprezintă reactivitatea încrucișată. Săgeata circulară indică faptul că profilinele și CCD-urile sunt panalergene prezente în toate tipurile de polen. Prezentare educațională cu modificare după Akdis și Agache (2014)(26)

Cynodon dactylon, Lol p 1 din Lolium perenne, reprezintă pentru majoritatea pacienților un marker al sensibilizării primare. Chiar și în cazul puținilor pacienți care au fost sensibilizați inițial la alte alergene din polenul de graminee, se vor produce rapid și IgE specifice pentru Phl p 1. De aceea IgE specifice pentru Phl p 1 reprezintă un marker esențial în determinarea sensibilizării reale, prezența acestui tip de IgE confirmând că un pacient cu un răspuns cutanat pozitiv la extractul de polen de graminee este cu siguranță sensibilizat la acesta. Absența IgE specifice pentru Phl p 1 nu exclude sensibilizarea reală la polenul de graminee, deoarece

aceasta poate fi determinată de alte alergene majore (de exemplu Phl p 5). În concluzie, la pacienții cu răspuns cutanat pozitiv la extractul de polen de graminee, dar fără IgE specifice pentru Phl p 1, trebuie determinate și IgE specifice pentru alte alergene precum Phl p 5, 7, 12. Phl p 5 (ribonuclează) este un alergen care rareori induce singur sensibilizarea la polenul de graminee. Prezența IgE specifice pentru Phl p 5, observată la aproximativ 50% dintre pacienții europeni alergici la acest polen, confirmă că o reacție cutanată pozitivă este expresia unei sensibilizări reale. Cu toate că, în procesul de ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Figura 4. Asocierea alergenelor din polenul de graminee cu gradul de sensibilizare IgE al pacienților, Prezentare educațională cu modificare după Harabina et al. (2008)(30)

sensibilizare, IgE specifice pentru Phl p 5 apar mai tardiv decât cele pentru Phl p 1, concentrația lor serică crește foarte mult. Determinarea IgE pentru Phl p 5 s-a dovedit utilă pentru a distinge între alergia la graminee și cea la polenul de măslin în zonele din sudul Europei(29). De asemenea, prezența IgE specifice pentru Phl p 5 poate avea valoare prognostică, indicând severitatea alergiei și evoluția de la rinita alergică la astm(29). Peste 90% dintre pacienții sensibilizați la polenul de graminee au anticorpi IgE specifici pentru Phl p 1 și/sau Phl p 5(27,31-33). Phl p 12 (profilină) este un alergen cu o mare capacitate de a induce reacții încrucișate. Sensibilizarea la această profilină apare tardiv, iar titrul anticorpilor IgE specifici este moderat. Acești anticorpi sunt prezenți doar la un procent redus dintre pacienții alergici la polenul de graminee și este un indicator al unui status atopic sever și/sau al unei alergii de lungă durată. La pacienții cu răspuns cutanat pozitiv la extractul de polen de graminee, dar fără răspuns pozitiv pentru alergenele majore Phl p 1 și Phl p 5, trebuie determinat răspunsul pentru Phl p 12. Reacția pozitivă doar pentru Phl p 12 dovedește că reacția cutanată la extractul de polen a fost fals pozitivă, fiind cauzată de reacția încrucișată dintre diversele profiline prezente în alte polenuri. Dacă un pacient prezintă IgE specifice pentru Phl p 12, trebuie întrebat dacă a manifestat sindrom de alergie orală, declanșat de ingestia unor fructe și legume care conțin profiline, cum ar fi tomata (Lyc e 1), cartoful (Sola t 8), portocala (Cit s 2). Phl p 7 (polcalcină) este un alergen cu o mare capacitate de a induce reacții încrucișate. Phl p 7 determină un titru ridicat de anticorpi IgE specifici după mulți ani de la debutul alergiei. Prezența IgE specifice pentru Phl p 7 poate avea valoare prognostică, indicând severitatea alergiei și evoluția de la rinita alergică la astm precum și o prevalență mai ridicată a comorbidităților alergice. Phl p 4 este un alergen major din polenul de graminee. În forma sa nativă, folosită în majoritatea testelor ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

Figura 5. Diagramă cu alergene din diferite surse, similare structural cu alergenele din polenul gramineelor din zonele temperate și/sau subtropicale. Alergenele majore sunt reprezentate cu scris îngroșat. Alergenele din aceeași familie sunt incluse în căsuțe de aceeași culoare. Panalergenele: profiline (căsuțe maro) și polcalcine (căsuțe roz) sunt reprezentate cu un scris de dimensiuni mai mici. Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(29)

diagnostice, această proteină conține CCD. Astfel se explică de ce în multe studii epidemiologice procentul pacienților alergici la polen de graminee cu IgE specifice pentru Phl p 4 depășește 90%. În cazul în care este folosit alergenul recombinat, procentul scade sub 50%, dovedind că un număr mare de reacții sunt fals pozitive induse de CCD. Phl p 2 și Phl p 11 sunt două alergene care rareori induc singure sensibilizare la polenul de graminee, iar Phl p 6 prezintă un grad ridicat de reactivitate încrucișată cu Phl p 5 și nu oferă informații suplimentare pentru diagnostic. Sensibilizarea concomitentă la alergenele majore și minore din polenul de graminee (figura 5) reprezintă un profil alergenic complex care se asociază clinic cu forme mai severe de boală și cu o perioadă mai îndelungată de manifestare a simptomelor (33).

Relevanța clinică a identificării IgE specifice pentru moleculele alergenice din polenul de graminee

La pacienții alergici la polen de graminee, testele IgE specifice ar trebui să dea răspunsul la următoarele întrebări: Q1a: este pacientul sensibilizat cu adevărat la alergenele majore din polenul de graminee? (Se va testa IgE specific pentru Phl p 1, iar dacă este negativ, se va testa IgE specific pentru Phl p 5 și alte alergene – Phl p 2, Phl p11.) Q1b: este pacientul sensibilizat la alergene cu o mare capacitate de a induce reacții încrucișate? (Se va testa IgE specific pentru Phl p 7 și Phl p 12.) Q2: în cazul în care pacientul nu are IgE specific pentru Phl p 1 sau alte alergene specifice speciei, dar

educaţie medicală continuă Tabelul 5

Grupurile de alergene ale polenului de graminee. Datorită relațiilor taxonomice și biochimice, multe specii de graminee au alergene similare și sunt grupate conform secvențelor de aminoacizi pe care le au în comun. Prezentare educațională cu modificare după García-Mozo et al. (2017) și Hrabina et al. (2008)(30,34)

are IgE specific pentru Phl p 7 și/sau Phl p 12, care polen induce o falsă sensibilizare la extractul de polen de graminee? După ce va răspunde la aceste întrebări (Q1a, Q1b, Q2), medicul alergolog va evalua dacă simptomele sunt cauzate de sensibilizare IgE la polenul de graminee și va decide prescrierea AIT cu extract de polen de graminee (25,35,36) (figura 6).

Exemplu de selectare a AIT pe baza criteriilor de diagnostic molecular

Pentru stabilirea profilului de sensibilizare al pacientului față de alergenele din polenul de arbori și graminee se efectuează testare moleculară la alergene marker Phl p 1/Phl p 5 (pentru polenul de graminee); Bet v 1 (pentru fag, mesteacăn și alte specii lemnoase din ordinul Fagales); Ole e 1 (pentru măslin și alte specii lemnoase din familia Oleaceae, inclusiv frasin); Pla a 1

(pentru platan) și Cup a 1/Cry j 1 (pentru chiparos) și panalergene Phl p 7/Phl p 12 (pentru reactivitate încrucișată polcalcine/profiline). În funcție de rezultatele obținute, sunt posibile mai multe decizii terapeutice prezentate în figura 7.

3. Alergia la polenul de buruieni

Termenul de buruieni nu constituie o familie din punct de vedere botanic, ci se referă la plante erbacee dicotiledonate segetale invazive și adaptative ecologic, dar și diverse plante utilizate uneori ca ierburi culinare sau medicinale (pelinul, pătlagina, parachernița, trepădătoarea, cicoarea, păpădia, urzica, spanacul sălbatic, știrul). Alergiile respiratorii mediate de IgE la polenuri de buruieni sunt induse în Europa în special de polenul de buruieni din familia Asteraceae (Compositae) – pelinariță (Artemisia vulgaris) și iarba pârloagelor (Ambrosia artemisiifolia) – și de polenul de ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Figura 6. Algoritm de diagnostic în vederea prescrierii AIT la pacienții alergici la polen de graminee, Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(29)

buruieni din familia Urticaceae – paracherniță (Parietaria officinalis). În regiunile mai aride este important și polenu l de buruieni din familia Amaranthaceae – ciulin rusesc (Salsola kali) –, iar pentru sudul Europei și pătlagina îngustă Plantago lanceolata din familia Plantaginaceae. Polenul de buruieni este considerat sursă importantă de alergii respiratorii. Sezonul de înflorire a acestor buruieni variază în funcție de specie (aprilie-septembrie). Cele mai relevante alergene prezente în polenul de buruieni aparțin familiilor de pectat-liaze (Amb a 1, Art v 6) , defensine (Art v 1, Amb a 4, Hel a 1), nsLTP (Amb a 6, Art v 3, Par j 1, Par j 2) și proteinelor omoloage Ole e 1 (Pla l 1, Che a 1, Sal k 5) (29). Multe proteine sunt considerate alergene minore și fac parte din familia profilinelor (Amb a 8, Art v 4, Hel a 2, Par j 3, Mer a 1, Che a 2, Sal k 4, Ama r 2) și a polcalcinelor (Amb a 9, Amb a 10, Art v 5, Par j 4, Che a 3), cunoscute ca panalergene (38). Modelele tridimensionale ale unor familii de proteine sunt prezentate în figura 8 (29). Reacții încrucișate pot avea loc între alergeni provenind de la specii de buruieni înrudite. În afară de profiline și CCD, ambrozia și pelinarița conțin și alte alergene care pot induce reacții încrucișate. Anticorpii IgE specifici acestora pot determina reacții alergice clinic semnificative (39,40). Un grad mare de reactivitate încrucișată a fost observat între diferite specii de ambrozia și pelinariță, dar și la alte plante din familia Asteraceae.

Polenul de iarba pârloagelor sau ambrozia (Ambrosia artemisiifolia)

Genul Ambrosia cuprinde în jur de 50 de specii native în partea centrală și de nord a Americii, care a invadat zone din Europa încă din secolul trecut și care s-au răspândit în ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

ultimele decenii la nivel european dat fiind caracterul transfrontalier al polenului aeropurtat(29). Ambrosia artemisiifolia var. elatior (ambrozia comună, denumită iarba pârloagelor sau floarea pustei) este o buruiană anuală, invazivă, cu un potențial înalt de a induce reacții de hipersensibilitate de tip I în ultima parte a verii și toamna. În România, ambrozia reprezintă una dintre cele mai importante surse alergenice, cu impact sever asupra sănătății. În prezent, sunt identificate 12 alergene din polenul de ambrozie, dintre care cele mai importante sunt(38): Amb a 1 (pectat-liaza) este alergenul major, care induce reacția la peste 90% dintre pacienții alergici la acest polen. Până în prezent au fost identificate și caracterizate imunologic 5 izoforme Amb a 1. Un grad moderat de reactivitate încrucișată a fost observat frecvent între Amb a 1 și alergenul din pelinariță, Art v 6 (familia pectat-liazelor), acestea având o omologie a secvențelor de 58%. De asemenea, Amb a 1 prezintă o omologie de 44-45% cu alergeni din familia Cupressaceae, cum ar fi Cry j 1 (cedrul japonez), Jun a 1 (cedru de munte), Cup a 1 (chiparos de Arizona), care aparțin familiei de pectat-liaze, dar între care nu s-a demonstrat o reactivitate încrucișată semnificativă. Alergenul cu care este cel mai similar din punct de vedere al secvenței este pectat-liaza din Hellianthus annuus (floarea-soarelui), cu care prezintă o omologie de 67,8%(38). Amb a 11 (cistein-proteaza) este un alergen major recent identificat, cu o rată de sensibilizare de până la 66%. Amb a 11 prezintă o structură moleculară comună cu alți alergeni majori care aparțin aceleiași familii de proteaze, cum ar fi Act d 1 din kiwi (36,9%), Ana c 2 din ananas (34,1%) și Der f/Der p 1 din acarieni (27,3/23,5%). Studii recente au relevat că există pacienți sensibilizați doar la Amb a 11 (15%), ceea ce impune includerea Amb a 11 în kitul de diagnostic și în preparatele de AIT(38).

educaţie medicală continuă

Figura 7. Selectarea AIT pe baza criteriilor de diagnostic molecular (Phl p 1, Phl p 5, Phl p 7, Phl p 12, Ole e 1, Fra e 1 și Bet v 1). Prezentare educațională cu modificare după Kleine et al. (2017)(37) *dacă există în arealul în care se află și Olea europaea

Amb a 4 (defensină) prezintă o reacție pozitivă la 20-39% dintre pacienții sensibilizați la polen de ambrozia. Pacienții sensibilizați la acest alergen minor reacționează frecvent cu molecule alergenice majore din clasa defensinelor prezente în alte polenuri. Spre exemplu, Art v 1 (Artemisia vulgaris), alergenul major din pelinariță, față de care nu este clar dacă răspunsul se datorează reactivității încrucișate sau cosensibilizării. Amb a 4 prezintă o omologie de peste 60% cu alergenii majori Par h 1 (Parthenium hysterosphorus) și Hel a 1 (Heliantus annuus)(38). Amb a 6 (nsLTP) prezintă o rată de sensibilizare între 20% și 35% în rândul populației alergice la polenul de ambrozie. Deși face parte din nsLTP, o familie de panalergene întâlnită în fructe și nuci, omologia dintre Amb a 6 și alte nsLTP este limitată sub 40%. Nu a fost observată o reactivitate încrucișată între proteine de transfer lipidic din polenuri, iar reactivitatea încrucișată între nsLTP dintre alimente și polenuri este limitată(38). Amb a 8 (profilină) este un panalergen și prezintă o rată de sensibilizare între 20% și 35% în rândul populației alergice la polenul de ambrozie. Amb a 8 prezintă secvențe structurale comune cu o omologie de peste 65% cu profiline din alimente și polenuri, cum ar fi Cor a 2 (alun), Mal d 4 (măr), Dau c 4 (morcov), Mus a 1 (banană), Pru p 4 (piersică), Hel a 2 (floarea-soarelui), Phl p 12 (timoftică), Bet v 2 (mesteacăn), Ole e 2 (măslin), Cyn d 12 (iarbă Bermuda) și alții. În plus, Amb a 8 prezintă o omologie de 89,5% a secvenței de aminoacizi cu Art v 4, rezultând o reactivitate încrucișată comparabilă în cadrul aceleiași familii, datorată asemănării structurale a celor două proteine. Amb a 8 și Hel a 2 prezintă cea mai ridicată omologie structurală (94%)(38). Amb a 9 și Amb a 10 aparțin familiei de polcalcine (proteine care leagă calciul cu două, respectiv trei domenii EF-hand) și prezintă o reacție pozitivă la 10-15% dintre pacienții sensibilizați la polen de ambrozie. Amb a 9 prezintă similarități structurale cu alte alergene din aceeași familie de proteine, cum ar fi Art v 5, Syr v 3, Bet v 4 și Ole e 3, iar Amb a 10 prezintă similarități structurale cu proteinele Ole e 8, Cyn d 7 și Phl p 12(38).

Figura 8. Modelele tridimensionale ale unor familii de proteine generate prin folosirea platformelor in silico Swiss-Model și UCSF Chimera. A) model Amb a 1.0101, B) model Art v 1.0101, C) model Art v 3.0201 și D) model Pla l 1.0101. Săgeata dublă reprezintă cross-reactivitate IgE demonstrată clinic. Săgeata simplă reprezintă o predicție a cross-reactivității pe baza gradului înalt de omologie al secvențelor de aminoacizi. Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(29)

Sindromul ambrozie-pepene-banană este un sindrom de alergie orală datorat reacției încrucișate între alergenele din Ambrosia și alimente. Posibili candidați implicați în acest sindrom sunt componentele alergenice care determină o reacție încrucișată din familia profilinelor (Amb a 8, Cit la 2, Cuc m 2, Cuc p 2, Cuc s 2, Mus xp 1) și LTP-urilor (Amb a 6, Cuc m LTP). În acest caz, pacienții cu simptome de rinită indusă de polenul de ambrozie pot dezvolta simptome orale când consumă diverși membri ai familiei Cucurbitaceae: pepene verde (Citrullus lanatus subsp. vulgaris), pepene galben (Cucumis melo var. inodorus), dovlecel (Cucurbita pepo), castravete (Cucumis sativus); și ai familiei Musaceae: banane (Musa x paradisiaca). Ca urmare a posibilei reactivități încrucișate între polenul de ambrozia și alte plante din familia Asteraceae, se recomandă să nu se administreze suplimente alimentare cu Echinacea la pacienții alergici la ambrozie(41). Alimente care prezintă reactivitate încrucișată cu polenul de ambrozie sunt prezentate în figura 9.

Polenul de pelinariță (Artemisia vulgaris)

Genul Artemisia cuprinde în jur de 350 de specii răspândite în emisfera nordică și Australia(29). Artemisia vulgaris (pelinarița sau pelinul negru) este o plantă perenă importantă, nativă în zonele temperate din Europa, Asia, nordul Africii, Alaska și America de Nord și este larg utilizată în medicina tradițională(42). Există o suprapunere a sezonului polinic la ambrozia și pelinariță, ambele având perioada de înflorire în iulie-septembrie(29). Componentele moleculare alergenice din polenul de pelinariță sunt: Art v 1 (defensina) este alergenul major din pelinariță și rata de sensibilizare este de 95% în rândul populației alergice la polenul de pelinariță. Prezintă o omologie ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Figura 9. Alimente care pot prezenta reactivitate încrucișată cu polenul de ambrozie. Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(29)

de peste 60% cu reprezentanți din aceeași familie de proteine, cum ar fi alergenele majore, Par h 1 și Hel a 1, dar și cu alergenul minor Amb a 4 (29). Art v 3 (LTP) prezintă o rată de sensibilizare de 22-70% în rândul populației alergice la polenul de pelinariță. S-a demonstrat frecvent o reactivitate încrucișată între proteina de transfer lipidic nonspecifică Art v 3 din pelinariță și molecule omoloage din alimente, cum ar fi Pru p 3. Sensibilizarea la Art v 3 în absența unei polinoze poate indica o sensibilizare primară la LTP în cazul alergiei alimentare (29). Art v 4 (profilina) prezintă o reacție pozitivă la 35% din populația alergică la polenul de pelinariță (29). Art v 4 prezintă o omologie ridicată cu alergenul Amb a 8 din ambrozie și cu alte proteine din aceeași familie, cum ar fi: Pru p 4 (piersică), Api g 5 (țelină), Bet v 2 (mesteacăn), Phl p 12 (timoftica)(41). Art v 5 (polcalcină cu 2 domenii EF-hand) prezintă o reacție pozitivă la 10-28% din populația alergică la polenul de pelinariță(29). Prezintă o omologie structurală comună cu polcalcine din ambrozie (Amb a 9 și Amb a 10) și alte polcalcine din mesteacăn (Bet v 4), timoftică (Phl p 7) (29). Art v 6 (pectat-liaza) prezintă o reacție pozitivă la 26% din populația alergică la polenul de pelinariță (29). Proteina determină reacție încrucișată cu alergenul major din ambrozie, Amb a 1, care face parte din aceeași familie de proteine (29). Sunt descrise o serie de sindroame de alergie orală datorate reacției încrucișate între alergenele din pelinariță și diferite alimente, dintre care: sindromul țelină-pelinariță-condimente, având ca posibili candidați Art v 4 Art v 60 kDa omolog cu Api g 5; sindromul pelinariță-piersică, având ca posibili candidați Art v 4, Art v 3 (LTP); sindromul pelinariță-mușețel – având ca posibil candidat Art v 1 (defensină); sindromul pelinariță-muștar, având ca posibili candidați Art v 3 (LTP), Art v 4 (profilină)(41). Mai mult, polenul de pelinariță, de ambrozie și de timoftică prezintă epitopi IgE comuni cu o glicoproteină ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

alergenică din latex, prezența acestor epitopi explicând în parte simptomele clinice prezentate de persoanele alergice la polen la contactul cu latexul(43). Diagnosticul alergiei la buruieni poate fi dificil de stabilit din cauza polisensibilizărilor frecvente și a anamnezei neconcludente datorată suprapunerii sezonului de înflorire al plantelor cu alte polenuri, cum ar fi cele de mesteacăn și graminee (29,4 4) . Astfel, diagnosticul molecular al alergiilor este avantajos și datorită faptului că limitează rezultatele nespecifice generate de polisensibilizare (29). Un exemplu privind diagnosticul diferențial la buruieni este prezentat în figura 10. Componentele alergenice din polenul de buruieni sunt redate în tabelul 6.

