Science & Solutions EDIÇÃO ESPECIAL: R&D (Português)

Número P&D Uma revista da

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A ciência de estar

Naturalmente à frente

Editorial A ciência de estar Naturalmente à frente Na BIOMIN, a pesquisa fundamental é o ponto de partida para produtos e serviços inovadores que dão suporte a você, nosso cliente, na realização de negócios sustentáveis e rentáveis. Neste número da Science & Solutions, apresentamos diversas ferramentas e tecnologias de ponta que os nossos 100 cientistas e pesquisadores utilizam como parte da nossa extensiva atividade de pesquisa e desenvolvimento (P&D).

No Centro de Pesquisas da BIOMIN (BRC), faz parte da nossa missão acompanhar o ritmo alucinante do crescimento do conhecimento científico.

A liderança das "-ômicas"

Registrou-se um progresso científico rápido em várias áreas, incluindo o campo do sequenciamento de genes. Em 2003, o genoma humano foi totalmente sequenciado após 13 anos de trabalho, com um custo de US$ 3 bilhões. Hoje em dia, o mapeamento do seu genoma pode ser realizado em apenas uma semana por US$ 1.000! Como estas tecnologias se tornaram mais acessíveis, os campos das "-ômicas", como a transcriptômica, a genômica e a metabolômica, tornaram-se um pré-requisito para a pesquisa de primeira linha sobre nutrição animal.

Implementamos estas tecnologias "-ômicas" na estrutura dos nossos projetos de P&D e criamos as nossas próprias instalações e conhecimento especializado internos, incluindo uma equipe de pesquisa GUTOMICS®.

Entre os diferentes projetos de pesquisa que realizamos, gostaria de salientar a nossa cooperação com o Bioinformatics Institute em Singapura. Esse esforço visa identificar novas vias e marcadores que forneçam informação adicional sobre o modo de ação dos aditivos fitogênicos em comparação aos antibióticos.

Biomarcadores: além do desempenho

No passado, experimentos de rações baseados no desempenho eram considerados suficientes para avaliar os aditivos para rações. Desde então, a ciência progrediu.

Atualmente, todas as partes interessadas na indústria da nutrição animal estão interessados em obter perspectivas mais profundas sobre o modo de ação dos produtos. É por esta razão que, na BIOMIN, os biomarcadores desempenham um papel importante no desenvolvimento e teste de produtos: identificar os efeitos específicos dos nossos produtos inovadores.

Escolher a BIOMIN como parceira representa a aplicação da mais recente tecnologia e conhecimentos para o seu êxito futuro. É uma das formas de que dispomos para ajudar você a permanecer naturalmente à frente.

Dr Gerd Schatzmayr Diretor de Pesquisa

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Science & Solutions • Número P&D

Índice

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Duas ferramentas avançadas para compreender a resistência antimicrobiana

Os ensaios IBE e qPCR são duas das várias ferramentas que os cientistas e pesquisadores da BIOMIN utilizam para melhor compreender e, possivelmente, combater os mecanismos da resistência aos antibióticos.

Por Andreas Köstelbauer, Gertrude Wegl e Dr. Viviana Klose

Sequenciamento de nova geração revela conexão entre a nutrição e os genes

8

As ferramentas de sequenciamento de RNA de nova geração originam novas possibilidades para compreender o crescimento, saúde e desempenho animal.

Por Dr. Bertrand Grenier

3 ideias-chave para garantir um recebimento adequado das substâncias ativas

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Obter uma distribuição homogênea, termoestabilidade e liberação controlada é necessário para a formulação correta de um aditivo eficaz para rações.

Por Dr. Stephen Cole

Biomarcadores: uma referência para a compreensão de processos in vivo

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Os biomarcadores são essenciais para a ciência do desempenho intestinal e para a gestão do risco de micotoxinas.

Por Drª. Silvia Wein, Líder de Equipe de Desenvolvimento de Experimentos In Vivo

6 ferramentas para medir a modulação da microbiota intestinal e o desempenho intestinal

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A modulação da microbiota intestinal e a integridade intestinal são importantes para avaliar a saúde intestinal do animal e o seu estado de saúde geral.

