Científica vol 12 n° 3

Volumen 12 N.° 3, 2015

ISSN 1997 - 700X

 Técnica XTT: pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa  Capacidad antioxidante total del plasma en fondistas de diversas altitudes  Monitoreo de contaminación por tributilestaño (TBT) en puertos de Paracas, Ica (Perú) mediante el fenómeno de imposex en Stramonita chocolata  Diarrea viral bovina. Enfermedad de las mil caras  Sala Cabieses: El ayahuasca

LIMA, PERÚ

UNIVERSIDAD CIENTÍFICA DEL SUR DIRECTORIO Mg. José Dextre Chacón Presidente del Directorio AUTORIDADES Mg. Luis Cardó Soria Presidente Ejecutivo Mg. Luis Pérez del Solar Vicepresidente Corporativo

Dra. Faviola Susana Jiménez Ramos Directora de la Escuela de Nutrición y Dietética Mg. Percy Rivadeneira Chumpitazi Director de la Escuela de Psicología Dra. Sonia Valle Rubio Directora de la Escuela de Biología Marina

Dra. Josefina Takahashi Sato Rectora

Arq. Javier Bouby Vega Director de la Escuela de Arquitectura y Urbanismo Ambiental

Mg. Jorge Esteban Pinedo Vicepresidente Ejecutivo

Mg. Alfonso Lizárraga Travaglini Director de la Escuela de Ingeniería Agroforestal

Dr. Edmundo González Zavaleta Vicerrector Académico

Ing. César Ordóñez Zúñiga Director de la Escuela de Ingeniería Económica y de Negocios

Dr. José Amiel Pérez Presidente del Instituto de Medicina Regenerativa Rector Emérito Dr. Rafael Elgegren Reátegui Decano de la Facultad de Ciencias de la Salud Director de la Escuela de Medicina Humana Dr. Manuel Rosemberg Barrón Decano de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Biológicas Director de la Escuela de Medicina Veterinaria y Zootecnia Mg. Anna Zucchetti Decana de la Facultad de Ciencias Ambientales Directora de la Escuela de Ingeniería Ambiental Mg. Carlos Fernando Romero Rojas Decano de la Facultad de Ciencias Empresariales Director de la Escuela de Administración de Negocios Internacionales Abg. Carlos Eduardo Chirinos Arrieta Decano de la Facultad de Ciencias Humanas Director de la Escuela de Derecho Dr. Raúl Enrique Injoque Espinoza Director de Investigación y Desarrollo Dr. Rodolfo Valdivia Maibach Director de la Escuela de Odontología

Mg. Fernando Muñoz Cho Director de la Escuela de Ingeniería de Sistemas Lic. Pablo Gustavo López Infantas Director de la Escuela de Artes Escénicas Mg. Maritza Enciso Zegarra Directora de la Escuela de Comunicación y Publicidad Mg. Luciano Zagastizábal Arnao Director de la Escuela de Turismo y Hotelería M. Sc. Alejandro Fukusaki Yoshizawa Coordinador de Cursos Básicos Ciencias Dr. Rubén Quiroz Ávila Coordinador de Cursos Básicos Humanidades Sr. Carlos Eduardo Pereyra Hinostroza Director de Servicios Académicos Ing. Ricardo de la Piedra Alegría Director Comercial Mg. Maritza Enciso Zegarra Directora de Extensión y Proyección Social Adm. Miguel Ruiz Effio Coordinador del Fondo Editorial

CIENTÍFICA

Revista CIENTÍFICA Vol. 12 N.° 3, setiembre-diciembre 2015 Director Dr. José Amiel Pérez Universidad Científica del Sur Presidente del Instituto de Medicina Regenerativa Rector Emérito jamielp@cientifica.edu.pe Comité Editorial Josefina Takahashi Sato Ph.D. Universidad Científica del Sur Rectora jtakahashi@cientifica.edu.pe Dr. Pedro Mendoza Arana Universidad Nacional Mayor de San Marcos Facultad de Medicina Humana pedro_mendoza_arana@yahoo.co.uk Mg. Hugo Aguirre Castañeda Pontificia Universidad Católica del Perú Facultad de Ciencias y Artes de la Comunicación haguirre@pucp.edu.pe Dr. Felipe Antonio San Martín Howard Universidad Nacional Mayor de San Marcos Presidente del Consejo de Gestión de la Investigación fsanmartinh@unmsm.edu.pe Javier Enciso Gutiérrez MV, MSc. Universidad Científica del Sur Laboratorio de Cultivo Celular jenciso333@yahoo.com.mx Mg. Héctor Aponte Ubillús Universidad Científica del Sur Editorialista invitado haponte@cientifica.edu.pe Sra. Laura Castro Ramos Universidad Científica del Sur Editora de contenidos lcastro@cientifica.edu.pe Editor general: Miguel Ruiz Effio Prensa: Rosario Gratelly Aguirre Corrector de estilo: Ángel García Tapia Diagramación: Estación La Cultura

CIENTÍFICA, revista de ciencias de la Universidad Científica del Sur, publica tres números al año.

La revista está dirigida a investigadores científicos, docentes y estudiantes universitarios.

La Universidad Científica del Sur no se solidariza necesariamente con las opiniones expresadas en los artículos publicados en esta edición de CIENTÍFICA. Se autoriza la reproducción de los textos y gráficos siempre que se cite la fuente.

revistacientifica@cientifica.edu.pe Fondo Editorial. Universidad Científica del Sur. Cl. Cantuarias 398. Miraflores. Lima 18, Perú.

Tel.: +511 6106400 anexo 528 Tiraje: 600 ejemplares Hecho el depósito legal en la Biblioteca Nacional del Perú: N.° 2008-15522 / ISSN: 1997-700X N.° de Proyecto Editorial: 21501421101425

CIENTÍFICA

CONTENIDO

Revista Científica Vol. 12 N.° 3, setiembre-diciembre 2015

COMITÉ CIENTÍFICO

178

EDITORIAL OBSERVAR, SENTIR, DUDAR: El CAMINO DE LA CIENCIA Héctor Aponte Ubillús

179

ARTÍCULOS ORIGINALES TÉCNICA XTT: PIGMENTOS INTERFERENTES EN FRACCIONES DE EXTRACTO METANÓLICO DE Bidens pilosa TECHNIQUE XTT: INTERFERING PIGMENTS IN FRACTIONS OF METHANOLIC EXTRACT OF Bidens pilosa

Alejandro Fukusaki, José Amiel-Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

182

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE TOTAL DEL PLASMA EN FONDISTAS DE DIVERSAS ALTITUDES TOTAL ANTIOXIDANT CAPACITY OF PLASMA IN LONG-DISTANCE RUNNERS FROM DIFFERENT ALTITUDES

Alan Murillo Salas, Néstor López Avilés, Emilio Guija Poma, Luzmila Troncoso Corzo, Victoria Bobadilla Flórez, Abraham Araujo Díaz, Roberto Baltodano Arellano, Cristel Apac Canchumanta, Stefan Arends Damiani, Sol Perleche Torres, Paul Ruiz Pinto, María Alejandra Baluarte La Torre, Bryan Astorga Guerrero, Luis Chirinos Rojas, Milagros Rodríguez Salas.

213

MONITOREO DE CONTAMINACIÓN POR TRIBUTILESTAÑO (TBT) EN PUERTOS DE PARACAS, ICA (PERÚ) MEDIANTE EL FENÓMENO DE IMPOSEX EN Stramonita chocolata MONITORING OF POLLUTION TRIBUTYLTIN (TBT) IN PORT OF PARACAS LIMA (PERU) BY IMPOSEX IN Stramonita chocolata

Laura Chumbimune Ilizarbe y Zuleika Ponce Mora

222

ISSN 1997-700X

ARTÍCULOS DE REVISIÓN DIARREA VIRAL BOVINA. ENFERMEDAD DE LAS MIL CARAS BOVINE VIRAL DIARRHEA. DISEASE OF THE THOUSAND FACESO

Patricio Berríos Etchegaray

231

SALA CABIESES EL AYAHUASCA Fernando Cabieses Molina

238

NOTAS

241

INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES

245

COMITÉ CIENTÍFICO Dr. Emilio Guija Poma Universidad de San Martín de Porres Dr. James Graham Universidad de Illinois - Chicago, EE.UU. Departamento de Farmacognosis Carlos Moslares García, Ph.D. Universidad Ramón Llull - Barcelona, España Decano IQS de la Facultad de Economía IQS Dra. Amparo Zavaleta Pesantes Universidad Nacional Mayor de San Marcos Facultad de Farmacia y Bioquímica Mg. Héctor Aponte Ubillús Universidad Científica del Sur Escuela de Biología Marina Dr. Ricardo Caballero Merino Hospiten Rambla - España Jefe de Servicios de Obstetricia y Ginecología Fanny L. Casado, Ph.D. McMaster University - Canadá Post-Doctoral Research Fellow Dr. Pedro San Martín Howard Hospital Nacional Dos de Mayo Jefe del Departamento de Pediatría Ing. Óscar Paiba Cossíos Universidad Científica del Sur Escuela de Ingeniería de Sistemas Empresariales Dra. Nancy Lozano Reyes Universidad Nacional Mayor de San Marcos Facultad de Farmacia y Bioquímica Ing. M. Sc. Juan Guerrero Barrantes Universidad Nacional Agraria La Molina Especialista en Suelos y Medioambiente M. V. Siever Morales Cauti Universidad Científica del Sur Escuela de Medicina Veterinaria y Zootecnia Ing. Doménico Guida Universidad de Salerno - Italia Decano de la Facultad de Ciencias Aplicadas Ing. José Dávila Tapia Universidad Científica del Sur Escuela de Ingeniería de Sistemas Empresariales Mg. Jenny Canales Peña Universidad Privada del Norte Comunicadora

CIENTÍFICA se encuentra indizada en Latindex

Imagen de portada: Himantopus mexicanus melanurus, Nestor Carazas Suárez, ACR Humedales de Ventanilla

EDITORIAL OBSERVAR, SENTIR Y DUDAR: EL CAMINO DE LA CIENCIA La ciencia es el camino que nos lleva a conocer el cómo y el porqué de las cosas.

El análisis fáctico de las preguntas sobre los fenómenos de la naturaleza y la comprobación de nuestras hipótesis nos llevan a conocer nuestro entorno. Cada día, miles de personas se esfuerzan por conocer un poco más lo que nos rodea.

Biólogos, físicos, químicos y otros científicos hacen su mejor esfuerzo para responder preguntas enmarcadas en un proceso denominado método científico. En este método, la observación (la obtención de información por medio de los sentidos, para generalizar) es un paso fundamental, ya que a partir de ella vamos adquiriendo ideas y conceptualizamos nuestro entorno.

En un contexto en el que el contacto con nuestro entorno está siendo reemplazado por la televisión, el computador y la monotonía, ¿estaremos perdiendo el hábito de observar a nuestro alrededor? ¿Estaremos con esto desviándonos del camino a más descubrimientos? ¿Podría esto afectar también nuestras relaciones interpersonales?

Cuando pensamos en alguien, ¿acaso no vienen a nuestra mente olores, colores, temperaturas y sabores distintos a los que podemos percibir a través de un celular?

Al no tener contacto físico con nuestros semejantes, ¿estaremos dejando de obtener información? ¿Acaso aquella misma tecnología que nos entretiene y acerca está haciendo que nuestros sentidos sean cada vez menos utilizados? Es importante encontrar un balance entre el uso de la tecnología y el de nuestros sentidos, a fin de no correr el riesgo de perder información sobre lo que nos rodea y, en consecuencia, sobre nosotros mismos.

El uso de nuestros sentidos es el punto de partida. A lo largo de la historia, los científicos se han adentrado en una línea de investigación a partir de este paso primordial: se identifica el problema científico a partir de la observación de un fenómeno. Hoy, la realidad parece ser distinta. Los científicos estamos supeditados a estudiar ciertos fenómenos de la naturaleza previamente identificados, temas que los gestores de la investigación llaman “prioritarios”. ¿Será que nuestra observación y las hipótesis que generamos están siendo sesgadas por los temas que pueden obtener financiamiento y reconocimiento social? ¿Algunas rutas para llegar al conocimiento están siendo cerradas en favor de estas líneas prioritarias?

En este contexto, la investigación parece desarrollarse a partir del proceso hipotéticodeductivo, propuesto por Popper: el método se inicia con una hipótesis sobre una temática determinada (en este caso el área prioritaria), la cual se comprueba por medio de la experimentación. Esto no es negativo y parece ser característico de formas más contemporáneas para investigar. Sin embargo, para evitar la pérdida de las rutas potenciales al conocimiento, es necesario que los gestores de la investigación no consideren solamente un grupo de líneas prioritarias, sino que también permanezcan abiertos a aquellas líneas que cuentan con científicos capacitados para desarrollarlas.

Un ejemplo claro en el Perú es la taxonomía, línea que, a pesar de contar con científicos taxónomos, está sufriendo una crisis en la actualidad.

Por lo tanto, replantear la forma de identificación de las áreas de investigación y de asignación de recursos, considerando líneas con capital humano, no solamente permitiría un mayor desarrollo de la ciencia, sino también mejorar políticas de recuperación de talentos, tan necesarias en países como el nuestro. El científico querría volver para desarrollar la línea de investigación en la que fue formado en el extranjero, esté o no dentro de las prioridades de investigación.

La búsqueda del conocimiento ha sido una tarea constante en la vida del ser humano, y gracias a ello nuestro cerebro ha logrado tener las capacidades que ostenta actualmente. Durante los últimos años, deducir y entender nuestro entorno ha sido pan de cada día. ¿Lograremos en algún momento comprender la naturaleza íntegramente? ¿Es esto posible? La ciencia es una labor constante, que nos acerca poco a poco al conocimiento, pero que tiene un límite determinado por el contexto social, histórico y tecnológico. Por ejemplo, cuando se pensaba que la Tierra era plana, ¿conocíamos los seres humanos la forma real de nuestro planeta? Hasta cierto punto no estábamos tan equivocados para lo que nuestros sentidos y la tecnología de entonces nos permitían conocer, pues la curvatura de la Tierra es muy próxima a cero grados por kilómetro. Ahora que sabemos que la Tierra es un esferoide achatado en los polos, ¿comprendemos realmente la forma de nuestro planeta? Probablemente, tampoco (desde 1958, se conoce que la porción norte de nuestro planeta es más protuberante que la porción sur y quizás ahora, con los avances tecnológicos, sabemos mucho más).

La relatividad y volatilidad del conocimiento es algo con lo que un científico del siglo XXI debe aprender a vivir. El considerar que existen verdades y errores absolutos puede habérsenos inculcado en las escuelas; sin embargo, no es la manera en la que opera el conocimiento. La ciencia es una carrera interminable y el científico, un corredor indispensable para estar cada vez más cerca de la meta: el conocimiento íntegro de nuestro entorno y de nosotros mismos. Mientras haya interés por observar, mientras recuperemos el interés por contactarnos con nuestros semejantes a través de todos nuestros sentidos, y mientras persistan las ganas por conocer más de lo que ya sabemos (sin estancarnos en verdades absolutas), pienso que la especie humana tiene un buen futuro.

Con estas reflexiones, inspiradas en ensayos de grandes filósofos como Isaac Asimov y Ruy Pérez Tamayo, quisiera presentar la presente edición de la revista Científica.

En ella se plasman los resultados de investigaciones relacionadas con estudios fitoquímicos, ecotoxicológicos y de fisiología humana. Asimismo, contiene un trabajo de revisión sobre una de las enfermedades más importantes que aqueja al ganado bovino: la diarrea viral bovina. Este número termina con un ensayo muy interesante sobre el uso de Banisteriopsis caapi (ayahuasca), escrito por el Dr. Fernando Cabieses.

Todos estos trabajos representan los esfuerzos de científicos que siguen manteniendo viva la llama de la ciencia y que nos permiten augurar un futuro sostenible para las siguientes generaciones. Con la presente edición, la revista Científica sigue cumpliendo su labor de presentar trabajos de investigación y de difusión de calidad, lo que contribuye a que podamos conocer más sobre nuestro entorno.

Mg. Héctor Aponte Ubillús Editorialista invitado Coordinador de Investigación de la carrera de Biología Marina, Universidad Científica del Sur

ARTÍCULOS ORIGINALES TÉCNICA XTT: PIGMENTOS INTERFERENTES EN FRACCIONES DE EXTRACTO METANÓLICO DE Bidens pilosa TECHNIQUE XTT: INTERFERING PIGMENTS IN FRACTIONS OF METHANOLIC EXTRACT OF Bidens pilosa

Alejandro Fukusaki1, José Amiel Pérez1,2,Nathaly Enciso2, Álvaro Marcelo1,2,Carlos Altamirano1, Rafael Amiel3, Obert Marín-Sánchez4, Javier Enciso2

Resumen El objetivo es determinar la presencia de pigmentos vegetales que interfieren con lecturas espectrofotométricas de extractos de plantas medicinales y sus fracciones químicas en una longitud de onda de 600 nm, para establecer protocolos que permitan aplicar la técnica XTT o sus modificaciones y detectar metabolitos secundarios que estimulen o inhiban el crecimiento celular. Se ha trabajado con extractos y fracciones cromatográficas de Bidens pilosa (Amor seco) aplicando la técnica XTT, pero en una zona de longitud de onda espectrofotométrica de 600 nm, diferente a la indicada tradicionalmente por los proveedores de los reactivos, que es de 450 a 500 nm. Los procedimientos de separación química y cromatográficos se han efectuado con los solventes metanol, cloroformo, acetona y acetato de etilo. Los equipos utilizados son el espectrofotómetro Pharo 300, para mediciones en el rango UV/ VIS, y el

lector de microplacas de absorbancia ELx808, para ejecutar la prueba de Elisa.

Los resultados se muestran en ocho figuras para la densidad óptica (DO) y una figura para la tasa de estímulo del crecimiento (TEC). Las fracciones ASAR, ASAA y ASF7 no muestran diferencias al compararlas con los valores blanco y control positivo. Se han analizado procedimientos que muestran presencia o ausencia de los pigmentos vegetales que acompañan a los extractos metanólicos de Bidens pilosa y algunas de sus fracciones que muestran las desviaciones que ocurren cuando se quiere encontrar metabolitos secundarios que estimulen o inhiban el crecimiento celular. Los resultados a una longitud de onda de 600 nm no deberían ser positivos, ya que la mayoría de pigmentos presentan sus picos en la zona que se extiende de 450 a 550 nm. Sin embargo, lo son, pero en menor grado, con una DO de 0,584 y 0,767. En conclusión, las fracciones ASAR, ASAA y ASF7, libres de pigmentos, pueden ser útiles para

Laboratorio de Bioquímica y Química de Productos Naturales, Universidad Científica del Sur. Laboratorio de Cultivo Celular, Universidad Científica del Sur. 3 Departamento de Economía para América Latina. Estadística. I.H.S. Filadelfia.

4 Instituto de Medicina Regenerativa, Universidad Científica del Sur. 1 2

182

Científica 12 (3), 2015

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

desarrollar técnicas de tinción que se lean a una longitud de onda de 600 nm al efectuar mediciones en un lector de microplacas. Estas podrían obtenerse con separaciones químicas a las que después se aplican procedimientos cromatográficos.

Palabras claves: Técnica XTT, pigmentos vegetales interferentes, separación cromatográfica de Bidens pilosa

Abstract Objective: To determine the presence of plant pigments interfering with spectrophotometric readings of extracts of medicinal plants and their chemical fractions at a wavelength of 600 nm, and to establish protocols that allow applying the XTT technique or its modifications and to detect secondary metabolites stimulating or inhibiting cell growth.

Materials and methods. We have worked with extracts and chromatographic fractions of Bidens pilosa (dry love) applying XTT technique, but in an area of spectrophotometric wavelength of 600 nm, unlike the 450 to 500 nm range, traditionally indicated by the suppliers of reagents. Methanol, chloroform, acetone and ethyl acetate were the solvents used to perform chemical separation and chromatographic procedures. The equipment used are the Pharo 300 spectrophotometer for measurements in the range UV/VIS and the Microplate Reader for Absorbance ELx808 to run the Elisa test. Results. These are shown in eight charts for optical density (OD) and one chart for the rate of growth stimulation (TEC). The fractions ASAR, ASAA and ASF7 do not show differences when compared with blanks values and positive control. Discussion. We have analyzed procedures showing the presence or absence of plant pigments accompanying methanolic extracts of Bidens pilosa and some of their fractions showing the deviations occurring when

we want to find secondary metabolites stimulating or inhibiting cell growth. The results at a wavelength of 600 nm, should not be positive since most pigments have their peaks in the area ranging from 450 to 550 nm. However, they are, but to a lesser degree, with an OD from 0,584 and 0.767. In conclusion, the fractions ASAR, ASAA and ASF7, free of pigments, can be useful to develop staining techniques which are read at a wavelength of 600 nm when measurements are made in a microplate reader. These could be obtained with chemical separations followed by chromatographic procedures.

Keywords: technique XTT, interfering plant pigments, chromatographic separation of Bidens pilosa.