Concluzii

Componentele alergenice moleculare prezentate în acest articol pot fi folosite pentru diagnosticarea la nivel molecular a sensibilizării alergice la aeroalergene sezoniere, cu o precizie și o sensibilitate analitică mai mari decât testarea bazată pe extracte din surse alergenice. Noțiunile de taxonomie sunt necesare pentru definirea corectă a alergenelor, dar și acuratețea datelor botanice(45). Diagnosticarea la nivel molecular bazată pe componente alergenice izolate și purificate din surse alergenice naturale sau produse recombinate prezintă și câteva limitări: disponibilitatea alergenului (depinde de procese biotehnologice complexe și în prezent nu sunt disponibile comercial toate componentele alergenice moleculare de interes) și costul mai ridicat al testării. În abordarea clinică se recomandă folosirea complementară a metodelor de diagnostic bazate pe componente alergenice moleculare și a celor bazate pe extracte din surse alergenice. În cazul mono- sau oligo-sensibilizării la alergeni, a cazurilor cu risc clinic scăzut și a alergenelor foarte stabile cu abundență ridicată în sursele alergenice, extractele din surse alergenice pot fi folosite pentru

educaţie medicală continuă Tabelul 6

Tabelul 6. Componentele alergenice din polenul de buruieni(38,44). Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(29)

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Figura 10. Model de diagnostic diferențial pentru alergia la polen de ambrozie și pelinariță. Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(29)

Bibliografie

diagnosticare, cu mențiunea că ele pot conține antigene fără relevanță clinică, ce pot produce rezultate fals pozitive. Diagnosticarea bazată pe componente alergenice moleculare este recomandată cu precădere în cazul pacienților polisensibilizați, a pacienților cu risc clinic ridicat (caz în care specificitatea analitică oferită de acest tip de diagnosticare conferă o mai bună evaluare 1. Aalberse RC, Akkerdaas J & van Ree R. Cross-reactivity of IgE antibodies to allergens. Allergy 56, 478–490 (2001). 2. Ferreira F, Hawranek T, Gruber P, Wopfner N & Mari A. Allergic cross-reactivity: from gene to the clinic. Allergy 59, 243–267 (2004). 3. Bublin M & Breiteneder H. Cross‐reactivities of non‐homologous allergens. Allergy (2019). 4. Sánchez-Monge R. & Salcedo G. Can cross-reactivity studies enable generic allergy prevention? in Allergy Matters (2007). doi:10.1007/1-4020-3897-6_6 5. Pierson Mullany LK, Jackola DR, Blumenthal MN & Rosenberg A. Evidence of an affinity threshold for IgE-allergen binding in the percutaneous skin test reaction. Clin. Exp. Allergy (2002). doi:10.1046/j.0022-0477.2001.01244.x 6. Luengo O & Cardona V. Component resolved diagnosis: when should it be used? Clin. Transl. Allergy 4, 28 (2014). 7. Matricardi PM et al. EAACI Molecular Allergology User’s Guide. Pediatr. Allergy Immunol. 27, 1–250 (2016). 8. Jakob T, Hamilton RG & Vieths S. Molecular Allergy Diagnostics. Molecular Allergy Diagnostics (2017). doi:10.1007/978-3-319-42499-6 9. Canonica GW et al. A WAO – ARIA – GA2LEN consensus document on molecular-based allergy diagnostics. World Allergy Organ. J. 6, 17 (2013). 10. Asam C, Hofer H, Wolf M, Aglas L & Wallner M. Tree pollen allergens-an update from a molecular perspective. Allergy 70, 1201–1211 (2015). 11. Barber D et al. Understanding patient sensitization profiles in complex pollen areas: a molecular epidemiological study. Allergy 63, 1550–1558 (2008). 12. Hauser M et al. Bet v 1-like pollen allergens of multiple Fagales species can sensitize atopic individuals. Clin. Exp. Allergy 41, 1804–1814 (2011). 13. Rodriguez R et al. Olive pollen recombinant allergens: value in diagnosis and immunotherapy. J. Investig. Allergol. Clin. Immunol. 17 Suppl 1, 4–10 (2007). 14. Charpin D et al. Cypress Pollinosis: from Tree to Clinic. Clin. Rev. Allergy Immunol. 56, 174–195 (2019). 15. https://www.pollenwarndienst.at/allergy/profiles/birch/SiegfriedJäger/Medizinische Universität Wien. 16. Bradshaw N. Part2. The allergen components. in Go molecular! A clinical reference guide to molecular allergy (ThermoFisherScientific, 2018). 17. Castro AJ, Alche JD, Calabozo B, Rodriguez-Garcia MI & Polo F. Pla l 1 and Ole e 1 pollen allergens share common epitopes and similar ultrastructural localization. J Investig Allergol Clin Immunol 17, 41–47 (2007). 18. Vieths S, Scheurer S. & Ballmer‐Weber B. Current understanding of cross‐reactivity of food allergens and pollen. Ann. N. Y. Acad. Sci. 964, 47–68 (2002). 19. Schmid-Grendelmeier P. Rekombinante Allergene: Routinediagnostik oder Wissenschaft? Hautarzt 61, 946–953 (2010). 20. Schmid-Grendelmeier P. Rekombinante Allergene. Der Hautarzt 61, 946–953 (2010). 21. European Academy of Allergy and Clinical Immunology. Molecular Allergology User’s Guide EAACI (European Academy of Allergy and Clinical Immunology). (2016). 22. Sekerková A & Poláčková M. Detection of Bet v1, Bet v2 and Bet v4 specific IgE antibodies in the sera of children and adult patients allergic to birch pollen: evaluation of different IgE reactivity profiles depending on age and local sensitization. Int. Arch. Allergy Immunol. 154, 278–285 (2011). 23. Arilla MC et al. Quantification of the major allergen from cypress (Cupressus arizonica) pollen, Cup a 1, by monoclonal antibody-based ELISA. Int. Arch. Allergy Immunol. 134, 10–16 (2004). 24. Di Felice G, Barletta B, Tinghino R & Pini C. Cupressaceae pollinosis: identification, purification and cloning of relevant allergens. Int. Arch. Allergy Immunol. 125,

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

a riscului clinic și a severității manifestărilor clinice) și când componentele alergenice care se doresc a fi testate se regăsesc într-o cantitate foarte mică sau sunt instabile biochimic în extractele din surse alergenice. Acest articol a fost elaborat în cadrul proiectului INSPIRED (Strategii inovative pentru prevenția, diagnosticul și terapia afecțiunilor respiratorii induse de polenul de ambrozie) cod SMIS 103662. n 280–289 (2001). 25. Valenta R, Twaroch T & Swoboda I. Component-resolved diagnosis to optimize allergenspecific immunotherapy in the Mediterranean area. J Investig Allergol Clin Immunol 17, 36–40 (2007). 26. Akdis CA & Agache I. Global atlas of allergy. (European Academy of Allergy and Clinical Immunology, 2014). 27. Andersson K & Lidholm J. Characteristics and Immunobiology of Grass Pollen Allergens. Int. Arch. Allergy Immunol. 130, 87–107 (2003). 28. Hatzler L et al. Molecular spreading and predictive value of preclinical IgE response to Phleum pratense in children with hay fever. J. Allergy Clin. Immunol. 130, 894-901. e5 (2012). 29. Matricardi PM et al. EAACI molecular allergology user’s guide. Pediatr. Allergy Immunol. 27, 1–250 (2016). 30. Hrabina M, Peltre G, Van Ree R. & Moingeon P. Grass pollen allergens. Clin. Exp. Allergy Rev. 8, 7–11 (2008). 31. Sekerkova A, Polackova M & Striz I. Detection of Phl p 1, Phl p 5, Phl p 7 and Phl p 12 Specific IgE Antibodies in the Sera of Children and Adult Patients Allergic to Phleum Pollen. Allergol. Int. 61, 339–346 (2012). 32. Tripodi S et al. Molecular profiles of IgE to Phleum pratense in children with grass pollen allergy: Implications for specific immunotherapy. J. Allergy Clin. Immunol. 129, 834-839. e8 (2012). 33. Cipriani F et al. Diagnostic relevance of IgE sensitization profiles to eight recombinant Phleum pratense molecules. Allergy 73, 673–682 (2018). 34. García-Mozo H. Poaceae pollen as the leading aeroallergen worldwide: A review. Allergy 72, 1849–1858 (2017). 35. Cappella A & Durham SR. Allergen immunotherapy for allergic respiratory diseases. Hum. Vaccin. Immunother. 8, 1499–1512 (2012). 36. Asero R. Component-resolved diagnosis-assisted prescription of allergen-specific immunotherapy: a practical guide. Eur Ann Allergy Clin Immunol 44, 183–187 (2012). 37. Kleine-Tebbe J & Jakob T. Molecular allergy diagnostics: Innovation for a better patient management. Molecular Allergy Diagnostics: Innovation for a Better Patient Management (2017). doi:10.1007/978-3-319-42499-6 38. Chen KW, Marusciac L, Tamas PT, Valenta R & Panaitescu C. Ragweed Pollen Allergy: Burden, Characteristics, and Management of an Imported Allergen Source in Europe. Int. Arch. Allergy Immunol. 176, 163–180 (2018). 39. Hirschwehr R. et al. Identification of common allergenic structures in mugwort and ragweed pollen. J. Allergy Clin. Immunol. 101, 196–206 (1998). 40. Asero R et al. Concomitant sensitization to ragweed and mugwort pollen: who is who in clinical allergy? Ann. Allergy, Asthma Immunol. 113, 307–313 (2014). 41. Popescu FD. Cross-reactivity between aeroallergens and food allergens. World J Methodol 2015; 5: 31-50. 42. Sundararajan B & Kumari BDR. Novel synthesis of gold nanoparticles using Artemisia vulgaris L. leaf extract and their efficacy of larvicidal activity against dengue fever vector Aedes aegypti L. J. Trace Elem. Med. Biol. 43, 187–196 (2017). 43. Fuchs T et al. Natural latex, grass pollen, and weed pollen share IgE epitopes. J. Allergy Clin. Immunol. 100, 356–364 (1997). 44. Gadermaier G, Hauser M & Ferreira F. Allergens of weed pollen: an overview on recombinant and natural molecules. Methods 66, 55–66 (2014). 45. Popescu FD. European standards and North American practice parameters for skin prick testing panels in allergic rhinitis and asthma. Rom. J. Rhinol. (2015). doi:10.1515/ rjr-2015-0002

educaţie medicală continuă

Diagnosticul molecular în bolile alergice respiratorii induse de alergene perene Molecular Diagnostics in Allergic Respiratory Diseases Induced by Perennial Allergens Paul Tudor Tamaș1,2, Laura Haidar1,2, Manuela Grijincu1,2, Michael-Bogdan Mărgineanu2, Bianca Vulpe2, Lauriana-Eunice Zbîrcea1,2, Carmen Panaitescu1,2 1. UMF „Victor Babeș”, Timișoara, Departamentul III Științe Funcționale, Disciplina Fiziologie 2. Centrul de terapii genice și celulare în tratamentul cancerului OncoGen – SCJUPB Timișoara Autor corespondent: Carmen Panaitescu, e-mail: cbunu@umft.ro

ABSTRACT

REZUMAT

Molecular diagnosis is currently based on the identification, characterization and use of molecular components from complex allergenic sources. Specific features of indoor allergen exposure are due to allergic patients’ quality of life impact of perennial exposure, with frequent development of rhinitis towards asthma. In this article we present the most common sources of perennial allergens (house dust mites, furry pets and moulds), as well as their allergenic molecular components. The major allergens responsible for primary sensitization, together with possible cross-reactivity manifestations with allergenic components from animal food sources or parasites, are described. Component resolved diagnosis usefulness towards establishing an optimal approach of allergen immunotherapy, in accordance with the patient’s sensitization profile, is also addressed. Keywords: perennial allergens, specific IgE, molecular diagnostics, cross-reactivity, allergen immunotherapy

Diagnosticul molecular se bazează pe identificarea, caracterizarea și utilizarea componentelor alergenice din surse complexe de alergene. Expunerea la alergene de interior are particularitățile sale datorate expunerii perene, care are impact asupra calității vieții pacienților alergici, cu evoluție mai frecventă de la rinită spre astm. În acest articol prezentăm principalele surse de aeroalergene perene (acarieni din praful de casă, animale de companie cu blană și mucegaiuri), precum și componentele moleculare alergenice. Sunt prezentate alergenele majore responsabile de sensibilizarea primară și posibile manifestări de reactivitate încrucișată față de alte alergene de interior, alimente sau paraziți. Totodată, este abordată utilitatea diagnosticului molecular în vederea stabilirii imunoterapiei alergenice adaptate profilului de sensibilizare al pacientului. Cuvinte-cheie: alergene perene, IgE specific, diagnostic molecular, reactivitate încrucișată, imunoterapie alergenică

Introducere

Primit: 19.02.2020 Acceptat: 25.02.2020

Incidența afecțiunilor alergice este în continuă creștere la nivel mondial, un număr tot mai mare de persoane se confruntă cu agravarea manifestărilor clinice de-a lungul vieții, de la rinită alergică (cea mai frecventă afecțiune IgE-mediată) până la astm(1). Rinita alergică și astmul au un impact negativ asupra calității vieții pacienților și implică costuri mai mari odată cu creșterea severității bolii alergice(2). Din 2018, ghidul ARIA reiterează că alergia poate avea caracter sezonier sau peren în funcție de tipul alergenului, durata expunerii și perioada apariției simptomelor. În zona de climă temperată alergia perenă este cauzată de aeroalergene de interior (provenite din spațiul habitual din încăperi) prezente tot timpul anului, precum acarienii din praful de casă, animale de companie și mucegaiuri, în timp ce alergia sezonieră este cauzată în mare parte de aeroalergene de exterior (provenite din mediu exterior) cum sunt polenurile și unii spori de mucegai.

Durata expunerii la un anumit alergen diferă în funcție de zonă, astfel încât polenurile și unele mucegaiuri pot deveni alergene perene (de exemplu, polenul de Parietaria în zona mediteraneeană). O problemă aparte o constituie faptul că majoritatea pacienților sunt polisensibilizați, fiind astfel expuși la multiple alergene de-a lungul anului. În alte cazuri, chiar dacă expunerea este sezonieră, pacienții prezintă simptome perene cu exacerbări sezoniere în funcție de gradul de expunere la polenuri sau mucegaiuri. Pacienții cu alergii respiratorii perene pot avea simptome doar la nivelul tractului respirator superior (rinită) și/sau inferior (astm). Studiile relevă că afectarea bronșică este mai pronunțată la pacienții cu rinite perene decât la cei cu rinite sezoniere(3). În situații particulare, simptomele alergiei perene pot fi absente în multe perioade din cursul anului (de exemplu, un număr semnificativ de pacienți cu alergie la acarienii din praful de casă au manifestări intermitente de rinită) și viceversa, unii pacienți sensibilizați doar la un tip de ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Tabelul 1

Alergene specifice acarienilor din praful de casă. Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(9)

Sursă alergen

Dermatophagoides pteronyssinus Dermatophagoides farinae (acarieni din praful de casă)

Componentă moleculară alergenică

Funcție biochimică

Reactivitate IgE

Reactivitate încrucișată

*Der p 1, Der f 1

cistein-protează

70-100 %

alergene de grup 1

*Der p 2, Der f 2

proteină din familia NPC2 (proteine secretorii epidermice)

80-100 %

alergene de grup 2

Der p 3, Der f 3

proteină de tip tripsină

16-100 %

Der p 4

alfa-amilază

25-46 %

*Der p 5

necunoscut

50-70 %

Der p 6

chimotripsină

41-65 %

*Der p 7, Der f 7

proteină de legare a lipidelor

50 %

alergene de grup 7

Der p 8, Der f 8

glutation-S-transferază

40 %

Der p 9

serin-protează colagenolitică

92 %

*Der p 10, Der f 10

tropomiozină

5-18 %

alergene din nevertebrate (crustacee, moluște, gândaci de bucătărie, helminți)

*Der p 11

paramiozină

80 %

*Der p 21

necunoscut

*Der p 23

proteină de tip peritrofină

74 %

* alergene disponibile comercial pentru testare in vitro în metode de analiză singleplex și multiplex

polen pot prezenta simptome perene. Totodată, expunerea la iritanți respiratori nespecifici, precum poluarea atmosferică, poate agrava tabloul clinic la pacienții alergici simptomatici și poate induce simptome la cei asimptomatici(4). Și în cazul alergenelor perene, reactivitatea încrucișată apare când răspunsul imun adaptativ la o anumită componentă alergenică provoacă reacții la alte componente cu omologie cu cea responsabilă de sensibilizarea primară (5). În acest articol sunt prezentate principalele alergene de interior, componentele lor moleculare, inclusiv cele responsabile de reactivitate încrucișată cu alte aeroalergene, alergene alimentare sau din alte surse, relevanța clinică a acestora și rolul diagnosticului molecular în alergiile perene.

Alergia la acarieni din praful de casă

Acarienii din praful de casă sunt cauza principală a alergiilor respiratorii la nivel mondial și reprezintă principala sursă de alergene de interior. Aceștia fac parte din încrengătura artropodelor, în zonele temperate cele mai comune specii fiind Dermatophagoides pteronyssinus (D. pteronyssinus) și Dermatophagoides farinae (D. farinae), din familia Pyroglyphidae. Blomia tropicalis este acarian din familia Echimyopodidae, tipic zonelor subtropicale și tropicale. D. pteronyssinus are o distribuție mai largă la scară globală, în special în zonele temperate, inclusiv în Europa (acarian din praf de casă de tip european), iar D. farinae este mai abundent în zonele mai uscate. Acarienii din praful de casă se găsesc mai ales în locuANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

ințele din zone cu climat cald și umed, dar și în condițiile unui climat rece și uscat, prin invazia locuințelor încălzite. Creșterea și reproducerea acarienilor este optimă la umiditate relativă peste 50% și este redusă prin menținerea umidității între 35% și 50%. Alergenele din acarieni au fost identificate în praful depus pe covoare, lenjeria de pat, saltele, mobilă tapițată, haine. Alergenele provin din corpul acarienilor, fragmente din acesta, precum și din peletele fecale eliminate. Particulele alergenice se depun predominant în căile respiratorii mari și mai puțin în cele mici, deoarece dimensiunea acarienilor este de 0,2-0,4 mm, iar peletele fecale au un diametru de 10-24 µm(6). Expunerea la praful de casă este perenă, dar variabilă, și constituie un factor trigger important al exacerbărilor de astm la pacienții sensibilizați(7). Făina poate fi contaminată cu acarieni, astfel că s-au raportat cazuri de reacții sistemice la persoane care au ingerat produse de panificație contaminate cu acarieni (clătite, mămăligă, baghete, turte etc.) (6). Ambele specii de acarieni din praful de casă din familia Pyroglyphidae sunt surse de alergene majore, descrise clasic ca proteine de grup 1 (Der p 1/ Der f 1 din familia cistein-proteazelor) și grup 2 (Der p 2/ Der f 2 din familia NPC2). Der p 1 este alergenul clonat și produs prima oară sub formă recombinată(8). Gradul de omologie structurală între alergenele din același grup este foarte mare, ceea ce determină frecvent reactivitate încrucișată (9). Au fost identificate la momentul actual peste 30 de alergene specifice acarienilor din praful de casă, în tabelul 1 fiind prezentate principalele alergene ale acestora.

educaţie medicală continuă Componentele moleculare principale ale acarienilor din praful de casă: Der p 1/Der f 1 și Der p 2/Der f 2, alergenele de grup 1 și 2, sunt recunoscute de mult timp drept alergene majore specifice din acarieni(7,9-11). Totuși, în medie, 20% dintre persoanele alergice la acarieni nu sunt sensibilizate la acestea. O proporție semnificativă (63-97%) dintre pacienții alergici la praf de casă sunt sensibilizați la Der p 1 și Der p 2 (12), astfel că un grup destul de mare de pacienți ar putea rămâne nedepistați dacă se folosesc teste de determinare serologică a IgE conținând doar componente de grup 1 și 2. O particularitate a Der p 1 (protează) este capacitatea de a cliva receptorii CD23 ai limfocitelor B, aceștia devenind liberi, fără a mai putea fi implicați în autoreglarea răspunsului IgE mediat(13). Der p 1 și celelalte proteaze din componența acarienilor (Der p 3, 6 și 9), pe lângă rolul direct în inducerea răspunsului imun de tip alergic, sunt implicate și în mecanisme inflamatorii non-IgE mediate, precum perturbarea funcției de barieră a epiteliului, clivarea receptorilor de suprafață, activarea unor receptori specifici imunității înnăscute (PAR), reducerea clearance-ului pulmonar (14). Der p 23 a fost identificat recent ca un alergen major (rata de sensibilizare este de 74%)(15,16). A fost încadrat, prin analiza secvenței peptidice, în grupul proteinelor de tip peritrofină (din stratul peritrofic care căptușește epiteliul digestiv), fiind de asemenea detectat în peletele fecale ale acarienilor. Importanța clinică a acestui alergen este legată de faptul că sensibilizarea la Der p 23 se asociază cu dezvoltarea astmului(17). La copii, sensibilizarea înaintea vârstei de 5 ani față de oricare din Der p 1, Der p 2 sau Der p 23 este asociată cu dezvoltarea simptomelor de astm(18,19). Acest alergen se găsește în concentrație scăzută în extractele de acarieni utilizate pentru testarea cutanată (15,16,20)2, 5, 7, 10 and 21. În consecință, pentru evidențierea sensibilizării față de Der p 23 este necesară testarea moleculară in vitro singleplex și/sau multiplex. Der p 3 este un alergen major din familia proteinelor de tip tripsină cu o reactivitate IgE-specifică de 50% în rândul pacienților sensibilizați la D. pteronyssinus, însă de obicei cu un titru scăzut (21,22). Der p 4 este o alfa-amilază din familia hidrolazelor de glicozide cu o reactivitate IgE-specifică destul de mare, însă cu un titru scăzut(23). Sensibilizarea apare mai rar la copii (25%) comparativ cu adulții (46%)(24). Pacienții infectați cu Sarcoptes scabiei prezintă un titru crescut de IgE specifice față de Der p 4 (25). Der p 5 are o reactivitate IgE-specifică de 50%, însă de obicei cu un titru scăzut (21). Prevalența sensibilizării la acest alergen variază în funcție de grupul de pacienți testați, unele populații având titru IgE similar cu cel indus de alergenele majore Der p 1 și Der p 2(26,27). Importanța clinică a acestei componente alergenice este legată de faptul că sensibilizarea la Der p 5 se asociază cu dezvoltarea astmului(28).