Por Gertrude Wegl, Theresa Kaschubek e Drª. Elisabeth Mayer ISSN: 2309-5954 Se desejar obter uma cópia digital e mais informações, visite: http://magazine.biomin.net Se desejar obter cópias de artigos ou assinar a Science & Solutions, contate-nos no e-mail: magazine@biomin.net Editores: Ryan Hines, Caroline Noonan Colaboradores: Andreas Köstelbauer, Gertrude Wegl, Viviana Klose, Bertrand Grenier, Stephen Cole, Silvia Wein, Theresa Kaschubek, Elisabeth Mayer Marketing: Herbert Kneissl, Karin Nährer Gráficos: GraphX ERBER AG Pesquisa: Franz Waxenecker, Ursula Hofstetter Editora: BIOMIN Holding GmbH

Erber Campus, 3131 Getzersdorf, Austria

Tel.: +43 2782 8030 www.biomin.net ©Copyright 2018, BIOMIN Holding GmbH. Todos os direitos reservados. Nenhuma parte da presente publicação pode ser reproduzida sob qualquer forma para fins comerciais sem a autorização escrita do detentor dos direitos autorais, exceto em conformidade com as disposições da Lei relativa aos Direitos Autorais, Desenhos e Patentes de 1998.

Todas as fotografias incluídas na presente publicação são propriedade de BIOMIN Holding GmbH ou foram usadas sob licença.

Impresso em papel ecológico: Austrian Ecolabel (Österreichisches Umweltzeichen) BIOMIN is part of ERBER Group

Uma revista da BIOMIN

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Duas ferramentas avançadas para compreender a resistência antimicrobiana Os ensaios inibidor de bomba de efluxo (IBE) e qPCR (Reação em cadeia da polimerase quantitativa) são duas das várias ferramentas que os cientistas e pesquisadores da BIOMIN utilizam para melhor compreender e, possivelmente, combater os mecanismos da resistência aos antibióticos.

Por Andreas Köstelbauer, Pesquisador Associado, Gertrude Wegl, Cientista, e Drª. Viviana Klose, Líder de Equipe de Pesquisa em Microbiologia

A

disseminação de bactérias resistentes a antibióticos representa uma grande ameaça para a medicina moderna (OMS, 2014).

A utilização extensiva de antibióticos na agricultura é um dos vários fatores que podem contribuir para a resistência aos antibióticos (Ventola, 2015). Uma questão essencial é a proliferação de bactérias patogênicas, envolvendo uma variedade de doenças, que apresentam resistência a múltiplos antibióticos, sendo conhecidas como bactérias multirresistentes.

4

Em termos globais, existe uma necessidade permanente de prevenir a continuação do aumento de bactérias multirresistentes, não só em contexto clínico, mas também em ambientes naturais. De modo a encontrar estratégias bem-sucedidas para evitar a disseminação da resistência antimicrobiana nos animais, determinados aditivos para rações com propriedades competitivas (por ex., que inibem o crescimento de bactérias patogênicas) também podem romper os mecanismos de resistência.

No Centro de Pesquisas da BIOMIN, utilizamos

Science & Solutions • Número P&D

No Centro de Pesquisas da BIOMIN, utilizamos diversos métodos analíticos avançados para melhor compreender e, potencialmente, combater os mecanismos da resistência aos antibióticos.

diversos métodos analíticos avançados para melhor compreender e, potencialmente, combater os mecanismos da resistência aos antibióticos. Em primeiro lugar, os ensaios do inibidor de bomba de efluxo (IBE) in vitro permitem-nos identificar substâncias como potenciais inibidores de resistência no laboratório. Em segundo lugar, as tecnologias metagenômicas de ponta permitem-nos detectar e rastrear genes ou elementos bacterianos em ambientes complexos utilizando amostras obtidas no campo.

plasmídeos de resistência, tendo cada gene um código de resistência a um agente específico (Figura 1A), e/ ou através da ação de bombas de efluxo de múltiplos antibióticos, com capacidade para eliminar mais do que um antibiótico (Figura 1C).

Os plasmídeos de resistência são frequentemente transferidos de forma muito eficiente de célula para célula (Figura 1B). A resistência pelas bombas de efluxo ocorre através do aumento da manifestação de genes com códigos para estas bombas. Algumas bombas em bactérias Gram-negativas (por ex., AcrAB-TolC na Salmonella) são particularmente importantes, uma vez que podem bombear ativamente a maioria dos antimicrobianos, utilizados atualmente, do meio intracelular para o extracelular.