I. Introducción Para la investigación de células madre (1, 2, 3) y la obtención de compuestos químicos antitumorales se vienen realizando trabajos científicos que permiten utilizar protocolos para el cultivo y expansión de células madre, identificando extractos y fracciones de plantas medicinales que pudieran estimular el crecimiento celular o su inhibición, y aislando aquellos que cuentan con potencial suficiente para aplicarse en medicina regenerativa o tratamiento del cáncer.

La técnica XTT, una prueba específica utilizada frecuentemente para estudios de crecimiento e inhibición celulares (4), puede, en ciertos casos, necesitar mayor especificidad, para lo que requiere el perfeccionamiento apropiado que le permita superar los problemas de medición que se pudieran presentar.

Cuando se trabaja con plantas medicinales o sus derivados, los principales problemas se suscitan por la cantidad y variedad de pigmentos que contienen en su estructura. La

Científica 12 (3), 2015

183

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

clorofila, los carotenoides, la xantófila, la antocianina y otros pigmentos pueden dar lugar a resultados erróneos al aplicarse la técnica XTT, porque los picos o áreas subtendidas en ellos aparecen en la misma longitud de onda en el lector de Elisa. Esta técnica detecta las células vivas en crecimiento o su inhibición por la presencia (o ausencia) de actividad de enzimas mitocondriales que reducen las sales de tetrazolium a compuestos de formazán, enzimas que dejan de emitirse cuando la célula muere. La coloración del formazán, cuando se añade el reactivo XTT, es naranja y se observa en la zona de 450 a 500 nm de longitud de onda en el lector de Elisa, zona que coincide con aquella en la que pueden observarse los pigmentos antes mencionados.

Por lo tanto, cualquier extracto de planta en el que se busquen metabolitos secundarios con efectos estimulantes del crecimiento y que contenga pigmentos de color anaranjado u otros, con absorción entre 450 y 500 nm, podría ofrecer resultados positivos como si fuera estimulante y deberá considerarse, por tanto, como una variable de confusión (5). La presencia de estos pigmentos en la variable independiente enmascara la situación e impide verificar si hay o no sustancias activas estimulantes de la expansión celular. Lo mismo ocurrirá si la experiencia que se realiza es la búsqueda de sustancias químicas antitumorales, en la que se puede tener resultados negativos de inhibición, cuando en realidad pudiera haberlos favorables.

En la búsqueda de productos quimioterapéuticos procedentes de plantas, se han obtenido muy buenos resultados a partir de diversas especies del reino vegetal, de sus extractos y fracciones; y cuando el estudio es más profundo y completo, se logran identificar los compuestos químicos que actúan exitosamente en el tratamiento de cáncer, como ocurrió con el paclitaxel obtenido de

184

Científica 12 (3), 2015

Taxus brevifolia L. en 1968, que luego de numerosos estudios fue aprobado por la FDA en 1992 para pacientes con cáncer de ovario y en 1994, para pacientes con cáncer de mama. Este mismo año se publicó la síntesis total del paclitaxel (6).

Son muy importantes los estudios de expansión de cultivos celulares efectuados con plantas medicinales para reemplazar el suero fetal bovino (SFB), en el caso de células madre (7), porque algunas sustancias de origen animal como el SFB, por su similitud genómica con el ADN del hombre, puedan inducir en las células mutaciones genéticas que podrían propiciar alteraciones de las células madre primarias, particularmente si se trabaja con células obtenidas después de varios pasajes (8).

Este trabajo tiene como objetivo determinar las desviaciones que pueden ocurrir en las lecturas cuantitativas realizadas a una longitud de onda de 600 nm, y eliminar los pigmentos del extracto con el fin de establecer el crecimiento o inhibición celular. Para ello se utilizan separaciones por solventes y procedimientos cromatográficos que permitan obtener fracciones que no contengan los pigmentos antes mencionados, y se leen los resultados en una longitud de onda apropiada.

II. Materiales y métodos MUESTRA La muestra vegetal Bidens pilosa (Amor seco) fue recolectada en el distrito de Cieneguilla, departamento de Lima, en el valle del río Lurín, a 360 m. s. n. m., a una temperatura promedio de 25 °C y 87% de humedad.

Su ubicación taxonómica fue realizada en el Museo de Historia Natural de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

Se utilizaron las hojas secadas a la sombra entre 22 °C y 25 °C, molidas y tamizadas, de las que se obtuvo un polvo de color marrón verdoso.

MATERIALES Se utilizaron los solventes metanol, acetato de etilo, ácido acético, acetona, 1-butanol, todos de calidad p. a., y los siguientes materiales: columna cromatográfica de vidrio, placas 20 x 20 preparadas con silica gel GF254+366, silica gel G60 mesh 60-200, silica gel G60 PF 254-366, cámara de desarrollo para placas de 20 x 20 cm y lámpara ultravioleta (onda corta y larga).

EXTRACCIÓN, SEPARACIÓN Y CROMATOGRAFÍA Se muestra el diagrama correspondiente (figura 1). Se pesaron 300 g de polvo de la muestra de B. pilosa. Fueron extraídos con 1500 ml de metanol p. a. y colocados a baño maría a 40 °C por 24 horas. La solución se filtró y al remanente se le agregaron 750 ml de metanol; esta operación se repitió seis veces, hasta lograr el agotamiento. Luego, se concentró al rotavapor a 39 °C y a presión de 200 mbar, con lo que se obtuvieron 40,4 gramos, con un rendimiento de 13,47% de extracto metanólico.

Se tomaron 15 g del extracto, que fueron disueltos en 250 ml de metanol

a 40 °C y filtrados con filtro de 0,45 mm (ASMeOH1). Se dejó reposar y se precipitaron 772 mg de un sólido de color marrón de aspecto arenoso (ASSMe y después de centrifugar AS-Sól).

El extracto metanólico, después del filtrado (ASMeOH1), fue lavado con 350 ml de n-hexano utilizando un tubo de decantación; quedó en la fase inferior el extracto metanólico (ASMeOH2).

A estos 250 ml del extracto metanólico se les agregaron 250 ml de agua y se extrajo con 200 ml de acetato de etilo por tres veces, hasta obtener el ASAcOEt (capa superior) y ASSAcOEt. Al ASAcOEt se le añadieron 250 ml de acetona y se precipitó un sólido que fue centrifugado (AS-Sól2).

El remanente del ASAcOEt, que es el ASMe2CO, se pasó a través de una columna y fue eluido con 14 l de acetato de etilo, con lo que se obtuvieron 1535 tubos de ensayo del colector de fracciones Spectrum, los que fueron agrupados en 15 fracciones.

Las fracciones 4 y 5 son las más apropiadas para el objetivo de este fraccionamiento.

Se separaron las sustancias ASAR y ASAA después de la cromatografía de 40 placas preparativas utilizando el solvente BAW (butanol - ácido acético y agua 4:1:1).

Científica 12 (3), 2015

185

ARTÍCULOS ORIGINALES ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

MUESTRA SECA Y MOLIDA Metanol Filtrado Extracto Metanólico (ASMeOH)

Residuo (Marco) Reposo (x24h) Filtrado

Extracto Metanólico (ASMeOH1)

Residuo sólido (cristalino) ASSMe (x reposo + AS-Sól (centrif)

n-Hexano

ASMeOH2 AS-EMEOH-n-H(f)

AS+nH(lav)(f) (Capa superior) Agua Acetato de etilo Separación

ASAcOEt (Capa superior)

ASS-AcOEt (Capa inferior) Acetona Centrifugación

ASMe2CO

AS-Sól2

Columna c/acetato de etilo

Las 1535 fracciones se agruparon en solo 15 fracciones

Con las fracciones y 5 (de las 15) se realizó una cromotografía preparativa con BAW (8:1:1). Y para ello se utilizó silicagel G-60 preparativa MERCK y se obtuvo el ASAR y ASAA

Figura 1. Diagrama de flujo de la extracción por separación con solventes y fraccionamiento Figura 1. Diagrama De Flujo De la extracción por separación con solventes y Fraccionamiento cromatográfico . cromatográFico.

186 186

Científica 12 (3), 2015 Científica 12 (3), 2015

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

Tabla 1. Muestras preparadas Muestra

Peso vial con muestra

Peso vial

Peso neto (mg)

1

ASAR

2,2345

2,1944

40,1

2

ASAA

2,3059

2,224

81,9

3

AS-Sól

2,1949

2,1824

12,5

4

ASMe2CO

2,2431

2,2199

23,2

5

ASMeOH

2,3067

2,2343

72,4

6

AS-Sól2

2,2030

2,1862

16,8

7

ASF9

2,2332

2,2129

20,3

8

ASM1

2,2277

2,2090

18,7

9

ASAcOEt

2,2670

2,2125

54,5

10

ASA

2,3200

2,2245

95,5

11

ASF7

2,1956

2,1734

22,2

12

ASSMe

2,3032

2,2179

85,3

Tabla 2. Leyenda de códigos Códigos

Significados

1

ASMeOH

Extracto metanólico de Bidens pilosa (original)

2

ASMeOH 1

Extracto metanólico de Bidens pilosa (después de mantenerlo en reposo por 24 horas) precipitó una pequeñísima cantidad de sólidos de color marrón (ASSMe)

3

ASMeOH 2 o AS-EMeOH-nH

Extracto de Bidens pilosa después del lavado con n-hexano. Es un extracto metanólico limpio.

4

AS+nH(lav)

Es la capa superior de lavado con n-hexano.

5

ASAcOEt

Extracto acetato de etilo de Bidens pilosa (capa superior)

6

ASS-AcOEt

Extracto metanólico extraído después con acetato de etilo

7

ASMe2CO

Extracto acetónico de Bidens pilosa, después de la centrifugación

8

AS-Sól

Residuo de extracto de Bidens pilosa después del centrifugado

9

ASAR

Fracción de Bidens pilosa de tono rojizo detectado después de la cromatografía preparativa (CCP) de las fracciones F4 y F5

10

ASAA

Fracción de tono amarillento, después de la CCP

11

ASF9

Fracción 9 de la columna

12

ASM1

Fracción metanólica de Bidens pilosa, después de extraída con acetato de etilo

13

ASF7

Fracción 7 después de pasar por la columna

14

ASSMe

Sólido de Bidens pilosa después de reposo x 24 horas

15

AS-Sól2

Sólido, después de agregar acetona al ASAcOEt

Científica 12 (3), 2015

187

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

DETERMINACIÓN DEL EFECTO PROLIFERATIVO

DOP = densidad óptica de la prueba DOC = densidad óptica del control

Se utilizaron células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano (ADSC). Para iniciar el procedimiento de prueba se sembraron 5,000 células madre mesenquimales obtenidas de tejido adiposo humano de 4 pasajes, colocándolas en cada pocillo de una microplaca de 96 a la que se añadieron el medio de cultivo celular DMEM - F12, las fracciones o el suero fetal bovino (SFB) según correspondiera.

Otra forma de evitar o disminuir la interferencia es seleccionando en el lector de microplacas una zona de longitud de onda libre de la incidencia de pigmentos vegetales. De acuerdo con la literatura científica (11, 12) verificada en este trabajo (ver anexo I), por espectrofotometría, usando un espectrofotómetro Pharo 300, para mediciones en el rango UV/ VIS, las zonas comprometidas por los pigmentos vegetales son las que se muestran en la tabla 3.

El efecto a comprobar se evaluó por triplicado a las 24, 48 y 72 horas con dosis crecientes de 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640 y 1280 μg/ml para extractos y fracciones, y como control SFB al 10%.

Todas las pruebas incluyeron DMSO, así como también la prueba en blanco. Se incubaron a 37 °C durante 2 horas para favorecer la adherencia de las células, sin medio de cultivo y en un ambiente del 5% de CO2 para medir el estímulo de crecimiento o bien los pigmentos interferentes.

LA TÉCNICA XTT Se utilizó la técnica XTT basada en la reducción de sales de tetrazolium (9).

La densidad óptica (DO) se midió en el lector de Elisa a una longitud de onda de 600 nm, diferente a la establecida regularmente que es de 450 a 500 nm, alejada de la zona de interferencia y verificando si esta es útil al comparar las fracciones con los grupos de control blanco y control positivo. El resultado de la intensidad de color referido a la menor o mayor dosis (concentración en µg/ml) se expresa en densidad óptica y, eventualmente, en porcentajes como tasa de estimulación celular (TEC) (10).

TEC = [(DOP/DOC)-1] x 100 en donde:

188

Científica 12 (3), 2015

Tabla 3. Longitudes de onda correspondientes a los pigmentos vegetales detectados en fracciones de extracto metanólico de

Bidens

pilosa

Pigmentos

Longitud en nanómetros

Clorofila a

429 y 660

Clorofila b

453 y 643

Xantófilas

De 430 a 490

β-caroteno

De 450 a 500

Antocianinas

De 500 a 540

Por este motivo se seleccionó 600 nm de longitud de onda que se estableció como la zona libre de pigmentos apta para realizar en ella las experiencias antes mencionadas.

ESTADÍSTICA Se aplicaron a los resultados las pruebas estadísticas requeridas, utilizando la hoja de cálculo del programa Microsoft Excel: análisis de regresión lineal, correlación, promedios, desviación estándar, prueba t de Student de comprobación de hipótesis por diferencia de promedios de las pruebas blanco con el control positivo y con la prueba especial ANOVA (ver anexo II).

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

III. Resultados Los resultados de absorbancia obtenidos como densidad óptica (DO) se muestran en las nueve figuras que se observan a continuación. Ocho corresponden a las diversas concentraciones de extractos de la especie Bidens pilosa y de sus fracciones obtenidas por solventes o por procesos cromatográficos, dosis (concentraciones) que aumentan gradualmente de 10 µg/ml hasta 1280 µg/ml. Además, se reservó una figura para ensayos de simulación que se expresan como la tasa de estímulo celular (TEC).

Extracto metanólico de Bidens pilosa (Amor seco) DO 24, 48 y 72 horas Longitud de onda: 600 nm 0,900 y = 0,0004x + 0,3279

0,800

r = 0,984

y = 0,0003x + 0,2457

Densidad óptica (DO)

0,700

r = 0,986

0,600

y = 0,0003x + 0,2537 r = 0,989

0,500 24 horas 0,400

48 horas 72 horas

0,300

Lineal (24 horas) Lineal (48 horas)

0,200

Lineal (72 horas)

0,100 0,000 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Concentración en µg (dosis)

Figura 2. Densidad óptica del extracto metanólico de Bidens pilosa según el tiempo de incubación y la dosis expresada en µ g/ml Se observa una buena correlación y la DO progresivamente aumentada conforme se incrementa la concentración.

Científica 12 (3), 2015

189

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

Fracciones de Bidens pilosa obtenidas por separación con solventes Fracción ASMeOH - DO 24, 48 Y 72 horas Longitud de onda: 600 nm 0,700 y = 0,0003x + 0,2698 r = 0,940

0,600

y = 0,0002x + 0,2627 r = 0,961

Densidad óptica (DO)

0,500

y = 0,0002x + 0,246 r = 0,961

0,400

24 horas 48 horas

0,300

72 horas 0,200

Lineal (24 horas)

0.100

0.000 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Concentración en µg (dosis)

Figura 3. Densidad óptica de una fracción de Bidens pilosa obtenida por separación con solventes según el tiempo de incubación y la dosis expresada como concentración en µ g/ml.

El índice de correlación disminuye con respecto al anterior (Figura 2). La DO no se incrementa como se observa en la figura anterior.

190

Científica 12 (3), 2015

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

Fracciones de Bidens pilosa obtenidas por dos cromatografías diferentes Fracción ASAR - DO 24, 48 y 72 horas Longitud de onda: 600 nm

0,300

0,280 y = -1E-05x + 0,2661

Densidad óptica (DO)

0,260

r = - 0,387 y = 3E -05x + 0,2116

0,240

r = 0,188 y = 9E -06x + 0,2174

0,220

r= 0,188

0,200 24 horas 0,180

48 Horas

0,160

72 horas

0,140 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Concentración en µg (dosis)

Figura 4. Densidad óptica (DO) de la fracción ASAR, según el tiempo de incubación (24, 48 y 72 horas) y dosis expresadas como concentración en µ g/ml.

La absorbancia expresada como DO es tan baja como la de la prueba blanco y no se incrementa con el aumento gradual de la dosis.

Científica 12 (3), 2015

191

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

Fracciones de Bidens pilosa obtenidas por dos cromatografías diferentes Fracción ASAA - DO 24, 48 y 72 horas Longitud de onda: 600 nm

0,7

24 horas 0,6 48 Horas

Densidad óptica (DO)

0,5

72 horas

0,4 y = 6E -06x + 0,2565 r = 0,194

0,3

y = 2E -05x + 0,2103 r = 0,452

0,2

y = 3E -05x + 0,2116 r = 0,631 0,1

0 0

200

400

600 800 1000 Concentración en µg (dosis)

1200

1400

Figura 5. Densidad óptica (DO) de la fracción ASAA, según el tiempo de incubación (24, 48 y 72 horas) y dosis expresadas como concentración en µ g/ml.

DO muy baja e índice de correlación también.

192

Científica 12 (3), 2015

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

Fracciones de Bidens pilosa obtenidas por Fracción AS - Sól - DO 24, 48 y 72 horas Longitud de onda: 600 nm

0,740

0,640

y = 0,0003x + 0,2824

y = 0,0003x + 0,2607

r = 0,917

r= 0,931

Densidad óptica (DO)

0,540 y = 0,0003x + 0,2576 r = 0,903

0,440

24 horas 48 horas

0,340

72 horas 0,240

0,140 0

200

400

600 800 1000 Concentración en µg (dosis)

1200

1400

Figura 6. DO de la fracción AS-SóL, según el tiempo de incubación y la dosis expresada como concentración en µ g/ml.

El índice de correlación ha mejorado gracias al aumento progresivo de la dosis y la DO. Sin embargo, estos aumentos se detienen a partir de la concentración de 640 µ g/ml.

Científica 12 (3), 2015

193

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

Fracciones de Bidens pilosa obtenidas por separación con solventes Fracción ASMe2CO - DO 24, 48, 72 horas Longitud de onda: 600 nm 0,7

y = 0,0003x + 0,3039 r = 0,917

0,65

y = 0,0002x + 0,277

Densidad óptica (DO)

0,6

r = 0,926

0,55

y = 0,0002x + 0,271 r = 0,980

0,5 24h

0,45

48h 0,4

72h

0,35

Lineal (24h)

0,3

Lineal (48h) Lineal (72h)

0,25 0

500

1000

Concentración en µg (dosis) Tamaño de muestra: n=8

Figura 7a. Densidad óptica (DO) de la fracción ASMe2CO, según el tiempo de incubación (24 h, 48 h y 72 h) y las dosis expresadas como concentración en µ g/ml.

La DO aumenta progresivamente conforme crecen las dosis hasta llegar a 640 µ g/ml. A partir de allí no aumenta en el hito siguiente, 1280 µ g/ml y sus valores son similares y aún menores con incubaciones de 48 y 72 horas. A pesar de ello, los índices de correlación se muestran elevados.

194

Científica 12 (3), 2015

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

Fracciones de Bidens pilosa Fracción ASMe2CO - DO 24, 48, 72 horas Longitud de onda: 600 nm 0,65

y = 0,0005x + 0,2743 r = 0,982

0,6

Densidad óptica (DO)

0,55

y = 0,0004x + 0,2551

24h 48h

r = 0,990 0,5

72h Lineal (24h)

0,45

Lineal (48h) 0,4

Lineal (72h) y = 0,0001x + 0,2769

0,35

r = 0,923 0,3 0,25 0

100

200

300

400

500

600

700

Concentración en µg (dosis) Tamaño de muestra: n=7

Figura 7b. Densidad óptica (DO) de la fracción ASMe2CO, según tiempo de incubación y dosis expresadas como concentración en µ g/ml.

La aplicación estadística se realiza solo hasta la dosis de 640 µ g/ml. Se observa que la correlación es mejor aún que la mostrada en la figura 7a.

Científica 12 (3), 2015

195

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

Fracciones de Bidens pilosa obtenidas por separación con solventes Fracción ASMe2CO - DO 24, 48, 72 horas Longitud de onda 600 nm

0,5

Densidad óptica (DO)

0,45 y = 0,0004x + 0,2848

24h

r = 0,929

48h

0,4

72h y = 0,0003x + 0,2623

Lineal (24h)

r = 0,981

0,35

Lineal (48h)

y = 0,0002x + 0,2686 Lineal (72h) r = 0,979 0,3

0,25 0

100

200 Concentración en µg (dosis)

300

400

Tamaño de muestra: n=6

Figura 7c. Densidad óptica (DO) de la fracción ASMe2CO, según el tiempo de incubación y 320 µ g/ml.

dosis expresadas como concentración en µ g/ml. Aplicación estadística solo hasta la dosis de

La DO se incrementa conforme aumenta la dosis, pero muestra mayor variación. La correlación es ligeramente menor que aquella que se observa en la figura 7b.

196

Científica 12 (3), 2015

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

Fracciones cromatográficas de Bidens pilosa Fracción ASF7 - DO 24, 48 y 72 horas Longitud de onda 600 nm 0,700 24 horas 0,600

48 horas

Densidad óptica (DO)

0,500

72 horas

0,400

Lineal (24

y = 4E -05x + 0,269

horas)

r = 0,655 0,300 y = -2E-05x + 0,2143 r = - 0,609

0,200

y = -2E-05x + 0,2191 r = -0,626

0,100

0,000

-0,100 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Concentración en µg (dosis)

Figura 8. Densidad óptica (DO) de la fracción cromatográfica ASF7, según el tiempo de incubación y dosis expresadas como concentración en µ g/ml.