Der p 6 este un alergen din familia chimotripsinelor, cu o reactivitate IgE-specifică de 40-50%, însă de obicei cu un titru scăzut(21,29). Der p 9 este un alergen omolog din punct de vedere structural atât cu Der p 3, cât și cu Der p 6(30). Într-o cohortă de pacienți alergici la acarieni, cu reacție înaltă la alergenele majore Der p 1 (97%), Der p 2 (100%) și Der p 3 (97%), s-a evidențiat și o rată de sensibilizare înaltă la Der p 9 (92%) și Der p 6 (65%)(31). Der p 7, o proteină de legare a lipidelor, induce o rată de sensibilizare de 50%, dar cu un titru IgE specific scăzut(21,32). Alergenul recombinat rDer p 7 prezintă o reactivitate similară cu cel natural(27). Prevalența sensibilizării la acest alergen este mai mică în rândul copiilor alergici la acarieni(33). La unii pacienți sensibilizați la acarieni, titrul IgE Der p 7-specific poate fi mai mare decât titrul IgE Der p 2-specific(34). Der p 8 este o proteină din familia glutation S-transferazelor, cu o reactivitate IgE-specifică de 40-56%. Importanța clinică a acestei componente este legată de faptul că sensibilizarea la Der p 8 se asociază cu dezvoltarea astmului(21,35). Der p 8 prezintă o omologie structurală ridicată cu glutation S-transferaza din Sarcoptes scabiei, asociată cu mecanismele formării crustelor din scabie (36). Din punct de vedere structural, ar putea da reactivitate încrucișată cu Asc l 13, însă reactivitatea nu a putut fi confirmată prin studii(36-38). Der p 10 este o proteină din familia tropomiozinelor care induce o rată de sensibilizare redusă. Der p 10 este principalul alergen responsabil de reactivitatea încrucișată între acarian și alte nevertebrate, spre exemplu, crustacee precum crevete Pen a 1, homari Hom a 1, moluște cum sunt melci Hel as 1, Tur c 1 sau stridii Cra g 1, gândaci de bucătărie Bla g 7 și helminți (Asc l 3, Ani s 3)(39-42). Dacă în cazul alergiei la acarienii din praful de casă, tropomiozina este un alergen minor, în cazul alergiei la crevete este considerată alergen major (figura 1). Tropomiozinele sunt proteine stabile atât la căldură, cât și la digestie, care produc reacții și după consumul alimentelor preparate termic. Acestea pot induce sindrom de alergie orală, dar și reacții sistemice severe. Un studiu populațional în zone urbanizate cu venit scăzut din Columbia a găsit o rată mai mare de sensibilizare la tropomiozina din limbric (Asc l 3) în rândul pacienților astmatici alergici la praful de casă. Studiul sugerează că infecțiile intermitente cu acest parazit concomitent cu sensibilizarea la acarieni contribuie la sinteza continuă de IgE și susține inflamația alergică (39). Der p 11 este o paramiozină (proteină structurală musculară) cu greutate moleculară mare (~100 kDa). Anticorpii IgE Der p 11-specifici sunt detectați mai frecvent în serul pacienților cu dermatită atopică (43). Der p 21 este o proteină încă necaracterizată, care provine din epiteliul digestiv al acarienilor (44). Der p 21 induce răspuns IgE-specific mai frecvent la copiii astmatici a lerg ici la acarieni față de cei nonastmatici(18). ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Figura 1. Prezentarea alergenelor majore (albastru) și cu reactivitate încrucișată (portocaliu) ale acarianului din praful de casă (Der p). (Pen a – crevete, Bla g, Per a – gândac de bucătărie, Sar s – sarcoptul scabiei, Asc l – limbric.) Prezentare educațională cu modificare după http://wikipedia.org(45)

Relevanța clinică a identificării IgE specifice pentru moleculele alergenice din acarienii din praful de casă constă în: Confirmarea sensibilizării primare la acarienii din praful de casă (Der p 1, Der p 2, Der p 23). Evaluarea riscului de evoluție spre astm a pacienților alergici la acarienii din praful de casă, prin profiluri de sensibilizare moleculară complexe ale IgE Der p-specifice (în particular Der p 1, Der p 2, Der p 23, Der p 5, Der p 7, Der p 8, Der p 21) sau cu titru înalt al acestor anticorpi(46). Cu cât o persoană este sensibilă la mai multe componente alergenice (pattern de sensibilizare mai complex), cu atât severitatea bolii alergice și riscul de evoluție spre astm sunt mai crescute(18). Recomandarea imunoterapiei alergenice (AIT) adecvate. Pacienții reactivi la Der p 1 sunt cei mai potriviți candidați pentru AIT, deoarece alergenul este prezent în preparatele pentru imunoterapie și este de așteptat ca acestea să producă o ameliorare a simptomelor(9,10,49,11,12,16,18-20,47,48). Având în vedere că în preparatele imunoterapeutice bazate pe extracte alergenice componentele moleculare Der p 2, Der p 23 și Der p 10 sunt prezente în cantitate redusă, pacienții sensibilizați doar la acestea nu ar fi candidați potriviți pentru AIT, fiind de așteptat să nu producă efecte benefice(7-11,11-17,19,20,35-37,40,46-48,49)(tabelul 2). Explicarea manifestărilor alergice în cazul pacienților sensibilizați la acarieni din praf de casă după ingerarea unor nevertebrate comestibile (crevete, stridii, midii, homari, melci etc.), datorată componentelor alergenice cu reactivitate încrucișată, cum ar fi tropomiozina Der p 10. ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

Alergia la epitelii ale animalelor de companie

Animalele de companie reprezintă o sursă importantă de aeroalergene, fiind considerate factori de risc pentru dezvoltarea rinitei și astmului alergic în mediul domestic și ocupațional. Dintre acestea, alergia la epitelii de pisică și câine este relevantă mai ales pentru mediul domestic, acestea fiind cele mai întâlnite animale de casă. Efectele expunerii la câini și pisici asupra dezvoltării atopiei și a bolilor alergice sunt în prezent controversate, dacă în trecut expunerea era considerată ca factor de risc major pentru dezvoltarea rinitei și astmului alergic(52-54). De asemenea, există controverse și cu privire la diferențele dintre efectele protectoare față de alergii induse de expunerea la una dintre cele două specii(60). Alergenele acestor animale sunt eliberate prin descuamații epiteliale, salivă și urină, după care se dispersează în aerul din mediul ambiental, aderă la mobilier, dar pot fi și transportate prin haine. Alergenele pot persista în locuințe chiar și șase luni după ce animalul a fost îndepărtat(61). Aceste alergene aparțin mai multor familii de proteine (figura 2), sursele alergenice conținând atât componente specifice speciei, cât și componente responsabile de reactivitate încrucișată. Până în prezent au fost identificate 8 alergene de la pisică și 6 de la câine, în tabelul 3 fiind prezentate cele majore și cele minore cu relevanță clinică. Dintre acestea, lipocalinele reprezintă cea mai importantă familie de proteine alergenice, majoritatea fiind alergene majore – Fel d 4, Can f 1, Can f 6. Aceste proteine prezintă secvență primară cu similaritate scăzută, dar structură tridimensională comună, ceea ce determină reacții de reactivitate

educaţie medicală continuă Tabelul 2

Interpretarea rezultatelor de diagnostic molecular. Prezentare educațională cu modificare după Bradshaw (2018)(51)

Extract total de acarieni

Der p 1

+/-

Der p 2

Der p 10 Der p 23

Interpretare Alergen major Marker de sensibilizare primară Bun indicator pentru AIT(9,10,49,11,12,16,18–20,47,48 Alergen major Marker de sensibilizare primară. Ar putea fi slab reprezentat în preparatele imunoterapeutice, acestea având astfel eficacitate redusă(9,10,48,49,11,12,15,16,18–20,47

Alergen minor Prevalența sensibilizării este de 10% în cazul copiilor și adulților cu astm. Cauză de reactivitate încrucișată cu alte specii, inclusiv crevete. Ar putea fi slab reprezentat în preparatele imunoterapeutice, acestea având astfel eficacitate redusă(9,11,20)

Alergen major Marker de sensibilizare primară. Prezent în cantitate mică în sursa naturală(9,10,48,49,11,15–20,47

Figura 2. Alergenele cunoscute la pisică și câine. Proteinele aparținând familiei lipocalinelor sunt reprezentate cu albastru, albuminele serice – cu portocaliu, laterinele – cu verde, imunoglobulinele – cu gri-deschis, cistatinele – cu galben, uteroglobina – cu roșu-închis și kalicreinele – cu gri-închis. Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(9)

încrucișată. Alergia la pisici este unică printre alergiile la mamifere, deoarece alergenul major Fel d 1 este o proteină din familia uteroglobinelor (implicată în protejarea epiteliilor uscate), și nu o lipocalină. Albuminele serice sunt considerate alergene minore care pot determina multiple răspunsuri pozitive la testarea cu extracte alergenice, datorită reactivității încrucișate. Alergenicitatea animalelor cu blană diferă în funcție de statusul hormonal al acestora (care depinde de sexul animalului, dacă a fost castrat sau nu etc.). Existența unor rase hipoalergenice este controversată, nefiind identificate alergene specifice unor anumite rase de câini sau pisici. În ceea ce privește câinii, nu există un alergen major care să fie responsabil de o prevalență disproporționat de înaltă a IgE specifice comparativ cu alte alergene, așa cum este Fel d 1 la pisică (moleculă care induce o rată de sensibilizare de peste 95%). Nici în cazul alergiei

la pisică eliminarea Fel d 1 nu ar aduce un beneficiu major, deoarece 70% dintre pacienți sunt sensibilizați la mai multe alergene specifice acesteia. În concluzie, nu există rase de pisică sau de câine cu adevărat hipoalergenice, deoarece ar fi necesară inactivarea expresiei tuturor acestor molecule alergenice, iar lipsa acestor proteine funcționale ar putea avea un efect negativ asupra stării de sănătate a animalului(61).

Alergenele epiteliilor de pisică

Pisica (Felis domesticus) este un mamifer carnivor de dimensiuni reduse. Pisica domestică este considerată o subspecie a pisicii sălbatice. Pisicile par să inducă sensibilizare mult mai frecvent decât câinii. S-a observat că 17% dintre persoanele care au pisici ca animale de casă prezintă reacție cutanată pozitivă la testele prick și doar 5% dintre cei care dețin câini(63). ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Tabelul 3

Componente alergenice specifice pentru pisică și câine. Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(62)

Sursă alergen

Felis domesticus (pisică)

Canis familiaris (câine)

Componentă moleculară alergenică

Funcția biochimică

Reactivitate IgE

Reactivitate încrucișată

*Fel d 1

uteroglobină

60-100%

Răspuns la Fel d 1 mai mare în rândul copiilor cu astm

*Fel d 2

albumină serică

14-54%

Risc înalt de reactivitate încrucișată cu alte albumine serice

*Fel d 4

lipocalină

63%

Risc moderat de reactivitate încrucișată cu Can f 6

*Can f 1

lipocalină

50-76%

Risc înalt de reactivitate încrucișată cu Fel d 7

*Can f 2

lipocalină

23-35%

–

*Can f 3

albumină serică

25-59%

Risc înalt de reactivitate încrucișată cu alte albumine serice

*Can f 5

kalicreină

71%

–

Can f 6

lipocalină

23-61%

Risc moderat de reactivitate încrucișată cu Fel d 4

* alergene disponibile comercial pentru testare in vitro în metode de analiză singleplex și multiplex

Componentele moleculare alergenice feline: Fel d 1 este alergenul major, cu o reactivitate IgEspecifică de peste 95%. Prezența reacției față de Fel d 1 este un marker al sensibilizării primare la pisică. Fel d 1 este o uteroglobină din familia secretoglobinelor, cu masa moleculară de 38 kDa, fiind produsă de glandele sebacee (în primul rând), anale și salivare, după care ajunge pe pielea și blana pisicii. Fel d 1 se răspândește în special pe cale aeriană, putând fi depistat și în locuințele fără pisici(64). Producția de Fel d 1 este influențată de hormonii sexuali(65). De exemplu, s-a observat că masculii produc mai mult Fel d 1 decât femelele, iar masculii castrați produc mai puțin Fel d 1 decât cei necastrați(65). Fel d 2 este o proteină cu masa moleculară de 69 kDa din familia albuminelor serice, care se găsește în ser, scuame și salivă(66). Fel d 2 este implicat în sindromul porc-pisică, în care apar reacții alergice induse de consumul cărnii de porc la persoanele sensibilizate la pisică, ca urmare a reacției încrucișate între albumina serică de pisică și cea de porc(67). Fel d 3 este un alergen minor aparținând familiei cistatinelor, care inhibă activitatea cistein-proteazei(68). Fel d 4 (alergen major, marker al sensibilizării primare la pisică) și Fel d 7 sunt alergene din familia lipocalinelor(69). Fel d 5 și Fel d 6 fac parte din familia imunoglobulinelor. Fel d 8 este o laterină cu proprietăți surfactante(70).

Alergenele epiteliilor de câine

Câinele (Canis familiaris) a fost unul dintre primele animale îmblânzite și domesticite, înrudit cu șacalul și vulpea. Alergenele provenite de la câine se găsesc în cantitate mare în ser, scuame, păr și salivă, aceste produse biologice prezentând astfel un grad ridicat de alergenicitate, și într-o foarte mică măsură în urină și fecale, acestea fiind produse biologice cu alergenicitate redusă(71). ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

Componentele moleculare alergenice canine: Can f 1, o proteină cu masa moleculară de 25 kDa din familia lipocalinelor, este cel mai important alergen major, cu o rată de sensibilizare de până la 90%. Can f 1 este marker al sensibilizării primare la câine (72). Acest alergen se găsește pe păr, descuamații epiteliale și în salivă. Poate deveni aeropurtat foarte ușor și rămâne în aer o perioadă lungă, iar datorită dimensiunii mici poate ajunge în căile respiratorii inferioare față de particulele mai mari, cum ar fi fecalele de acarieni și grăuncioarele de polen. Există puține studii cu privire la nivelurile de Can f 1 la diferite rase de câini, dar se pare că există variabilitate mai mare între exemplare de aceeași rasă decât între rase diferite (73). Can f 2 este un alergen minor din familia lipocalinelor, cu masa moleculară cuprinsă între 19 kDa și 27 kDa, care se găsește în salivă și descuamații epiteliale. Can f 2 prezintă un grad redus de reactivitate încrucișată cu Fel d 4, deși secvențele proteice sunt identice în procent de doar 22%. Can f 3 este un alergen minor cu masa moleculară de 69 kDa, care face parte din familia albuminelor serice și se găsește din abundență în salivă și descuamații epiteliale. Prezintă potențial înalt de reacții încrucișate cu alte albumine serice, precum Fel d 2. Can f 4 este un alergen minor identificat în scuamele de câine, care aparține familiei lipocalinelor. Can f 5 este un alergen major din familia serin-proteazelor, fiind o kalicreină prostatică, izolată din urina câinilor masculi, dar care se găsește și în descuamații epiteliale și pe păr (74) . Acest alergen poate prezenta reactivitate încrucișată cu componente din fluidul seminal uman, putând determina manifestări alergice la persoanele sensibilizate (75). Pacienții monosensibilizați la acest alergen pot tolera câinii femele (70).

educaţie medicală continuă Relevanța clinică și diagnosticul alergiilor la animalele de companie cu blană constă în: Confirmarea sensibilizării primare prin reacția IgEmediată la alergenele majore (la pisică – Fel d 1, la câine – Can f 1, Can f 2, Can f 5). Evaluarea severității bolii alergice la pacienții prin identificarea de profiluri complexe ale IgE specifice la animale, asociate cu un grad crescut al inflamației bronșice în cazul astmului sever (76). Recomandarea imunoterapiei alergenice (AIT) adecvate. Animalele de companie produc molecule cu potențial de reactivitate încrucișată, precum albuminele serice, unele lipocaline, posibil și alte molecule, astfel că identificarea sursei de sensibilizare primară prin markerii specifici pentru sensibilizare este importantă pentru alegerea unei imunoterapii alergenice adecvate(77). Explicarea simptomelor care apar în cazul pacienților alergici prin sensibilizarea la alergenele care induc reactivitate încrucișată, de exemplu pentru clasa albuminelor, titrul ridicat de IgE Fel d 2-specific a fost asociat cu dermatita atopică la copiii cu alergie la pisici(78). De asemenea, albuminele serice sunt implicate în sindromul porc-pisică, unde sensibilizarea la albumina serică de pisică reprezintă evenimentul care declanșează producția de IgE cu reactivitate încrucișată față de albumina serică de porc (79). În cazul lipocalinelor cu un grad scăzut de omologie structurală, IgE specifice nu determină apariția simptomelor datorate reactivității încrucișate. În schimb, în cazul sensibilizării la lipocaline cu grad înalt de omologie structurală, sensibilizarea primară va determina apariția simptomelor datorate reactivității încrucișate cu alte surse de alergene. Deoarece monosensibilizarea la aceste componente pare a fi rară, există puține date legate de apariția simptomelor datorate reactivității încrucișate. Opțiunea pentru un animal de casă aparent mai puțin alergenic – femelă mai degrabă decât mascul, mascul castrat mai degrabă decât necastrat.

Alergia la fungi/mucegaiuri

Principalele genuri de fungi care produc sensibilizare alergică sunt Alternaria, Aspergillus, Cladosporium și Penicillium, la care expunerea poate avea loc în atât în interior, cât și în exterior (51). Sporii acestora sunt de dimensiuni mici (3-10 µm) astfel încât penetrează profund în tractul respirator și duc la dezvoltarea rinitei și astmului(80). Expunerea la spori poate fi sezonieră – în cazul Cladosporium și Alternaria (cu expunere maximă în timpul verii(80)) sau perenă – în cazul Aspergillus și Penicillium, fiind favorizată și de prezența acestora în alimente (80). Sensibilizarea la mucegaiuri asociată cu sensibilizarea la alergene din alte surse crește riscul de dezvoltare a astmului sever, denumit „astm sever cu sensibilizare fungică” (SAFS) (51). Alternaria alternata și Aspergillus fumigatus sunt speciile care produc cel mai frecvent sensibilizare la mucegaiuri și contribuie la declanșarea și la creșterea severității astmului(81). Testarea reactivității la compo-

nente moleculare alergenice este o abordare diagnostică modernă in vitro a sensibilizării la mucegaiuri(51).

Alergenele din Alternaria alternata

Alternaria alternata (Alt a) este o sursă de alergene prezentă atât în exteriorul, cât și în interiorul locuinței. Sporii Alternaria aeropurtați sunt detectabili din luna mai până în luna noiembrie, cu un vârf la sfârșitul verii și toamna în regiunile cu climă temperată (82). În spațiile interioare, sporii Alternaria sunt prezenți îndeosebi în praful de casă și în spațiile cu umiditate ridicată (83), ceea ce contribuie la o expunere perenă (84). Această specie de fungi este detectată în cereale și în praful din ferme, astfel încât fermierii au un risc crescut pentru boli respiratorii ocupaționale(85,86). Alternaria alternata este una dintre principalele surse de alergene care afectează copiii și adolescenții cu rinită alergică și astm(87-89). Sensibilizarea la A. alternata este recunoscută ca factor de risc atât pentru dezvoltarea și persistența astmului, cât și pentru severitatea și exacerbările astmatice severe(51,83). Pacienții sensibilizați la A. alternata au de asemenea risc să dezvolte forme severe de rinită alergică(51). Componentele moleculare alergenice prezente în A. alternata: Alt a 1 este alergenul major, care induce reacție IgEmediată la 80-100% dintre pacienții alergici la acesta. Reacția pozitivă la Alt a 1 indică faptul că sensibilizarea primară este la A. alternata (51). S-a descoperit recent că Alt a 1 este componenta alergenică implicată în sindromul Alternaria-spanac(90). Acesta se datorează unui tip de reactivitate încrucișată între aeroalergenele din Alternaria, alergenele alimentare din spanac și ciupercile din specia Agaricus bisporus și se datorează secvențelor peptidice omoloage, care sunt recunoscute de anticorpii pacienților (42). Au fost identificate și caracterizate 11 alergene minore provenind de la A. alternata, dintre care 9 (Alt a 3, Alt a 5, Alt a 6, Alt a 7, Alt a 8, Alt a 10, Alt a 14, Alt a 15) induc reactivitate încrucișată cu alte specii de fungi provenind din genurile înrudite Cladosporium, Penicillium și Aspergillus (83). Alt a 6, o enolază, este un alergen minor cu o rată de sensibilizare de 22%, care este inclus în setul de alergene utilizate pentru diagnosticarea moleculară a alergiei la A. alternata (91). Alt a 14 este o mangan-superoxid dismutază și un alergen minor recent identificat, care poate prezenta reactivitate încrucișată cu mangan-superoxid dismutaza de origine umană, proces care poate contribui la perpetuarea răspunsului inflamator în astm(83). În baza unor studii recente, se recomandă ca și acest alergen să fie inclus în diagnosticarea moleculară a alergiei la A. alternata, alături de Alt a 1 și Alt a 6(91).