Como ocorre a resistência a múltiplos antibióticos

Figura 1. Mecanismos bacterianos importantes conferindo resistência a múltiplos antibióticos (multidrug resistance, MDR). A) As bactérias resistentes a múltiplos antibióticos transportam, frequentemente, elementos genéticos móveis, como plasmídeos de resistência, que podem adquirir muitos genes de resistência através da acumulação de genes. B) A transferência horizontal de genes através de plasmídeos de resistência passa genes de resistência eficazmente de uma bactéria para outra, contribuindo para a disseminação da resistência aos antibióticos em populações de bactérias. C) Outro mecanismo da resistência a múltiplos antibióticos é o bombeamento ativo desses fármacos através de bombas de efluxo.

A Elementos genéticos móveis Envelope bacteriano

B Transferência horizontal de genes 1. Bactéria resistente

C Bombas de efluxo de múltiplos antibióticos

Bactéria sensível Periplasma

TolC

Membrana exterior

tra +

por ex., tetA

AcrA

plasmídeos de resistência (R) transferíveis tetraciclina resistência

2. Cópia do plasmídeo transferido

vancomicina resistência

Membrana interna

Citoplasma

estreptomicina resistência da família

Um único plasmídeo tem capacidade para transportar genes de resistência a diversos antibióticos

H+

Ponte de conjugação 3. Ambas as bactérias resistentes

penicilina resistência da família

AcrB Antibiótico

genes que ajudam na disseminação do plasmídeo

AcrA

Adaptado de Andrea Eberle, Universidade Heinrich-Heine de Düsseldorf, Düsseldorf, Alemanha

Photo: iStockphoto_Dr_Microbe

A resistência a múltiplos antibióticos nas bactérias ocorre através da acumulação de genes de resistência em

Os plasmídeos R são transferidos de forma eficiente entre as células bacterianas.

Nome Resistência Gênero acriflavina Citrobacter tetraciclina Enterobacter

ácido nalidíxico Escherichia AcrAB-TolC cloranfenicol Klebsiella aminoglicosídeo Salmonella beta-lactâmico Shigella glicilciclina macrolídeos Na membrana bacteriana eliminando diversos antibióticos

Fonte: BIOMIN

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Duas ferramentas avançadas para compreender a resistência antimicrobiana

Figura 2. Princípio do ensaio de inibidores de bomba de efluxo. A multirresistente cepa de Salmonella com supraregulação da bomba de efluxo apresenta uma fluorescência muito fraca, pois o corante de fluorescência é bombeado para fora das células (direita).

A mesma cepa de Salmonella tratada com um inibidor de bomba de efluxo perde a resistência, apresentando uma fluorescência mais forte, uma vez que o corante não é eliminado (esquerda).

No laboratório Na Salmonella sensível tratada com IBE, o corante fluorescente (ou antibiótico) penetra nas células e não é eliminado resistência = perdida

Na Salmonella resistente portadora de bomba de efluxo, o corante fluorescente (ou antibiótico) é rapidamente eliminado das células = nível de resistência elevado

Uma cepa de Salmonella MDR tratada com um IBE perde a resistência.

Uma cepa de Salmonella MDR com uma bomba MDR com suprarregulação é resistente a diversos antibióticos.

Efluxo de diversos antibióticos: um alvo essencial para reverter a resistência aos antibióticos

Uma forma de prolongar a eficiência dos antibióticos contra agentes patogênicos resistentes a múltiplos antibióticos consiste em bloquear as respectivas bombas de efluxo com inibidores específicos. As substâncias naturais derivadas de plantas (fitogênicos) emergiram como candidatos promissores, capazes de melhorar a potência dos antibióticos mesmo em concentrações reduzidas, prevenindo o surgimento de resistência.

A atividade de efluxo pode ser medida diretamente através de ensaios à base de fluorescência com base em dois princípios. Primeiro: vários corantes fluorescentes irão alterar a cor e a intensidade quando entram no ambiente lipofílico dentro das células bacterianas. Segundo: esses corantes são ativamente bombeados das células através do mecanismo de efluxo. A monitoração das alterações da fluorescência permite-nos verificar a rapidez com que as bactérias eliminam os corantes e se uma substância adicionada é um possível inibidor (Figura 2).

Resultados do ensaio do inibidor de bomba de efluxo

Fonte: BIOMIN

Unidades de fluorescência relativas

Figura 3. Liberação da fluorescência das células de uma cepa de Salmonella MDR com super manifestação do gene de efluxo após tratamento com dois IBE conhecidos.