DO muy bajas, particularmente en incubaciones a 48 y 72 horas. Correlación negativa para incubaciones a 48 y 72 horas.

Científica 12 (3), 2015

197

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

Fracciones cromatográficas de Bidens pilosa Fracción ASF9 - DO 24, 48 y 72 horas Longitud de onda: 600 nm 0,700 0,600 y = 0,0001x + 0,2816

Densidad óptica (DO)

0,500

r = 0,893 y = 7E -05x + 0,2571

0,400

r = 0,954

0,300

y = 7E -05x + 0,2446 r = 0,957

24 horas

0,200

48 horas 0,100 72 horas 0,000

Lineal (24 horas)

-0,100

Lineal (48 horas) 0

500

1000

Concentración en µg (dosis)

1500 Lineal (72 horas)

Figura 9. Densidad óptica (DO) de la fracción cromatográfica ASF7, según el tiempo de incubación y dosis expresadas como concentración en µ g/ml.

Aunque aumentan progresivamente los valores de DO, conforme lo hacen las dosis, no se La correlación es positiva y alta, particularmente en incubaciones a 48 y 72 horas.

muestran muy elevados.

198

Científica 12 (3), 2015

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

Fracciones cromatográficas de Bidens pilosa Fracción ASF9 - TEC 24, 48 y 72 horas Longitud de onda: 600 nm 90 y = 9,559x - 13,177

Tasa de estimulación celular (TEC

80

r = 0,893

70 y = 4,7619x - 4,2112

60

r = 0,957 50

24 horas

40

48 horas 72 horas

30

Lineal (24 horas)

y = 0,0297x + 7,7402

20

Lineal (48 horas)

r= 0,957

10

Lineal (72 horas)

0 -10 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Concentración en µg (dosis)

Figura 10a. Tasa de estimulación de crecimiento (TEC) de la fracción cromatográfica ASF9 de Bidens pilosa, según tiempo de incubación (24, 48 y 72 horas) y dosis expresadas como concentración en µ g/ml.

Las TEC aumentan progresivamente conforme lo hacen también las dosis. La correlación es buena y positiva.

Científica 12 (3), 2015

199

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

Fracciones cromatográficas de Bidens pilosa Fracción ASAR - TEC 24, 48 y 72 horas Longitud de onda:600 nm 15,000 y = 0,0054x - 0,8846

10,000

r = 0,189

5,000 y = 0,0053x - 2,6624 r = 0,190

Densidad óptica (DO)

0,000

24 horas

-5,000

y = -0,0047x + 1,7633

48 horas

r = - 0,380

-10,000

72 horas -15,000

Lineal (24 horas)

-20,000

Lineal (48 horas) Lineal (72 horas)

-25,000 -30,000 -35,000 0

200

400 600 800 1000 Concentración en µg (dosis)

1200

1400

Figura 10b. Simulación de la tasa de estimulación de crecimiento (TEC) de la fracción ASAR de Bidens pilosa, según tiempo de incubación y dosis expresadas como concentración en µ g/ml.

La incubación a 24 horas muestra disminución en su valor de TEC con correlación Las incubaciones de 48 y 72 horas son positivas, pero sus valores de TEC no son elevados, más bien moderados.

significativamente negativa.

200

Científica 12 (3), 2015

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

Fracciones cromatográficas de Bidens pilosa Fracción ASAA - TEC 24, 48, 72 horas Longitud de onda: 600 nm 20 y = 0,011x - 3,0788 r = 0,371

Tasa de estimulación celular (TEC)

10

y = 0,0125x - 7,4726 r = 0,407

0 y = 0,0019x - 1,57 r = 0,239

-10

24 horas 48 horas 72 horas Lineal (24 horas)

-20

Lineal (48 horas) Lineal (72 horas)

-30

-40 0

200

400

600

800

1000

1200

1400

Concentración en µg (dosis)

Figura 10c. Simulación de la tasa de estimulación de crecimiento (TEC) de la fracción ASAA de Bidens pilosa, según tiempo de incubación y dosis expresadas como concentración en µ g/ml.

Valores de TEC son significativamente bajos, incluso algunos negativos. La correlación no es buena.

Los resultados en las figuras b y c muestran que cuando los valores son moderados o DO a los promedios del control blanco, no afectan el objetivo del trabajo (de estímulo del crecimiento).

negativos, y similares en

Científica 12 (3), 2015

201

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

La prueba blanco realizada con células madre mesenquimales humanas (MSC-H), medios de cultivo DMEM más el 1% de los antibióticos estreptomicina y penicilina presenta un promedio de 0,257 de DO para un total de 108 observaciones.

El control positivo conformado además de los componentes del blanco (células madre, medios de cultivo y antibióticos) con suero fetal bovino (SFB), reconocido como el mejor estimulante del crecimiento celular a la fecha, adicionado al 10% y cuya DO obtenida en promedio de 54 observaciones es de 0,242, no muy distinto al de la prueba blanco. A estos valores se ha aplicado la prueba estadística t de Student que establece la diferencia entre ambos y concluye que no la hay, validando la hipótesis nula.

Este resultado es lógico porque estas pruebas, como todas las otras, se leen en una zona (pico) de 600 nm que no corresponde a la detección de crecimiento celular establecida para la prueba XTT, que es de 450 a 500 nm de longitud de onda en el lector de microplacas.

Las figuras 2 y 3 muestran resultados de extractos de Bidens pilosa con valores crecientes a partir de 20 mg/ml con DO de 0,229 y 0,240 hasta la dosis de 1280 mg/ml con DO de 0,767 y 0,584.

Las fracciones AS-Sól y ASMe2CO (figs. 6 y 7) obtenidas por simple separación con solventes muestran en sus concentraciones más altas, 640 mg/ml y 1280 mg/ml, y después de un crecimiento gradual, sus DO máximas de 0,575 y 0,611, respectivamente.

Las fracciones ASF7 y ASF9 (figs. 8 y 9) son dos de las quince que se obtuvieron de la columna cromatográfica. La primera, la ASF7, así como las dos que se sometieron a una segunda cromatografía con placas preparativas y utilizando el solvente BAW, se denominaron ASAR y ASAA (Figura 4 y 5), y no muestran

202

Científica 12 (3), 2015

diferencias significativas al compararlas con los valores blanco y control positivo; por tanto, pueden ser útiles para, después de desarrollar técnicas de tinción que manifiesten crecimiento o inhibición celular en la longitud de onda de 600 nm, buscar las sustancias químicas de interés.

La figura 7, fracción ASMe2CO, permite apreciar la correlación con valores de dosis totales (7a) y parciales (7b y 7c) logradas con la aplicación estadística a solo 320 mg/ml y 640 mg/ ml, respectivamente, efectuadas para apreciar mejor la correlación y validez de la curva de pigmentos en esta fracción hasta una dosis de 640 mg/ml. A partir de esta concentración, en este estudio, no aumenta la DO y en consecuencia no tienen validez cuantitativa, pruebas realizadas con concentraciones tan elevadas. Por ello y para aplicar correctamente la Ley de Lambert y Beer, se recomienda trabajar con muestras diluidas.

La correlación para una dosis de 1280 mg/ml e incubación a 48 horas fue de 0,926 y mejora a 0,990 leída en una concentración de 640 mg/ml.

IV. Discusión Este trabajo es parte de un conjunto de ensayos que pretenden establecer procesos de utilización de técnicas sencillas de alto rendimiento, bajo costo y rápida ejecución.

Hemos mostrado con estas experiencias que una técnica con estas características es la prueba XTT, pero que plantea problemas en su aplicación cuando se utiliza para mediciones de extractos de plantas y sus derivados que contienen pigmentos que afectan sus resultados.

Las lecturas a realizarse en un lector de microplacas (Elisa) deben efectuarse

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

a una longitud de onda de 450 a 500 nanómetros. Sin embargo, se han utilizado en este trabajo todas las lecturas a 600 nm de longitud de onda, con los resultados que se han apreciado antes, habiéndose extraído previamente los pigmentos de los extractos de Bidens pilosa con solventes apropiados para, en la última etapa, fraccionar la solución cromatográficamente.

Las fracciones así obtenidas mantienen valores significativamente mayores al blanco y su presencia o ausencia concuerda con las propiedades de los solventes empleados en las diferentes etapas de separación.

Los valores de absorción máximos obtenidos en este trabajo experimental, expresados como DO, para concentraciones de 640 y 1280 mg/ml, varían entre 0,584 y 0,767. Posiblemente, detectan algunos pocos pigmentos a esta longitud de onda de 600 nm; pero son significativamente menores a los que usualmente se observa cuando se miden extractos hidroalcohólicos de Buddleja globosa a una longitud de onda de 450 nm, que van de 1,938 (24 horas) a 2,253 (48 horas) de DO para una concentración de 100 mg/ml (13).

Sorprende que los resultados de las pruebas comparativas de las muestras de extractos de Bidens pilosa+células madre, que se denominan pruebas especiales en este estudio, no muestran mayor diferencia en cuanto a su DO: 0,240 con las pruebas blanco y, por ende, con las pruebas control positivo, cuando deberían resultar con valores claramente más altos, si es que los pigmentos por sí solos fueran responsables del aumento de la DO, como ocurre con el extracto metanólico de Bidens pilosa que a concentraciones de 640 y 1280 mg/ml presenta una DO de 0,470 y 0,638, para una incubación de 48 horas.

Lo único diferente entre los componentes de la prueba especial y los de la prueba experimental del extracto metanólico de Bidens pilosa es que a esta última se le ha agregado el medio de cultivo celular DMEN. Este medio está constituido por el colorante rojo de metilo, como indicador de pH en la prueba, y pudiera modificar los resultados habidos en la prueba especial, en favor del aumento de la DO observada y que pudiera haber ocurrido al sumarse este colorante a la mezcla de pigmentos de Bidens pilosa.

No se descartan otras posibilidades.

Teóricamente, las curvas espectrofotométricas obtenidas de los extractos acuosos y metanólicos de Zea mays L. (maíz morado) (ver Anexo I) indicarían que las antocianinas que contienen pudieran ser responsables de esta elevación de la DO. Pero no en este caso, porque si así fuera también habría aparecido este aumento en la prueba especial.

La simulación evidencia un resultado positivo de TEC, cuando en la muestra existen pigmentos registrados en el lector de microplacas. A estos se les denomina, en este estudio, pigmentos vegetales interferentes, porque distorsionan los resultados y no deben aceptarse como tasa de estímulo celular (TEC).

Estos estudios no han abordado la posibilidad de que los pigmentos vegetales mismos pudieran ser la causa de estimulación del crecimiento de las células mesenquimales. Se recomienda realizar experiencias para determinar la DO de otras plantas, además de Bidens pilosa.

Es este un ejemplo más acerca de la importancia de identificar y cuantificar las variables (14), particularmente las intervinientes o de confusión (15), y cuando estas forman parte de la variable

Científica 12 (3), 2015

203

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

independiente, anularlas por separación, extracción u otros procedimientos que impidan su accionar interferente.

de onda, fraccionamiento que puede complementar la eficiencia de la técnica antes sugerida.

En conclusión, la longitud de onda de 600 nm corresponde a una buena zona que no detecta significativamente los pigmentos contenidos en los vegetales, pero tampoco es útil para detectar crecimiento celular según la técnica XTT, que lo hace en forma apropiada en una longitud que va de 450 a 500 nm. Se propone, por ello, desarrollar técnicas de tinción que se lean en la longitud de onda de 600 nm, modificando el color resultante del reactivo que afecta a los compuestos enzimáticos mitocondriales o ensayando otro tipo de pruebas bioquímicas.

Deberá verificarse si este extracto metanólico, así tratado y leído espectrofotométricamente, conserva los metabolitos secundarios o moléculas químicas capaces de estimular o inhibir el crecimiento celular.

Se ha obtenido, a partir del extracto metanólico de Bidens pilosa, las fracciones cromatográficas ASAR, ASAA y ASF7 libres de pigmentos vegetales cuando se leen a 600 nm de longitud

204

Científica 12 (3), 2015

V. Agradecimientos A la Sra. Laura Castro, por su eficiente colaboración en la preparación de este artículo.

Fuente de financiamiento Este trabajo fue financiado por la Universidad Científica del Sur. Conflictos de interés Los autores declaran no tener conflictos de interés.

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

Anexo I Espectrofotometría de pigmentos vegetales

3,5

214, 3,017

Densidad óptica (DO)

3 2,5 271, 1,216

2

323, 0,887

1,5 1

408, 0,514

450,0,142

600,0,055

0,5

665,0,205

190 208 226 244 262 280 298 316 334 352 370 388 406 424 442 460 478 496 514 532 550 568 586 604 622 640 658 676 694 712 730 748 766 784

0

Longitud de onda en nanómetros (nm)

Figura 11. Extracto metanólico de Medicago sativa (alfalfa), 2.5 mg/ mL con alto contenido de clorofila.

Se observan valores importantes a 450 nm y a 665 nm. No así a 600.

2 1,8

217, 1.737

1,6

Densidad óptica (DO)

1,4 1,2 1

260, 0.703 450,0.198

0,8 0,6

447, 0.207

476, 0.167

0,4

600,0 665,0

0,2

-0,2

190 208 226 244 262 280 298 316 334 352 370 388 406 424 442 460 478 496 514 532 550 568 586 604 622 640 658 676 694 712 730 748 766 784

0

Longitud de onda en nanómetros (nm)

Figura 12. Extracto metanólico de Daucus carota (zanahoria) 51.3 mg/ mL, con alto contenido de b caroteno.

Se muestran valores importantes en DO entre 447 y 476 nm de longitud de onda.

Científica 12 (3), 2015

205

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

2,5 526,1.791

Densidad óptica (DO)

527,1.805

528,1.79

525,1.771

2

529,1.739

1,5

600,1.297

450,1.772 1

665,0.304 0,5

400 409 418 427 436 445 454 463 472 481 490 499 508 517 526 535 544 553 562 571 580 589 598 607 616 625 634 643 652 661 670 679 688 697

0 Longitud de onda en nanómetros (nm)

Figura 13. Extracto metanólico de Zea mays L. (maíz morado) 1.77 mg/ ml con alto contenido de antocianinas.

Se observan valores importantes en DO a 600 nm de longitud, aunque menores siguen siéndolo a 665 nm, e incluso a mayor longitud de onda

3

Densidad óptica (DO)

2,5 2 326, 0.731 1,5 1

377, 0.511 450,0.26

0,5

600, 0.052 665,0.209

190 217 244 271 298 325 352 379 406 433 460 487 514 541 568 595 622 649 676 703 730 757 784 811 838 865 892 919 946 973 1000 1027 1054 1081

0

Longitud de onda en nanómetros (nm)

Figura 14. Extracto metanólico de Bidens pilosa (amor seco) 0.2 mg/ ml con alto contenido de clorofila y probablemente otros pigmentos.

Se muestran valores importantes en DO de 450 a 478 nm de longitud de onda, pero no a 600 nm.

206

Científica 12 (3), 2015

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

Anexo II Estadística Tabla 4. Comparación de la prueba blanco con el control positivo SFB A) PRUEBA EN BLANCO Incubación: 24 horas Placa 1

0,247

0,261

0,276

0,272

0,288

0,272

Placa 2

0,157

0,265

0,294

0,238

0,259

0,255

Placa 3

0,272

0,210

0,234

0,231

0,228

0,221

Placa 4

0,257

0,235

0,253

0,252

0,290

0,529

Placa 5

0,271

0,249

0,280

0,255

0,374

0,268

Placa 6

0,230

0,451

0,709

0,284

0,313

0,299

Placa 1

0,204

0,221

0,225

0,251

0,245

0,234

Placa 2

0,208

0,231

0,240

0,241

0,240

0,231

Placa 3

0,205

0,209

0,221

0,216

0,237

0,227

Placa 4

0,240

0,217

0,224

0,226

0,246

0,242

Placa 5

0,227

0,214

0,225

0,223

0,423

0,229

Placa 6

0,189

0,193

0,308

0,210

0,224

0,213

Placa 1

0,215

0,234

0,237

0,250

0,260

0,250

Placa 2

0,222

0,242

0,253

0,251

0,252

0,243

Placa 3

0,224

0,231

0,243

0,250

0,257

0,254

Placa 4

0,255

0,239

0,245

0,246

0,256

0,253

Placa 5

0,236

0,227

0,238

0,235

0,702

0,239

Placa 6

0,208

0,219

0,230

0,229

0,239

0,231

Incubación: 48 horas

Incubación: 72 horas

B) CONTROL POSITIVO CON SFB 24 horas

48 horas

72 horas

Placa 1

0,251

0,307

0,289

0,238

0,254

0,229

0,237

0,268

0,248

Placa 2

0,228

0,268

0,257

0,216

0,249

0,235

0,226

0,258

0,247

Placa 3

0,222

0,248

0,235

0,216

0,228

0,210

0,232

0,243

0,229

Placa 4

0,255

0,277

0,258

0,222

0,248

0,232

0,238

0,257

0,243

Placa 5

0,245

0,268

0,237

0,219

0,238

0,225

0,23

0,252

0,237

Placa 6

0,281

0,283

0,259

0,199

0,218

0,195

0,223

0,236

0,210

Científica 12 (3), 2015

207

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso C) DOS MUESTRAS, ASUMIENDO VARIANZAS DISTINTAS Prueba en Blanco

Control positivo Con SFB

Promedio

0,256787037

0,241722222

Varianza

0,006035739

0,000498544

108

54

Observaciones Hipótesis sobre la diferencia de promedios

0

138

1,866855476

P(T<=t) una cola

0,032021778

t Crítica una cola

1,655970383

P(T<=t) dos colas

0,064043555

t Crítica dos colas

1,977303512

Grados de libertad t-Estadístico

Se rechaza la hipótesis nula que estipula que no hay diferencia entre los promedios o, lo que es lo mismo, que la diferencia entre promedios es igual a cero.

Tabla 5. Comparación de la prueba blanco con la prueba especial (extracto de amor seco + células madre) A) PRUEBA EN BLANCO. Ver página anterior y compararla con lo siguiente: B) PRUEBA ESPECIAL Incubación

24 horas

48 horas

72 horas

Placa 1

0,246, 0,267, 0,262

0,231, 0,255, 0,254

0,236, 0,256, 0,258

Placa 2

0,205, 0,271, 0,298

0,249, 0,253, 0,268

0,252, 0,254, 0,273

Placa 3

0,300, 0,255, 0,255

0,241, 0,232, 0,245

0,260, 0,255, 0,264

Placa 4

0,242, 0,278, 0,278

0,223, 0,247, 0,251

0,241, 0,265, 0,267

Placa 5

0,273, 0,283, 0,324

0,238, 0,243, 0,255

0,247, 0,250, 0,262

Placa 6

0,313, 0,313, 0,317

0,217, 0,219, 0,228

0,232, 0,232, 0,238

t-Test: Dos muestras asumiendo varianzas distintas Blanco

Prueba especial de extracto de Bidens pilosa

Promedio

0,256787037

0,25687037

Varianza

0,006035739

0,00063653

108

54

0

Observaciones Hipótesis sobre la diferencia de promedios Grados de libertad

144

t-Estadístico

-0,010129957

P(T<=t) una cola

0,495965811

t Crítica una cola

1,655504178

P(T<=t) dos colas

0,991931622

t Crítica dos colas

1,976575034

No existe la diferencia estadística entre las medias (promedios) y no se puede rechazar la hipótesis nula (hipótesis cero en el cuadro anterior), lo que significa que no hay diferencias entre las dos muestras comparadas, blanco y prueba especial. El valor t-Estadístico calculado es -0,010129957.

208

Científica 12 (3), 2015

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

Tabla 6. Dosis óptica obtenida de aplicar la técnica xtt al extracto metanólolico total de bidens pilosa + células madre + medio de cultivo dmem e incubado, a 24, 48 y 72 horas Incubado a 24 horas

Incubado a 48 horas

Microgramos/ mililitro

Incubado a 72 horas

Densidad óptica (DO)

10

0,288, 0,306, 0,336

0,207, 0,223, 0,234

0,227, 0,239, 0,251

20

0,290, 0,302, 0,304

0,224, 0,226, 0,237

0,237, 0,235, 0,247

40

0,305, 0,334, 0,345

0,229, 0,244, 0,264

0,244, 0,259, 0,270

80

0,361, 0,366, 0,350

0,270, 0,272, 0,286

0,266, 0,268, 0,284

160

0,387, 0,428, 0,450

0,312, 0,334, 0,347

0,316, 0,335, 0,348

320

0,474, 0,491, 0,466

0,370, 0,383, 0,370

0,383, 0,390, 0,380

640

0,575, 0,585, 0,599

0,457, 0,476, 0,478

0,459, 0,438, 0,476

1280

0,778, 0,751, 0,773

0,661, 0,618, 0,636

0,665, 0,615, 0,639

La mayor dosis de 1280 microgramos de esta prueba es la misma de la prueba especial de extracto de Bidens pilosa + células madre, pero difiere significativamente de esta, porque contiene el medio de cultivo DMEM y sus resultados en DO son más elevados.