Alergenele din Aspergillus fumigatus

Aspergillus fumigatus (Asp f) este o altă sursă importantă de spori, prezenți atât la interior, cât și la exterior. Expunerea la conidii și micelii provenind de la A. fumiANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Figura 3. Componente alergenice caracteristice A. fumigatus, utilizate în diagnosticarea ABPA. Prezentare educațională cu modificare după Kespohl și Raulf (2014)(93)

gatus este perenă, fiind responsabilă pentru o serie de manifestări clinice, de la astm alergic, pneumonită de hipersensibilitate de tip „plămânul fermierului” până la aspergiloză invazivă și aspergilom. Complexitatea structurii antigenice a A. fumigatus și răspunsurile imune variabile determină severitatea manifestărilor clinice(51). Unii autori estimează că între 15% și 20% dintre cazurile de astm alergic se datorează sensibilizării la Aspergillus(92). De asemenea, A. fumigatus este agentul etiologic pentru cea mai întâlnită și severă formă de micoză alergică bronhopulmonară, aspergiloza bronhopulmonară alergică (ABPA)(51). Sensibilizarea la A. fumigatus nu este ușor identificabilă, acesta prezentând reactivitate încrucișată cu alte specii de fungi, ceea ce poate duce la rezultate nespecifice. De aceea folosirea unor componente alergenice IgEspecifice pentru A. fumigatus poate ajuta la identificarea sensibilizării primare la A. fumigatus (51). Procedura de rutină pentru diagnosticul ABPA presupune determinarea IgE specific la A. fumigatus. Componentele alergenice incluse în testul diagnostic ImmunoCAP pot diferenția pacienții care prezintă ABPA de cei sensibilizați doar la Aspergillus.

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

Componentele moleculare alergenice prezente în A. fumigatus: Asp f 1, o ribotoxină, este o componentă alergenică majoră cu specificitate de specie și o rată de sensibilizare de 83% la pacienții cu ABPA. Asp f 2 este o altă componentă cu specificitate de specie, care induce reacție IgE specifică în 96% dintre cazurile clinice care manifestă ABPA. Asp f 3 este o proteină peroxizomală cu o rată de sensibilizare de 88% pentru pacienții cu ABPA și de 52% pentru pacienții alergici. Asp f 4 induce reacție IgE specifică în 96% dintre cazurile clinice care manifestă ABPA. Asp f 6, o mangan superoxid dismutază, induce reacție IgE specifică la 55% dintre pacienții cu ABPA. Asp f 6 prezintă reactivitate încrucișată cu Alt a 14, alergen caracteristic A. alternata, și cu mangan superoxid dismutaza de origine umană, proces care poate contribui la perpetuarea răspunsului inflamator în astm. Componentele alergenice Asp f 2, Asp f 4 și Asp f 6 pot fi folosite pentru a identifica exclusiv pacienții cu ABPA, totuși sunt necesare studii clinice pe cohorte mai mari pentru a confirma această asociere(51) (figura 3).

educaţie medicală continuă Tabelul 4

Componente alergenice majore și cu reactivitate încrucișată, caracteristice Alternaria alternata și Aspergillus fumigatus. Prezentare educațională cu modificare după Matricardi et al. (2016)(9) și Gabriel et al. (2016)(83)

Sursă alergen

A. alternata

A. fumigatus

Componentă moleculară alergenică

Funcție biologică

Reactivitate IgE

Reactivitate încrucișată –

*Alt a 1

necunoscută

82% (alergie) (94)

Alt a 3

proteină de șoc termic

Cu specii din genurile Penicillium și Malassezia(83)

Alt a 5

proteină ribozomală

20-50%(96)

Cu specii din genurile Cladosporium, Aspergillus(83)

*Alt a 6

enolază

7-22%(91,97)

Cu specii din genurile Cladosporium, Penicillium, Aspergillus(83)

Alt a 7

flavodoxină

7%(97)

Cladosporium herbarum(83)

Alt a 8

manitol dehidrogenază

Necunoscută

Cladosporium herbarum(83)

Alt a 10

aldehid dehidrogenază

2%(98)

Cladosporium herbarum(83)

Alt a 12

proteină ribozomală

Necunoscută

Cu specii din genurile Cladosporium, Penicillium(83)

Alt a 14

mangan superoxid dismutază (MnSOD)

Necunoscută

Cu proteina MnSOD de origine umană(83)

Alt a 15

serin protează

Necunoscută

Cu specii din genurile Cladosporium, Penicillium, Aspergillus(83)

*Asp f 1

ribotoxină

83% (ABPA) 45% (alergie) (99)

–

*Asp f 2

necunoscută

96% (ABPA) 0% (alergie) (43)

–

*Asp f 3

proteină peroxizomală

88% (ABPA) 52% (alergie) (99)

*Asp f 4

necunoscută

80% (ABPA) 0% (alergie) (99)

Asp f 5

metaloprotează

93% (ABPA) 74% (alergie) (102)

Aspergillus oryzae(103)

*Asp f 6

mangan superoxid dismutază (MnSOD)

55% (ABPA) 0% (alergie) (99)

Cu proteina MnSOD de origine umană(104)

Asp f 9

necunoscută

89% (ABPA) 31% (alergie) (102)

–

Asp f 11

ciclofilină

90% (alergie) (105)

–

Asp f 16

necunoscută

70% (ABPA)

–

Asp f 18

serin-protează vacuolară

Asp f 22

(95)

(106)

Penicillium citrinum(100), Malassezia furfur(101). –

79% (alergie)

(107)

–

enolază

86% (alergie)

(108)

–

Asp f 27

ciclofilină

75% (ABPA)

Asp f 34

proteină de perete celular PhiA

93% (ABPA) 46% (alergie) (110)

(109)

– –

* alergene disponibile comercial pentru testare in vitro în metode de analiză singleplex și multiplex

Principalele alergene caracteristice A. alternata și A. fumigatus sunt prezentate în tabelul 4.

Concluzii

Identificarea anticorpilor IgE specifici față de componentele moleculare alergenice a îmbunătățit semnificativ diagnosticul bolilor alergice. Diagnosticul molecular permite identificarea sensibilizării primare, diferențierea între sensibilizare primară și reactivitate încrucișată și chiar evaluarea riscului de a dezvolta reacții alergice severe din cauza particularităților unor componente alergenice (rezistență la pregătire termică a alimentelor și digestie, capaci-

tate de a induce anafilaxie). Este importantă și cunoașterea sindroamelor/asocierilor prin reactivitate încrucișată induse de alergenele de interior (sindrom porc-pisică, Alternaria-spanac, acarieni-crustacee) și a componentelor alergenice implicate. Pacienții sensibilizați la acarieni pot dezvolta reacții alergice la alimente nevertebrate (crustacee, moluște)(111). Pacienții sensibilizați la epitelii de pisică, pot semnala simptome alergice după consumul de carne de porc, ca urmare a reacției încrucișate a albuminelor. Pacienții sensibilizați la epitelii de câine pot prezenta reactivitate încrucișată redusă cu carnea de porc și mai ridicată cu componentele alergenice majore din epitelii de pisică(112). ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Bibliografie

Rareori, un pacient alergic la mucegaiuri poate prezenta reacție alergică după consumul de spanac, condiție cunoscută drept sindromul Alternaria-spanac(90). Există reactivitate încrucișată între alergene din mucegaiuri și alergene alimentare provenite din spanac și ciuperci din genul Agaricus bisporus(42). Imunoterapia alergenică este recomandată ca tratament specific în rinita alergică și în astm conform ghidurilor recente ARIA și GINA, datorită faptului că, la momentul actual, este singura opțiune terapeutică disponibilă pentru a modifica evoluția bolii alergice pe termen lung (ani), prin efectele de diminuare a răspunsului imun de tip IgE și promovare a toleranței imunologice nu doar față de alergenul vizat, ci și ca mecanism de răspuns al organismului la alte potențiale alergene. Pentru a 1. Plaschke PP, Janson C, Norrman E, Bjornsson E, Ellbjar S, Jarvholm B. Onset and remission of allergic rhinitis and asthma and the relationship with atopic sensitization and smoking. Am J Respir Crit Care Med. 2000;162(3 I):920-924. doi:10.1164/ajrccm.162.3.9912030 2. Belhassen M, Demoly P, Bloch-Morot E, et al. Costs of perennial allergic rhinitis and allergic asthma increase with severity and poor disease control. Allergy Eur J Allergy Clin Immunol. 2017;72(6):948-958. doi:10.1111/all.13098 3. Ciprandi G, Cirillo I, Vizzaccaro A, et al. Seasonal and perennial allergic rhinitis: Is this classification adherent to real life? Allergy Eur J Allergy Clin Immunol. 2005;60(7):882887. doi:10.1111/j.1398-9995.2005.00602.x 4. Bousquet J, Khaltaev N, Cruz AA, et al. Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma (ARIA) 2008 update (in collaboration with the World Health Organization, GA(2)LEN and AllerGen). Allergy. 2008;63 Suppl 8:8-160. doi:10.1111/j.1398-9995.2007.01620.x 5. García B, Lizaso M. Cross-reactivity Syndromes in Food Allergy. J Investig Allergol Clin Immunol. 2011;21:162-170; quiz 2 p following 170. 6. Portnoy J, Miller JD, Williams PB, et al. Environmental assessment and exposure control of dust mites: a practice parameter. Ann Allergy Asthma Immunol. 2013;111(6):465-507. doi:10.1016/j.anai.2013.09.018 7. Calderón MA, Kleine-Tebbe J, Linneberg A, et al. House Dust Mite Respiratory Allergy: An Overview of Current Therapeutic Strategies. J Allergy Clin Immunol Pract. 2015;3(6):843-855. doi:10.1016/J.JAIP.2015.06.019 8. Chua KY, Stewart GA, Thomas WR, et al. Sequence analysis of cdna coding for a major house dust mite allergen, Der p 1: Homology with cysteine proteases. J Exp Med. 1988. doi:10.1084/jem.167.1.175 9. Matricardi PM, Kleine-Tebbe J, Hoffmann HJ, et al. EAACI Molecular Allergology User’s Guide. Pediatr Allergy Immunol. 2016;27(S23):1-250. doi:10.1111/pai.12563 10. Canonica GW, Ansotegui IJ, Pawankar R, et al. A WAO – ARIA – GA2LEN consensus document on molecular-based allergy diagnostics. World Allergy Organ J. 2013;6(1):117. doi:10.1186/1939-4551-6-17 11. Kleine-Tebbe J, Jakob T. Molecular Allergy Diagnostics: Innovation for a Better Patient Management.; 2017. doi:10.1007/978-3-319-42499-6 12. Nolte H, Plunkett G, Grosch K, Larsen JN, Lund K, Bollen M. Major allergen content consistency of SQ house dust mite sublingual immunotherapy tablets and relevance across geographic regions. Ann Allergy, Asthma Immunol. 2016;117(3):298303. doi:10.1016/J.ANAI.2016.07.004 13. Hewitt CRA, Brown AP, Hart BJ, Pritchard DI. A major house dust mite allergen disrupts the immunoglobulin E network by selectively cleaving CD23: Innate protection by antiproteases. J Exp Med. 1995. doi:10.1084/jem.182.5.1537 14. Reithofer M, Jahn-Schmid B. Allergens with protease activity from house dust mites. Int J Mol Sci. 2017. doi:10.3390/ijms18071368 15. Weghofer M, Grote M, Resch Y, et al. Identification of Der p 23, a Peritrophinlike Protein, as a New Major <em>Dermatophagoides pteronyssinus</em> Allergen Associated with the Peritrophic Matrix of Mite Fecal Pellets. J Immunol. 2013;190(7):3059 LP – 3067. doi:10.4049/jimmunol.1202288 16. Becker S, Schlederer T, Kramer MF, et al. Real-Life Study for the Diagnosis of House Dust Mite Allergy – The Value of Recombinant Allergen-Based IgE Serology. Int Arch Allergy Immunol. 2016;170(2):132-137. doi:10.1159/000447694 17. Mueller GA, Randall TA, Glesner J, et al. Serological, genomic and structural analyses of the major mite allergen Der p 23. Clin Exp Allergy. 2016;46(2):365-376. doi:10.1111/ cea.12680 18. Resch Y, Michel S, Kabesch M, Lupinek C, Valenta R, Vrtala S. Different IgE recognition of mite allergen components in asthmatic and nonasthmatic children. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(4):1083-1091. doi:10.1016/J.JACI.2015.03.024 19. Posa D, Perna S, Resch Y, et al. Evolution and predictive value of IgE responses toward a comprehensive panel of house dust mite allergens during the first 2 decades of life. J Allergy Clin Immunol. 2017;139(2):541-549.e8. doi:10.1016/J. JACI.2016.08.014 20. Casset A, Mari A, Purohit A, et al. Varying Allergen Composition and Content Affects the in vivo Allergenic Activity of Commercial Dermatophagoides pteronyssinus Extracts. Int Arch Allergy Immunol. 2012;159(3):253-262. doi:10.1159/000337654 21. Thomas WR, Smith W-A, Hales BJ, Mills KL, O’Brien RM. Characterization and immunobiology of house dust mite allergens. Int Arch Allergy Immunol. 2002;129(1):1-18. 22. Thomas WR, Smith WA, Hales BJ. The allergenic specificities of the house dust mite. Chang Gung Med J. 2004;27(8):563-569. 23. Mills K, Thomas WR, Smith W. Characterisation of the Group 4 Allergens from the House Dust Mite. University of Western Australia; 2002. 24. Lake FR, Ward LD, Simpson RJ, Thompson PJ, Stewart GA. House dust mite-derived amylase: Allergenicity and physicochemical characterization. J Allergy Clin Immunol. 1991;87(6):1035-1042. doi:10.1016/0091-6749(91)92147-S 25. Sánchez-Borges M, González-Aveledo L, Capriles-Hulett A, Caballero-Fonseca

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

selecta varianta imunoterapeutică optimă este necesar un diagnostic de precizie prin alergologia moleculară, cu identificarea sensibilizării primare și distingerea între polisensibilizarea alergică cauzată de reactivitatea încrucișată și cosensibilizarea primară la alergene provenite din mai multe surse. Astfel, medicul alergolog are un rol foarte important în interpretarea corectă a rezultatelor diagnosticului molecular, cu identificarea relevanței clinice a alergenelor, precum și în administrarea și monitorizarea imunoterapiei alergenice. n Acest articol a fost elaborat în cadrul proiectului INSPIRED (Innovative Strategies for Prevention, Diagnosis and Therapy of Ragweed Pollen Induced Respiratory Diseases) cod SMIS 103662. F. Scabies, crusted (Norwegian) scabies and the diagnosis of mite sensitisation. Allergol Immunopathol (Madr). 2018;46(3):276-280. doi:10.1016/j.aller.2017.05.006 26. Chen K-W, Zieglmayer P, Zieglmayer R, et al. Selection of house dust mite–allergic patients by molecular diagnosis may enhance success of specific immunotherapy. J Allergy Clin Immunol. 2019;143(3):1248-1252.e12. doi:10.1016/J.JACI.2018.10.048 27. Shen HD, Chua KY, Lin WL, Hsieh KH, Thomas WR. Characterization of the house dust mite allergen Der p 7 by monoclonal antibodies. Clin Exp Allergy. 1995;25(5):416-422. doi:10.1111/j.1365-2222.1995.tb01072.x 28. Lin K-L, Hsieh K-H, Thomas WR, Chiang B-L, Chua K-Y. Characterization of Der p V allergen, cDNA analysis, and IgE-mediated reactivity to the recombinant protein. J Allergy Clin Immunol. 1994;94(6):989-996. 29. Yasueda H, Mita H, Akiyama K, et al. Allergens from Dermatophagoides mites with chymotryptic activity. Clin Exp Allergy. 1993;23(5):384-390. 30. Bennett BJ, Thomas WR. Cloning and sequencing of the group 6 allergen of Dermatophagoides pteronyssinus. Clin Exp Allergy. 1996;26(10):1150-1154. 31. Kinga C, Simpsonc RJ, Moritzc RL, Reedc GE, Thompsond PJ, Stewarta GA. The isolation and characterization of a novel collagenolytic serine protease allergen (Der p 9) from the dust mite Dermatophagoides pteronyssinus. J Allergy Clin Immunol. 1996;98(4):739-747. 32. Shen H, Lin W, TSAI L, et al. Characterization of the allergen Der f 7 from house dust mite extracts by species‐specific and crossreactive monoclonal antibodies. Clin Exp Allergy. 1997;27(7):824-832. 33. Shen H, Chua K, Lin K, Hsieh K, Thomas WR. Molecular cloning of a house dust mite allergen with common antibody binding specificities with multiple components in mite extracts. Clin Exp Allergy. 1993;23(11):934-940. 34. Shen H, Chua KY, Lin WL, Chen HL, Hsieh K, Thomas WR. IgE and monoclonal antibody binding by the mite allergen Der p 7. Clin Exp Allergy. 1996;26(3):308-315. 35. Huang CH, Liew LM, Mah KW, Kuo IC, Lee BW, Chua KY. Characterization of glutathione S-transferase from dust mite, Der p 8 and its immunoglobulin E crossreactivity with cockroach glutathione S-transferase. Clin Exp Allergy. 2006;36(3):369376. doi:10.1111/j.1365-2222.2006.02447.x 36. Dougall A, Holt DC, Fischer K, Currie BJ, Kemp DJ, Walton SF. Identification and characterization of Sarcoptes scabiei and Dermatophagoides pteronyssinus glutathione S-transferases: implication as a potential major allergen in crusted scabies. Am J Trop Med Hyg. 2005;73(5):977-984. 37. Acevedo N, Mohr J, Zakzuk J, et al. Proteomic and immunochemical characterization of glutathione transferase as a new allergen of the nematode Ascaris lumbricoides. PLoS One. 2013;8(11):e78353-e78353. doi:10.1371/journal.pone.0078353 38. Mueller GA, Pedersen LC, Glesner J, et al. Analysis of glutathione S-transferase allergen cross-reactivity in a North American population: Relevance for molecular diagnosis. J Allergy Clin Immunol. 2015;136(5):1369-1377. doi:10.1016/j.jaci.2015.03.015 39. Acevedo N, Caraballo L. IgE cross-reactivity between Ascaris lumbricoides and mite allergens: Possible influences on allergic sensitization and asthma. Parasite Immunol. 2011;33(6):309-321. doi:10.1111/j.1365-3024.2011.01288.x 40. Ree R, Antonicelli L, Akkerdaas JH, et al. Asthma after consumption of snails in house-dust-mite-allergic patients: a case of IgE cross-reactivity. Allergy. 1996;51(6):387-393. doi:10.1111/j.1398-9995.1996.tb04635.x 41. Ferreira F, Hawranek T, Gruber P, Wopfner N, Mari A. Allergic cross-reactivity: from gene to the clinic. Allergy. 2004;59(3):243-267. doi:10.1046/j.1398-9995.2003.00407.x 42. Popescu F-D. Cross-reactivity between aeroallergens and food allergens. World J Methodol. 2017;5(2):31. doi:10.5662/wjm.v5.i2.31 43. Banerjee B, Greenberger PA, Fink JN, Kurup VP. Immunological characterization of Asp f 2, a major allergen from Aspergillus fumigatus associated with allergic bronchopulmonary aspergillosis. Infect Immun. 1998;66(11):5175-5182. 44. Weghofer M, Dall’Antonia Y, Grote M, et al. Characterization of Der p 21, a new important allergen derived from the gut of house dust mites. Allergy. 2008;63(6):758-767. 45. https://en.wikipedia.org/. 46. Arasi S, Porcaro F, Cutrera R, Fiocchi AG. Severe Asthma and Allergy: A Pediatric Perspective. Front Pediatr. 2019;7:28. doi:10.3389/fped.2019.00028 47. Thomas WR. House Dust Mite Allergens: New Discoveries and Relevance to the Allergic Patient. Curr Allergy Asthma Rep. 2016;16(9). doi:10.1007/s11882-016-0649-y 48. Asero R. Component-resolved diagnosis-assisted prescription of allergen-specific immunotherapy: A practical guide. Eur Ann Allergy Clin Immunol. 2012;44(5):183-187. 49. Schmid-Grendelmeier P. Rekombinante Allergene: Routinediagnostik oder Wissenschaft? Hautarzt. 2010;61(11):946-953. doi:10.1007/s00105-010-1967-y 50. Shafique RH, Inam M, Ismail M, Chaudhary FR. Group 10 allergens (tropomyosins) from house-dust mites may cause covariation of sensitization to allergens from other invertebrates. Allergy Rhinol. 2013;3(2):74-90. doi:10.2500/ar.2012.3.0036 51. Bradshaw N. Part2. The allergen components. In: Go Molecular! A Clinical Reference Guide to Molecular Allergy. ThermoFisherScientific; 2018. 52. Perzanowski MS, Rönmark E, Platts-Mills TAE, Lundbäck B. Effect of cat and dog