1.000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Tempo após adição de glicose [min] Controle

Fonte: BIOMIN

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PaßN 20 mg/L

Artesunato 200 mg/L

Em experiências realizadas no Centro de Pesquisas da BIOMIN, a cepa Salmonella enterica sorovar Typhimurium que transporta a bomba acrAB-TolC originou a super manifestação do gene de efluxo, adaptando-o gradualmente a concentrações mais elevadas de enrofloxacina, um antibiótico frequentemente utilizado por veterinários, até ter conseguido sobreviver milhares de vezes a concentração inicial (0,06 a 60 mg/L).

Esta cepa de Salmonella origina a super manifestação do gene de efluxo, tornando-a resistente a um vasto conjunto de antibióticos (por ex., tetraciclinas, beta-lactâmicos). Para o rastreio de substâncias, a cepa foi corada com um corante fluorescente na presença de potenciais IBE. Após adicionar glicose, que induz a atividade de efluxo, foram medidas as alterações na fluorescência (Figura 3). No controle não tratado, o corante foi expulso e, consequentemente, a fluorescência diminuiu rapidamente. Quando a Salmonella é tratada com IBE conhecidos, a fenilalanina-arginina-ß-naftilamida (PAßN) e o fármaco antimalárico artesunato, o efluxo é claramente inibido.

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Andreas Köstelbauer, Pesquisador Associado, Gertrude Wegl, Cientista, e Drª. Viviana Klose, Líder de Equipe de Pesquisa em Microbiologia

O trato gastrointestinal é o habitat de uma grande diversidade e densidade de espécies, um reservatório para milhares de genes de resistência aos antibióticos.

Figura 4. Metodologias para avaliar a resistência bacteriana aos antibióticos em amostras complexas a diferentes níveis. Partindo de uma amostra fecal, a resistência pode ser avaliada por cultura através de detecção direcionada e de detecção de genes de resistência (através de reação em cadeia da polimerase quantitativa, qPCR) ou através do sequenciamento metagenômico, de modo a caracterizar o resistoma intestinal.

Isolamento e contagem de bactérias resistentes

DNA

bactéria

fezes + antibiótico

Quantificação por PCR de determinados genes de resistência

genes alvo

alvo qPCR tetA, sul1, ...

resistoma

Sequenciamento metagenômico do conjunto de genes completo

Extração Prep. da biblioteca e Bioinformática de DNA sequenciamento e análise Leituras de mapeamento ou reunião para a base de dados do gene AR (Resistente a antibióticos) Fonte: BIOMIN

Estudos do resistoma intestinal para avaliar a resistência aos antibióticos no campo

O trato gastrointestinal é o habitat de uma grande diversidade e densidade de espécies, um reservatório para milhares de genes de resistência aos antibióticos.

A avaliação da resistência aos antibióticos depende, há muito, de técnicas de isolamento convencionais através da cultura e contagem de bactérias em ágar nutriente com e sem antibióticos.

Contudo, estas fornecem informação apenas sobre uma minoria das bactérias — as que têm capacidade para se desenvolver em condições laboratoriais.

Reação em cadeia da polimerase quantitativa

Os métodos moleculares, cujo alvo é a base genética da resistência, utilizam o DNA para caracterizar e quantificar os determinantes da resistência aos antibióticos. A extração do DNA de amostras obtidas do campo (por ex., fezes) permite uma quantificação confiável dos genes de resistência num número elevado de amostras utilizando a reação em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR) (Figura 4). A PCR é uma abordagem direcionada que utiliza oligonucleotídeos sintéticos (“iniciadores”) que

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complementam as extremidades do gene de interesse para amplificar este fragmento do gene em particular.

Não fornece informação sobre a presença dos genes que não são alvo dos iniciadores.

A metagenômica proporciona uma perspectiva completa

A abordagem mais completa para a exploração da resistência aos antibióticos em ambientes complexos utiliza a metagenômica, cujo objetivo consiste em avaliar toda a informação genômica armazenada numa determinada amostra (“metagenoma”) utilizando tecnologias de sequenciamento modernas. As plataformas atuais, como a Illumina HiSeq, originam entre 10 a 1000 GB de sequências de DNA numa única faixa. Os conjuntos de dados de sequenciamento podem ser analisados reunindo-se as leituras curtas em fragmentos de DNA contínuos maiores ou mapeando sequências de referência. Este método permite determinar a composição da microbiota e a detecção e quantificação simultâneas do conjunto completo de genes de resistência (“resistoma”) ou outros genes de interesse (por ex., virulência) na microbiota.