En la misma placa 6, se ha trabajado la prueba experimental constituida por el extracto metanólico total de Bidens pilosa, con dosis que van de 10 a 1280 microgramos e incubadas durante 24, 48 y 72 horas.

Tabla 7. Comparación por análisis de varianza (anova) de los resultados promedio en do de tres poblaciones, incubadas a 24, 48 y 72 horas, para determinar si son iguales o diferentes 24 horas 0,247, 0,157, 0,272, 0,257, 0,271, 0,230, 0,261, 0,265, 0,210, 0,235, 0,249, 0,451, 0,276, 0,294, 0,234, 0,253, 0,280, 0,709, 0,272, 0,238, 0,231, 0,252, 0,255, 0,284, 0,288, 0,259, 0,228, 0,290, 0,374, 0,313, 0,272, 0,255, 0,221, 0,529, 0,268, 0,299, 0,251, 0,228, 0,222, 0,255, 0,245, 0,281, 0,307, 0,268, 0,248, 0,277, 0,268, 0,283, 0,289, 0,257, 0,235, 0,258, 0,237, 0,259 48 horas 0,204, 0,208, 0,205, 0,240, 0,227, 0,189, 0,221, 0,231, 0,209, 0,217, 0,214, 0,193, 0,225, 0,240, 0,221, 0,224, 0,225, 0,308, 0,251, 0,241, 0,216, 0,226, 0,223, 0,210, 0,245, 0,240, 0,237, 0,246, 0,423, 0,224, 0,234, 0,231, 0,227, 0,242, 0,229, 0,213, 0,238, 0,216, 0,216, 0,222, 0,219, 0,199, 0,254, 0,249, 0,228, 0,248, 0,238, 0,218, 0,229, 0,235, 0,210, 0,232, 0,225, 0,195 72 horas 0,215, 0,222, 0,224, 0,255, 0,236, 0,208, 0,234, 0,242, 0,231, 0,239, 0,227, 0,219, 0,237, 0,253, 0,243, 0,245, 0,238, 0,230, 0,250, 0,251, 0,250, 0,246, 0,235, 0,229, 0,260, 0,252, 0,257, 0,256, 0,702, 0,239, 0,250, 0,243, 0,254, 0,253, 0,239, 0,231, 0,237, 0,226, 0,232, 0,238, 0,230, 0,223, 0,268, 0,258, 0,243, 0,257, 0,252, 0,236, 0,248, 0,247, 0,229, 0,243, 0,237, 0,210 RESUMEN Grupos

Muestras

Suma total

Media

Varianza

24 horas

54

14,947

0,276796

0,006518

48 horas

54

12,430

0,230185

0,001068

72 horas

54

13,409

0,248315

0,004128

ANOVA Variación de fuente

SS

df

MS

F

P-valor

F crítico

Entre grupos

0,059625

2

0,029812

7,635643

0,000682

3,052891

En grupos

0,620793

159

0,003904

Total

0,680417

161

Científica 12 (3), 2015

209

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

El resultado muestra que los promedios de las tres poblaciones (24, 48, 72 horas) no son iguales; por tanto, se rechaza la hipótesis nula Ho, que todos son iguales: "Al menos una es diferente". t-Test: Dos muestras asumiendo varianzas distintas 24 horas

48 horas

Media

0,276796296

0,230185185

Varianza

0,006517750

0,001067814

54

54

Hipótesis sobre la diferencia de promedios

0

Grados de Libertad

70

3,932714223

9,7636E-05

t Crítica una cola

1,66691448

P(T<=t) dos colas

0,000195272

T Crítica dos colas

1,994437086

Observaciones

t-Estadístico P(T<=t) una cola

t-Test: Dos muestras asumiendo varianzas distintas 24 horas

72 horas

Promedio

0,276796296

0,248314815

Varianza

0,006517750

0,004127503

54

54

Observaciones Hipótesis sobre la diferencia de promedios

0

101

2,028530129

P(T<=t) una cola

0,022569106

t Crítica una cola

1,660080631

P(T<=t) dos colas

0,045138213

t Crítica dos colas

1,983730950

Grados de libertad t-Estadístico

t-Test: Dos muestras asumiendo varianzas distintas 48 horas

72 horas

Promedio

0,230185185

0,248314815

Varianza

0,001067814

0,004127503

Observaciones

54

54

Hipótesis sobre la diferencia de promedios

0

Grados de libertad

79

t-Estadístico

-1,848331179

P(T<=t) una cola

0,034148219

t Crítica una cola

1,664371410

P(T<=t) dos colas

0,068296438

t Crítica dos colas

1,990450177

Como la prueba ANOVA no indica cuáles son las medias diferentes de estas tres poblaciones, se hicieron pruebas t (Student) por pares. Hipótesis nula: los promedios son iguales. a.

Comparando, al 95% de confianza, los resultados de 24 y 48h, se rechaza la hipótesis nula.

Comparando, al 95% de confianza, los resultados de 24 y 72h, se rechaza la hipótesis nula. c. Comparando, al 95% de confianza, los resultados de 48 y 72h, no se rechaza la hipótesis nula. b.

210

Científica 12 (3), 2015

Técnica XTT: Pigmentos interferentes en fracciones de extracto metanólico de Bidens pilosa

VI. Referencias bibliográficas 1. Liu ZJ, Zhuge Y, Velásquez OC. Trafficking and Differentiation of Mesenchylmal Steam Cells. Journal of Cellular Biochemistry 2009; 106: 984-91.

2. Yang JA, Chung HM, Won CH, Sung JH. Potential application of adiposederived stem cells and their secretory factors to skin: discussion from both clinical and industrial viewpoints. Expert Opin Biol Ther. 2010; 10(4): 495-503.

3. Kuhbier JW, Weyand B, Sorg H, Radtke C, Vogt PM, Reimers K. Stem cells from fatty tissue: A new resource for regenerative medicine? Chirurg. 2010; 81(9): 82632.

4. Lam HW, Lin HCH, Lao SCH, Gao JL, Hong SJ, Leong CHW, Yue PYK, Kwan YW, Leung AYH, Wang YT, Lee SM. The angiogenic effects of Angeliuca sinensis extracto on HUVEC in vitro and zebrafish in vivo. J. Cell. Biochem. 2008; 103: 195211.

5. Amiel-Pérez J, Enciso N, Fukusaki A, Amiel-Sáenz J. Metaanálisis de la técnica XTT utilizada en estudios de extractos de plantas en la inhibición o expansión celular. Científica 2014; 11(3): 205-14.

6. Nicolaou KC, Yang Z, Liu JJ, Ueno H, Nanterment PG, Guy RK, Claiborne CF, Renaud J, Coladouros EA, Paulvannan K, Sorensen EJ. Total synthesis of taxol.

Nature 1994; 367: 630-4.

7. Vicente MA, Vázquez MN, Entrena A, Olmedillas S, García-Arranz M, García-Olmo D, Zapata AG. Low doses of bone morphogenetic protein 4 increase the survival of human adipose-derived stem cells maintaining their stemness and multipotency.

Stem Cells and Development 2011; 20(6): 1011-9.

8. Baer PC, Griesche N, Luttmann W, Schubert R, Luttmann A, Geiger H. Human adipose-derived mesenchymal stem cells in vitro: evaluation of an optimal expansion medium preserving stemness. Cytotherapy 2010; 12(1): 96-106.

9. Scudiero DA et al. Evaluation of a soluble tetrazolium/formazan assay for cell growth and drug sensitivity in cultura using human and other tumor cell lines.

Cancer Res. 1988; 48: 4827-33.

10. Cui J, Nan KJ, Tian T, Guo YH, Zhao N, Wang L. Chinese medicinalcompound delisheng has satisfactory anti-tumor activity, and is associated with up-regulation of endostatin in human hepatocelular carcinoma cell line HepG2 in threedimentional cultura. World J Gastroenterol 2007; 13(41): 5432-9.

11. Dikio ED, Isabirye DA. Determination of chlorophyll-a, pheophytin-a and β-carotene contents of isolated photosynthetic reaction centre complexes. Asian Journal of Chemistry; 2011; 23(11): 5001-3.

Científica 12 (3), 2015

211

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alejandro Fukusaki, José Amiel Pérez, Nathaly Enciso, Álvaro Marcelo, Carlos Altamirano, Rafael Amiel, Obert Marín-Sánchez, Javier Enciso

12. Yang Z, Zhai W. Identification and antioxidant activity of anthocyanins extracted from the seed and cob of purple corn (Zea mays L.). Innovative Food Science and Emerging Technologies 2010; (11): 169-76.

13. Enciso J, Amiel J, Guija E, Fukusaki A, Reátegui O, Amiel D, Enciso N, Valdivia E, Rodríguez R, Neyra K, Cano A. Efectos sobre la proliferación de fibroblastos y actividad antioxidante del extracto hidroalcohólico de plantas medicinales peruanas. Científica 2008; 5: 164-76.

14. Bunge M. La investigación científica. Su estrategia y su filosofía. 2da. ed. corregida.

Barcelona: Ariel; 1983.

15. Amiel-Pérez J. Metodología y diseño de la investigación científica. 1ra. ed. Lima: Fondo Editorial de la Universidad Científica del Sur; 2014.

Recibido: 9/11/2015 Aceptado: 19/12/2015

212

Científica 12 (3), 2015

Coautor: José Amiel Pérez Correspondencia: jamielp@cientifica.edu.pe

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE TOTAL DEL PLASMA EN FONDISTAS DE DIVERSAS ALTITUDES TOTAL ANTIOXIDANT CAPACITY OF PLASMA IN LONG-DISTANCE RUNNERS FROM DIFFERENT ALTITUDES

Alan Murillo Salas1, Néstor López Avilés1, Emilio Guija Poma2, Luzmila Troncoso Corzo3, Victoria Bobadilla Flórez4, Abraham Araujo Díaz5, Roberto Baltodano Arellano6, Cristel Apac Canchumanta7, Stefan Arends Damiani8, Sol Perleche Torres8, Paul Ruiz Pinto8, María Alejandra Baluarte La Torre8, Bryan Astorga Guerrero , Milagros Rodríguez Salas9, Luis Chirinos Rojas9

Resumen El presente estudio tuvo como objetivo comparar los niveles de capacidad antioxidante total del plasma (CAT) en fondistas procedentes de diversas ciudades y altitudes: Huancayo (3245 m. s. n. m.), Arequipa (2350 m. s. n. m.), Cusco (3399 m. s. n. m.) y Lima (154 m. s. n. m.), en el Perú. Treinta y dos varones nativos, residentes en las diferentes altitudes señaladas y que practican fondismo participaron en esta investigación. Después del consentimiento informado, se obtuvo muestras de sangre para el análisis antioxidante mediante el método FRAP (Ferric Reducing Ability of Plasma). Los valores promedio de CAT encontrados fueron los siguientes: para Cusco, 1113,1 micromol Fe2+/l; para Huancayo, 1211,3 micromol Fe2+/l; para Arequipa, 600,3 micromol Fe2+/l, y para Lima, 304,5 micromol Fe2+/l. Se halló, además, una diferencia significativa en los valores de CAT en los grupos de Huancayo y Cusco, con respecto a los encontrados en los grupos

de Arequipa y Lima (p < 0,05). De igual manera, se encontró una diferencia significativa entre el grupo de Arequipa y el de Lima (p < 0,05). Finalmente, se concluyó que los niveles de CAT fueron superiores en los grupos de Huancayo (n = 8), Cusco (n = 8) y Arequipa (n = 8), con respecto al grupo de Lima (n = 8).

Palabras clave: altitud elevada, capacidad antioxidante total del plasma, fondista

Abstract In this study we aimed to compare the levels of total antioxidant capacity (T-AOC) in long-distance runners of various altitudes in the cities of Huancayo (3245 meters), Arequipa (2350 m), Cusco (3399 m) and Lima (154 m) Peru. Thirtytwo native men living in different altitudes who train long distance race participated in this research. After informed consent blood samples for antioxidant analysis was obtained by FRAP (Ferric Reducing

Laboratorio de Fisiología. Facultad de Medicina Humana, Universidad Científica del Sur. Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición. Instituto de Investigación. Facultad de Medicina Humana, Universidad San Martín de Porres.

3 Centro de Investigación de Bioquímica y Nutrición. Facultad de Medicina Humana, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

4 Departamento de Educación Física, Institución Educativa Juana Alarco de Dammert.

5 Unidad Técnica. Divisiones Menores, Club Alianza Lima.

6 Departamento de Cardiología, Hospital Guillermo Almenara Martins.

7 Estudiante. Facultad de Nutrición y Bioquímica, Universidad Científica del Sur. 8 Estudiante. Facultad de Medicina Humana, Universidad Científica del Sur. 9 Estudiante. Facultad de Medicina Humana, Universidad Católica de Santa María.

1 2

Científica 12 (3), 2015

213

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alan Murillo Salas, Néstor López Avilés, Emilio Guija Poma, Luzmila Troncoso Corzo, Victoria Bobadilla Flórez, Abraham Araujo Díaz, Roberto Baltodano Arellano, Cristel Apac Canchumanta, Stefan Arends Damiani, Sol Perleche Torres, Paul Ruiz Pinto, María Alejandra Baluarte La Torre, Bryan Astorga Guerrero , Milagros Rodríguez Salas, Luis Chirinos Rojas

Ability of Plasma) method. The average values ​​ of T-AOC were found: Cusco: 1113.1 umol Fe2+/l; Huancayo: 1211.3 umol Fe2+/l; Arequipa: 600.3 umol Fe2+/l and Lima: 304.5 umol Fe2+/l. Significant difference was found in T-AOC values ​​in Huancayo and Cusco groups regarding T-AOC values found ​​ in Arequipa and Lima groups (p <0.05). It was concluded that the levels of CAT were higher in the groups of: Huancayo (n = 8), Cusco (n = 8) and Arequipa (n = 8) with respect to the Lima group (n = 8).

Key words: high altitude, total antioxidant capacity of plasma, long-distance runner

I. Introducción Los radicales libres (RL) producidos durante la respiración aeróbica causan pérdida gradual de las funciones celulares, lo que ocasiona estrés oxidativo (EO), principalmente mediante la generación de superóxido mitocondrial y peróxido de hidrógeno (1). El exceso de producción de estos RL y especies reactivas de oxígeno (ERO) en vivo tiene una variedad de efectos dañinos que incluyen la peroxidación de la membrana lipídica, la oxidación de proteínas y la degradación del ADN (2).

Los trabajos sobre el rol del EO en relación con la exposición a la hipoxia y el ejercicio en altura señalan un incremento de la formación de ERO debido a una disminución en la mitocondria del potencial redox o un aumento en la producción de catecolaminas (3). Ante esta amenaza, la respuesta celular antioxidante está dada por mecanismos a través de los cuales la célula anula la reactividad o inhibe la generación de RL (4). Se sabe que los atletas de resistencia sometidos al ejercicio en condiciones de hipoxia tienen una respuesta antioxidante superior en comparación con los individuos sedentarios (5).

214

Científica 12 (3), 2015

Todos los sistemas antioxidantes se encuentran enlazados en un sistema amortiguador celular. Los sistemas antioxidantes se pueden medir de diferentes formas específicas y el sistema amortiguador antioxidante global se puede evaluar en el plasma con las pruebas de capacidad antioxidante total (CAT), la cual depende especialmente de la capacidad y cantidad de albúmina, vitamina C y ácido úrico (AU) (6). La hipoxia es un estímulo potente para el incremento en la producción de urato, sobre todo a gran altitud (7). La principal fuente de un aumento inducido por la hipoxia en el urato es el desglose de adenosina (6).

Una prioridad de estudio en nuestro país es el efecto que tiene la altitud sobre el ser humano, puesto que en nuestros Andes y más allá de los 3500 m. s. n. m. vive alrededor del 15% de los peruanos ya sea por motivos de trabajo, comercio, turismo y deporte (8). Nuestros atletas se ven enfrentados a uno de los factores más limitantes en este desafío, la hipoxia; sin embargo, hoy en día, el entrenamiento de resistencia normalmente incorpora el uso de entrenamiento hipóxico, que implica la exposición breve o prolongada a este fenómeno para así mejorar el rendimiento a nivel del mar (9).

Con la finalidad de aportar a este tema fue que nos propusimos realizar el presente trabajo, que considera la CAT como marcador del estado antioxidante y que los estudios sobre los niveles de este marcador antioxidante son escasos en atletas nativos de altura. Justificamos la realización del presente estudio con la necesidad de tener más datos acerca de los eventos fisiológicos que suceden en diferentes altitudes. Así, nuestros hallazgos contribuirán a una mejor comprensión de la fisiología del sistema antioxidante en condiciones de hipoxia, generadas en las zonas con mayor altitud geográfica de nuestro país. Resulta de

Capacidad antioxidante total del plasma en fondistas de diversas altitudes

gran interés aprovechar lo mejor de los conocimientos y experiencias adquiridas, para determinar cómo se adaptan las funciones del cuerpo humano.

II. Materiales y métodos Se realizó un estudio descriptivo, transversal y comparativo en el periodo comprendido entre junio y agosto de 2013. Este fue aprobado por las autoridades del Instituto Peruano del Deporte (IPD) y todos los sujetos con sus tutores fueron informados de los riesgos potenciales, incomodidades y beneficios involucrados en el estudio antes de dar su consentimiento informado por escrito.

El estudio se realizó en 32 fondistas varones sanos, participantes regulares en competiciones regionales e internacionales, realizadas en 4 ubicaciones geográficas diferentes.

Se seleccionó a 8 voluntarios varones entre los deportistas de la Federación Deportiva Peruana de Atletismo (FDPA), quienes nacieron y entrenan en la ciudad de Lima, a una altitud de 154 m. s. n. m. El resto de atletas fue seleccionado entre los residentes habituales de los

Centros de Alto Rendimiento (CAR), los cuales nacieron y entrenan según la siguiente distribución: 8 deportistas en la ciudad de Arequipa, a 2350 m. s. n. m. (aproximadamente, 550 mmHg), 8 deportistas en la ciudad de Huancayo, a 3245 m. s. n. m. (aproximadamente, 510 mmHg), y 8 deportistas en la ciudad de Cusco, a 3399 m. s. n. m. (aproximadamente, 496 mmHg) (10).

Para la determinación del IMC, mediante el índice de Quetelet, se midió el peso en una balanza calibrada con una precisión de +0,05 kg (marca Seca, modelo 700) y la talla, en posición supina, utilizando un tallímetro (según normas reconocidas a nivel internacional: Weiner and Lourie, 1981), con los sujetos ligeramente vestidos y descalzos. El porcentaje de grasa corporal se calculó a partir de seis mediciones de los pliegues cutáneos, en promedio tres mediciones por cada sitio, utilizando un cáliper (marca Rosscraft, modelo Gaucho Pro), según criterios ISAK y de acuerdo con la fórmula de Carter-Yuhasz (11). La edad, talla, antropometría y características del entrenamiento de estos cuatro grupos se resumen en la tabla 1.

Tabla 1. Edad, talla, antropometría y características del

entrenamiento de los participantes

Parámetro

Lima n=8

Arequipa n=8

Huancayo n=8

Cusco n=8

Edad (a)

17,71 + 0,51

17,63 + 0,50

17,10 + 0,50

17,5 + 1,85

Talla (cm)

168,66 + 6,38

168,37+ 8,12

167,96 + 3,22

167,45 + 3,46

Peso (kg)

62,78 + 7,98

62,34 + 7,76

56,34 + 4,11

56, 41 + 3,26

Índice de Masa Corporal (IMC)

22,27 + 1,04

21,59 + 1,51

20,33 + 1,44

20,41 + 0,17

Porcentaje de grasa (%)

8,44 + 0,81

8,19 + 0,37

7,76 + 1,30

7,81 + 0,46

Años de entrenamiento

3,5 + 0,43

3,43 + 0,39

3,37 + 0,41

3,31 + 0,34

Sesiones de entrenamiento (días/ semana)

5,62 + 0,51

5,62 + 0,51

5,75 + 0,46

5,75 + 0,46

Valores: promedio + desviación estándar

Científica 12 (3), 2015

215

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alan Murillo Salas, Néstor López Avilés, Emilio Guija Poma, Luzmila Troncoso Corzo, Victoria Bobadilla Flórez, Abraham Araujo Díaz, Roberto Baltodano Arellano, Cristel Apac Canchumanta, Stefan Arends Damiani, Sol Perleche Torres, Paul Ruiz Pinto, María Alejandra Baluarte La Torre, Bryan Astorga Guerrero , Milagros Rodríguez Salas, Luis Chirinos Rojas

Para establecer que los atletas de los cuatro grupos tuvieron niveles similares de macronutrientes, se coordinó con los nutricionistas y se elaboró un registro de la dieta durante siete días previos a la

toma de muestras de sangre (12). Para su análisis, se utilizó el sistema Ciencia Fit Dieta 200A (Sciencefit). El análisis de la ingesta alimentaria aparece en la tabla 2.