ownership on sensitization and development of asthma among preteenage children. Am J Respir Crit Care Med. 2002;166(5):696-702. 53. Remes ST, Castro-Rodriguez JA, Holberg CJ, Martinez FD, Wright AL, Remes ST. Dog exposure in infancy decreases the subsequent risk of frequent wheeze but not of atopy. J Allergy Clin Immunol. 2001. doi:10.1067/mai.2001.117797 54. Wahn U, Lau S, Bergmann R, et al. Indoor allergen exposure is a risk factor for sensitization during the first three years of life. J Allergy Clin Immunol. 1997. doi:10.1016/S0091-6749(97)80009-7 55. Ownby DR, Johnson CC, Peterson EL. Exposure to dogs and cats in the first year of life and risk of allergic sensitization at 6 to 7 years of age. J Am Med Assoc. 2002. doi:10.1001/jama.288.8.963 56. Hesselmar B, Åberg N, Åberg B, Eriksson B, Björkstén B. Does early exposure to cat or dog protect against later allergy development? Clin Exp Allergy. 1999. doi:10.1046/ j.1365-2222.1999.00534.x 57. Custovic A, Hallam CL, Simpson BM, Craven M, Simpson A, Woodcock A. Decreased prevalence of sensitization to cats with high exposure to cat allergen. J Allergy Clin Immunol. 2001. doi:10.1067/mai.2001.118599 58. Mandhane PJ, Sears MR, Poulton R, et al. Cats and dogs and the risk of atopy in childhood and adulthood. J Allergy Clin Immunol. 2009;124(4):745-50.e4. doi:10.1016/j.jaci.2009.06.038 59. Almqvist C, Egmar AC, Van Hage-Hamsten M, et al. Heredity, pet ownership, and confounding control in a population-based birth cohort. J Allergy Clin Immunol. 2003. doi:10.1067/mai.2003.1334 60. Custovic A, Simpson BM, Simpson A, et al. Current mite, cat, and dog allergen exposure, pet ownership, and sensitization to inhalant allergens in adults. J Allergy Clin Immunol. 2003. doi:10.1067/mai.2003.55 61. Chan SK, Leung DYM. Dog and cat allergies: Current state of diagnostic approaches and challenges. Allergy, Asthma Immunol Res. 2018. doi:10.4168/aair.2018.10.2.97 62. Matricardi PM, Kleine‐Tebbe J, Hoffmann HJ, et al. EAACI molecular allergology user’s guide. Pediatr Allergy Immunol. 2016;27:1-250. 63. Butt A, Rashid D, Lockey RF. Do hypoallergenic cats and dogs exist? Ann Allergy, Asthma Immunol. 2012. doi:10.1016/j.anai.2011.12.005 64. de Groot H, van Swieten P, van Leeuwen J, Lind P, Aalberse RC. Monoclonal antibodies to the major feline allergen Fel d I: I. Serologic and biologic activity of affinity-purified Fel d I and of Fel d I-depleted extract. J Allergy Clin Immunol. 1988;82(5, Part 1):778-786. doi:https://doi.org/10.1016/0091-6749(88)90079-6 65. Charpin C, Zielonka TM, Charpin D, ANSALDI J, Allasia C, Vervloet D. Effects of castration and testosterone on Fel d I production by sebaceous glands of male cats: II—morphometric assessment. Clin Exp Allergy. 1994;24(12):1174-1178. 66. Hilger C, Grigioni F, Hentges F. Sequence of the gene encoding cat (Felis domesticus) serum albumin. Gene. 1996;169(2):295-296. doi:https://doi. org/10.1016/0378-1119(95)00851-9 67. Wallenbeck I, Einarsson R. Identification of dander-specific and serum-specific allergens in cat dandruff extract. Ann Allergy. 1987;59(2):131-134. 68. Ichikawa K, Vailes LD, Pomes A, Chapman MD. Identification of a novel cat allergen-cystatin. Int Arch Allergy Immunol. 2001;124(1-3):55-56. doi:10.1159/000053667 69. Smith W, Butler AJL, Hazell LA, et al. Fel d 4, a cat lipocalin allergen. Clin Exp Allergy. 2004;34(11):1732-1738. doi:10.1111/j.1365-2222.2004.02090.x 70. Zahradnik E, Raulf M. Respiratory Allergens from Furred Mammals: Environmental and Occupational Exposure. Vet Sci. 2017;4(3). doi:10.3390/vetsci4030038 71. Brehm K, Plock K, Doepp M, Baier H. [Antigenicity of serum albumin in allergy against cat or dog epithelium (significance of the radioallergosorbens test in the diagnosis of allergies)]. Dtsch Med Wochenschr. 1975;100(10):472-476. doi:10.1055/s-0028-1106240 72. FORD AW, ALTERMAN L, KEMENY DM. The allergens of dog. I. Identification using crossed radio-immunoelectrophoresis. Clin Exp Allergy. 1989;19(2):183-190. doi:10.1111/j.1365-2222.1989.tb02362.x 73. Vredegoor DW, Willemse T, Chapman MD, Heederik DJJ, Krop EJM. Can f 1 levels in hair and homes of different dog twbreeds: Lack of evidence to describe any dog breed as hypoallergenictw. J Allergy Clin Immunol. 2012. doi:10.1016/j.jaci.2012.05.013 74. Schoos A-MM, Bønnelykke K, Chawes BL, Stokholm J, Bisgaard H, Kristensen B. Precision allergy: Separate allergies to male and female dogs. J Allergy Clin Immunol Pract. 2017;5(6):1754-1756. 75. Basagaña M, Bartolome B, Pastor-Vargas C, Mattsson L, Lidholm J, Labrador-Horrillo M. Involvement of Can f 5 in a case of human seminal plasma allergy. Int Arch Allergy Immunol. 2012;159(2):143-146. 76. Virtanen T. Immunotherapy for pet allergies. Hum Vaccines Immunother. 2018. doi:10 .1080/21645515.2017.1409315 77. Asarnoj A, Hamsten C, Wadén K, et al. Sensitization to cat and dog allergen molecules in childhood and prediction of symptoms of cat and dog allergy in adolescence: a BAMSE/MeDALL study. J Allergy Clin Immunol. 2016;137(3):813-821. 78. Wisniewski JA, Agrawal R, Minnicozzi S, et al. Sensitization to food and inhalant allergens in relation to age and wheeze among children with atopic dermatitis: Clinical Mechanisms in Allergic Disease. Clin Exp Allergy. 2013;43(10):1160-1170. 79. Hilger C, Kohnen M, Grigioni F, Lehners C, Hentges F. Allergic cross‐reactions between cat and pig serum albumin: Study at the protein and DNA levels. Allergy. 1997;52(2):179-187. 80. Canonica GW, Ansotegui IJ, Pawankar R, et al. A WAO – ARIA – GA2LEN consensus document on molecular-based allergy diagnostics. World Allergy Organ J. 2013;6(1):17. doi:10.1186/1939-4551-6-17 81. Byeon JH, Ri S, Amarsaikhan O, et al. Association Between Sensitization to Mold and Impaired Pulmonary Function in Children With Asthma. Allergy Asthma Immunol Res. 2017;9(6):509-516. doi:10.4168/aair.2017.9.6.509 82. Weber RW. Alternaria alternata. Ann Allergy Asthma Immunol. 2001. 83. Gabriel MF, Postigo I, Tomaz CT, Martinez J. Alternaria alternata allergens: Markers of exposure, phylogeny and risk of fungi-induced respiratory allergy. Environ Int. 2016;89-90:71-80. doi:10.1016/j.envint.2016.01.003 84. Salo PM, Arbes Jr SJ, Sever M, et al. Exposure to Alternaria alternata in US homes

is associated with asthma symptoms. J Allergy Clin Immunol. 2006;118(4):892-898. doi:10.1016/j.jaci.2006.07.037 85. Prester L, Macan J. Determination of Alt a 1 (Alternaria alternata) in poultry farms and a sawmill using ELISA. Med Mycol. 2010;48(2):298-302. doi:10.1080/13693780903115402 86. Pulimood TB, Corden JM, Bryden C, Sharples L, Nasser SM. Epidemic asthma and the role of the fungal mold Alternaria alternata. J Allergy Clin Immunol. 2007;120(3):610617. doi:10.1016/j.jaci.2007.04.045 87. Mari A, Schneider P, Wally V, Breitenbach M, Simon-Nobbe B. Sensitization to fungi: epidemiology, comparative skin tests, and IgE reactivity of fungal extracts. Clin Exp Allergy. 2003;33(10):1429-1438. doi:10.1046/j.1365-2222.2003.01783.x 88. Katotomichelakis M, Anastassakis K, Gouveris H, et al. Clinical significance of Alternaria alternata sensitization in patients with allergic rhinitis. Am J Otolaryngol. 2012;33(2):232-238. doi:https://doi.org/10.1016/j.amjoto.2011.07.004 89. Perzanowski MS, Sporik R, Squillace SP, et al. Association of sensitization to Alternaria allergens with asthma among school-age children. J Allergy Clin Immunol. 1998;101(5):626-632. doi:10.1016/S0091-6749(98)70170-8 90. Melioli G, Spenser C, Reggiardo G, et al. Allergenius, an expert system for the interpretation of allergen microarray results. World Allergy Organ J. 2014;7(1):15. doi:10.1186/1939-4551-7-15 91. Postigo I, Gutiérrez-Rodríguez A, Fernández J, Guisantes JA, Suñŕn E, Martínez J. Diagnostic value of Alt a 1, fungal enolase and manganese-dependent superoxide dismutase in the component-resolved diagnosis of allergy to pleosporaceae. Clin Exp Allergy. 2011. doi:10.1111/j.1365-2222.2010.03671.x 92. Harris Steinman. Asp f 1 Aspergillus fumigatus. http://www.phadia.com/en/ Products/Allergy-testing-products/ImmunoCAP-Allergen-Information/Molds-andother-Microorganisms/Allergen-Components/rAsp-f-1-Aspergillus-fumigatus/. 93. Kespohl S, Raulf MA. Mould allergens: Where do we stand with molecular allergy diagnostics? Part 13 of the series Molecular Allergology. Allergo J. 2014. doi:10.1007/ s40629-014-0014-4 94. De Vouge MW, Thaker AJ, Curran IH, et al. Isolation and expression of a cDNA clone encoding an Alternaria alternata Alt a 1 subunit. Int Arch Allergy Immunol. 1996;111(4):385-395. doi:10.1159/000237397 95. De Vouge MW, Thaker AJ, Zhang L, Muradia G, Rode H, Vijay HM. Molecular cloning of IgE-binding fragments of Alternaria alternata allergens. Int Arch Allergy Immunol. 1998;116(4):261-268. doi:10.1159/000023954 96. Breitenbach M, Simon-Nobbe B. The allergens of Cladosporium herbarum and Alternaria alternata. Chem Immunol. 2002;81:48-72. doi:10.1159/000058862 97. Achatz G, Oberkofler H, Lechenauer E, et al. Molecular cloning of major and minor allergens of Alternaria alternata and Cladosporium herbarum. Mol Immunol. 1995. doi:10.1016/0161-5890(94)00108-D 98. Sanchez H, Bush RK. A review of Alternaria alternata sensitivity. Rev Iberoam Micol. 2001. 99. Crameri R, Hemmann S, Ismail C, Menz G, Blaser K. Disease-specific recombinant allergens for the diagnosis of allergic bronchopulmonary aspergillosis. Int Immunol. 1998;10(8):1211-1216. doi:10.1093/intimm/10.8.1211 100. Shen HD, Wang CW, Chou H, et al. Complementary DNA cloning and immunologic characterization of a new Penicillium citrinum allergen (Pen c 3). J Allergy Clin Immunol. 2000;105(4):827-833. doi:10.1067/mai.2000.105220 101. Lindborg M, Magnusson CG, Zargari A, et al. Selective cloning of allergens from the skin colonizing yeast Malassezia furfur by phage surface display technology. J Invest Dermatol. 1999;113(2):156-161. doi:10.1046/j.1523-1747.1999.00661.x 102. Crameri R. Recombinant Aspergillus fumigatus allergens: from the nucleotide sequences to clinical applications. Int Arch Allergy Immunol. 1998;115(2):99-114. doi:10.1159/000023889 103. Bowyer P, Fraczek M, Denning DW. Comparative genomics of fungal allergens and epitopes shows widespread distribution of closely related allergen and epitope orthologues. BMC Genomics. 2006. doi:10.1186/1471-2164-7-251 104. Fluckiger S, Scapozza L, Mayer C, Blaser K, Folkers G, Crameri R. Immunological and structural analysis of IgE-mediated cross-reactivity between manganese superoxide dismutases. Int Arch Allergy Immunol. 2002;128(4):292-303. doi:10.1159/000063862 105. Fluckiger S, Fijten H, Whitley P, Blaser K, Crameri R. Cyclophilins, a new family of cross-reactive allergens. Eur J Immunol. 2002;32(1):10-17. doi:10.1002/15214141(200201)32:1<10::AID-IMMU10>3.0.CO;2-I 106. Banerjee B, Kurup VP, Greenberger PA, Johnson BD, Fink JN. Cloning and expression of Aspergillus fumigatus allergen Asp f 16 mediating both humoral and cell-mediated immunity in allergic bronchopulmonary aspergillosis (ABPA). Clin Exp Allergy. 2001. doi:10.1046/j.1365-2222.2001.01076.x 107. Shen HD, Lin WL, Tam MF, et al. Identification of vacuolar serine proteinase as a major allergen of Aspergillus fumigatus by immunoblotting and N-terminal amino acid sequence analysis. Clin Exp Allergy. 2001. doi:10.1046/j.1365-2222.2001.01026.x 108. Lai HY, Tam MF, Tang R Bin, et al. cDNA cloning and immunological characterization of a newly identified enolase allergen from Penicillium citrinum and Aspergillus fumigatus. Int Arch Allergy Immunol. 2002. doi:10.1159/000053862 109. Glaser AG, Limacher A, Flückiger S, Scheynius A, Scapozza L, Crameri R. Analysis of the cross-reactivity and of the 1.5 Å crystal structure of the Malassezia sympodialis Mala s 6 allergen, a member of the cyclophilin pan-allergen family. Biochem J. 2006. doi:10.1042/BJ20051708 110. Glaser AG, Kirsch AI, Zeller S, Menz G, Rhyner C, Crameri R. Molecular and immunological characterization of Asp f 34, a novel major cell wall allergen of Aspergillus fumigatus. Allergy Eur J Allergy Clin Immunol. 2009. doi:10.1111/j.1398-9995.2009.02029.x 111. Bessot JC, Metz-Favre C, Rame JM, De Blay F, Pauli G. Tropomyosin or not tropomyosin, what is the relevant allergen in house dust mite and snail cross allergies? Eur Ann Allergy Clin Immunol. 2010;42(1):3-10. 112. Mamikoglu B. Beef, Pork, and Milk Allergy (Cross Reactivity with Each Other and Pet Allergies). Otolaryngol Neck Surg. 2005;133(4):534-537. doi:10.1016/j. otohns.2005.07.016

Reclamă ALG 4(1)0103

Bibliografie

educaţie medicală continuă

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

rubrica specialistului

Inhibitorii de N-glicani în metodele de imunoanaliză pentru IgE alergen-specifice serice N-Glycan Inhibitors in Immunoassay Methods for serum Allergen Specific IgE Florin-Dan Popescu1, Mariana Vieru1, Carmen Saviana Ganea2, Carmen Panaitescu3,4 1. Disciplina Alergologie Spitalul Clinic „Nicolae Malaxa”, Universitatea de Medicină și Farmacie „Carol Davila”, București 2. Spitalul Clinic „Nicolae Malaxa”, București 3. UMF „Victor Babeș”, Timișoara, Departamentul III Științe Funcționale, Disciplina Fiziologie 4. Centrul de terapii genice și celulare în tratamentul cancerului OncoGen – SCJUPB Timișoara Autor corespondent: Mariana Vieru, e-mail: mariana.vieru@umfcd.ro

Primit: 19.02.2020 Acceptat: 28.02.2020

ABSTRACT

REZUMAT

Cross-reactive carbohydrate determinants (CCDs) represent fucosylated/xylosylated N-glycans present in pollen and food of plant origin, latex and hymenoptera venoms. IgE antibodies against CCD do not have significant clinical relevance, but represent an important cause of cross-reactivity in the case of in vitro immunoassay methods for determining serum specific IgE. CCD inhibitors play a key role in the laboratory for preventing misinterpretation of such in vitro positive assays and for increasing their specificity. Keywords: cross-reactive carbohydrate determinants, N-glycan inhibitors, IgE immunoassay

Determinanții carbohidrați cu reactivitate încrucișată/crossreactivi (CCD) reprezintă N-glicani fucozilați/xilozilați prezenți în polenuri și alimente de origine vegetală, latex și veninuri de himenoptere. Anticorpii IgE față de CCD nu au relevanță clinică semnificativă, dar reprezintă o cauză importantă de reactivitate încrucișată în cazul metodelor de imunoanaliză in vitro pentru determinarea IgE specifice serice. Inhibitorii CCD utilizați în laborator au un rol-cheie pentru a evita interpretarea greșită ca pozitive a unor astfel de teste in vitro și cresc specificitatea lor. Cuvinte-cheie: determinanți carbohidrați cross-reactivi, inhibitori de N-glicani, imunoanaliză IgE

Determinanții carbohidrați cu reactivitate încrucișată/cross-reactiv i (Cross-reactive Carbohydrate Determinants, CCD) reprezintă N-glicani care sunt oligozaharide legate de asparagină, având miez cu α(1→3)-fucoză și/sau β(1→2)-xiloză, ca urmare a modificărilor posttranslaționale comune ale unor glicoproteine din plante, insecte și alte nevertebrate(1). N-glicanii constituie un grup cu diversitate mare de oligozaharide legate prin asparagină la glicoproteinele eukariotelor, fiind implicați în plierea, stabilitatea, traficul intracelular, secreția și funcționarea proteinelor (2). Termenii de „cross-reactivitate” (reactivitate încrucișată) și „cross-reactiv” (cu reactivitate încrucișată) sunt cuvinte de origine engleză împrumutate în limba română (anglicisme) și recent integrate în limbajul de specialitate ca neologisme, fiind utilizați în documente oficiale ale Ministerului Sănătății (MS), inclusiv în documentele pentru curriculum de pregătire în specialitatea alergologie și imunologie clinică, și ale Ordinului Biochimiștilor, Biologilor și Chimiștilor în Sistemul Sanitar din România (OBBCSSR) (3,4) . Similar, în limba italiană, termenul „cross-reattività” (reattività crociata) este utilizat în documente de pe paginile online oficiale ale Societății Italiene de Alergologie, Astm și Imunologie Clinică (Societa’ Italiana di Allergologia, Asma ed Immunologia Clinica, SIAAIC) și ale Societății Italiene de Alergologie și Imunologie Pediatrică (Società Italiana di Allergologia e Immunologia Pediatrica, SIAIP)(5,6).