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O sequenciamento de nova geração revela conexão entre a nutrição e os genes As ferramentas de sequenciamento do RNA originam novas possibilidades para compreender o crescimento, a saúde e o desempenho animal.

Por Dr. Bertrand Grenier, Cientista

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Science & Solutions • Número P&D

O sequenciamento de nova geração (SNG) permite que os pesquisadores estudem os sistemas biológicos a um nível nunca antes possível.

Figura 1. O processo de sequenciamento do RNA.

RT

mRNA

biblioteca de sequenciamento Sequenciador RT

leituras de sequência curtas

fragmentação

Fonte: BIOMIN

Figura 2. Estudos científicos utilizando o “sequenciamento do RNA”.

A abordagem transcriptômica

Fonte: PubMed

Transcriptômica refere-se ao estudo do transcriptoma — a soma total de todas as moléculas de RNA mensageiro (mRNAs) ativamente expressas a partir dos genes de um organismo. A utilização de tecnologia de SNG para estudar o transcriptoma ao nível do nucleotídeo é conhecida como sequenciamento do RNA (Figura 1). O sequenciamento do RNA é um importante avanço no estudo da manifestação dos genes, pois permite obter uma imagem de todo o transcriptoma, em vez de um subconjunto de genes pré-determinado. Isto proporciona uma imagem completa de um perfil transcricional celular num determinado momento biológico — o que implica a quantificação de cada produto de manifestação do gene de cerca de 20.000 a 25.000 genes. Avanços recentes na tecnologia de sequenciamento do RNA tornaram

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3.000 2.500 2.000 1.500 1.000 500 0

200 5 200 6 200 7 200 8 200 9 201 0 201 1 201 2 201 3 201 4 201 5 201 6 201 7

Número de estudos publicados

Photo: iStockphoto_HYWARDS

É

extraordinário que o sequenciamento do primeiro genoma humano em 2003 tenha envolvido 13 anos de trabalho e custado cerca de US$ 3 bilhões. Em contrapartida, o HiSeqX Ten, lançado em 2013, pode sequenciar mais de 45 genomas humanos num único dia por aproximadamente US$ 1.000 cada. A evolução crítica em termos de tecnologia/química é que, em vez do sequenciamento de um único fragmento de DNA como acontecia no passado, atualmente, o sequenciamento de nova geração (SNG) alarga este processo a milhões de fragmentos de forma maciçamente paralela e permite que os pesquisadores estudem os sistemas biológicos a um nível nunca antes possível.

esta plataforma de sequenciamento com elevada produtividade mais acessível aos pesquisadores e prevê-se que se torne a ferramenta predominante para a análise do transcriptoma. Conforme apresentado na Figura 2, a utilização do sequenciamento do RNA em estudos científicos aumentou exponencialmente, em grande parte devido às vantagens que oferece em relação à utilização de microarranjos.

Aplicação na nutrição animal

O rápido desenvolvimento da tecnologia de SNG irá desempenhar um papel importante no aumento da nossa compreensão sobre a forma como a nutrição

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O sequenciamento de nova geração revela conexão entre a nutrição e os genes

O rápido desenvolvimento da tecnologia de SNG irá desempenhar um papel importante no aumento da nossa compreensão sobre a forma como a nutrição influencia as vias metabólicas e imunológicas e promove a saúde e o bem-estar do animal.

Figura 3. Aditivos para rações e análise das diferenças na manifestação dos genes.

1 Gene 2 Gene 3

Quantificação de todas as moléculas de mRNA (mRNA = produto do gene; realizado para ≈ 20.000 genes)

Molécula de DNA

Gene 2 Gene 1 Gene 3 Molécula de DNA

2 “Ração de controle”

mRNAs (gene 1)

mRNAs (gene 2)

mRNAs (gene 3)

Comparação do número de moléculas do mRNA para cada gene e identificação dos genes diferencialmente expressos

“Aditivo para rações”

mRNAs (gene 1)

mRNAs (gene 2)

mRNAs (gene 3)

Fonte: BIOMIN

influencia as vias metabólicas e imunológicas e aumenta a saúde e o bem-estar do animal — uma área da ciência animal designada nutrigenômica. A sua principal linha de investigação analisa os efeitos diretos dos constituintes da ração sobre a manifestação dos genes. Consequentemente, a nutrigenômica poderia liderar o desenvolvimento de meios racionais para otimizar a nutrição animal e conseguir uma agricultura mais sustentável e rentável.