Tabla 2. Aporte total de macronutrientes de los fondistas Parámetro

Lima

Arequipa

Huancayo

Cusco

Energía (kcal)

2997,14

3058

3053,11

3089,15

Carbohidratos (kcal)

1962,34

2000,85

2012,48

2025,53

Grasas (kcal)

441,08

449,55

442,23

462,57

Proteínas (kcal)

593,61

607

598,35

601

Valor: promedio + desviación estándar

La frecuencia cardiaca y la saturación arterial de oxígeno se midieron usando un oxímetro de pulso marca Nonin, modelo 8000A. Asimismo, las muestras de sangre para el análisis hematológico fueron tomadas de cada sujeto en posición sentada y de la vena antecubital del antebrazo derecho, en tubos Vacutainer, y colocadas en viales con EDTA, con un total de 5 ml cada una.

Todas las muestras fueron rotuladas con los nombres de cada participante, se mantuvieron a -20 °C para el transporte al laboratorio y se mantuvieron a -40 °C (congeladora marca Coldex, modelo CH10P) hasta el análisis final.

La sangre fue centrifugada a 2000 rpm durante 30 minutos (centrífuga marca Sigma, modelo 2-16), la concentración de hemoglobina se realizó por el método de la cianometahemoglobina, el microhematocrito se determinó mediante el método de D´angelo and Lacombe y el recuento de hematíes se obtuvo por el método hematimétrico (13). El plasma fue separado, almacenado en tubos y congelado a -20 °C para su adecuado transporte y posterior análisis. El análisis de las características fisiológicas se muestra en la tabla 3.

Tabla 3. Características fisiológicas de los participantes Parámetro

Lima

Arequipa

Huancayo

Cusco

Frecuencia cardiaca (lpm)

54 + 6,92

55 + 7,83

59 + 7,03

57 + 5,57

Saturación arterial (%)

94 + 1,02

97 + 0,99

95 + 1,45

93 + 1,60

Hemoglobina (g/dl)

15,12 + 0,54

15,52 + 0,87

16,43 + 1,08

17,26 + 0,57

Hematocrito (%)

43,47 + 1,79

45,88 + 2,32

50,11 + 3,10

51,6 + 2,0

Hematíes (millones/UI)

4,68 + 0, 23

4,97 + 0,32

5,51 + 0,33

5,62 + 0,27

Valores: promedio + desviación estándar

216

Científica 12 (3), 2015

Capacidad antioxidante total del plasma en fondistas de diversas altitudes

Se determinaron los niveles plasmáticos de CAT mediante el método FRAP, el cual midió de forma total el potencial reductor de las sustancias antioxidantes del plasma para reducir el tripiridiltriazina férrica (Fe3+-TPTZ) a la forma ferrosa (Fe2+), con una absorbancia máxima a 593 nm. Las concentraciones plasmáticas de FRAP se midieron a una temperatura controlada de 37 °C, en un espectrofotómetro (marca Spectronic, modelo Genesys), de acuerdo con el método propuesto por Benzie y Strain (14). Este análisis se realizó durante el periodo precompetitivo del ciclo de entrenamiento para evitar elevación de las enzimas antioxidantes como producto del aumento de la intensidad y volumen del protocolo orientado a la competición de alto rendimiento (15).

Para verificar la consistencia de datos, se utilizó el programa de archivo de formato Microsoft Office Excel versión 2010. Se realizó el análisis estadístico respectivo mediante la prueba t de Student para grupos independientes y se expresaron todos los resultados como media. El nivel

de significación estadística se estableció fijo en un valor de valor de p < 0,05 y los resultados se expresaron como media ± desviación estándar.

III. Resultados Los fondistas del grupo de Lima (154 m. s. n. m.) tuvieron menor cantidad de hemoglobina (15,12 + 0,54), hematocrito (43,47 + 1,79) y número de hematíes (4,68 + 0, 23) en comparación con los demás grupos (tabla 3). Se midieron los niveles basales de CAT (micromol Fe2+/l) para evaluar el estado antioxidante del plasma. No se encontró diferencia significativa en los valores de CAT encontrados entre los grupos de Cusco y Huancayo, pero sí se observó entre estos dos grupos con respecto a los encontrados en los grupos de Arequipa y Lima (p < 0,05). De igual manera, se halló una diferencia significativa entre el grupo de Arequipa y el de Lima (p < 0,05) (tabla 4). Los valores de CAT de cada fondista de las diversas altitudes aparecen en la figura 1.

1600 1400

CAT (micrmol Fe 2+/l)

1200 1000 800 600 400 200 0

1

2

3

4

5

6

7

8

1009,1

1040,3

1085,1

1124

1132,6

1145,4

1167,2

1201,1

Huancayo

984,6

995,8

998,1

1192,9

1291,3

1372,4

1378,9

1476,7

Arequipa

542,8

550,1

575,5

576,4

578,5

637,3

653,3

688,6

Lima

269,7

278,6

296,8

305,2

307,3

311,9

327,2

339,4

Cusco

Figura 1. Valores de capacidad antioxidante total del plasma (CAT) de los fondistas de las diversas altitudes.

Científica 12 (3), 2015

217

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alan Murillo Salas, Néstor López Avilés, Emilio Guija Poma, Luzmila Troncoso Corzo, Victoria Bobadilla Flórez, Abraham Araujo Díaz, Roberto Baltodano Arellano, Cristel Apac Canchumanta, Stefan Arends Damiani, Sol Perleche Torres, Paul Ruiz Pinto, María Alejandra Baluarte La Torre, Bryan Astorga Guerrero , Milagros Rodríguez Salas, Luis Chirinos Rojas

Tabla 4. Cuadro comparativo de la capacidad antioxidante total del plasma entre los diferentes grupos

Parámetro

Lima (154 m. s. n. m.)

Arequipa (2350 m. s. n. m.)

Huancayo (3245 m. s. n. m.)

Cusco (3399 m. s. n. m.)

CAT (micromol Fe2+/l)

304,5 + 23,1

600,3 + 52,7a

1211,3 + 198a,b

1113,1 + 64,5a,b

Valores: promedio + desviación estándar CAT: capacidad antioxidante total del plasma p < 0,05, a en comparación con el grupo de Lima; b en comparación con el grupo de Arequipa

IV. Discusión Las recientes investigaciones sobre el sistema antioxidante plasmático en deportistas que entrenan a diversas altitudes mostraron resultados diversos.

El trabajo de Sinha y col. (16) se realizó en dos grupos de soldados varones, el primero conformado por nativos que residen a nivel del mar y el segundo también por nativos que residen a gran altitud (3800 - 4000 m. s. n. m.). El primer grupo fue expuesto, durante 4 semanas, a una altitud de 4560 m. s. n. m. Como resultado, los niveles de CAT fueron superiores y mostraron una correlación positiva (p<0.001) en relación a sus niveles basales. La investigación resaltó la importancia del ácido úrico (AU) como contribuyente en dos tercios del total de CAT en sangre en situaciones de hipoxia, pero puede no ser eficaz para la prevención del estrés oxidativo en la altura. Sin embargo, en el estudio no se consideró al ejercicio como factor oxidativo agregado, a pesar de que los participantes fueron soldados sometidos a entrenamiento físico regular. Tampoco se reportaron datos de nativos que residen por debajo de los 3800 m. s. n. m.

Tong y col. (17) investigaron la influencia de un programa de entrenamiento de 12 semanas sobre una población de jóvenes fondistas, dividida en un grupo de nativos que residen y entrenan a nivel del mar y su contraparte conformada por nativos con las mismas características que fue 218

Científica 12 (3), 2015

sometido al programa de entrenamiento durante el mismo periodo de tiempo, pero a una altitud de 1700 m. s. n. m. Para ello, se realizó una selección homogénea de la población (edad, peso, talla, IMC y años de entrenamiento), con características muy similares a las de nuestro estudio (tabla 1). Se encontró que en ambos grupos no hubo variación en los niveles de CAT al inicio y al final del programa de entrenamiento. Los autores señalaron estos resultados como favorables al contribuir a la regulación del perfil redox como respuesta al entrenamiento de resistencia a largo plazo a baja altitud natural. Cabe destacar que los niveles de CAT no siempre cambian, pues dependen de la intensidad del entrenamiento, la frecuencia y el tiempo, así como de otros factores endógenos (genómicos y fenotípicos) y exógenos (18). Además, en el trabajo no se obtuvo evidencia de algún análisis por encima de los 1700 m. s. n. m. y tampoco sobre exposiciones mayores de 12 semanas. Sin embargo, el ejercicio físico en la altura podría llevar a la exacerbación del estrés oxidativo inducido por la altitud en función de la dosis de hipoxia y la intensidad del ejercicio (19).

El efecto del ejercicio físico sobre la concentración de CAT se consigue tras el entrenamiento físico progresivo, lo que disminuye el estrés oxidativo adaptando los tejidos a los radicales libres y aumentando los niveles de CAT en valores altos a nivel vascular, que reducen el daño oxidativo endotelial (20).

Capacidad antioxidante total del plasma en fondistas de diversas altitudes

Consideramos como puntos débiles en nuestra investigación el número bajo de deportistas que formaron parte de nuestra población del estudio y de biomarcadores adicionales para aclarar las incertidumbres existentes en el mantenimiento del equilibrio redox en corredores profesionales. Son necesarios estudios posteriores para una mejor comprensión de este fenómeno y extrapolar los resultados a una base de datos que sirva como guía de entrenamiento para el deporte nacional y permita esclarecer la literatura actual.

Para finalizar, nuestro estudio mostró resultados en una muestra de deportistas nativos que residen y entrenan a diferentes altitudes, como las de Cusco (3399 m. s. n. m.), Huancayo (3245 m. s. n. m.), Arequipa (2350 m. s. n. m.) y Lima (154 m. s. n. m.). En el grupo a nivel del mar, los valores de CAT fueron inferiores en relación con los demás grupos.

V. Agradecimientos Los autores agradecemos a las autoridades del Instituto Peruano del Deporte por su colaboración e interés en este estudio, así como el apoyo técnico proporcionado por los metodólogos licenciados en educación física Vladimir Armenteros y Alfredo Herrera. También Estamos también muy agradecidos con el magíster en economía Fernando Vásquez, por los análisis estadísticos.

Y, en especial, agradecemos a todos los deportistas que se ofrecieron voluntariamente para la investigación y a los trabajadores de los Centros de Alto Rendimiento por su ayuda logística.

CONFLICTOS DE INTERESES Los autores refieren no tener ningún conflicto de intereses o vínculos financieros a revelar.

Científica 12 (3), 2015

219

ARTÍCULOS ORIGINALES

Alan Murillo Salas, Néstor López Avilés, Emilio Guija Poma, Luzmila Troncoso Corzo, Victoria Bobadilla Flórez, Abraham Araujo Díaz, Roberto Baltodano Arellano, Cristel Apac Canchumanta, Stefan Arends Damiani, Sol Perleche Torres, Paul Ruiz Pinto, María Alejandra Baluarte La Torre, Bryan Astorga Guerrero , Milagros Rodríguez Salas, Luis Chirinos Rojas

VI. Referencias bibliográficas 1. Forman HJ, Boveris A. Superoxide radical and hydrogen peroxyde in mitochondria.

Free Radicals in Biology 1982; 5: 65-90.

2. Halliwell B, Chirico S. Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance. Am J Clin Nutr. 1993; 57 (5): 715-24.

3. Mazzeo RS, Child A, Butterfield GE, Mawson JT, Zamudio S, Moore LG. Catecholamine response during 12 days of high-altitude exposure (4300 m) in women. J Appl Physiol. 1998; 84: 1151-7.

4. Avello M, Suwalsky M. Radicales libres, antioxidantes naturales y mecanismos de protección. Atenea (Concepc.) 2006; 2 (494): 161-72.

5. Marzatico F, Pansarasa O, Bertorelli L, Somenzini L, Della Valle G. Blood free radical antioxidant enzymes and lipid peroxides following long distance and lactacidemic performances in highly trained aerobic and sprint athletes. J Sports Med Phys Fitness 1997; 37: 235-9.

6. Quintanar M, Calderón J. La capacidad antioxidante total. Bases y aplicaciones.

Revista de Educación Bioquímica 2009; 28 (3): 89-101.

7. Vij AG, Dutta R, and Satija NK. Acclimatization to oxidative stress at high altitude.

High Alt. Med. Biol 2005; 6: 301-10.

8. Ramírez A. Exposición toxicológica en las grandes alturas: ¿es necesario corregir los valores límite umbral de exposición de tóxicos? An. Fac. Med. 2011; 72 (1): 61-7.

9. Stray-Gundersen J, Chapman RF, Levine BD. “Living high-training low” altitude training improves sea level performance in male and female elite runners. J Appl Physiol. 2001; 91: 1113-20.

10. Monge C, León-Velarde F, editores. El reto fisiológico de vivir en los Andes. Lima: IFEA-UPCH; 2003.

11. Carter JEL, Yuhasz MS. Skinfolds and body composition of Olympic athletes.

Medicine Sport Scie. 1984; 18: 144-82.

12. Bingham, S. The dietary assessment of individuals: Methods, accuracy, new techniques and recommendations. Nutr. Abstr. Rev.1987; 57: 705-41.

13. Gonzáles de Buitrago J. Técnicas y métodos de laboratorio clínico. 3ra. ed.

Barcelona: Elsevier; 2010.

14. Benzie IF, Strain JJ. Ferric reducing/antioxidant power assay: Direct measure of total antioxidant activity of biological fluids and modified version for simultaneous measurement of total antioxidant power and ascorbic acid concentration. Meth.

Enzymol. 1999; 299: 15-27.

220

Científica 12 (3), 2015

Capacidad antioxidante total del plasma en fondistas de diversas altitudes

15. Viru A, Viru M. AnĂĄlisis y control del rendimiento deportivo. Bercelona: Paidotribo; 2003.

16. Sinha S, Singh S, Ray U. Total antioxidant status at high altitude in lowlanders and native highlanders: role of uric acid. High Altitude Medicine and Biology 2009; 10 (3): 269-70.

17. Tong TK, Kong Z, Lin H, He Y, Lippi G, Shie Q, Zhang H, Nie J. Effects of 12week endurance training at natural low altitude on the blood redox homeostasis of professional adolescent athletes: a quasi experimental field trial. Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2016; 2016: 1-9.

18. Souza G, Kusano C. Exercise modulation of total antioxidant capacity (TAC): towards a molecular signature of healthy aging. Frontiers in Life Science 2011; 5 (3): 81-90.

19. Debevec T, Pialoux V, Mekjavic I, Eiken O, Mury P, Millet G. Moderate exercise blunts oxidative stress induced by normobaric hypoxic confinement. Medicine and Science in Sports and Exercise 2014; 46 (1): 33-41.

20. Suvorava T, Kojda G. Prevention of transient endothelial dysfunction in acute exercise: a friendly fire? Thromb Haemost. 2007; 97: 331-3.

Recibido: 8/11/2015 Aceptado: 10/12/2015

Autor: Alan Patricio Murillo Salas Correspondencia: alan-murillo@hotmail.com

CientĂ­fica 12 (3), 2015

221

MONITOREO DE CONTAMINACIÓN POR TRIBUTILESTAÑO (TBT) EN PUERTOS DE PARACAS, ICA (PERÚ), MEDIANTE EL FENÓMENO DE IMPOSEX EN Stramonita chocolata MONITORING OF POLLUTION TRIBUTYLTIN (TBT) IN PORT OF PARACAS LIMA (PERU)

BY IMPOSEX IN Stramonita chocolata

Laura Margarita Chumbimune Ilizarbe1 y Zuleika Joana Ponce Mora1

Resumen El imposex es la imposición de caracteres sexuales masculinos sobre el sistema reproductivo femenino de caracoles gasterópodos prosobranquios. Este fenómeno se ha asociado a compuestos organoestañosos empleados como agentes biocidas en las pinturas antiincrustantes aplicadas sobre muelles, embarcaciones e instalaciones de cultivo, principalmente con el tributilestaño (TBT).

El presente trabajo pretende evaluar la ocurrencia de imposex en los caracoles marinos Stramonita chocolata que habitan en la playa La Mina de la isla San Gallán (Ica, Perú). El porcentaje de imposex fue del 33,3 %. El índice de la longitud relativa del pene (RPLI) fue de 36,23. La relación entre la longitud de la conchilla y la longitud del pene en machos y en hembras no fue estadísticamente significativa.

Palabras claves: imposex, organoestañosos, tributilestaño, S. chocolata

Abstract Imposex is the imposition of male sexual characteristics of the female reproductive system prosobranch snails gastropods.

This phenomenon has been associated with organotin compounds used as biocide in antifouling paints applied on docks, boats and culture facilities 1

222

mainly tributyltin (TBT). The current work evaluates the occurrence of imposex in San Gallán- Isla Playa La Mina, Ica, Peru in the marine snail Stramonita chocolata. Imposex percentage was 33.3%. The index of the relative length of the penis (RPLI) was 36.23. Statistically the relationship between the length of the conchilla and length of the penis in males and females was not significant.

Key words: imposex, organotin, tributyltin, Stramonita chocolata.

Introducción Las actividades humanas, entendidas como parte de su desarrollo, causan perturbaciones en los ecosistemas, lo que se hace cada vez más frecuente (1). Entre las consecuencias de las actividades contaminantes sobre las diferentes poblaciones de animales se ha detectado el fenómeno denominado disrupción endocrina (2), que trastorna los mensajes trasmitidos por las hormonas debido a la presencia o intervención de sustancias o productos químicos (3). Las sustancias que actúan de esa forma reciben el nombre de disruptores endocrinos, hormonas medioambientales o moduladores endocrinos. Sus implicancias se traducen en impactos mayores sobre la salud y el sistema reproductivo de los organismos (4).

Laboratorio de Ingeniería Ambiental. Facultad de Ciencias Ambientales, Universidad Científica del Sur (UCSUR).

Científica 12 (3), 2015

Monitoreo de contaminación por tributilestaño (TBT) en puertos de Paracas, Lima (Perú), mediante el fenómeno de imposex en Stramonita chocolata

El imposex es la imposición de caracteres sexuales masculinos sobre el sistema reproductivo femenino, como el crecimiento de pene y vasos deferentes.

Este fenómeno afecta principalmente a moluscos gasterópodos prosobranquios (5). Aunque el mecanismo exacto de inducción imposex es desconocido, se entiende que se da a través de las hormonas peptídicas que imitan el factor morfogénico del pene (6, 7) o la alteración del metabolismo de la testosterona (8, 9). A su vez, esta imposición es causada por la disminución de la actividad de la aromatasa (enzima encargada de convertir los andrógenos en estrógenos) (10, 11).

Esta alteración ha sido asociada históricamente a compuestos organoestañosos empleados como agentes biocidas en las pinturas antiincrustantes aplicadas sobre muelles, embarcaciones e instalaciones de cultivo (12, 13, 14, 15).

El uso de este tipo de pinturas disminuye la resistencia de fricción entre el agua y los cascos de los barcos, lo que a su vez reduce el consumo de combustible y la frecuencia de entrada en dique seco (16). El riesgo potencial de esta sustancia se basa en que, con el transcurso del tiempo, estos componentes lixivian al medio circundante, lo que afecta a los organismos no blanco.

El TBT ha sido identificado, entre los compuestos organoestañosos, como el principal causante de imposex en varias especies de gasterópodos, incluso en bajas concentraciones (17, 12, 18, 19, 20).

liberación continua al ambiente marino (21, 22, 23). El TBT y sus derivados son disruptores endocrinos que afectan el sistema endocrinológico de vertebrados e invertebrados (24).

En un contexto general, los efectos nocivos de TBT en el ambiente se presentan a través del imposex en gasterópodos marinos (25); todos relacionados con las áreas costeras e intensa de actividad marina. Bajas concentraciones de TBT han mostrado inducción de imposex en gasterópodos marinos (25, 26, 27, 28,10, 29, 2, 30). En algunos casos, el desarrollo del imposex ha sido significativo, ya que el crecimiento de los vasos deferentes impidió la actividad normal de crianza y ocasionó una disminución de la población (17). Se han identificado efectos asociados con TBT en 268 especies de gasterópodos de todo el mundo, correspondientes a los órdenes Vetigastropoda, Mesogastropoda y Neogastropoda. Este último ha sido el más afectado, con 214 especies de las cuales 101 son parte de la familia Muricidae (31).

Stramonita chocolata (nombre común: caracol, caracol plomo o negro) (32) es un gasterópodo que tiene una distribución geográfica que va desde Ecuador hasta Valparaíso, Chile (32). En cuanto a sus características físicas, se observa una concha gruesa con forma de cono, globoso, y en su mayoría de color marrón grisáceo; además presenta reproducción interna y sin dimorfismo sexual. De esta forma, el presente estudio está destinado a evaluar la ocurrencia de imposex en la playa La Mina de la isla San Gallán (Ica, Perú), usando al caracol S. chocolata.

Desde su descubrimiento, en la década de 1960, el TBT ha sido ampliamente usado en diferentes aplicaciones marinas, debido a sus propiedades antiincrustantes; esto se transforma en la

Científica 12 (3), 2015

223

ARTÍCULOS ORIGINALES

Laura Margarita Chumbimune Ilizarbe, Zuleika Joana Ponce Mora

Materiales y métodos ÁREA DE ESTUDIO La isla San Gallán (13°50’20’’ S y 76°27’01’’ O) es una de las islas de la Reserva Nacional de Paracas (figura 1) que se encuentran protegidas bajo la Ley de Áreas Naturales Protegidas (Ley n.° 26834). Se ubica en el distrito de Paracas, a unos 5,2 km al oeste de la península de Paracas. La isla es visitada anualmente por miles de peruanos y extranjeros, no solo con fines turísticos o culturales, sino además con propósitos científicos.