Termenul de determinant carbohidrat cross-reactiv (CCD) a fost folosit prima dată în 1981, când s-a constatat că anticorpii IgE din anumite seruri umane reacționează cu antigene prezente într-un număr mare de alimente de origine vegetală neînrudite, precum arahide, cartof, spanac, făină de grâu, orez, antigenele existând, de asemenea, și în grăuncioarele de polen. Anticorpii au reacționat in vitro surprinzător și cu venin de albină și viespe și au fost uneori induși de înțepăturile de himenoptere(7). Cele mai multe extracte alergenice naturale provenite din plante sau venin de insecte conțin CCD, dar CCD nu se comportă ca alergene in vivo și nu au semnificație relevantă clinic(8-12). Inducerea anticorpilor IgE față de CCD la om se consideră că este determinată de expunerea la polen și/sau de înțepăturile de insecte(13). Anticorpii de tip IgE față de CCD reacționează încrucișat cu toate proteinele care conțin astfel de epitopi CCD, de aceea reprezintă o cauză importantă de reactivitate încrucișată în cazul metodelor de imunoanaliză in vitro pentru determinarea IgE specifice serice față de alergene de origine vegetală care conțin CCD. Anticorpii IgE anti-CCD sunt detectați la până la 25% dintre pacienții alergici, dar în general nu au nicio relevanță clinică în comparație cu anticorpii IgE față de regiunile proteice specifice. Deoarece mulți pacienți au anticorpi IgE antiCCD nerelevanți clinic, un număr semnificativ de rezultate ale metodelor de imunoanaliză pentru IgE specifice serice sunt interpretate ca pozitive, dacă nu se utilizează ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

inhibitor CCD. Prezența IgE anti-CCD poate deruta evaluarea reactivității in vitro în cazul în care se utilizează extracte naturale sau glicoproteine purificate care conțin CCD, cum ar fi cele din polenuri, alimente de origine vegetală, latex sau veninuri de himenoptere(11,14-17). Mai multe componente alergenice naturale purificate utilizate în diagnosticul molecular alergologic prin imunoanaliză bazată pe nanotehnologie cu alergene cuplate cu nanoparticule și interpretare prietenoasă pentru pacient (patient-friendly allergen nano-bead array) conțin CCD: expansina nLol p 1 din polen de graminee zâzanie sau raigras (Lolium perenne), nOle e 1 din polen de măslin (Olea europaea), pectat liaza nCup a 1 din polen de chiparos de Arizona (Cupressus arizonica), patatina nSola t 1 din tubercul de cartof (Solanum tuberosum), globulina 7S de tip vicilină nAra h 1 din arahidă (Arachis hypogaea), vicilina sau globulina 7S Jug r 2 din nucă (Juglans regia), fosfolipaza A2 nApi m 1 din venin de albină (Apis melifera), tipic peroxidaza de hrean (Armoracia rusticana) nArm r HRP (horseradish peroxidase) și cistein proteaza nAna c 2 din tulpină și fruct de ananas (Ananas comosus)(18). nAna c 2 (nMUXF3) este un N-glican purificat din bromelaina provenită din tulpina de ananas (Ananas comosus) capabil să detecteze IgE față de N-glicani din cele mai multe surse vegetale. Prescurtările din structura glicanului sunt: manoza (M), manoza nesubstituită central (U), xiloza (X) și fucoza (F). IgE serice anti-CCD sunt biomarker de reactivitate față de fragmente de tip carbohidrat ale glicoproteinelor(11,16,17). Proteinele recombinate produse în Escherichia coli nu sunt afectate de recunoașterea CCD, datorită pierderii glicozilării posttranslaționale a proteinelor(19). Cu toate acestea, metodele de imunoanaliză singleplex pentru IgE cu alergene recombinate, care utilizează celuloza, pot furniza rezultate fals-pozitive de până la 2 kUA/L în serurile intens pozitive pentru CCD, ca urmare a prezenței reziduurilor de glicoproteine cu CCD în matricea de celuloză. Polimerul celulozic capsulat din imunoanaliza fluoroenzimatică în fază solidă conține mici cantități reziduale de CCD, suficiente pentru a produce legare de fond în serurile cu nivel ridicat de IgE anti-CCD. Acest fapt poate induce rezultate pozitive chiar și la alergene recombinate neglicozilate la 2-3% din serurile pacienților atopici(20). Determinarea IgE anti-CCD folosind un identificator de tip MUXF fixat la faza solidă este utilă, dar nu poate discrimina între rezultatele fals-pozitive și cele cu adevărat pozitive(15). Eliminarea IgE anti-CCD cu CCD imobilizate a fost de asemenea sugerată, dar neaplicată, fiind considerată prea laborioasă pentru a fi utilizată de rutină (9,21). În cercetarea științifică a fost utilizată și distrugerea epitopilor de carbohidrați prin tratament cu periodat. Din păcate, conformația proteică poate fi modificată de acest tratament, ceea ce provoacă reducerea sensibilității și rezultate fals-negative. Prin urmare, oxidarea prin periodat nu este aplicată în testele de imunoanaliză disponibi le comercia l pentr u deter m ina rea Ig E specifice(1). ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

Una dintre soluțiile practice pentru a evita rezultate fals-pozitive datorate IgE anti-CCD în cazul metodelor de imunoanaliză pentru determinarea IgE specifice serice poate fi adăugarea unui exces de glicoconjugate care să competiționeze cu legarea anticorpilor anti-CCD, dar, surprinzător, această soluție nu a fost aplicată de rutină în laboratorul de alergologie și imunologie clinică, chiar dacă glicoproteinele naturale din plante, cum ar fi peroxidaza de hrean sau ascorbat oxidaza, au fost alegeri evidente(15). Un inhibitor de N-glican CCD, semisintetic de primă generație, constă din glicopeptide din bromelaină (din tulpină de ananas) legate cu albumină serică bovină (MUXF-BSA)(22). Un inhibitor potent CCD de a doua generație a fost creat ca un conjugat glicopeptid-albumină serică umană (HSA), pentru care glicopeptidele vegetale au fost supuse unei scheme riguroase de purificare, iar polimerul transportor este albumina umană. Astfel de glicopeptide care conțin maximum patru reziduuri de aminoacizi sunt purificate din bromelaină ca glicoproteină vegetală și cuplate la albumina serică umană în proporție de cel puțin 7 la 1. Această abordare asigură absența epitopilor pentru IgE pe bază de proteine și, prin urmare, specificitate maximă. Măsurile de control al calității prin spectrometrie de masă asigură calitatea constantă a produsului. Doza recomandată este de 2 volume de blocant CCD la 100 de volume de ser – sau, altfel spus, 20 µL de blocant CCD pentru fiecare mL de ser. Inhibitorul CCD și serul pacientului se amestecă corect înainte de prelucrarea ulterioară, cu etapă de preincubare scurtă. Astfel de inhibitor de N-glican CCD este disponibil sub formă de pulbere liofilizată, care la dizolvarea în apă realizează concentrație de 1 mg/mL inhibitor într-un tampon slab de acetat de amoniu. Există și imunoanaliză multiplex care integrează inhibitor CCD în diluentul probelor. Utilizarea inhibitorilor de N-glicani CCD poate fi aplicată în metode de imunoanaliză pentru IgE specifice de tip singleplex, multiparametric și multiplex(1,15,17,22,23). Referitor la recunoașterea alergenelor într-un sistem de imunoanaliză in vitro, același alergen cu un epitop glican și un epitop peptidil poate conduce la rezultat pozitiv în trei situații diferite. Dacă serul de testat conține doar anticorpi IgE specifici pentru N-glican (anticorpi IgE anti-CCD), rezultatul este fals-pozitiv și se datorează CCD, dacă serul conține doar anticorpi IgE specifici peptidelor, rezultatul este pozitiv real și se datorează sensibilizării peptidice, iar dacă serul de testat conține anticorpi IgE față de peptide și glicani, rezultatul pozitiv incert este datorat unei sensibilizări mediate IgE față de peptide cu semnal amplificat din cauza anticorpilor IgE anti-CCD. Problema CCD poate fi mai puțin perceptibilă în cazul imunoanalizelor singleplex cu indicație ghidată anamnestic, dar exercită efect confuzionant mai amplu în cazul sistemelor de imunoanaliză cu alergene multiple evaluate concomitent(23). Într-o metodă de imunoanaliză multiparametrică pentru diagnostic in vitro cu extracte alergenice naturale și componente alergenice purificate caracterizate biochi-

rubrica specialistului

Bibliografie

mic, acoperind benzi în linii subțiri paralele de tip lineblot, pentru a preveni potențiale rezultate fals-pozitive ale testelor datorate IgE anti-CCD, anticorpii cu reactivitate încrucișată din eșantionul pacientului pot fi eliminați prin legare prealabilă a unui absorbant anti-CCD(24). O altă analiză imunoenzimatică multiparametrică cu extracte naturale și componente alergenice care acoperă o membrană fixată în casete, utilizează inhibitor de N-glican compus din structuri CCD polivalente de bromelaină, cu mai puțin de patru aminoacizi rămași după proteoliză și purificare, ceea ce garantează lipsa epitopilor peptidici. Glicopeptidul astfel obținut este atașat la proteină transportor, care este albumina serică umană extrem de purificată (25). Imunoanaliza multiplex în fază solidă bazată pe nanotehnologie tip macroarray utilizată ca explorator de alergologie moleculară (macroarray nanotechnology-based immunoassay as a molecular allergy explorer), introdusă recent în laboratorul de alergologie și imunologie clinică, integrează inhibitor CCD potent în timpul incubării serului(17,26). Acest conjugat glicopeptid-HSA reduce dificultatea interpretării de către medicii alergologi clinicieni a rezultatelor in vitro CCD pozitive și creșterea specificității rezultatelor testului. Un astfel de test in vitro de generație nouă pentru alergiile mediate IgE

1. Hemmer W. Human IgE antibodies against Cross-Reactive Carbohydrate Determinants. In: Anticarbohydrate antibodies: from molecular basis to clinical application. Kosma P, Muller-Loennies S. (eds). Springer. Wien New York. 2012, 191-203. 2. Lannoo N, Van Damme EJ. Review/N-glycans: The making of a varied toolbox. Plant Sci. 2015; 239: 67-83. 3. www.ms.ro/wp-content/uploads/2016/12/Alergologie-si-imunologie-clinica.pdf (accesare online la data de 13 ianuarie 2019). 4. www.obbcssr.ro/files/6._D.Popa_Rolul_Specialistului_OBBCSSR_2018.pdf (accesare online la data de 13 ianuarie 2019). 5. www.siaaic.org/?p=3799 (accesare online la data de 13 ianuarie 2020). 6. www.siaip.it/upload/riap/1482_Le%20reazioni%20di%20ipersensibilita%20agli%20 antibiotici%20beta-lattam (accesare online la data de 13 ianuarie 2019). 7. Aalberse RC, Koshte V, Clemens JG. Immunoglobulin E antibodies that crossreact with vegetable foods, pollen, and Hymenoptera venom. J Allergy Clin Immunol. 1981; 68(5):356-64. 8. van der Veen MJ, van Ree R, Aalberse RC, Akkerdaas J, Koppelman SJ, Jansen HM, van der Zee JS. Poor biologic activity of cross-reactive IgE directed to carbohydrate determinants of glycoproteins. J Allergy Clin Immunol. 1997; 100(3):327-34. 9. Malandain H, Giroux F, Cano Y. The influence of carbohydrate structures present in common allergen sources on specific IgE results. Eur Ann Allergy Clin Immunol. 2007; 39: 216-220. 10. Mari A, Ooievaar-de Heer P, Scala E, Giani M, Pirrotta L, Zuidmeer L, Bethell D, van Ree R. Evaluation by double-blind placebo-controlled oral challenge of the clinical relevance of IgE antibodies against plant glycans. Allergy. 2008; 63(7):891-6. 11. Altmann F. Coping with cross-reactive carbohydrate determinants in allergy diagnosis. Allergo J Int. 2016; 25(4): 98-105. 12. Mahler V, Gutgesell C, Valenta R, Fuchs T. Natural rubber latex and hymenoptera venoms share Immunoglobin E-epitopes accounting for cross-reactive carbohydrate determinants. Clin Exp Allergy. 2006; 36(11): 1446-56. 13. Matricardi PM, Kleine-Tebbe J, Hoffmann HJ, Valenta R, Hilger C, Hofmaier S, Aalberse RC, Agache I, Asero R, Ballmer-Weber B, Barber D, Beyer K, Biedermann T, Bilò MB, Blank S, Bohle B, Bosshard PP, Breiteneder H, Brough HA, Caraballo L, Caubet JC, Crameri R, Davies JM, Douladiris N, Ebisawa M, EIgenmann PA, Fernandez-Rivas M, Ferreira F, Gadermaier G, Glatz M, Hamilton RG, Hawranek T, Hellings P, Hoffmann-Sommergruber K, Jakob T, Jappe U, Jutel M, Kamath SD, Knol EF, Korosec P, Kuehn A, Lack G, Lopata AL, Mäkelä M, Morisset M, Niederberger V, NowakWęgrzyn AH, Papadopoulos NG, Pastorello EA, Pauli G, PlattsMills T, Posa D, Poulsen LK, Raulf M, Sastre J, Scala E, Schmid JM, Schmid-Grendelmeier P, van Hage

are un panel extins de peste 290 alergene, cu extracte alergenice naturale și alergene moleculare native (n) sau recombinate (r), completat de determinarea concomitentă a IgE totale. Diferitele extracte și componente alergenice moleculare sunt disponibile pe membrană de nitroceluloză în cipul din cartuș. La fiecare cartuș se adaugă 400 µL de diluent de probă care include inhibitorul CCD și se adaugă 100 µL din proba pacientului, asigurându-se că soluția rezultată este răspândită uniform. Incubarea serului se efectuează timp de 2 ore. Lactoferina umană Hom s LF este o proteină cu CCD care poate fi utilizată pentru evaluarea eficacității inhibitorului CCD. Cu procedura standard de inhibare a CCD, eficiența inhibării anticorpilor anti-CCD este de 85%. O etapă suplimentară de inhibare a CCD conduce la o rată de inhibare a acestor anticorpi de peste 95%(26-29).

Concluzii

Interferențele analitice datorate IgE anti-CCD pot afecta rezultatele metodelor imunologice pentru determinarea IgE specifice serice față de polenuri, alimente de origine vegetală, latex sau veninuri de himenoptere, de aceea inhibitorii de CCD ca N-glicani fucozilați și/sau xilozilați utilizați în laborator au un rol-cheie pentru a evita interpretarea greșită ca pozitive a rezultatelor unor astfel de teste in vitro și creșterea specificității lor. n M, van Ree R, Vieths S, Weber R, Wickman M, Muraro A, Ollert M. EAACI Molecular Allergology User’s Guide. Pediatr Allergy Immunol. 2016; 27 Suppl 23: 1-250. 14. Mari A. IgE to cross-reactive carbohydrate determinants: analysis of the distribution and appraisal of the in vivo and in vitro reactivity. Int Arch Allergy Immunol 2002; 129: 286-295. 15. Holzweber F, Svehla E, Fellner W, Dalik T, Stubler S, Hemmer W, Altmann F. Inhibition of IgE binding to cross-reactive carbohydrate determinants enhances diagnostic selectivity. Allergy. 2013; 68: 1269-1277. 16. Altmann F. The role of protein glycosylation in allergy. Int Arch Allergy Immunol 2007; 142: 99. 17. Popescu FD, Vieru M. Precision medicine allergy immunoassay methods for assessing immunoglobulin E sensitization to aeroallergen molecules. World J Methodol. 2018; 8(3):17-36. 18. www.caam-allergy.com/pdf/Green_John_IgE_Multiplex_FABER244_ENG.pdf (accesare online la data de 13 ianuarie 2020). 19. Demain AL, Vaishnav P. Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms. Biotechnol Adv. 2009; 27: 297-306. 20. Hemmer W, Altmann F, Holzweber F, Gruber C, Wantke F, Wöhrl S. ImmunoCAP cellulose displays cross-reactive carbohydrate determinant (CCD) epitopes and can cause false-positive test results in patients with high anti-CCD IgE antibody levels. J Allergy Clin Immunol. 2018; 141(1): 372-381. 21. Jin C, Nitsch S, Hemmer W, Altmann F. Improving allergy diagnosis by removal of CCD-specific IgE from patients′ sera. Allergy 2009; 64(Suppl. 90):30. 22. www.proglycan.com/allergy-diagnosis/proglycan-ccd-blocker/how-it-works (accesare online la data de 13 ianuarie 2020). 23. https://mediwiss-analytic.de/ccd.html (accesare online la data de 13 ianuarie 2020). 24. www.euroimmunblog.com/cross-reactive-anti-ccd-antibodies-can-hinder-allergydiagnostics (accesare online la data de 13 ianuarie 2020). 25. Grzywnowicz M, Majsiak E, Gaweł J, Miśkiewicz K, Doniec Z, Kurzawa R. Inhibition of Cross-Reactive Carbohydrate Determinants in allergy diagnostics. Adv Exp Med Biol. 2018; 1116: 75-79. 26. Heffler E, Puggioni F, Peveri S, Montagni M, Canonica GW, Melioli G. Extended IgE profile based on an allergen macroarray: a novel tool for precision medicine in allergy diagnosis. World Allergy Organ J. 2018; 11(1):7. 27. https://a.storyblok.com/f/69176/x/81f1990ace/alex2_allergen_list_en.pdf (accesare online la data de 13 ianuarie 2020). 28. www.macroarraydx.com (accesare online la data de 13 ianuarie 2020). 29. ALEX (Allergy Explorer) Instruction for use. 20170821_RZ_ALEX_ Gebrauchsanweisung_EN.indd

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

comunicare pe scurt REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

Componente alergenice din alimente declarabile ca surse de alergene în UE, disponibile în metodele de imunoanaliză multiplex Allergen Components from Foods Declarable as Allergen Sources in The EU Available in Multiplex Immunoassays Florica Popescu1, Mariana Vieru2, Florin-Dan Popescu2, Carmen Panaitescu3,4 1. Școala Doctorală, Universitatea de Medicină și Farmacie, Craiova 2. Disciplina Alergologie, Spitalul Clinic „Nicolae Malaxa”, Universitatea de Medicină și Farmacie „Carol Davila”, București 3. UMF „Victor Babeș”, Timișoara, Departamentul III Științe Funcționale, Disciplina Fiziologie 4. Centrul de terapii genice și celulare în tratamentul cancerului OncoGen – SCJUPB Timișoara Autor corespondent: Florica Popescu, e-mail: prof_floricapopescu@hotmail.com

Primit: 19.03.2020 Acceptat: 23.03.2020

ABSTRACT

REZUMAT

Molecular allergy diagnosis in food allergies is a modern approach utilized to characterize the molecular components of food allergens from the point of view of specific IgE-mediated immune responses. In the clinical practice, it can improve diagnosis accuracy and may assist the allergist in many aspects of the specialty workup. Modern multiplex immunoassay methods used for the detection of serum specific IgE against food allergen components are the immuno solid-phase allergen chip microarray, patient-friendly allergen nano-bead array and macroarray nanotechnology-based immunoassay as a new generation molecular allergy explorer. It is important to know the allergenic molecules available for multiplex diagnosis immunoassays from food sources which must be declared as containing food allergens in the European Union (EU). Keywords: food allergens, molecular components, multiplex immunoassays

Diagnosticul alergologic molecular în alergiile alimentare este o abordare modernă, utilizată pentru a caracteriza componentele moleculare ale alergenelor alimentare din punctul de vedere al răspunsurilor imunitare mediate prin IgE specifice. În practica clinică, poate îmbunătăți acuratețea diagnosticului și poate ajuta medicul alergolog în multe aspecte ale investigațiilor de specialitate. Metodele moderne de imunoanaliză de tip multiplex utilizate pentru detectarea IgE specifice serice față de componentele alergenice alimentare sunt: imunoanaliza pe cip microarray cu alergene în fază solidă, imunoanaliza bazată pe nanotehnologie cu alergene cuplate la nanoparticule și interpretare prietenoasă pentru pacient și imunoanaliza bazată pe nanotehnologie tip macroarray utilizată ca explorator de alergologie moleculară de nouă generație. Este importantă cunoașterea moleculelor alergenice disponibile pentru testele de diagnostic multiplex din surse alimentare care trebuie declarate ca fiind conținătoare de alergene alimentare în Uniunea Europeană (UE). Cuvinte-cheie: alergene alimentare, componente moleculare, imunoanaliză multiplex

Diagnosticul alergologic molecular în alergiile alimentare este o abordare modernă utilizată pentru a caracteriza componentele alergenice moleculare ale fiecărui alergen alimentar din punctul de vedere al răspunsurilor imunitare specif ice mediate prin Ig E specifice(1,2). Metodele moderne de imunoanaliză multiplex utilizate pentru detectarea IgE specifice serice față de componentele alergenice alimentare sunt: imunoanaliza bazată pe cip microarray cu alergene pe lamelă acoperită cu polimer ca fază solidă (immuno solid-phase allergen chip), imunoanaliza bazată pe nanotehnologie cu alergene cuplate cu nanoparticule și interpretare prietenoasă pentru pacient ( patient-friendly allergen nano-bead array) și imunoanaliza bazată pe nanotehnologie tip macroarray utilizată ca explorator de alergologie mole-

culară (macroarray nanotechnology-based immunoassay as a molecular allergy explorer) cu încorporare de inhibitor potent de determinanți carbohidrați crossreactivi (CCD) pentru interpretarea cu acuratețe a testelor de IgE specifice in vitro (3). Modificările aduse legislației privind etichetarea produselor alimentare au condus la îmbunătățiri semnificative ale informațiilor disponibile cu privire la natura și compoziția acestora. O informare corectă a consumatorilor este necesară pentru o gestionare eficientă a alergiilor alimentare. Pentru un diagnostic corect de alergie alimentară și pentru interpretarea precisă a reactivității încrucișate este important să fie cunoscute moleculele alergenice disponibile (n = naturale, r = recombinate) pentru metode de imunoanaliză de tip multiplex din sursele alimentare care trebuie declarate