A Figura 3 apresenta uma visão geral de como o sequenciamento do RNA pode determinar o modo de ação dos constituintes da ração e/ou encontrar potenciais biomarcadores.

A nutrigenômica e os fitogênicos nas aves

Até onde sabemos, há poucos estudos nutrigenômicos sobre os efeitos dos fitogênicos no transcriptoma inteiro.

Em 2016, foi realizado um experimento em frangos de corte no Centro de Pesquisas da BIOMIN, onde foi efetuada uma análise do sequenciamento do RNA em amostras de tecido do trato intestinal de aves alimentadas com e sem fitogênicos.

Foi determinada a manifestação de mais de 20.000 genes. Os resultados preliminares demonstraram que foram expressos 73 genes diferentes entre aves alimentadas com ração basal e aves alimentadas com a mesma ração suplementada com fitogênicos. A Tabela 1

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apresenta uma visão geral de algumas vias de sinalização associadas a estes GDE (genes diferencialmente expressos), nomeadamente as vias de sinalização de resposta de fase aguda e da citocina relacionadas com a resposta inflamatória. Estes resultados foram obtidos com base numa versão atualizada do genoma da galinha (Galgal5) publicado em dezembro de 2016. Isto faz com que sejam mais exatos do que os resultados obtidos com a utilização de versões (por ex., Galgal4) ou tecnologias anteriores, como os microarranjos, que dependem de uma sonda de detecção de sequência pré-desenhada para hibridação que teria de ser redesenhada para cada nova atualização do genoma.

Limitações do SNG e da transcriptômica

Tal como acontece com qualquer tecnologia, o sequenciamento de nova geração também tem as suas limitações e desafios. Por exemplo, apesar das superiores vantagens do sequenciamento do RNA, os microarranjos continuam a ser a opção mais comum dos pesquisadores quando realizam experimentos de perfil transcricional.

Isto se deve, provavelmente, ao fato de a nova tecnologia de sequenciamento do RNA ser mais dispendiosa do que os microarranjos, o armazenamento de dados ser mais desafiador e a análise, mais complexa.

As plataformas de SNG fornecem grandes quantidades

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Dr. Bertrand Grenier Cientista

Tabela 1. Efeito dos fitogênicos no intestino de frangos de corte com 35 dias de idade.

Número total de genes analisados com Galgal5

24.838

Número de genes diferencialmente expressos em comparação a aves de controle — mapeamento Galgal5

73

Vias de sinalização associadas a estes genes diferencialmente expressos:

— Sinalização de resposta de fase aguda — Sinalização de citocina (via IL-22 e STAT3)

Fonte: BIOMIN

Figura 4. Requisitos para a análise de sequenciamento do RNA. Conhecimento especializado necessário | Conhecimento técnico

20.000 genes

1 amostra = 30 milhões de dados para processar

Comandos do Linux para executar programas

Avaliação do programa sem regras fixas

Scripts necessários para as estatísticas

Conhecimento especializado = formação avançada

Conhecimento especializado necessário | Conhecimento prático RNA=mRNA, tRNA, rRNA, miRNA, siRNA, lncRNA...

Estrutura do gene éxon, íntron, CDS, UTR, poliA

manifestação do gene, isoformas de transcritos, fusão de genes

Anotação do genoma

Conhecimentos em bioquímica necessários

Base de dados e browsers do genoma

Fonte: BIOMIN

de dados (por ex., 200 GB gerados do sequenciamento do RNA para 30 amostras biológicas) e, consequentemente, necessitam de servidores com consideráveis recursos informáticos. Não existe uma metodologia de referência para o processamento e análise de dados de SNG: trata-se de uma área em expansão com desenvolvimento contínuo de ferramentas bioinformáticas. Todas têm vantagens e limitações, e é necessário avaliá-las e chegar a um consenso da análise dos dados. A complexidade da análise do SNG e a interpretação de dados requer conhecimento especializado e conhecimento em informática e biologia (Figura 4).

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Além disso, a abordagem transcriptômica isoladamente não é suficiente para chegar a conclusões definitivas sobre o modo de ação dos constituintes da ração. Por exemplo, o ambiente do trato gastrointestinal é bastante complexo: o tecido, células e nutrientes do hospedeiro interagem com a microflora intestinal. A combinação das denominadas abordagens “-ômicas”, como a genômica, transcriptômica, proteômica e metabolômica, proporcionariam um entendimento ainda melhor sobre o modo de ação e o desempenho intestinal.