La isla San Gallán se caracteriza por un bajo tránsito marino, en marea baja y a una profundidad de 5 m.

ESPECIE EN ESTUDIO El 31 de mayo del 2015 se recolectaron de la isla San Gallán 50 individuos de S. chocolata. Estos fueron colocados en

dos baldes de plástico de 20 L con agua marina para mantenerlos vivos durante su transporte hasta el laboratorio. La toma de muestra se realizó con ayuda de buzos en la playa La Mina.

DETERMINACIÓN DE IMPOSEX El ensayo ecotoxicológico se realizó en el Laboratorio de Ingeniería Ambiental de la Facultad de Ciencias Ambientales de la Universidad Científica del Sur (UCSUR). Los organismos fueron narcotizados con una solución de MgCl2 por 45 minutos siguiendo la metodología (33). La longitud de la conchilla (LC) de los caracoles fue medida con un vernier desde el ápex hasta la base (34).

Las conchillas fueron fraccionadas y removidas para el análisis correspondiente. La identificación del sexo se basó en la presencia o ausencia de la glándula de la cápsula y ovarios para las hembras, y testículos y vesículas seminales para los machos (8).

Fuente: Google Earth Figura 1. Zona de estudio: Isla San Gallán (encerrada en un círculo) en la Reserva Nacional de Paracas (Ica, Perú).

224

Científica 12 (3), 2015

Monitoreo de contaminación por tributilestaño (TBT) en puertos de Paracas, Lima (Perú), mediante el fenómeno de imposex en Stramonita chocolata

Se anotó la longitud del pene (LP) y la presencia del vaso deferente para los machos, y hembras con imposex. Los niveles de imposex fueron evaluados usando los siguientes índices: índice relativo de longitud de pene hembras (FPLI, por sus siglas en inglés) e Índice relativo de longitud de pene (RPLI).

Donde: RPLI=

(Longitud promedio del pene en hembras con imposex) (Longitud promedio del pene en los machos)

ANÁLISIS ESTADÍSTICO La distribución normal de los datos (LC y LP) fue verificada usando la prueba estadística de Kolmogorov. Se empleó regresión y correlación lineal para determinar si LP fue afectada por LC. La prueba de Kruskal-Wall permitió contrastar si las muestras aleatorias e independientes proceden de una misma población. Se empleó el paquete estadístico Minitab, versión 17.0 de Windows 7 para los cálculos de los parámetros estadísticos descriptivos e inferencias.

Resultados NIVELES DE IMPOSEX Los resultados muestran que, de 50 ejemplares muestreados de S. chocolata, el 84% fueron hembras y el 16%, machos. La LC de los caracoles fluctuó entre 6,1 y 7,4 cm de longitud en los machos, mientras que en las hembras alcanzó entre 5,6 y 8,2 cm. En cuanto a la condición reproductiva, de un total de 42 hembras muestreadas, 14 ejemplares

×100

presentaron imposex (33.33%), lo que se evidenció por el desarrollo de un pseudopene. La LP varió entre 0,6 y 1,4 cm en machos, y en hembras con imposex varió entre 0,6 y 1,3 cm.

Los parámetros de imposex (FPLI, RPLI, FPL stand, RPLI stand) obtenidos para S. chocolata están resumidos en las tablas 1 y 2.

Tabla 1. Parámetros de imposex analizados para S. chocolata Parámetros de Imposex en S. chocolata

%

FPLI

0,34

RPLI

36,26

FPL stand

0,05

RPLI stand

35,26

%I

33,33

Una correlación de Pearson entre LC y LP = 0,099, y el valor de correlación muestra una baja correlación en las variables, se debió a que en las hembras con imposex la LP pudiera depender de la exposición del contaminante y no de la longitud de la conchilla (36).

Científica 12 (3), 2015

225

ARTÍCULOS ORIGINALES

Laura Margarita Chumbimune Ilizarbe, Zuleika Joana Ponce Mora

Tabla 2. Datos biométricos medidos a S. chocolata. XLC: media de longitud de la conchilla; LCmax y LCmin: valor máximo y mínimo de la longitud de la conchilla; XLP: media de longitud del pene; LPmax y LPmin: valor máximo y mínimo de longitud del pene; DE: desviación estándar; N: número de especímenes analizados.

Biometría (cm)

Machos

H. imposex

N

8

52

14

XLC±DE

6,74 ± 0,44

6,93 ± 0,57

6,98 ± 0,66

LCmax

7,4

8,2

8,2

LCMIN

6,1

5,6

6,1

XLP±DE

0,93 ± 0,23

0,34 ± 0,5

1,01 ± 0,22

LPMAX

1,4

1,3

1,3

LPMIN

0,6

0

0,6

Se determinó (p < 0,05) que el valor del pene del macho y el pene de la hembra por imposex fueron diferentes. Asimismo, se calculó (p < 0,4) la longitud de la conchilla de la hembra variaba con la longitud de conchilla del macho.

Discusión El imposex en gasterópodos (como es el caso de S. chocolata) se relaciona con la presencia de compuestos organoestañosos acumulados en el cuerpo de estos organismos, estas revelaciones se obtuvieron tras diversas investigaciones (33). En el presente estudio, los datos revelan que el fenómeno de imposex afecta poblaciones de S. chocolata en la playa La Mina, de la isla San Gallán, en Paracas (Ica, Perú).

Esto puede sugerir que la población es susceptible y está afectada por TBT (37).

El imposex ha sido detectado en la costa sudamericana en Olivancillaria vesica vesica (38) y, en el Perú, en Thais chocolata (33), con niveles significativos.

Mientras que en el presente estudio se detectó un valor de I% = 33,33%, lo que representa que la especie no sufrió una seria exposición al TBT en comparación con valores para este parámetro de 97,6% mostrados en la investigación de Guabloche y sus colaboradores (35), debido principalmente al ambiente

226

Hembras

Científica 12 (3), 2015

acuático.

Un estudio previo (35) mostró un LC entre 1,8-3,91 cm y LP entre 0,31-0,68 cm en hembras y machos. Estos valores son alrededor de dos a tres veces menores que los analizados en este estudio. Esta diferencia depende básicamente de la zona donde se extrajo la muestra: playa Hermosa, en Ancón (Lima-Perú), lugar con una permanencia de embarcaciones recreacionales.

En relación con la profundidad de tráfico marítimo, se muestran valores bajos de %I a niveles más profundos (34).

De manera similar, el presente estudio contempló la zona de muestreo a una profundidad de 1 a 5 mostrando valores bajo de %I. Es importante considerar que la isla San Gallán se encuentra en la Reserva Nacional de Paracas y en ella habita una importante comunidad de lobos marinos (Otaria flavescens). Por ser un lugar turístico, frente a su litoral se encuentran varias lanchas y barcos que brindan servicios turísticos y otras actividades de entretenimiento. En otro estudio similar, el constante tráfico marítimo sería el responsable de los valores de imposex (35). Los valores obtenidos permiten deducir que en la zona de muestreo, por ser un área natural protegida (ANP), la

Monitoreo de contaminación por tributilestaño (TBT) en puertos de Paracas, Lima (Perú), mediante el fenómeno de imposex en Stramonita chocolata

especie S. chocolata no estuvo expuesta demasiado tiempo al compuesto TBT. El Perú no presenta una legislación que regule el uso de compuestos organoestañosos (33) y no existe control por ser un área natural protegida por el Estado, por lo que es bastante probable que las pinturas con TBT se sigan usando.

Esto explicaría los niveles de imposex encontrados en S. chocolata. Además, no hay restricciones en la importación de TBT, a pesar de que este compuesto está en la lista de la Convención de Rottherdam (31).

EFECTOS DE TOXICIDAD Una de la hipótesis más aceptadas para explicar la ocurrencia de imposex es la inhibición de la P-450 de la aromatasa, responsable de la conversión de andrógenos en estrógenos (39), lo que induce la aparición de estructuras masculinas en individuos de sexo femenino.

De acuerdo con una investigación previa (40), los contaminantes tales como compuestos orgánicos de estaño resultan fácilmente asimilables, ya que son hidrófobos y pueden acumularse en las reservas lipídicas del animal. Y

la dieta es de gran importancia en la absorción de compuestos orgánicos de estaño (38).

Los factores ambientales a tener en cuenta son la concentración de TBT relativa en diferentes lugares y la abundancia relativa de los diferentes alimentos disponibles que son importantes como indicativo de las rutas de asimilación de los contaminantes.

Conclusión El presente estudio revela que el 33,33% en la especie S. chocolata mostró imposex, un fenómeno poco diseminado en el área investigada. Es fundamental ampliar la investigación en esta especie debido a que se encuentra en un área natural protegida junto a la evaluación química del compuesto TBT en sedimentos y tejidos de las especies.

Agradecimientos Los autores agradecen a la Facultad de Ciencias Ambientales de la Universidad Científica del Sur, Laboratorio de Ingeniería Ambiental, y en especial al profesor José Iannacone por sus consejos y sugerencias, que han hecho posible la realización de este trabajo.

Científica 12 (3), 2015

227

ARTÍCULOS ORIGINALES

Laura Margarita Chumbimune Ilizarbe, Zuleika Joana Ponce Mora

Referencias bibliográficas 1. Almeida E, Diamantino T, De Sousa O. Marine paints: The particular case of antifouling paints. Progress in Organic Coatings. 2007; 59: 2-20.

2. Chacón O, Cuevas F, De La Fuente C, Díaz F, Huaquín L. Disrupción endocrina e imposex. Avances en Ciencias Veterinarias 2007; 22: 42-8.

3. Axiak V, Micallef D, Muscat J, Vella A, Mintoff B. Imposex as a biomonitoring tool for marine pollution by tributyltin: Some further observations. Environment International 2003; 28: 743-9.

4. Guzmán M, Ramírez P. Disfunción endocrina debido a contaminantes ambientales.

Elementos 2012; 87: 19-25.

5. Gravel P, Johanning K, McLachlan J, Vargas J, Oberdörster E. Imposex in the intertidal snail Thais brevidentata (Gastropoda-Muricidae) from the Pacific coast of Costa Rica. Rev. Biol. Trop. 2006; 54: 21-6.

6. Oberdörster E, McClellan-Green P. The neuropeptide APGWamide induces imposex in the mud snail, Ilyanassa obsoleta. Peptides 2000; 21: 1323-30.

7. Oberdörster E, Romano J, McClellan-Green P. The Neuropeptide APGWamide as a Penis Morphogenic Factor (PMF) in Gastropod Mollusks. Integr. Comp. Biol.

2005; 45 (1): 28-32.

8. Gooding M, Gallardo C, Leblanc G. Imposex in three marine gastropod species in Chile and potential impact on mariciculture. Marine Pollution Bulletin 1999; 38: 1227-31.

9. LeBlanc G, Gooding M, Sternberg R. Testosterone-Fatty acid esterification: a unique target for the endocrine toxicity of tributyltin to gastropods. Integr. Comp.

Biol. 2005; 45 (1): 81-7.

10. Matthiesen P, Gibbs P. Critical appraisal of the evidence for tributyltin-mediated endocrine disruption in mollusks. Environ. Toxicol. Chem. 1998; 17: 37-43.

11. McAllister B, Kime D. Early life exposure to environmental levels of the aromatase inhibitor tributyltin causes masculinization and irreversible sperm damage in zebrafish (Daniorerio). Aquat. Toxicol. 2003; 65: 309-16.

12. Gibbs P, Pascoe P, Burt G. Sex change in the female dogwhelks Nucella lapillus, induced by tributyltin from antifouling paints. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 1988; 68: 715-31.

13. Oehlmann J, Bettin C. Tributyltin- induced imposex and the role of steroids in marine snails. Malacol. Rev. Suppl. 1996; 6: 157-61.

228

Científica 12 (3), 2015

Monitoreo de contaminación por tributilestaño (TBT) en puertos de Paracas, Lima (Perú), mediante el fenómeno de imposex en Stramonita chocolata

14. Rodríguez F. Imposex en la laguna de Términos, Campeche, México. Revista Científica UDO Agrícola 2010; 10: 141-9.

15. Castro I, Perina F, Fillmann G. Organotin contamination in South American coastal areas. Environmental Monitoring and Assessment 2011; 184: 1781-99.

16. Kotrikla A. Environmental management aspects for TBT antifouling wastes from the shipyards. Journal of Environmental Management 2009; 90: 77-85.

17. Bryan G, Gibbs P, Pascoe P, Burt G. The use of the dog-whelk Nucella lapillus, as an indicator of tributyltin (TBT) contamination. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 1987; 67: 507-23.

18. Stroben E, Oehlmann J, Fioroni P. Hinia reticulata and Nucella lapillus. Comparison of two gastropod tributyltin bioindicators. Marine Biology 1992; 114: 289-96.

19. Barreiro R, Quintela M, Ruiz JM. TBT e imposex en Galicia: los efectos de un disruptor endocrino en poblaciones de gasterópodos marinos. Ecosistemas 2004; 13: 13-29.

20. Rodríguez J, Tueros I, Borja A, Franco J, Ignacio G, Garmendia J, Muxica I, Sariego C, Valencia V. European ports and along coastal areas. Continental Shelf Research 2008; 29: 1165-73.

21. De Mora S. The tributyltin debate: ocean transportation versus seafood harvesting.

In: De Mora SJ (ed.). Tributyltin: case of study of an environmental contaminant.

Cambridge: Cambridge University Press; 1996.

22. Fent K. Ecotoxicology of organotin compounds. Crit. Rev. Toxicol. 1996; 26: 1-117.

23. Champ M. A review of organotin regulatory strategies, pending actions, related costs and benefits. Sci. Total Environ. 2000; 258: 21-71.

24. Golub M, Doherty J. Triphenyltin as a potential human endocrine disruptor. Journal Toxicol. Environ. 2004; 7: 281-95.

25. Smith B. Tributyltin compounds induce male characteristics on female mud snails Nassarius obsoletus = Ilyanassa obsoleta. Journal Appl. Toxicol. 1981; 1: 141-4.

26. Smith B. The estuarine mud snail, Nassarius obsoletus: abnormalities in the reproductive system. Journal Mollus. Stud. 1980; 46: 247-56.

27. Bryan G, Burt G, Gibbs P, Pascoe P. Nassarius reticulatus (Nassariidae: Gastropoda) as an indicator of tributyltin pollution before and after TBT restrictions. Journal of the Marine Biological Association of the United Kingdom 1993; 73: 913-29.

28. Horiguchi T, Shiraishi H, Shimizu M, Morita M. Imposex in sea snails, caused by organotin (tributyltin and triphenyltin) pollution in Japan: a survey. Appl. Organomet.

Chem. 1997; 11: 451-5.

Científica 12 (3), 2015

229

ARTÍCULOS ORIGINALES

Laura Margarita Chumbimune Ilizarbe, Zuleika Joana Ponce Mora

29. Nishikawa J. Imposex in marine gastropods may be caused by binding of organotins to retinoid X receptor. Mar. Biol. 2006; 149: 117-24.

30. Oehlmann J, Di Benedetto P, Tillman M, Duft M, Oetken M, Shulte-Oehlmann U. Endocrine disruption in prosobranch mollusks: evidence and ecological relevance.

Ecotoxicology 2007; 16: 29-43.

31. Tittley-O´Neal C, MacDonald B, Pelletier E, Saint-Louis R, Phillips O. The relationship between imposex and Tributyltin (TBT) concentration in Strombus gigas from the British Virgin islands. Bulletin of Marine Science 2011; 87: 421-35.

32. Ramírez R, Paredes C, Arenas J. Moluscos del Perú. Revista de Biología Tropical 2003; 51: 225-89.

33. Castro I, Fillman G. High tribultyltin and imposex levels in the comercial muricid Thais chocolata from two Peruvian harbor areas. Environmental Toxicology and Chemistry 2012; 31: 1-6.

34. Miloslavich P, Penchaszadeh P, Bigatti G. Imposex en gastrópodos de Venezuela.

Ciencias Marinas 2007; 33: 319-24.

35. Guabloche A, Álvarez J, Rivas R, Hurtado S, Pradel R, Iannacone J. Imposex in the marine snail Xanthochorus buxea (Broderip, 1833) (Muricidae) from the South American Pacific. The Biologist 2013; 11 (2): 237-49.

36. Vasconcelos P, Moura P, Barroso C, Gaspar M. Size matters: Importance of penis length variation on reproduction studies and imposex monitoring in Bolinus brandaris. Hydrobiologia 2011; 661: 363-75.

37. Bezerra F, Braga I, De Almeida C. Imposex occurrence in Nassarius vibex from South America: a potential bioindicator in estuarine environments. Marine Biodiversity Records 2010; 3.

38. Caetano C, Albsalao R. Imposex in Olivancillaria vesica (Gmelin) (Gastropoda, Olividae) from Southeastern Brazilian Sandy beach. Revista Brasileira de Zoologia 2002; 19: 215-18.

39. Morcillo Y, Porte C. Monitoring of organotin compounds and their effects in marine molluscs. Trends Anal. Chem. 1998; 17: 109-16.

40. Kure L, Depledge M. Accumulation of organotin in Littorina littorea and Mya arenaria from Danish coastal waters. Environ. Pollut. 1994; 84: 149-57.

Recibido: 16/10/2015 Aceptado: 5/12/2015

230

Científica 12 (3), 2015

Autoras: Laura Margarita Chumbimune Ilizarbe y Zuleika Joana Ponce Mora Correspondencia: lalimargot@gmail.com zuleikaponcem@gmail.com

ARTÍCULOS DE REVISIÓN DIARREA VIRAL BOVINA. ENFERMEDAD DE LAS MIL CARAS BOVINE VIRAL DIARRHEA. DISEASE OF THE THOUSAND FACES

Patricio Berríos E.1

Resumen La diarrea viral bovina es una enfermedad de distribución mundial y está considerada como la más importante infección viral de los bovinos. Es causada por un virus ARN que pertenece al género pestivirus, de la familia Flaviviridae, y del cual se describen dos biotipos y dos genotipos. Este virus afecta los sistemas digestivo, respiratorio, reproductivo e inmunológico, por lo que se le ha denominado “enfermedad de las mil caras”. La enfermedad se puede presentar con infecciones inaparentes, infecciones respiratorias, infecciones del tracto digestivo, síndrome hemorrágico, enfermedad de las mucosas e infecciones del tracto reproductivo y fetal. En esta revisión se discuten, además, aspectos sobre su diagnóstico y prevención.

Palabras clave: bovinos, diarrea, virus

Abstract Bovine viral diarrhea is a worldwide disease and is considered the most important viral infection in cattle. It is caused by an RNA virus that belongs to the genus pestivirus of the Flaviviridae family; two biotypes and two genotypes 1

Médico veterinario, Máster of Science, Doctor Especialista en virología y enfermedades virales.

are described. This virus affects the digestive, respiratory, reproductive and immune systems, which has been called “disease of a thousand faces”.The disease can occur with unapparent infections, respiratory infections, infections of the digestive tract, hemorrhagic syndrome, mucosal disease and infections and fetal reproductive tract. In this review aspects of diagnosis and prevention are also discussed.

Key words: cattle, diarrhea, virus

Introducción La diarrea viral bovina fue descrita por primera vez en Nueva York (EE.UU.), en 1946. Siete años después, apareció la enfermedad de las mucosas (EM).

En 1957 se identificó al virus causante, denominado virus de la diarrea viral bovina (VDVB). Posteriormente, se comprobó que ambos cuadros son causados por el mismo virus y se denominan complejo diarrea viral bovina/ enfermedad de las mucosas (DVB/EM).

Desde un punto de vista económico, esta enfermedad ha sido considerada como la más importante infección viral de los bovinos (1).

of philosophy

(PH.D),

profesor titular de la

Universidad

de

Chile.

Científica 12 (3), 2015

231

ARTÍCULOS DE REVISIÓN

Patricio Berríos E.

El VDVB pertenece al género pestivirus, de la familia Flaviviridae. Inicialmente, se le consideró como patógeno solo para los bovinos, aunque luego se comprobó que puede infectar a otros rumiantes. El género pestivirus incluye a los virus de la peste porcina clásica y de la enfermedad de Border, y a dos especies del VDVB: VDVB-1 (virus tipo NADL) y VDVB-2 (virus tipo 890). Todos los pestivirus tienen un cierto grado de reacción cruzada, lo que no permite diferenciarlos solamente por serología.

El VDVB es un ribovirus cuyo ARN genómico está envuelto por una membrana bilipídica en la que se insertan dos glicoproteínas que contienen los principales determinantes antigénicos del virus, las que además participan en la unión y fusión celular. Una tercera glicoproteína actúa en la inmunosupresión. Las cepas del VDVB presentan una considerable variabilidad genética. El VDVB infecta a los bovinos como una población de variantes virales, diversidad que se creía debida a su replicación en animales previamente infectados o vacunados, aunque actualmente se acepta que los cambios genéticos ocurren más rápido en hembras gestantes, en una serie de infecciones y en ausencia de una respuesta inmune. Se acepta que esta diversidad genética se debe a una falta de corrección de lectura en la enzima ARN polimerasa ARN dependiente, por lo que se incorporan nucleótidos en forma equivocada que introducen mutaciones generadoras de poblaciones diferentes de virus llamados “cuasiespecies” (2).