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

comunicare pe scurt ca fiind conținătoare de alergene alimentare în țările din Uniunea Europeană. Aceste molecule vor fi prezentate în continuare (4-7). Normele de etichetare alimentară în Uniunea Europeană impun informarea obligatorie de către operatorii din sectorul alimentar prin listarea a 14 alergene alimentare de origine animală (crustacee, moluște, pește, lapte, ouă), de origine vegetală (fructe nucifere, arahide, soia, lupin, cereale, susan, țelină, muștar) și conservant alimentar de tip dioxid de sulf [E220] și/sau sulfiți [E221-228](8). Componente alergenice din crustacee disponibile în metode de imunoanaliză de tip multiplex: nLit v 1 tropomiozina din crevete Litopenaeus vannamei (familia Penaeidae, clasa Malacostraca) nPen m 1 tropomiozina din crevete Peneus monodon (familia Penaeidae, clasa Malacostraca) rPen m 2 arginin-kinaza din crevete Peneus monodon (familia Penaeidae, clasa Malacostraca) rPen m 3 lanț ușor de miozină din crevete Peneus monodon (familia Penaeidae, clasa Malacostraca) rPen m 4 proteina sarcoplasmică de legare a calciului din crevete Peneus monodon (familia Penaeidae, clasa Malacostraca) rCra c 6 troponina C din crevete Crangon crangon (familia Crangonidae, clasa Malacostraca) Componente alergenice din moluște disponibile în metode de imunoanaliză de tip multiplex: nUro du 1 tropomiozina din calamar Uroteuthis duvauceli (familia Loliginidae, clasa Cephalopoda) nVen ga 1 tropomiozina din scoică Venus gallina (familia Venereidae, clasa Bivalvia) nHel as 1 tropomiozina din melc de grădină Helix aspersa (familia Helicidae, clasa Gastropoda) Componente alergenice din pești disponibile în metode de imunoanaliză de tip multiplex: Pești osoși din ordinul Gadiformes: nGad m 1 beta-parvalbumina din cod Gadus morhua rGad c 1 beta-parvalbumina din cod Gadus callarias nMer mr 1 beta-parvalbumina din merluciu Merluccius merluccius nGad m 2&3 beta-enolaza și aldolaza din cod Gadus morhua Pești osoși din ordinul Perciformes: nThu a 1 beta-parvalbumina din ton Thunnus albacares rXip g 1 beta-parvalbumina din pește spadă Xiphias gladius Pești osoși din ordinele Salmoniformes și Clupeiformes: rSal s 1 beta-parvalbumina din somon Salmo salar rClu h 1 beta-parvalbumina din hering Clupea harengus Pește osos din ordinul Cypriniformes: rCyp c 1 beta-parvalbumina din crap Cyprinus carpio Pește cartilaginos din ordinul Rajiformes: rRaj c alfa-parvalbumina din vatos/vulpe-de-mare Raja clavata

Componente alergenice din lapte de vacă (Bos domesticus) disponibile în metode de tip multiplex: nBos d 4 alfa-lactalbumina nBos d 5 beta-lactoglobulina nBos d 6 albumina serică din lapte și carne nBos d 8 cazeina termostabilă nBos d LF lactoferina nBos d CA anhidraza carbonică (marker alfa-Gal) Componente alergenice din ou de găină (Gallus domesticus), disponibile în metode de tip multiplex: nGal d 1 ovomucoidul termostabil nGal d 2 ovalbumina nGal d 3 ovotransferina nGal d4 lizozim (E1105) nGal d 5 alfa-livetina Componente alergenice din leguminoase și susan disponibile în metodele de imunoanaliză multiplex: Arahide/alune de pământ Arachis hypogaea (familia Fabaceae, ordin Fabales) n/rAra h 1 globulina 7/8S, cupina de tip vicilina n/rAra h 2 conglutina, albumina 2S n/rAra h 3 globulina 11S, glicinina, cupina tip legumina nAra h 6 albumina 2S, conglutina n/rAra h 8 proteina PR-10 de tip Bet v 1 n/rAra h 9 proteina transfer lipidic nsLTP1 rAra h 15 oleozina Boabe de soia Glycine max (familia Fabaceae, ordin Fabales) rGly m 4 proteina PR-10 de tip Bet v 1 nGly m 5 beta-conglicinina, vicilina, globulina 7S nGly m 6 glicinina, legumina, globulina 11S Semințe de susan Sesamum indicum (familia Pedaliaceae, ordin Lamiales) r/nSes i 1 albumina 2S Componente alergenice din cereale disponibile în metodele de imunoanaliză de tip multiplex: Semințe de grâu comun Triticum aestivum (subfamilia Pooideae, familia Poaceae, ordin Poales) rTri a 14 proteina de transfer lipidic nsLTP1 nTri a 18 aglutinina, lectina de tip heveină rTri a 19 omega-5-gliadina nTri a 28 inhibitor dimeric alfa-amilaza/tripsina Tri a aA_TI Componente alergenice din țelină și muștar disponibile în metodele de imunoanaliză de tip multiplex: Țelină Apium gaveolans (familia Apiaceae/ Umbelliferae, ordin Apiales) proteina PR-10, Bet v 1-like din rădăcină rApi g 1 proteina de transfer lipidic nsLTP1 din rApi g 2 tulpină rApi g 6 proteina de transfer lipidic nsLTP2 din rădăcină Semințe de muștar Sinapis alba (familia Brassicaceae, ordin Brasicales) nSin a 1 albumina 2S ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

1. Matricardi PM, Kleine-Tebbe J, Hoffmann HJ, Valenta R, Hilger C, Hofmaier S, Aalberse RC, Agache I, Asero R, Ballmer-Weber B, Barber D, Beyer K, Biedermann T, Bilò MB, Blank S, Bohle B, Bosshard PP, Breiteneder H, Brough HA, Caraballo L, Caubet JC, Crameri R, Davies JM, Douladiris N, Ebisawa M, EIgenmann PA, Fernandez-Rivas M, Ferreira F, Gadermaier G, Glatz M, Hamilton RG, Hawranek T, Hellings P, Hoffmann-Sommergruber K, Jakob T, Jappe U, Jutel M, Kamath SD, Knol EF, Korosec P, Kuehn A, Lack G, Lopata AL, Mäkelä M, Morisset M, Niederberger V, Nowak-Węgrzyn AH, Papadopoulos NG, Pastorello EA, Pauli G, Platts-Mills T, Posa D, Poulsen LK, Raulf M, Sastre J, Scala E, Schmid JM, Schmid-Grendelmeier P, van Hage M, van Ree R, Vieths S, Weber R, Wickman M, Muraro A, Ollert M. EAACI Molecular Allergology User's Guide. Pediatr Allergy Immunol. 2016; 27 Suppl 23: 1-250. 2. Calamelli E, Liotti L, Beghetti I, Piccinno V, Serra L, Bottau P. Component-Resolved Diagnosis in Food Allergies. Medicina (Kaunas). 2019; 55(8). 3. Popescu FD, Vieru M. Precision medicine allergy immunoassay methods for assessing immunoglobulin E sensitization to aeroallergen molecules. World J Methodol. 2018; 8(3): 17-36.

În practica clinică alergologică, diagnosticul molecular poate îmbunătăți acuratețea diagnosticului și poate ajuta medicul alergolog în mai multe aspecte ale evaluării de specialitate, poate aborda diferențiat fenomenele de cosensibilizare și de sensibilizare încrucișată sau cross-reactivitate și poate fi util pentru stratificarea riscurilor clinice asociate cu modele specifice de sensibilizare moleculară. Astfel, unele componente alergenice sunt asociate cu un risc mai crescut de reacții severe: cele care sunt proteine de stocare (Ara h 1, Ara h 2 și Ara h 3 din arahide, Gly m 5 și Gly m 6 din soia etc.), proteine de transfer lipidic nespecific nsLTP (Cor a 8 din alune de pădure, Ara h 9 din arahide etc.) sau proteine termostabile, precum Bos d 8 din lapte și Gal d 1 din ou (9). Tropomiozina, panalergen termostabil al nevertebratelor, prezent în moluștele și crustaceele comestibile, precum și beta-parvalbumina acidică și termostabilă din peștii osoși, este de asemenea alergen alimentar care poate induce reacții sistemice(10). Există însă și unele aspecte nesatisfăcătoare ale diagnosticului molecular fără anamneză alergologică detaliată, cum ar fi riscul de a prescrie excesiv diete de eliminare inutile și autoinjectoare de adrenalină. Mai mult, diagnosticul molecular nu trebuie să înlocuiască anamneza alergologică detaliată și nu exclude total testele de provocare orală, care reprezintă standardul de aur în diagnosticul alergiilor alimentare(2). n

4. www.allergen.org (accesare online la data de 13 ianuarie 2020). 5. https://a.storyblok.com/f/69176/x/81f1990ace/alex2_allergen_list_en.pdf (accesare online la data de 13 ianuarie 2020). 6. www.caam-allergy.com/pdf/Green_John_IgE_Multiplex_FABER244_ENG.pdf (accesare online la data de 13 ianuarie 2020). 7. www.phadia.com/Global/A%20Document%20Library/Product%20Catalogues/ Product-Catalog-2018.pdf (accesare online la data de 13 ianuarie 2020). 8. Food allergen labelling and information requirements under the EU Food Information for Consumers Regulation No. 1169/2011: Technical Guidance March 2015 www.food.gov.uk/sites/default/ files/media/document/food-allergenlabelling-technical-guidance.pdf (accesare online la data de 13 ianuarie 2020). 9. Panaitescu C, Marusciac L, Buzan MR, Tamaș TP. Diagnosticul molecular în alergiile alimentare. Alergologia 2018; 2(4): 158-164. 10. Tong WS, Yuen AW, Wai CY, Leung NY, Chu KH, Leung PS. Diagnosis of fish and shellfish allergies. J Asthma Allergy. 2018; 11: 247-260.

Reclamă ALG 4(1)0105

Bibliografie

Componente alergenice din fructe nucifere, disponibile în metodele de imunoanaliză multiplex: Nuca Juglans regia (familia Juglandaceae, ordin Fagales) nJug r 1 albumina 2S vicilina, globulina 7/8S nJug r 2 proteina de transfer lipidic nsLTP1 rJug r 3 nJug r 4 globulina 11S Alune de pădure Corylus avellana (familia Betulaceae, ordin Fagales) proteina PR-10 de tip Bet v 1 rCor a 1 rCor a 8 proteina de transfer lipidic nsLTP1 nCor a 9 globulina 11S de tip legumina de tip vicilina nCor a 11 globulina 7/8S rCor a 12 oleozina rCor a 14 albumina 2S Fistic Pistacia vera (familia Anacardiaceae, ordin Sapindales) albumina 2S rPis v 1 subunitatea globulina 11S nPis v 2 globulina 7/8S, vicilina nPis v 3 mangan superoxid-dismutaza rPis v 4 Anacard/caju Anacardium occidentale (familia Anacardiaceae, ordin Sapindales) de tip legumina rAna o 2 globulina 11S rAna o 3 albumina 2S Nuca de Brazilia Bertholletia excelsa (familia Lecythidaceae, ordin Ericales) rBer e 1 albumina 2S bogată în sulf Nuca macadamia Macadamia integrifolia (familia Proteaceae, ordin Proteales) nMac i 2S albumina

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

prezentare de caz

Sindrom de alergie orală în rinita alergică la polen de platan Oral Allergy Syndrome in Allergic Rhinitis to Plane Tree Pollen Carmen Saviana Ganea1, Mariana Vieru2, Florin-Dan Popescu2 1. Spitalul Clinic „Nicolae Malaxa” București 2. Disciplina Alergologie Spitalul Clinic „Nicolae Malaxa”, Universitatea de Medicină și Farmacie „Carol Davila”, București Autor corespondent: Carmen Saviana Ganea, e-mail: carmensavianaganea@yahoo.com

Primit: 19.02.2020 Acceptat: XXXX.2020

ABSTRACT

REZUMAT

Cross-reactivity between Platanus pollen and plant-derived foods is described in the literature, but cross-reactive allergen components were not accurately defined. We report a case of spring seasonal intermittent allergic rhinitis with sensitization to plane tree and multiple episodes of oral allergy syndrome after consumption of maize-derived products such as polenta and popcorn, and to lettuce, mentioning in addition professional exposure to chickpea (packaging process) suggesting the importance of combining the in vivo skin prick and prick-prick tests with pollen extracts and foods of plant origin with in vitro immunoassays with molecular components in order to assess this relatively rare allergy association between plane tree and fruit/vegetables. Keywords: Platanus pollen, lettuce, maize, allergy

Reactivitatea încrucișată dintre polenul de Platanus și alimente de origine vegetală este descrisă în literatura de specialitate, dar componentele alergenice cu reactivitate încrucișată/cross-reactive nu au fost stabilite cu exactitate. Prezentăm un caz de rinită alergică intermitentă sezonieră primăvara, cu sensibilizare la polen de platan și cu episoade multiple de sindrom de alergie orală după consumul de produse alimentare cu porumb, cum ar fi mămăligă și pop-corn, și de salată verde, menționând în plus expunere profesională la năut (proces de ambalare), sugerând importanța combinării testelor in vivo prick și prick-prick cu extracte de polen și alimente de origine vegetală cu teste imunologice in vitro cu componente moleculare, pentru a evalua această asociație relativ rară de alergie asociată între polenul arborelui platan și fructe/legume. Cuvinte-cheie: polen de Platanus, salata verde, porumb, alergie

Reactivitatea încrucișată dintre polenul de Platanus și alimente de origine vegetală este descrisă în literatura de specialitate, dar componentele alergenice cross-reactive nu au fost stabilite cu exactitate. Reactivitatea încrucișată sau cross-reactivitatea reprezintă fenomenul de legare a anticorpilor de tip IgE cu inducere a unui răspuns imunitar la o proteină alergenică similară dintr-o altă sursă (1-3). Pacienții cu polinoză (rinoconjunctivită alergică cu sensibilizare la polen) manifestă adesea reacții alergice la ingestia de alimente de origine vegetală de tip fructe și/sau legume, deoarece proteinele cu reactivitate încrucișată au o distribuție largă și se regăsesc într-o serie amplă de surse alergenice. Înțelegerea reactivității încrucișate între specii diferite este utilă în interpretarea sensibilizărilor multiple, de exemplu, cele observate în sindromul de alergie la polen-alimente, care reprezintă alergii alimentare care afectează pacienții sensibilizați la polen și care a devenit un fenotip răspândit de alergie alimentară la adolescenți și adulți europeni, afectând aproximativ 5% din populația din Europa Centrală. Simptomele sindroamelor de alergie la polen-alimente variază de la sindrom de alergie orală până la anafilaxie, iar alimentele implicate sunt de origine vegetală, în special fructe și legume consumate crude (1-10). Platanul londonez Platanus acerifolia (Platanus x acerifolia, sinonim Platanus x hispanica), considerat un

hibrid dintre Platanus orientalis (platan oriental) și Platanus occidentalis (platan american), este un arbore din familia Platanaceae plantat ornamental în orașe din Europa, America de Nord, Africa de Sud și Australia. În perioada de înflorire, polenul eliberat poate atinge niveluri ridicate (11). Au fost descrise câteva alergene moleculare pentru polenul de Platanus acerifolia. Pla a 1, inhibitor de invertază vegetală putativ este un alergen major de 18 kDa, deși cantitatea sa aproximativă din extractul alergenic reprezintă mai puțin de 0,5% din conținutul proteic. La pacienții spanioli alergici la platan monosensibilizați sau polisensibilizați, Pla a 1 este recunoscut până la 92% și, respectiv, 83% din cazuri, acest alergen major fiind responsabil pentru aproximativ 60% din capacitatea totală de legare la IgE a extractului de polen de Platanus sp (11-15). Pla a 2, al doilea alergen major, este o glicoproteină de 43 kDa, cu funcție de poligalacturonidază, implicat în răspunsurile alergice a 84% dintre pacienții cu alergie la polen la platan londonez și reprezintă 52% din capacitatea totală de legare la IgE a extractului de polen de Platanus sp (11,16). Pla a 3 este o proteină de transfer lipidic nespecific de 10 kDa (nsLTP1), a treia componentă alergenică moleculară care reprezintă până la 0,08% din extractul proteic total și prezintă identitate de secvență de 58,3% cu

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

REVISTA SOCIETĂŢII ROMÂNE DE ALERGOLOGIE ȘI IMUNOLOGIE CLINICĂ

FOTO: ARHIVA PERSONALĂ

nsLTP Pru p 3, alergen major din piersică. Pla a 3 a fost depistat ca inducând IgE specifice la 27,3% dintre pacienții alergici la polen de platan, totuși reactivități de până la 63,8% au fost raportate la pacienți alergici la Pru p 3 din regiunea mediteraneeană. Interesant, o mică proporție (16,6%) dintre pacienții fără sensibilizare la Pru p 3 recunosc Pla a 3, indicând prezența de IgE față de epitopi specifici speciilor (11,17). S-a dovedit recent că Pla a 3 poate fi eliberat și în particule subpolinice (18). Există reactivitate încrucișată importantă între polenul de Platanus cu alune și banană și moderată cu țelină și arahide. De asemenea, alte fructe și legume pot fi menționate (piersică, porumb, măr, năut, salată). Proteinele de transfer lipidic (nsLTP) pot fi implicate în reactivitatea încrucișată, acestea fiind prezente în polenul de Platanus (Pla a 3), dar și în alune de pădure Corylus avellana (Cor a 8), banană Musa acuminata (Mus a 3), piersică Prunus persica (Pru p 3), țelină Apium graveolans (Api g 2), arahide Arachis hypogaea (Ara h 9) (1,2). Deși polenul de platan poate fi o sursă de sensibilizare la LTP, în unele regiuni precum nordul Italiei acest aspect este puțin probabil (19) . Mai mult, profilina prezentă în polenul de platan pare a fi implicată uneori în reactivitatea încrucișată dintre polen de platan și fructe/legume (20).

Platanul Platanus x acerifolia este una dintre cele mai notabile specii de arbori cu polen alergizant, inclusiv ca urmare a prezenței sale extinse în unele orașe europene (21,22). Deși sensibilizarea la polenul de arbori nu este atât de frecventă în sudul României, comparativ cu gramineele și buruienile Asteraceae, platanul se găsește la noi în țară ornamental în parcuri și grădini, pe alei și străzi și înflorește în aprilie (23). Raportăm în continuare un caz de sindrom de alergie orală asociat polinozei la platan. O pacientă în vârstă de 52 de ani, dintr-o zonă urbană cu platani din București, cu rinită alergică intermitentă sezonieră primăvara, a relatat episoade multiple sugestive pentru sindrom de alergie orală după consumul de porumb din produse tradiționale și produse derivate, cum ar fi mămăligă și pop-corn, precum și la consumul de salată verde. De asemenea menționăm că pacienta prezenta expunere profesională la năut (proces de ambalare). Am efectuat teste cutanate alergologice prick cu extracte comerciale de aeroalergene și porumb, precum și teste cutanate prick-prick la salată verde, boabe de porumb conservate și năut. Ca metodă in vitro am efectuat imunoanaliză multiplex în fază solidă, pentru explorarea alergiei mediate IgE bazată pe nanotehnologie (6). Rezultatele testelor cutanate prick au fost pozitive (4 mm diametrul papulei eritematoase) pentru extracte comerciale de polen de platan Platanus sp (figura 1) și porumb (figura 2). Testele cutanate prick-prick au fost pozitive (papulă 3-4 mm diametru) la boabe de porumb conservate și la salată verde proaspătă (figurile 2 și 3), precum și la năut (papulă 3 mm) (figura 4).