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3 ideias-chave para garantir um recebimento adequado das substâncias ativas Obter uma distribuição homogênea, termoestabilidade e liberação controlada é necessário para a formulação correta de um aditivo para rações eficaz.

Por Dr. Stephen Cole, Líder de Equipe de Desenvolvimento — Formulação de Ingredientes Bioativos

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A

s substâncias ativas presentes nos aditivos para rações podem ser um único ingrediente ou uma mistura complexa de enzimas, adsorventes, fitoquímicos, microrganismos vivos e ácidos orgânicos. Independentemente da sua natureza, devem ser fornecidos ao animal específico numa forma que garanta que a substância chegará, com segurança, no local de ação específico do organismo do animal e que permanecerá 100 % ativa.

Uma variedade de técnicas

Devido à natureza diversa das substâncias ativas, devem ser utilizadas diferentes técnicas de formulação para diferentes produtos. Por exemplo, as enzimas e os microrganismos podem ser bastante frágeis, portanto

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é normal secar as preparações que contêm enzimas e microrganismos para preservar a sua atividade. No caso dos microrganismos, este processo é efetuado, normalmente, através da liofilização de culturas de células estabilizadas, embora a secagem por pulverização ou a secagem do leito fluidizado, a granulação e o revestimento possam ser utilizados para as enzimas.

Quando as substâncias ativas são líquidos voláteis, como as preparações fitogênicas de óleos essenciais, são necessárias técnicas de formulação alternativas, como a encapsulação, para proteger as substâncias ativas voláteis.

Em alternativa, podemos, por vezes, desejar que o aditivo para rações seja uma preparação líquida, como uma enzima para aplicação pós-granulação. Neste caso, o desafio adicional envolve a estabilização da substância

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3 ideias-chave para garantir uma administração adequada de substâncias ativas

A densidade e o tamanho da preparação do aditivo para rações irá determinar se a substância ativa pode ser eficaz e precisamente distribuída pela ração.

ativa ao mesmo tempo que garante que o produto pode ser aplicado de forma reprodutível nas rações terminadas.

Em geral, a formulação bem-sucedida de aditivos para rações deve ultrapassar três desafios distintos: distribuição homogênea, termoestabilidade e liberação controlada, de modo a atingir os melhores resultados em animais.

Figura 1. Secador de leito fluidizado, granulador e revestidor de escala laboratorial.

Desafio 1: Distribuição homogênea

O primeiro desafio para o formulador de ingredientes bioativos consiste em garantir que o produto seja distribuído precisamente pela ração. Os aditivos para rações são sempre microingredientes e, normalmente, são adicionados a um nível de inclusão de cerca de 100 g por tonelada de ração. A densidade e o tamanho da preparação do aditivo para rações irá determinar se a substância ativa pode ser eficaz e precisamente distribuída pela ração. Por exemplo, em média, o granulado de ração para frangos de corte de 4 mm pesa 0,055 g, o que equivale a mais de 18 milhões de granulados por tonelada de ração. Para garantir que todo o granulado da ração receba a substância ativa seria necessário existirem, pelo menos, 18 milhões de partículas da substância ativa numa inclusão típica de 100 g. Este cálculo deve ser sempre efetuado para determinar o tamanho e a distribuição do tamanho ideais da preparação ativa.

Desafio 2: Termoestabilidade

O segundo desafio consiste na substância ativa sobreviver ao condicionamento de vapor e granulação subsequentes, onde a ração e os aditivos incluídos são sujeitos a temperaturas elevadas (acima de 85 °C), a um teor de umidade elevado e a elevadas pressões físicas.

Tem sido alcançado êxito significativo na proteção de enzimas através deste processo, secando-se a enzima dentro de uma matriz granular e aplicando-se um revestimento simples ou múltiplo nos grânulos. Ambos os processos foram obtidos através do processamento do leito fluidizado (Figura 1). Os leitos fluidizados podem ser utilizados para secar cuidadosamente substâncias ativas sensíveis, mas também podem ser utilizados para formar materiais granulares que tornam o produto muito mais fácil e seguro de manusear, pois a quantidade de pó é reduzida ou inexistente e é mais fácil dispersar os produtos de forma precisa numa matriz de ração. A Figura 1 ilustra uma máquina de escala laboratorial,

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Fonte: BIOMIN

cujo lote pode ter até aproximadamente 1 kg. Também existem máquinas de maior dimensão, de escala-piloto, escala industrial e de fluxo contínuo, com capacidade para granular e revestir materiais à taxa de uma tonelada por hora.