Existen dos genotipos del virus, VDVB1 y VDVB2, que se subclasifican a su vez en subgenotipos, basados en diferencias antigénicas y genómicas, con 12 VDVB1 (a-1) y dos VDVB2 (a y b). En EE.UU., se describen tres subtipos: VDVB-1a, 1b y 2a, y un reporte de un VDVB-2b. Otra categorización se basa en la presencia o ausencia de efecto citopático viral en

232

Científica 12 (3), 2015

cultivos celulares, biotipos citopáticos (cp) y no citopáticos (ncp). En las infecciones naturales se verifica un 90% de cepas ncp y un 10% de cepas cp. En EE.UU., las cepas predominantes en los casos naturales son ncp (2).

El clonado y la secuenciación de la región 5’ UTR de algunas muestras obtenidas de búfalos de agua (Bubalus bubalis) reveló la presencia de coinfección natural con al menos dos subtipos diferentes de VDVB (1a y 1b) y con las especies virales BVDV-1 y BVDV-2 (3).

La DVB es una enfermedad cosmopolita.

El VDVB afecta a los sistemas digestivo, respiratorio, reproductivo e inmunológico, por lo que se la ha denominado “enfermedad de las mil caras”. Generalmente, se presenta como una enfermedad sistémica. Debido a su efecto inmunodepresor, este virus está estrechamente relacionado con el complejo respiratorio del bovino. También ha sido detectado en ovinos, caprinos y porcinos, así como en rumiantes silvestres y búfalos africanos.

Muchos años necesitó la medicina veterinaria para conocer en detalle la evolución del VDVB, sus implicancias patogénicas y epidemiológicas, entre ellas la recombinación del ARN viral, las consecuencias de la infección intrauterina y su efecto sobre el sistema inmunológico (1).

Esta enfermedad compleja y complicada se inicia con la presentación de cuadros agudos de diarrea, los que paulatinamente van decreciendo en intensidad. Luego, aparece la enfermedad de las mucosas, de mayor gravedad, relacionada con el biotipo ncp, que en animales inmunotolerantes, luego de la reinfección con el biotipo cp, produce una diarrea aguda con erosiones en todo el tracto digestivo.

En 1992, se describió un síndrome hemorrágico que se presenta con alta mortalidad y está asociado con el biotipo ncp. El virus causante se conoce como

Diarrea viral bovina. Enfermedad de las mil caras

VDVB tipo 2. En el complejo DVB/EM se describen animales persistentemente infectados, con viremia, y que eliminan continuamente el virus. Estos animales son inmunotolerantes contra el biotipo ncp (4).

responsables del enfermedad (5).

En esta actualización, que resume más de 60 años de investigación, se entrega información sobre aspectos prácticos tales como diagnóstico, vacunas e inmunología contra la infección por el VDVB, así como también sobre la biología del virus y sus interacciones con el sistema inmunológico del hospedero.

Para el control y eventual erradicación de esta enfermedad es fundamental contar con adecuadas pruebas de diagnóstico.

De hecho, estas pruebas son esenciales para realizar cualquier programa. La idea que la DVB podría ser erradicada de la población bovina comercial descansa en los progresos que se han realizado durante los últimos años para detectar con seguridad la infección por VDVB en el ganado. La biología molecular ha aportado el desarrollo de los anticuerpos monoclonales y la implementación de la prueba de reacción en cadena de la polimerasa-transcriptasa reversa. Tres acciones son importantes para intentar el control: identificación y eliminación de animales persistentemente infectados, aumento de la respuesta inmune posvacunación e implementación de medidas de bioseguridad (6).

IMPACTO DE LA INFECCIÓN POR EL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA EN LA INMUNIDAD ADAPTATIVA Estudios recientes sobre los efectos de la infección por el VDVB en la respuesta inmune abarcan desde la presentación del antígeno hasta la apoptosis de células B. La infección por el VDVB causa inmunosupresión de la inmunidad adaptativa, efecto que es cepadependiente. Se ha enfatizado el estudio de la respuesta inmune en pulmones y tracto intestinal. Las cepas ncp activan la rama humoral del sistema inmune adaptativo en forma más rápida que las cepas cp; además, trafican más a órganos del SI asociados con la respuesta inmune de las mucosas, y persisten más tiempo en tejidos inmunológicos que las cepas cp. Las infecciones agudas con cepas cp son más bien raras, mientras que las cepas ncp son las predominantes en el terreno. En infecciones agudas o peragudas, las interacciones se dan con el sistema inmune intacto, mientras que en las infecciones persistentes el sistema inmune presenta inmunotolerancia hacia el VDVB, producida durante el desarrollo fetal. Los animales con infección persistente y que presentan EM tienen ambas cepas, la cepa ncp persistente y la cepa cp mutante, que juntas son

desarrollo

de

la

DIAGNÓSTICO DE LABORATORIO DE LA DIARREA VIRAL BOVINA

TÉCNICAS DE DIAGNÓSTICO Aislamiento viral. Para el VDVB, se utiliza una línea celular de riñón fetal bovina (MDBK). Es importante esta tecnología porque, además, puede detectar otros virus presentes en la muestra e incluso revelar la presencia de virus DVB como contaminante del suero fetal bovino utilizando anticuerpos monoclonales.

Inmunofluorescencia e inmunohistoquímica.

La detección directa del VDVB en tejidos de animales sospechosos ha sido de gran ayuda en el diagnóstico, especialmente en la detección y eliminación de animales persistentemente infectados.

Científica 12 (3), 2015

233

ARTÍCULOS DE REVISIÓN

Patricio Berríos E.

Elisa (captura de antígeno). Utiliza el antígeno NS3 (P 80), que se encuentra muy conservado en la mayoría de las cepas del VDVB. Esta prueba es útil para detectar el antígeno viral en sueros de animales persistentemente infectados, biopsias de piel y en muestras individuales de leche. Las muestras de elección para estas pruebas son suero (plasma), y tejidos, como biopsias de piel (orejas). La utilización de esta técnica ha permitido realizar planes de control económicamente factibles.

Pruebas de detección de ácidos nucleicos. La amplificación de ácidos nucleicos ha sido facilitada por el rápido progreso en su secuenciación.

La comercialización de la reacción en cadena de la polimerasa transcriptasa reversa y su alta sensibilidad permiten trabajar con “pooles” de muestras de rebaños para detectar animales infectados en forma aguda, animales persistentemente infectados y animales inmunizados con vacunas preparadas con virus vivo modificado. Cabe señalar que estas técnicas no están disponibles rutinariamente por su alto costo.

Pruebas serológicas.

Las más utilizadas son seroneutralización viral y Elisa. Estas pruebas son empleadas para determinar si un animal ha estado infectado por el VDVB, si un ternero posee anticuerpos calostrales específicos, si están inmunizados apropiadamente, si están infectados en forma aguda y si un ternero ha sido infectado in utero (4 y 5).

Pruebas diagnósticas de apoyo en programas de control. Las pruebas diagnósticas antes señaladas son capaces de apoyar los programas de control de la DVB. A pesar de detectar infecciones por el VDVB, animales persistentemente infectados siguen existiendo debido a la carencia de efectivos programas de manejo.

Tres métodos de diagnóstico se

234

Científica 12 (3), 2015

utilizan actualmente para detectar animales persistentemente infectados: pruebas de inmunofluorescencia e inmunohistoquímicas en trozos de piel de orejas; pruebas de Elisa en sueros, piel y muestras de leche individuales; y pruebas PCR-TR en sangre, leche y piel de orejas. Las pruebas serológicas se recomiendan para pesquisar animales persistentemente infectados en rebaños en que no se vacuna contra la DVB (3).

RESPUESTA DEL HOSPEDERO AL VIRUS DE LA DIARREA VIRAL BOVINA E INTERACCIÓN CON AGENTES INFECCIOSOS EN EL FEEDLOT Y EN GANADO DE REPRODUCCIÓN La infección por el VDVB puede afectar varios órganos del hospedero y actuar en concomitancia con otros agentes infecciosos. El virus tiene un tropismo por varios órganos. Es muy específico en el caso de los terneros persistentemente infectados que se han contagiado durante la preñez, y en el caso de que estos animales se sobreinfectan con una cepa cp y se produce la enfermedad de las mucosas. El papel del VDVB en las infecciones mixtas o sinergísticas se debe a su capacidad inmunosupresora. La inmunosupresión, a nivel de inmunidad innata (vías respiratorias) y adquirida, condiciona la producción de infecciones secundarias o coinfecciones (7).

La DVB se puede presentar en diferentes formas asociadas a la inmunosupresión viral: Infecciones inaparentes. Como muchas infecciones postnatales, pueden pasar desapercibidas en forma inaparente, aunque afectan al feto y no presentan síntomas en la madre. Los jóvenes terneros se infectan con más facilidad debido a la pérdida de la inmunidad materna. La vida media de los anticuerpos maternos es de unos 23 días. El período

Diarrea viral bovina. Enfermedad de las mil caras

de incubación en el ternero va entre 5 y 7 días, y la viremia no dura más de 15 días.

Se describe la presencia de anticuerpos específicos en animales no vacunados.

Infección respiratoria.

Se ha demostrado la enfermedad respiratoria por infección experimental. La infección sinergística, viral-bacteriana, debido al compromiso de sistema inmune por daño en el epitelio nasal y traqueal, y la consecuente alteración del aparato mucociliar de limpieza, permite la colonización bacteriana. Se suma la alteración de la inmunidad innata, macrófagos, células fagocíticas y neutrófilos, junto a la supresión de linfocitos B y T. En casos de infecciones respiratorias con neumonías fatales, se han aislado junto al VDVB otros agentes que incluyen virus herpes bovino, virus parainfluenza tipo 3, coronavirus bovino, M. haemolytica, P. multocida, Histophilus somni y varios tipos de mycoplasmas.

En un brote de neumonías en un feedlot en Oklahoma se aislaron el VDVB-1a, VDVB-1b y el VDVB-2a. Incluso, en un caso semejante se aisló el virus vacunal VDVB-1a cp NADL. Infecciones en el tracto digestivo.

Estas infecciones pueden ocurrir a cualquier edad, desde neonatos hasta adultos. La presentación primaria generalmente ocurre entre los seis y 24 meses de edad, y se manifiesta con fiebre, anorexia, depresión y, a veces, con diarrea, úlceras y erosiones en la mucosa oral y lingual. Debido al efecto inmunosupresor del VDVB, en algunos casos se encuentran infecciones concurrentes con E. coli, Salmonella spp, cryptosporidiosis, rotavirus o coronavirus bovino.

Presentación trombocitopenia hemorrágica. El síndrome hemorrágico se caracteriza por trombocitopenia, diarrea sanguinolenta, hemorragias en las mucosas y muerte. El biotipo viral es la cepa

ncp. La enfermedad es generalmente fatal.

Enfermedad de las mucosas. Es de baja morbilidad y alta mortalidad. La EM resulta de la infección de un ternero persistentemente infectado con una cepa cp, la que probablemente ha evolucionado o mutado de la cepa ncp. La enfermedad se caracteriza por una grave patología digestiva con úlceras y erosiones por todo el tracto digestivo, lesiones en la piel y espacios interdigitales. En la EM se pueden aislar ambas cepas.

Infecciones del tracto reproductivo y fetal. Estas infecciones se presentan según el tiempo de gestación. Si la infección ocurre en los primeros días, hay efectos negativos en la concepción e implantación del huevo, que dan como resultado menores tiempos de la concepción y repetidos ciclos. El aborto puede ocurrir debido a la infección viral entre los días 45 y 175, con cepas cp y ncp. Las vacunas preparadas con VDVB vivo modificado no deben emplearse en vacas gestantes.

Defectos congénitos y malformaciones pueden ocurrir como resultado de la infección viral entre los días 10 y 150. Los posibles defectos son: hipoplasia cerebelar, microencefalia, hidrocefalia, hidroencefalia, poroencefalia, hipomielinización, cataratas, microoftalmia, degeneración retinal, neuritis óptica, hipoplasia tímica, hipotricosis, osteogénesis alterada y retardo en el crecimiento (8).

Terneros persistentemente infectados.

Fetos infectados con cepas ncp entre los días 42 y 125 pueden sobrevivir, portar el virus y diseminarlo de por vida, siendo los principales reservorios del VDVB. Estos animales son inmunotolerantes a la cepa ncp infectante, aunque pueden responder con producción de anticuerpos contra cepas heterólogas o cepas vacunales. Las infecciones que ocurren en el último trimestre de la gestación dan lugar a terneros con anticuerpos

Científica 12 (3), 2015

235

ARTÍCULOS DE REVISIÓN

Patricio Berríos E.

específicos pero sin virus. El término “infectados congénitamente” se refiere a estos animales con anticuerpos al nacer, pero sin virus detectable (7).

RESPUESTA INMUNOLÓGICA CONTRA LAS VACUNAS DIARREA VIRAL BOVINA Las vacunas contra la DVB están disponibles desde 1960. Estas son preparadas con cepas cp. Vacunas inactivadas o preparadas con virus vivo modificado han demostrado ser eficaces bajo condiciones controladas. Tanto la inmunidad humoral como la celular son protectivas. La respuesta de los linfocitos B está dirigida preferentemente contra las proteínas virales E2 y NS2/3, y en menor grado contra las proteínas Erns y E1. El mayor epitope neutralizante se ubica en la mitad N-terminal de la proteína E2. Las vacunas son efectivas a nivel de rebaño.

La vacunación contra la DVB/EM presenta difíciles desafíos debido a que el VDVB carece de lectura de pruebas, lo que causa la gran heterogeneidad entre los genomas de las diferentes generaciones del virus. Por otra parte, la presencia de animales persistentemente infectados por toda la vida del animal afecta el control de la enfermedad. El uso de la vacunación para el control de la DVB se justifica porque limita la diseminación del

236

Científica 12 (3), 2015

virus, además de reducir la extensión de la enfermedad en animales infectados.

Con respecto a la RI, la vacunación induce una respuesta por LC-B y T contra le VDVB, que reduce la incidencia de la presentación aguda y la presencia de animales persistentemente infectados en un rebaño, aunque no previene la infección de todos los animales debido a la heterogeneidad de las poblaciones virales. Inclusive el uso de vacunas preparadas con VVM puede producir un cierto grado de inmunosupresión. Se acepta que, para que la vacunación sea efectiva, se deben eliminar previamente todos los animales persistentemente infectados (9).

En 2015, para mejorar su inmunogenicidad, una versión truncada de la E2 (tE2) se fusionó a un anticuerpo de cadena simple (APCH). Se expresaron las proteínas APCH-tE2 y tE2 en el sistema de baculovirus y su inmunogenicidad fue evaluada y comparada en cobayos.

La proteína APCH-tE2 fue la que indujo la mejor respuesta humoral. Por dicha razón, se la evaluó en bovinos utilizando 1,5 μg de antígeno. Los animales presentaron altos títulos de anticuerpos neutralizantes contra el VDVB hasta un año luego de la inmunización (10).

Diarrea viral bovina. Enfermedad de las mil caras

Referencias bibliográficas 1. Moennig V. Foreword. Biologicals 2013; 41: 1.

2. Neill JD. Molecular biology of bovine viral diarrhea virus. Biologicals 2013; 41: 2-7.

3. Craig M, König G, Benítez D, Draghi M. Detección molecular de coinfección con los virus de la diarrea viral bovina (BVDV) en búfalos de agua (Bubalus bubalis) serológicamente negativos. Revista Argentina de Microbiología 2015; 47 (2): 14851.

4. Eschbaumer M, Law S, Solís C, Chernick A, Van der Meer F, Czub M. Rapid detection of neutralizing antibodies against bovine viral diarrhoea virus us using quantitative high-content screening. J. Virological Methods 2014; 198: 56-63.

5. Dubovi EJ. Laboratory diagnosis of bovine viral diarrhea virus. Biologicals 2013; 41: 8-13.

6. Chase C. The impact of BVDV infection on adaptive immunity. Biologicals 2013; 41: 52-60.

7. Fulton RW. Host response to bovine viral diarrhea virus and interactions with infectious agents in the feedlot and breeding herd. Biologicals 2013; 41: 31-8.

8. Lanyon R, Hill FI, Reichel MP, Brownlie J. Bovine viral diarrhoea: Pathogenesis and diagnosis. Vet J. 2014; 199: 201-9.

9. Ridpath J. Immunology of BVDV vaccines. Biologicals 2013; 41: 14-9.

10. Pecora A, Malacari D, Pérez M, Bellido D, Escribano J, Dus Santos M, Wigdorovitz A. Desarrollo de una vacuna de subunidad BVDV mejorada basada en la glucoproteína E2 fusionada a un anticuerpo de cadena simple que se dirige a células presentadoras de antígeno Revista Argentina de Microbiología 2015; 47 (1): 4-8.

Recibido: 10/12/2015 Aceptado: 19/12/2015

Autor: Patricio Berríos E. Correspondencia: pbetch19@gmail.com

Científica 12 (3), 2015

237

SALA CABIESES EL AYAHUASCA FERNANDO CABIESES El uso de esta planta selvática es muy antiguo. Ya el padre Vicente Valverde, capellán de las fuerzas de Pizarro y primer obispo del Cusco, se refiere a ella en una de sus informativas cartas al Santo Oficio de la Inquisición, y habla de sus poderosos efectos diabólicos. Ocasionalmente, siguió siendo mencionada por los curas extirpadores de idolatrías durante el período colonial y, en 1858, un geógrafo ecuatoriano, don Manuel Villavicencio, anotó con claridad sus propiedades psicoactivas. Por la misma época, quizás unos años antes, Richard Spruce, un botánico británico, la había clasificado botánicamente y registrado sus interesantes propiedades; pero los apuntes se extraviaron hasta que otro científico compatriota suyo, A. R. Wallace, los hizo conocer recién en 1908.

El ayahuasca es conocido por los botánicos como Banisteriopsis caapi y, además del nombre vernacular que usaremos ahora, es conocido también como caapi, yajé, pinda, natema, nishi y varios otros nombres locales en diversos dialectos de la selva amazónica. Es planta silvestre en toda la Amazonía, la cuenca del Orinoco y en las selvas de la vertiente occidental de los Andes, en Ecuador y Colombia. El género Banisteriopsis (en honor a Juan Banister, muerto en 1692) tiene aproximadamente cien especies, alguna de las cuales tiene también propiedades psicoactivas. Pertenece a la familia de las Malpigiáceas. A los interesados, le recomendamos los estudios de Cuatrecasas, Morton, y una buena rela-

238

Científica 12 (3), 2015

ción de las especies útiles puede hallarse en la monografía de Plutarco Naranjo.

Ayahuasca significa “cuerda del muerto” o “enredadera de la muerte”. Es pues una enredadera que puede crecer masivamente envolviendo un árbol hasta de 10 a 15 m de altura. Su tallo tiene la tendencia de enroscarse sobre sí mismo, acompañándose de tallos hermanos y formando así una especie de cuerda trenzada que llega a veces a un diámetro de 10-15 cm. Su corteza es lisa, de color bruno verdoso y sus hojas son lanceoladas, de 15 a 20 cm de largo por 4 a 7 cm de ancho. Sus flores, rara vez solitarias, abren en racimos de color rosado o lila. Los 5 pétalos se caracterizan por ser cóncavos y de bordes serrados. El fruto es una pequeña nuez alada (los botánicos la llaman samara) de 2 a 3 cm de largo.

Crece en la selva pero hay preciosos ejemplares cultivados en Lima y tolera hasta 1500 m sobre el nivel del mar.

Cuando se habla de variedades, los botánicos entran en pequeñas discrepancias con los herbolarios indígenas, pues estos últimos consideran variantes importantes las basadas en la edad de la planta, brebajes preparados con diferentes partes anatómicas o cualidades derivadas de las condiciones de cultivo. Por eso, las diversas clases de ayahuasca de las que habla un chamán selvático no son necesariamente especies botánicas diferentes.

La literatura temprana sobre los alcaloides del ayahuasca menciona algunos nombres ya descartados (telepatina, yageína, yagenina, banisterina), que ocasionan confusión y solamente tienen interés histórico.

A partir de los trabajos de Wolfer y Rumpf y de Elger en 1928, se llegó al consenso de que el principio activo básico es un alcaloide que ya había sido descrito muchos años antes: la harmina. Esta substancia recibió su nombre de una planta del Cercano Oriente, la harmala o ruda siria. (Peganum harmala).

Cuando se identificó la existencia de la harmina en el ayahuasca, ya la estructura del alcaloide era bien conocida por las investigaciones de Perkin y Robertsar, y hasta había sido sintetizado por Späeth, a quien ya vimos sintetizando la mescalina.

Varios grupos, entre los cuales debemos mencionar a Hochstein y Paradies, a Rivier y Lindgrenm, a Hashimoto y Kawanishi, y a McKenna y sus colaboradores, encontraron que al lado de la harmina está presente la harmalina, la tetrohidroharmihna, el harmol y otras seis B carbolinas: la harmina-N-óxido, el Metilester del ácido harmínico, el ácido harmalínico, el ácido hármico, la acetilnorharmina y la ketotetrahidronorharmina.