Figura 1. Test cutanat prick pozitiv la polen de platan

Figura 3. Test cutanat prick-prick pozitiv la salată verde

Figura 2. Test cutanat prick pozitiv la extract comercial de porumb și test cutanat prick-prick pozitiv la boabă de porumb conservată

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

Figura 4. Test cutanat prick-prick pozitiv la năut

prezentare de caz

1. Miralles JC, Caravaca F, Guillén F, Lombardero M, Negro JM. Cross-reactivity between Platanus pollen and vegetables. Allergy. 2002; 57(2): 146-9. 2. Popescu FD. Cross-reactivity between aeroallergens and food allergens. World J Methodol. 2015; 5(2): 31-50. 3. Sampson HA, Aceves S, Bock SA, James J, Jones S, Lang D, Nadeau K, NowakWegrzyn A, Oppenheimer J, Perry TT, et al. Food allergy: a practice parameter update - 2014. J Allergy Clin Immunol. 2014; 134: 1016-25. 4. Wangorsch A, Larsson H, Messmer M, et al. Molecular cloning of plane pollen allergen Pla a 3 and its utility as diagnostic marker for peach associated plane pollen allergy. Clin Exp Allergy. 2016; 46(5): 764-74. 5. Scala E, Cecchi L, Abeni D, et al. Pla a 2 and Pla a 3 reactivities identify plane treeallergic patients with respiratory symptoms or food allergy. Allergy. 2017; 72(4): 671-4. 6. Popescu FD, Vieru M. Precision medicine allergy immunoassay methods for assessing immunoglobulin E sensitization to aeroallergen molecules. World J Methodol. 2018; 8(3): 17-36. 7. Egger M, Mutschlechner S, Wopfner N, Gadermaier G, Briza P, Ferreira F. Pollen-food syndromes associated with weed pollinosis: an update from the molecular point of view. Allergy. 2006;61: 461–476. 8. Bohle B. The impact of pollen-related food allergens on pollen allergy. Allergy. 2007; 62: 3-10. 9. Skypala IJ, Bull S, Deegan K, Gruffydd-Jones K, Holmes S, Small I, Emery PW, Durham SR. The prevalence of PFS and prevalence and characteristics of reported food allergy; a survey of UK adults aged 18-75 incorporating a validated PFS diagnostic questionnaire. Clin Exp Allergy. 2013; 43: 928-40. 10. Rashid RS, Smith KA, Nambiar KZ, Frew AJ, Tarzi MD. Pollen-food syndrome is related to Bet v 1/PR-10 protein sensitisation, but not all patients have spring rhinitis. Allergy. 2011; 66: 1391-2. 11. Asam C, Hofer H, Wolf M, Aglas L, Wallner M. Tree pollen allergens - an update from a molecular perspective. Allergy. 2015; 70: 1201-11. 12. Asturias JA, Ibarrola I, Bartolome B, Ojeda I, Malet A, Martinez A. Purification and characterization of Pla a 1, a major allergen from Platanus acerifolia pollen. Allergy 2002; 57(3): 221-7. 13. Asturias JA, Ibarrola I, Amat P, Tella R, Malet A, Cistero-Bahima A, Enrique E, Malek T, Martinez A. Purified allergens vs. complete extract in the diagnosis of plane tree pollen allergy. Clin Exp Allergy. 2006; 36(12): 1505-12. 14. Asturias J, Ibarrola I, Eraso E, Arilla M, Martinez A. The major Platanus acerifolia

verde (tratat cu antihistaminic H 1 oral de generație nouă și evicții alimentare corespunzătoare) sugerează importanța combinării testelor cutanate prick și prick-prick cu extracte de polen și alimente de origine vegetală, cu teste imunologice in vitro cu componente moleculare, pentru a evalua din punct de vedere alergologic, inclusiv molecular, asociația relativ rară dintre alergia la polenul arborelui platan și la fructe/legume prin reactivitate încrucișată. n

Figura 5. Detalii din etapele de lucru în imunoanaliza multiplex ca explorator molecular de alergie (arhivă foto personală)

pollen allergen Pla a 1 has sequence homology to invertase inhibitors. Clin Exp Allergy 2003;33(7):978-85 15. Arilla MC, Ibarrola I, Mir A, Monteseirin J, Conde J, Martinez A, Asturias JA. Development of a Sandwich-Type ELISA for Measuring Pla a 1, the major allergen of Platanus acerifolia pollen. Int Arch Allergy Immunol. 2005; 138(2): 2-133. 16. Ibarrola I, Arilla MC, Martnez A, Asturias JA. Identification of a polygalacturonase as a major allergen (Pla a 2) from Platanus acerifolia pollen. J Allergy Clin Immunol. 2004; 113(6): 1185-91. 17. Lauer I, Miguel-Moncin MS, Abel T, Foetisch K, Hartz C, Fortunato D, Cistero-Bahima A, Vieths S, Scheurer S. Identification of a plane pollen lipid transfer protein (Pla a 3) and its immunological relation to the peach lipid-transfer protein, Pru p 3. Clin Exp Allergy. 2007; 37(2): 261-9. 18. Fucheng Y, Zheng Z, Yichun L, Yang L, Luying Z, Jiaxian P, Wei Z, Shumin Z, Senlin L. Subpollens delivery of Platanus acerifolia pollen allergen Pla a3 and nucleic acid into lungs and cells. Biochem Biophys Res Commun. 2019; 513(4): 767-74. 19. Asero R. Co-recognition of lipid trasfer protein in pollen and foods in northern Italy: clinician’s view. Eur Ann Allergy Clin Immunol. 2010; 42(6): 205-8. 20. Enrique E, Alonso R, Bartolome B, San Miguel-Moncin M, Bartra J, Fernandez-Parra B, Tella R, Asturias JA, Ibarrola I, Martinez A, Cistero-Bahima A. IgE reactivity to profilin in Platanus acerifolia pollen-sensitized subjects with plant-derived food allergy. J Investig Allergol Clin Immunol. 2004; 14(4): 4-342. 21. Cariñanos P, Grilo F, Pinho P, Casares-Porcel M, Branquinho C, Acil N, Andreucci MB, Anjos A, Bianco PM, Brini S, Calaza-Martínez P, Calvo E, Carrari E, Castro J, Chiesura A, Correia O, Gonçalves A, Gonçalves P, Mexia T, Mirabile M, Paoletti E, Santos-Reis M, Semenzato P, Vilhar U. Estimation of the allergenic potential of urban trees and urban parks: towards the healthy design of urban green spaces of the future. Int J Environ Res Public Health. 2019; 16(8). pii: E1357. 22. Pecero-Casimiro R, Fernández-Rodríguez S, Tormo-Molina R, Monroy-Colín A, Silva-Palacios I, Cortés-Pérez JP, Gonzalo-Garijo Á, Maya-Manzano JM. Urban aerobiological risk mapping of ornamental trees using a new index based on LiDAR and Kriging: A case study of plane trees. Sci Total Environ. 2019; 693: 133576. 23. Passali D, Bellusi LM, Kern EB, Sarafoleanu C, Popescu FD. Genes, allergens and inflammation in allergic rhinitis. In: Rhinosinusal inflammation and infections: modern thinking and current treatment. Bucharest: Editura Academiei Romane; 2013. pp. 101–167.

Reclamă ALG 4(1)0104

Bibliografie

Un test nou de imunoanaliză multiplex pentru explorarea alergiei in vitro bazat pe nanotehnologie a fost efectuat pentru evaluarea moleculară alergologică (figura 5), fiind primul test in vitro multiplex care permite măsurarea simultană a IgE totale și IgE specifice pentru extracte alergenice și alergene moleculare (5) (figura 5). S-au detectat IgE specifice serice la năut (0,50 kUA /L), dar nu și la extractele native din polen de platan Pla a (Platanus acerifolia), porumb Zea m (Zea mays), salată verde Lac s (Lactuca sativa) și nici la Pla a 1 (inhibitor de invertază), componenta alergenică majoră din polenul de Platanus acerifolia, conținute în testul multiplex efectuat. IgE specifice serice la componente alergenice cu potențial de reactivitate încrucișată, și anume Bet v 2 (profilina), Pru p 3 și Art v 3 (proteine de transfer lipidic) nu au fost detectate. IgE specifice serice pentru Cor a 8, o proteină PR-14 cu omologie cu Pla a 3, Zea m 14 și Lac s 1, care poate fi implicată în asocierea alergică polen de Platanus cu fructe/legume, au fost detectate la valoare foarte scăzută (0,06 kUA /L). În concluzie, un astfel de caz diagnosticat ca rinită alergică intermitentă sezonieră cu sensibilizare la polen de platan și sindrom de alergie orală la porumb și salată

ANUL IV v NR. 1 v MARTIE 2020

Informații de prescriere. Denumirea comercială a medicamentului: Dymista 137 micrograme/50 micrograme/doză spray nazal suspensie. Compoziția calitativă și cantitativă: Fiecare gram de suspensie conţine clorhidrat de azelastină 1000 micrograme şi propionat de fluticazonă 365 micrograme. O acţionare (doză de 0,14 g) eliberează clorhidrat de azelastină 137 micrograme (= 125 micrograme de azelastină) şi propionat de fluticazonă 50 micrograme. Excipient cu efect cunoscut:o acţionare (doză de 0,14 g) eliberează clorură de benzalconiu 0,014 mg. Forma farmaceutică: Spray nazal suspensie. Suspensie omogenă, albă. Indicaţii terapeutice: Ameliorarea simptomelor de rinită alergică sezonieră şi perenă moderate până la severe dacă monoterapia cu antihistaminice intranazale sau glucocorticoizi nu este considerată suficientă. Doze şi mod de administrare. Doze: Utilizarea regulată este esenţială pentru beneficiul terapeutic complet. Contactul cu ochii trebuie să fie evitat. Adulţi şi adolescenţi (în vârstă de 12 ani şi peste această vârstă): O acţionare (doză) în fiecare fosă nazală de două ori pe zi (dimineaţa şi seara). Copii şi adolescenţi cu vârsta sub 12 ani: Dymista spray nazal nu este recomandat pentru utilizare la copii cu vârsta sub 12 ani atâta timp cât siguranţa şi eficacitatea nu au fost stabilite la această grupă de vârstă. Vârstnici: Nu este necesară ajustarea dozei la această categorie de populaţie. Insuficienţă renală şi hepatică: Nu există date privind experienţa clinică la pacienţii cu insuficienţă renală şi hepatică. Durata tratamentului: Dymista spray nazal este adecvat pentru administrarea de lungă durată. Durata tratamentului trebuie să corespundă cu perioada de expunere alergenică. Mod de administrare: Dymista Spray Nazal este destinat numai utilizării nazale. Instrucţiuni pentru utilizare: Pregătirea spray-ului: Flaconul trebuie agitat cu blândeţe cu aproximativ 5 secunde înaintea administrării prin înclinarea acestuia în sus şi în jos, iar ulterior va fi înlăturat capacul protector. Înainte de prima utilizare a Dymista spray nazal, acesta trebuie amorsat prin apăsare în jos, eliberând pompa, de 6 ori. Dacă Dymista spray nazal nu a fost utilizat timp de mai mult de 7 zile, acesta trebuie reamorsat o singură dată, prin apăsare în jos eliberând pompa. Utilizarea spray-ului: Flaconul trebuie agitat cu blândeţe cu aproximativ 5 secunde înaintea administrării prin înclinarea acestuia în sus şi în jos, iar ulterior va fi înlăturat capacul protector. După suflarea nasului suspensia va fi pulverizată o singură dată în fiecare nară ţinând capul înclinat în jos. După utilizarea spray-ului vârful flaconului va fi şters, iar capacul protector va fi repus. Contraindicaţii: Hipersensibilitate la substanţele active sau la oricare din excipienţi. Atenţionări şi precauţii speciale pentru utilizare: După punerea pe piaţă au existat raportări referitoare la interacţiuni medicamentoase semnificative din punct de vedere clinic la pacienţii trataţi cu propionat de fluticazonă şi ritonavir care au determinat efecte corticosteroide sistemice inclusiv sindrom Cushing şi supresia corticosuprarenalei. De aceea, utilizarea concomitentă a propionatului de fluticazonă şi ritonavir trebuie evitată, cu excepţia cazului în care beneficiul potenţial depăşeşte riscul reacţiilor adverse corticosteroide sistemice. Pot apărea reacţii adverse sistemice după administrarea corticosteroizilor nazali, în special când aceştia sunt prescrişi în doze mari pentru perioade îndelungate, dar mult mai puţin probabil decât în cazul administrării orale a corticosteroizilor şi pot varia de la pacient la pacient şi între diferite medicamente care conţin corticosteroizi. Potenţialele reacţii adverse sistemice pot include sindromul Cushing, caracteristici cushingoide, supresia corticosuprarenalei, retard de creştere la copii şi adolescenţi, glaucom şi mult mai rar un spectru de reacţii psihologice sau comportamentale incluzând hiperactivitate psihomotorie, tulburări de somn, anxietate, depresie sau agresiune (în special la copii şi adolescenţi). Dymista spray nazal este supus unui proces metabolic de prim pasaj extensiv, de aceea este probabil ca expunerea sistemică să crească la pacienţii cu boală hepatică severă după administrarea intranazală a propionatului de fluticazonă. Aceasta poate conduce la o frecvenţă mai mare a reacţiilor adverse sistemice. Se recomandă prudenţă în tratarea acestor pacienţi.Tratamentul cu corticosteroizi administraţi nazal cu doze mai mari decât cele recomandate, poate conduce la o supresie semificativă clinic a corticosuprarenalei. Dacă există dovezi referitoare la utilizarea de doze mai mari decât cele recomandate a fi utilizate, ulterior trebuie luată în considerare administrarea suplimentară de corticosteroizi sistemici în timpul perioadelor de stres sau de intervenţii chirurgicale. În general doza de fluticazonă din formularea pentru administrare intranazală trebuie redusă la cea mai mică doză la care este menţinut un control eficient al simptomelor de rinită. Retardul de creştere a fost raportat la copiii care au primit corticosteroizi administraţi nazal în doze aprobate. Retardul de creştere poate fi de asemenea posibil şi la adolescenţi. Dacă creşterea este încetinită terapia trebuie revizuită cu scopul reducerii dozei de corticosteroid administrat nazal, dacă este posibil, la cea mai mica doză la care este menţinut un control eficient al simptomelor. Tulburările de vedere pot apărea în cazul utilizării sistemice și topice de corticosteroizi. Dacă pacientul prezintă simptome cum sunt vedere încețoșată sau alte tulburări de vedere, trebuie luată în considerare trimiterea sa la un oftalmolog pentru evaluarea cauzelor posibile care pot include cataractă, glaucom sau boli rare, precum corioretinopatia centrală seroasă (CRSC), care au fost raportate după utilizarea sistemică și topică de corticosteroizi. Este necesară o atentă monitorizare la pacienţii cu modificări de vedere sau la pacienţii cu antecedente de presiune intraoculară crescută, glaucom şi/ sau cataractă. Dacă există orice motiv să credem că funcţia corticosuprarenalei este afectată, o atenţie deosebită trebuie avută în vedere atunci când se efectuează trecerea pacienţilor de pe tratamentul cu corticosteroizi sistemici pe tratamentul cu Dymista spray nazal.La pacienţii care au tuberculoză, orice tip de infecţie netratată, sau care au suferit recent o intervenţie chirurgicală sau un traumatism la nivelul nasului sau cavităţii bucale, beneficiul posibil al tratamentului cu Dymista spray nazal trebuie să depăşească riscurile posibile. Infecţiile căilor respiratorii nazale trebuie tratate cu chimioterapice antibacteriene sau antimicotice, dar nu constituie o contraindicaţie specifică a tratamentului cu Dymista spray nazal. Dymista conţine clorură de benzalconiu. Acesta poate produce iritaţii ale mucoasei nazale şi bronhospasm. Interacţiuni cu alte medicamente şi alte forme de interacţiune: Propionatul de fluticazonă: Este de așteptat ca tratamentul concomitent cu inhibitori ai CYP3A, inclusiv cu medicamente care conțin cobicistat, să mărească riscul de reacţii adverse sistemice. Administrarea concomitentă trebuie evitată, cu excepția cazurilor în care beneficiul obținut depășește riscul crescut de reacţii adverse sistemice induse de corticosteroizi, în acest caz fiind obligatorie monitorizarea pacienților pentru depistarea reacţiilor adverse sistemice induse de corticosteroizi. Se recomandă o atenţie deosebită la coadministrarea unui inhibitor potent al citocromului P450 3A4 (ex. ketoconazol), deoarece există un potenţial de expunere sistemică crescută la fluticazonă propionat. Clorhidrat de azelastină: Trebuie acordată o atenţie deosebită atunci când se administrează clorhidrat de azelastină la pacienţii care primesc în acelaşi timp sedative sau alte medicamente cu acţiune la nivelul sistemului nervos central, deoarece efectul sedativ poate fi amplificat. Alcoolul poate amplifica de asemenea acest efect. Fertilitatea, sarcina şi alăptarea: Fertilitatea. Sunt disponibile doar date limitate referitoare la fertilitate. Sarcina. Dymista spray nazal trebuie utilizat în timpul sarcinii doar dacă beneficiile potenţiale justifică riscul potential asupra fătului. Alăptarea. Dymista spray nazal poate fi utilizat în timpul alăptării, doar dacă beneficiile potențiale justifică riscul potenţial la nou născuţi/copii. Efecte asupra capacităţii de a conduce vehicule şi de a folosi utillaje: Dymista spray nazal are o influenţă mică asupra capacităţii de a conduce vehicule sau de a folosi utilaje. În cazuri izolate atunci când se administrează Dymista spray nazal pot apărea fatigabilitate, oboseală, epuizare, ameţeală sau slăbiciune, care pot fi de asemenea determinate de boala în sine. În aceste cazuri poate fi afectată capacitatea de a conduce sau de a folosi utilaje. Alcoolul poate amplifica acest efect. Reacţii adverse: Foarte frecvente: epistaxis; Frecvente: cefalee, disgeuzie (gust neplăcut), miros neplăcut; Mai puţin frecvente: discomfort nazal (incluzând iritaţie nazală, înţepături, măncărime), strănut, uscăciune nazală ,tuse, uscăciune în gât, iritaţie la nivelul gâtului; Rare: uscăciunea gurii; Foarte rare: hipersensibilitate incluzând reacţii anafilactice, angioedem (edem la nivelul feţei sau limbii, eritem cutanat), bronhospasm, ameţeală, somnolenţă, glaucom, presiune intraoculară crescută, cataractă, perforaţie de sept nazal, eroziuni ale mucoasei, greaţă, eritem cutanat, prurit, urticarie, fatigabilitate (oboseală, epuizare), slăbiciune; Cu frecvenţă necunoscută: vedere încețoșată, ulcerații nazale. În cazuri rare a fost observată osteoporoza, dacă glucocorticoizii au fost administraţi nazal pentru o perioadă de timp îndelungată. Supradozaj: Pentru calea de administrare nazală nu sunt anticipate reacţii de supradozaj. În caz de supradozaj după ingestia orală accidentală, pe baza rezultatelor studiilor experimentale la animale, pot fi aşteptate tulburări la nivelul sistemului nervos central (incluzând somnolenţă, comă, tahicardie şi hipotensiune arterială) produse de clorhidratul de azelastină. Tratamentul acestor tulburări trebuie să fie simptomatic. Se recomandă lavajul gastric în funcţie de cantitatea înghiţită. Nu există un antidot cunoscut. Lista excipienţilor: edeteat disodic, glicerol, celuloză microcristalină, carmeloză sodică, polisorbat 80, clorură de benzalconiu, alcool feniletilic, apă purificată. Perioada de valabilitate: Flacoane cu 23 g suspensie în flacoane de 25 ml: 2 ani. Perioada de valabilitate în timpul utilizării (după prima utilizare): 6 luni. Precauţii speciale pentru păstrare: A nu se păstra la frigider sau congela. Natura şi conţinutul ambalajului: Flacon din sticlă brună tip I prevăzut cu pompă de pulverizare, aplicator nazal din polipropilenă şi capac protector, care conţine 23 g (cel puţin 120 de acţionări). Mărimi de ambalaj:1 flacon cu 23 g suspensie în flacoane de 25 ml (cel puţin 120 de acţionări). Deţinătorul autorizaţiei de punere pe piaţă: MEDA Pharma GmbH & Co. KG, Benzstraße 1.D-61352 Bad Homburg, Germania. Numărul autorizaţiei de punere pe piaţă:11003/2018/01-04. Data primei autorizări sau a reînnoirii autorizaţiei: Autorizare – Aprilie 2013. Data ultimei reînnoiri a autorizaţiei: Septembrie 2018. Data revizuirii textului: Ianuarie 2019. Acest medicament se eliberează pe bază de prescripție mediacală PRF. Pentru raportarea evenimentelor adverse vă rugăm să utilizaţi următoarele date de contact: Tel.: 0372.579.004 Fax: 0371.600.328; Email: pv.romania@mylan.com.

Tratament de primă alegere în rinita alergică*,1,2 Cel mai rapid debut de acțiune dintre toate opțiunile de tratament al RA – 5 minute de la administrare.§,3,4 Prima linie în recomandările internaționale de tratament al RA.5,6,7 De două ori mai eficace față de alte terapii de prima linie în tratamentul RA.8

003_11_02-20_LB-Dymi-RO

* Rinita alergică sezonieră și perenă, moderată până la severă. § Vs. placebo; studiu de expunere controlată la alergeni. RA: rinita alergică 1. Carr W et al. J Allergy clin immunol 2012;129(5):1282-89; 2. Leung DYM et al. the Editors’ choice – MP29-02: a major advancement in the treatment of allergic rhinitis. J Allergy clin immunol 2012;129(5):1216; 3. Bousquet J et al. JACI Pract. 2018; 4. Bachert C et al. Clin Transl Allergy 2018; 5. Brozek J et al. Allergic Rhinitis and its Impact on Asthma (ARIA) Guidelines – 2016 Revision. JACI 2017; 6. Bousquet J et al. J. Allergy Clin. Immunol. 2020; 145(1): 70-80; 7. Bousquet J et al. MACVIA clinical decision algorithm in adolescents and adults with allergic rhinitis. J. Allergy Clin. Immunol. 2016; 138(2): 367-74; 8. Meltzer E et al. Int Arch Allergy immunol 2013;161(4):369-77. Clădirea Equilibrium 1, Str. Gara Herăstrău 2, Et. 3, sector 2, cod poștal 020334, București Telefon: 0372 579 000; Fax: 0371 600 326; E-mail: office.ro@mylan.com

Material promoțional destinat profesioniștilor din domeniul sănătății. Informațiile de prescriere a medicamentului sunt atașate acestui material. Pentru informații detaliate consultați Rezumatul Caracteristicilor Produsului.

Revista ALERGOLOGIA Volumul IV, nr.1 2020

Articles inside

RUBRICA SPECIALISTULUI

Diagnosticul molecular în bolile alergice respiratorii induse de alergene perene

COMUNICARE PE SCURT

Diagnosticul molecular în bolile alergice respiratorii induse de polenuri

REFERATE GENERALE