El ayahuasca tiene una concentración de alcaloides igual al 0,17%-1,25% del producto seco. El 62%-96% de este contenido está constituido por harmina.

Los interesados en mayor información al respecto pueden encontrarla en el libro de Schultes y Hofmann o en la monografía de Deulofen.

La harmina y su familia de alcaloides son inhibidores de la mono-amino-oxidasa (MAO) cerebral y, como tales, permiten

acumular norepinefrina y son antidepresivos. Así, pueden producir químicamente puros, una cierta sensación de euforia y bienestar. Los turistas o principiantes que por motivos médicos estén consumiendo antidepresivos incompatibles con estas sustancias pueden sufrir serios accidentes farmacológicos.

Está claro, después de repetidas experiencias realizadas por observadores fidedignos, que el ayahuasca puro produce frecuentemente alucinaciones, lo que se explicaría por las trazas que contiene de algunos alcaloides triptamínicos (6-metoxi-tripta-mina). Esto varía con respecto a las diversas variedades consumidas. En la práctica ritual, sin embargo, el ayahuasca nunca se utiliza en forma pura. Siempre se acompaña de otros vegetales que contienen una buena concentración de N-N-dimetil-triptamina u otros alcaloides triptamínicos. La suma de estas dos familias de alcaloides es fuertemente alucinógena, lo que nos hace admirar, una vez más, los resultados de la investigación psicofarmacológica de los herbolarios indígenas que, aunque usted quiera hablar de brujería, querido lector, nadie llega a conclusiones similares por pura casualidad.

El aditivo principal usado para el ayahuasca en el brebaje indígena recibe el nombre de “chacruna”. La mayor parte de los chamanes entrevistados por el autor de estas líneas coinciden con lo que se puede constatar en la literatura existente: la “chacruna” es la Psychotria viridis, una planta psicoactiva, con alto contenido triptamínico. Baste transcribir aquí las frases de Eduardo Shahuano, un unaya shipibo, amigo de Clara Cárdenas, la admirable antropóloga peruana: “… siempre se mezcla con chacruna. Sin chacruna no hay mareación… siempre se debe cocinar ayahuasca con las hojas de chacruna que se llama también cahua... sin cahua no hay mareación...”

Científica 12 (3), 2015

239

Lo malo es que chacruna también le dicen en otros sitios a la Banisteriopsis rusbyana, una prima del ayahuasca que sí tiene abundantes triptaminas y que, proporcionada sola, produce alucinaciones. A esta liana también le dicen yajé, pero ese es el nombre que otros le dan al ayahuasca o a la Psychotria. Hay aquí una verdadera confusión que nos hace inhibimos de mayores aclaraciones en esta nota.

Menos mal que los botánicos y los químicos están desenredando esta madeja. Lo cierto es que el herbolario indígena, con nomenclatura o sin ella, sabe cómo mezclar sus plantas para obtener los efectos psicofarmacológicos que desea.

Le puede también agregar al brebaje de ayahuasca una serie de otras plantas psicoactivas: la Brugmansia suaveolens (que él llama toé blanco), la Brunfelsia grandiflora (que él llama chiricsanango), la Nicotiana glauca (que él llama supaiccarco), la Justicia pectoralis, la Clusia, la Iresine y diez más que, en latín o en quechua o en shipibo, a ti y a mí, querido lector, se nos olvidará en un momento… lupuna, huayracaspi, pichacaspi, yoyo, catahua. Pero “para preparar, siempre se mezcla con chacruna”.

No vamos ahora a ponernos a explicar todo el rito con oscuridad, maracas, silbidos, icaros y lo que se te pueda ocurrir. Pero, en vía de ilustración, resumiremos la preparación de un brebaje de ayahuasca con una de las recetas de Clara Cárdenas: “Los tallos del ayahuasca se cortan sin hojas en trozos pequeños. En una olla, se pone en el fondo una capa de hojas de chacruna sin tallos. Los trocitos de ayahuasca se trituran con piedras y después se pone una capa de ellos sobre la chacruna. Todo se cubre con

240

Científica 12 (3), 2015

una nueva capa de hojas de chacruna y se agrega entonces agua para cubrir todo el contenido. Se hace hervir durante tres horas, agregando agua cuando sea necesario y cuidando que la espuma no rebose y se pierda. Después se deja enfriar, se trasvasa el líquido y se descarta la chacruna. Se vuelven a machacar los trozos de ayahuasca y se hierve todo durante dos horas más”.

Al final de este procedimiento, que se realiza en el patio trasero del chamán ayahuasquero, sin mayor ceremonia y como parte de una manufactura totalmente desprovista de histrionismo o de liturgia, se obtiene un líquido espeso, achocolatado, amargo, de olor herbario, que se guarda en botellas para ser consumido en el rito.

Los maestros indígenas recolectan los tallos de ayahuasca en la selva. Cortados en trozos manejables, los guardan bajo tierra donde se conservan sin tendencia a deterioro. De esos escondrijos los extraen para la preparación del brebaje.

En el mercado puede obtenerse la liana trozada para el consumo popular.

A través del reciente interés generacional en todas estas formas de viajar a los paraísos artificiales, el uso del ayahuasca, fuera del contexto chamánico amazónico, ha construido un tinglado que, amparándose en la inmadurez legalística, arrastra y explota el afán exploratorio de la joven generación. Esto pertenece a un aspecto que específicamente deseo evitar hoy.

NOTAS CÉLULAS MADRE: CONCEPTOS Y APLICACIONES La Dra. Fanny Casado, investigadora afiliada al Instituto de Investigación en Células Madre y Cáncer de la McMaster University, de Canadá, ha tenido una estancia de cuatro meses auspiciada por el Instituto de Medicina Regenerativa de la UCSUR y financiada por Innóvate Perú (Programa Nacional de Innovación para la Competitividad y Productividad del Ministerio de la Producción). Durante su estadía en nuestra casa de estudios, la Dra. Casado desarrolló actividades de capacitación de docentes y alumnos interesados en realizar investigación en células madre, así como presentaciones informativas sobre este tema, dirigidas a investigadores y profesionales de la salud. Además, participó en la elaboración de un análisis de las oportunidades y limitaciones en el Perú para el desarrollo de la innovación en aspectos relacionados con la investigación en ciencias básicas y clínicas sobre células madre adultas. Este análisis fue publicado en la prestigiosa Revista Peruana de Medicina Experimental y Salud Pública, en coautoría con el Dr. José Amiel Pérez, presidente del Instituto de Medicina Regenerativa de la UCSUR.

RECTORA DE LA UNIVERSIDAD CIENTÍFICA DEL SUR La Dra. Josefina Takahashi Sato, nueva rectora de la Universidad Científica del Sur, en una entrevista realizada el 25 de setiembre del 2015, al referirse a su responsabilidad y los objetivos de su gestión, manifestó lo siguiente: “Indudablemente, es una gran responsabilidad asumir el cargo de rectora de la universidad, porque aun cuando en los últimos años, gracias al esfuerzo y calidad profesional de nuestros directivos y docentes, hemos crecido y logrado resultados importantes que se manifiestan en el éxito de nuestros egresados, este año nos trazamos metas muy importantes: aplicar la enseñanza por competencias, que tiene como objetivo la mejora significativa de la calidad de la enseñanza integral y multidisciplinaria de nuestros educandos; promover la creatividad y el desarrollo de la investigación y la innovación; así como implementar la autoevaluación para la acreditación de 5 carreras que ofrece la universidad (Medicina Humana, Estomatología, Ingeniería Ambiental, Arquitectura y Urbanismo Ambiental y Administración de Negocios Internacionales). En ese sentido, este nuevo cargo lo asumo con responsabilidad, por la envergadura de los retos que enfrentamos, pero al mismo tiempo con confianza, porque contamos con un equipo de primer nivel y estoy segura de que, con el esfuerzo y participación de toda la comunidad universitaria, los resultados serán positivos.

Los objetivos del Rectorado son objetivos institucionales que compartimos a nivel de la Presidencia del Directorio. Mi objetivo principal es contribuir al logro de los mismos, así como cumplir las funciones inherentes al cargo, establecidas en la legislación vigente. En el corto y mediano plazo, espero ampliar las relaciones institucionales a nivel nacional e internacional, para brindar a nuestros estudiantes mayores y mejores posibilidades de estudiar o investigar en otras universidades o instituciones de prestigio internacional. Así, mediante el trabajo en conjunto, lograremos resultados que estén a la altura de las demandas de la sociedad presente y futura”.

Científica 12 (3), 2015

241

SEIS PROYECTOS DE STARTUP CIENTÍFICA SON APROBADOS POR INNÓVATE PERÚ El coordinador y líder del equipo de Startup Científica, Ing. Martín Pérez Campos, explicó cada uno de los seis proyectos que hace unos días recibieron la aprobación de Innóvate Perú (antes FINCYT) para obtener el pase a la Etapa de Formulación de Proyectos, con la finalidad de conseguir el financiamiento para su desarrollo.

Papeletas Express. Ofrece una mejora al sistema de control de papeletas.

EducaVial. Proyecto que busca fomentar la educación vial con un programa en los colegios.

Comunicación mental. Aplicación de utilidad para personas sordomudas. El usuario comenzará a imaginarse letras que aparecerán en un dispositivo móvil y se enviarán como mensajes.

Followme: Aplicación móvil que identifica el interés que tiene el usuario sobre un producto específico que desea adquirir.

YourDate: Aplicación que ofrece orientación sobre actividades a realizar en una fecha especial.

Emergencia QR: Brazalete con un código QR que contiene información valiosa para el usuario; por ejemplo, su historia clínica en caso de accidentes.

Estos proyectos tienen dos vertientes: el apoyo social, con un impacto en la comunidad, y el modelo de negocio, proyectos de innovación con base tecnológica que permitan crear empresa.

CONGRESO NACIONAL DE ACREDITACIÓN: POR UNA MEJOR CALIDAD EDUCATIVA Los días 22 y 23 de noviembre, el Sistema Nacional de Evaluación, Acreditación y Certificación de la Calidad Educativa (Sineace) llevó a cabo el Congreso Nacional de Acreditación de la Calidad Educativa “Puente de Mejora Continua”.

El evento contó con la participación del Mg. José Dextre Chacón, presidente del Directorio de la Universidad Científica del Sur, y cerca de 2200 educadores nacionales y extranjeros.

A fin de presentar los nuevos modelos surgidos a partir de la evaluación realizada por el Sineace, en la segunda jornada se desarrolló el panel “Hacia nuevos modelos de acreditación en el Perú”, que tuvo entre sus ponentes al Mg. José Dextre, como director de la Federación de Instituciones Privadas de Educación Superior (FIPES).

Este congreso propició un espacio para desarrollar conocimiento e intercambiar experiencias entre los representantes de 20 regiones del interior. Los participantes presenciales, cerca de mil maestros, se comprometieron a desarrollar acciones para mejorar la calidad educativa en el Perú. Además de ellos, 1188 participantes se conectaron en línea a la transmisión, tanto nacionales como de once países más.

242

Científica 12 (3), 2015

JORNADA INTERNACIONAL CIENTÍFICA En un contexto de creciente interés por el avance y desarrollo de la tecnología, la Universidad Científica del Sur llevó a cabo, el viernes 11 de diciembre de 2015, la primera edición de la Jornada Internacional Científica. Este encuentro sirvió para intercambiar experiencias y mostrar la calidad de investigación que viene realizando esta casa de estudios como parte de su propuesta científica.

Durante la jornada, profesionales de UCSUR e invitados extranjeros como el Ph. D. Paul Schiller, de la Universidad de Miami, expusieron algunos de sus más importantes proyectos en materia de medicina, biología, veterinaria, entre otras disciplinas. Entre estos hay proyectos sobre células cancerígenas, nuevas estrategias de tratamiento del cáncer e infertilidad en animales domésticos.

Participaron en este evento la investigadora Ph. D. Fanny Casado Peña, de la Universidad Mc Master de Canadá, y el Ph. D. Juan Manuel Iglesias, quienes llegaron al Perú hace cuatro meses para desarrollar diferentes actividades e investigaciones, gracias a subvenciones para estancias cortas y becas de repatriación respectivamente, concedidas por Innóvate Perú (FINCYT).

UNIVERSIDAD CIENTÍFICA DEL SUR CONFORMA SU COMITÉ AMBIENTAL El recientemente conformado Comité Ambiental de la Universidad Científica del Sur buscará promover, fortalecer e implementar entre todos sus miembros el principio de sostenibilidad para el desarrollo institucional y del país. Esta casa de estudios será un modelo de gobernanza eficiente que contribuirá al bienestar y el desarrollo integral y sostenible de las generaciones presentes y futuras.

El Comité Ambiental de UCSUR está presidido por la rectora, Dra. Josefina Takahashi Sato, e integrado por los vicepresidentes ejecutivos, Sres. Luis Pérez del Solar y Jorge Esteban Pinedo; los decanos de las cinco facultades, Drs. Manuel Rosemberg Barrón, Carlos Chirinos Arrieta, Rafael Elgegren Reátegui y los MSc. Fernando Romero Rojas y Anna Zucchetti; además de los directores de Administración y Operaciones, la Sra. Norka Silva y el Ing. Marcelo Pizarro.

Científica 12 (3), 2015

243

En opinión de la Dra. Takahashi, el cumplimiento de los planes de trabajo y los logros obtenidos por nuestra política ambiental tendrán múltiples impactos positivos en la comunidad universitaria. “Fortalecerá las capacidades de todos sus miembros para contribuir a la conservación del planeta, el desarrollo sostenible de las poblaciones más vulnerables y el fortalecimiento integral de la institución, por los beneficios que genera ser una empresa ecoeficiente que se desarrolla y crece equilibradamente en los aspectos sociales, ambientales y económicos”.

Se promoverá también el desarrollo de investigaciones que generen conocimiento sobre los problemas ambientales más importantes, lo que contribuirá a la formación de ciudadanos humanistas, involucrados en el desarrollo de proyectos de responsabilidad socioambiental. Así mismo, se generarán hábitos que contribuirán a la sostenibilidad de la institución; por ejemplo, la formación de hábitos contra el consumismo innecesario, el respeto e interés por trabajar e investigar para el bienestar de las poblaciones más vulnerables, y el acceso a recursos financieros verdes (a nivel institucional y personal).

Entre los lineamientos de la política ambiental destaca el siguiente: • Investigación: desarrollar líneas de investigación en materia ambiental, que contribuyan directa o indirectamente a la adaptación o mitigación de los impactos del cambio climático, a la salud de las personas y al desarrollo sostenible.

244

Científica 12 (3), 2015

INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES

La revista Científica, editada por la Universidad Científica del Sur, tiene como objetivo promover el avance de la ciencia y la tecnología en las diversas áreas del conocimiento, ciencias formales, naturales y tecnología. Está orientada a investigadores científicos, docentes, estudiantes universitarios y, en general, a todos aquellos que crean y aplican el conocimiento científico.

adjuntando el currículum vitae resumido del autor, con teléfonos, correo electrónico y dirección postal. El Comité Editor asignará el texto propuesto a uno o dos árbitros externos o internos para su evaluación. Estos árbitros remitirán su opinión dentro de los 30 días calendario siguientes. De haber controversia, el Comité Editor tendrá facultad dirimente, en un plazo de 15 días más.

Científica publica trabajos originales e inéditos de carácter científico y tecnológico en el campo de las ciencias.

Acepta, preferentemente, trabajos que expresen resultados valiosos, producto de la investigación científica básica o aplicada, así como los de divulgación que, por su importancia y claridad de exposición, constituyan material valioso para fines docentes. Pueden incluirse trabajos presentados a congresos científicos, pero no publicados por sus organizadores u otros.

Los trabajos y otros artículos a publicar serán remitidos con carta a nuestro Director, firmada por todos los autores y coautores en original y copia, y además deberá entregarse el texto del artículo, incluidas tablas y figuras, en disco compacto o remitido por correo electrónico, de acuerdo con las siguientes características:

También se aceptarán artículos de revisión de hasta aproximadamente 12 páginas, cartas al editor con una extensión no mayor a las 10 páginas, así como notas informativas relacionadas con el quehacer en el área de la investigación.

Los artículos propuestos para su publicación en la revista serán remitidos

1. El texto completo debe ser escrito en formato Microsoft Word, tamaño de página A4, márgenes izquierdo de 3 cm, derecho 3 cm, superior 3 cm, inferior 2 cm. Espacio 1.5, fuente Arial, estilo de fuente regular y tamaño 12.

Se imprimirá de manera vertical. Para todo el texto, excepto el título, deberá usarse la opción “justificar”. El título deberá centrarse.

2. Los idiomas de publicación son tres: español, inglés y portugués.

Científica 12 (3), 2015

245

3.

Los nombres de los autores, con numeración colocada como superíndice, van después del título.

Por esta numeración, al pie de página se indicará la institución, facultad o departamento al que pertenecen los autores. Uno de los autores agregará su dirección postal o correo electrónico.

4. El título del artículo se consignará en español o portugués, primero, y luego en inglés. Además, se presentarán dos resúmenes, uno en español o portugués, según sea el caso, y otro en inglés (abstract), con una extensión entre 100 y 250 palabras.

Después de cada resumen se deberán incluir entre 3 y 6 palabras clave, en español e inglés. El resumen (así como el abstract) deberá constituir un solo cuerpo, de modo que no se fragmentará con puntos aparte.

5. Para los artículos originales se recomienda que el texto desarrolle las siguientes secciones: I. INTRODUCCIÓN, II. MATERIALES Y MÉTODOS, III. RESULTADOS, IV. DISCUSIÓN, V. AGRADECIMIENTOS y VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. 6. Las tablas y figuras deben ser originales y, además de insertarse en el texto mismo, deberán enviarse en formato JPG. No deben denominarse cuadros

246

Científica 12 (3), 2015

o gráficos y, en caso de tomarse de otra fuente, se indicará claramente el libro o artículo en el que se han publicado inicialmente; además, se acreditará haber recibido autorización expresa para su publicación. Deben tener numeración secuencial arábiga seguida de punto (en negritas). A continuación, se colocará la leyenda que explique su significado. La leyenda de una tabla se coloca en la parte superior, a diferencia de las figuras, en las que se ubica en la parte inferior. Las tablas y figuras deberán insertarse apropiadamente en el texto mismo, o también en un anexo cuando la información es complementaria.

7. Las referencias bibliográficas se harán, según la Convención de Vancouver, por orden de aparición, con un máximo de 20 referencias. Los libros, según la secuencia: autores, título, número de edición, lugar de edición, editorial, fecha, volumen y páginas.

Cuando los libros son compilados por un editor y contienen capítulos escritos por diversos autores se harán por: autor(es), título, editor, número de edición y volumen si los hubiera, nombre del libro, lugar de edición, fecha y páginas. Las revistas se citarán por autor(es), título del artículo, nombre de la revista, año de la publicación, volumen y, opcionalmente, número de la revista; finalmente, páginas del

artículo en referencia. Las tesis se citarán por autor, título de la tesis, grado o título profesional al que se opta, universidad, lugar y páginas.

Las páginas web se citan como se ha indicado para revistas en general, pero deberán incluir necesariamente la organización responsable de la página web, la dirección electrónica subrayada y, entre paréntesis, la fecha más reciente de acceso.

Se incluye un ejemplo para el caso de referencias en revistas: Uysal AC, Mizuno H. Tendon regeneration and repair with adipose derived stem cells. Curr Stem Cell Res Ther. 2010; 5 (2): 161-7.

Deberá cumplirse estrictamente el orden, así como los signos de puntuación que se muestran en el ejemplo. En el texto, la numeración correlativa de las referencias se colocará entre paréntesis, no como superíndices. Las palabras en latín, particularmente las clasificaciones, se anotarán en cursivas. Los números, cuando correspondan a un solo dígito, se expresarán en letras.

Solo cuando los autores son más de seis, a partir del sétimo autor se podrá usar et al. para indicar un mayor número

de colaboradores, en cursiva y con el término al sin tilde.

Unidades de medida. Puede insertarse las unidades de volumen litro, múltiplos y submúltiplos, con la letra ele mayúscula (L) o (l) minúscula. Serán ml, μl y mL o μL. Se pueden incluir comentarios a pie de página, pero no bibliografía. Esta última se ubicará al final, en referencias.

No se duplicará la información de resultados obtenidos; por ejemplo, usar tablas y figuras con la misma información. El autor elegirá una de ellas.

No se consignarán nombres de marcas ni referencias comerciales.

Los autores deben indicar claramente el correo que aparecerá en la revista y al que deberán dirigirse los lectores para comentarios, consultas y observaciones.

Los artículos, de acuerdo con lo antes indicado, serán remitidos por correo electrónico o entregados personalmente en USB o CD. Los autores de los trabajos publicados son los únicos responsables de la autenticidad del artículo y de las opiniones expresadas en los mismos.

Científica 12 (3), 2015

247

CIENTÍFICA

Revista CIENTÍFICA Vol. 12 N.° 3, setiembre-diciembre 2015 Fondo Editorial de la Universidad Científica del Sur. Cantuarias 398. Miraflores. Lima 18, Perú.

Tel.: +511 6106400 anexo 528 Tiraje: 600 ejemplares. Canje o donación.