A formulação de uma enzima para a ração pode até resultar num produto com um melhor desempenho do que produtos concorrentes inerentemente termoestáveis.

A Figura 2 apresenta a recuperação de uma enzima inerentemente termoestável juntamente com uma enzima termolábil (normal) e uma enzima termolábil revestida, o blend enzimático foi adicionado às rações, que passaram por três temperaturas de peletização distintas. O revestimento da enzima normal resultou num produto com mais de 70 % de recuperação a 95 °C e um desempenho claramente superior, mesmo em relação à enzima inerentemente termoestável criada.

Desafio 3: Liberação controlada

O terceiro desafio consiste em garantir que as substâncias ativas se encontrem disponíveis na parte

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Dr. Stephen Cole Líder de Equipe de Desenvolvimento — Formulação de Ingredientes Bioativos

A formulação de uma enzima para a ração pode até resultar num produto com um melhor desempenho do que produtos concorrentes inerentemente termoestáveis.

Figura 2. Recuperação da atividade das enzimas de rações condicionadas em diferentes temperaturas.

120%

Recuperação da atividade

100% 80% 60% 40% 20% 0%

75 °C

85 °C Temperatura de condicionamento

95 °C

n Termoestável n Normal n Normal revestido Fonte: BIOMIN

desejada do trato gastrointestinal do animal específico.

Deve-se ter sempre cuidado para não encapsular nem revestir um produto de forma a que a disponibilidade e eficácia no animal sejam reduzidas. No entanto, a formulação de uma substância ativa pode ser utilizada para visar o local onde ela se torna disponível ou para proteger a substância enquanto passa por uma parte do trato gastrointestinal; por ex., proteção gástrica ou do rúmen para um produto que necessita funcionar no trato gastrointestinal inferior.

A Biomin Duplex Capsule® recentemente lançada, que designa o Digestarom® DC, ilustra o poder da formulação de um produto. O núcleo interno da cápsula contém os óleos essenciais e substâncias que são ativas no trato gastrointestinal inferior do animal. Estes são encapsulados em matriz de forma a permitir a sua liberação ao longo do trato gastrointestinal inferior, ao mesmo tempo que o protegem da liberação no estômago, melhorando a palatabilidade de alguns componentes. O melhoramento adicional da palatabilidade foi alcançado aplicando-se uma segunda substância à base de óleos essenciais na

Uma revista da BIOMIN

Figura 3. Micrografia eletrônica de uma Biomin Duplex Capsule®

Fonte: BIOMIN

matriz de revestimento, que se encontra imediatamente disponível para os sentidos olfativo e gustativo do animal.

A Figura 3 representa uma micrografia eletrônica de uma cápsula dupla, exibindo claramente as regiões do núcleo e revestimento.

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Biomarcadores:

uma referência para a com de processos in vivo Os biomarcadores são essenciais para a ciência do desempenho intestinal e para a gestão do risco de micotoxinas.

Por PD Drª. Silvia Wein, Líder de Equipe de Desenvolvimento de Experimentos In Vivo

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Biomarcadores: uma referência para a compreensão de processos in vivo

Na prática, os biomarcadores podem ser utilizados a) para o diagnóstico ou determinação do estágio de uma doença, b) para a monitoração da resposta a uma terapia ou c) para indicar a exposição a fatores ambientais em organismos vivos.

E

mbora frequentemente seja referido como uma proteína na corrente sanguínea, um biomarcador pode ser qualquer molécula nos fluidos corporais, tecidos ou excreções, que funciona como indicador de saúde, doença, exposição ou efeito. Existem diversas definições sobrepostas de biomarcadores encontradas na literatura.

Umas das primeiras fontes define biomarcador como “uma característica que é objetivamente medida e avaliada como indicador de processos biológicos normais, processos patológicos ou respostas farmacológicas a uma intervenção terapêutica”.

3 aplicações principais

A identificação e utilização de biomarcadores válidos contribui significativamente para a pesquisa clínica.

Além da validade, o biomarcador ideal deve possuir as seguintes características: ser fácil e seguro de medir, ter um seguimento rentável, ser consistente entre gêneros e modificável devido a tratamento.

Na prática, os biomarcadores podem ser utilizados a) para o diagnóstico ou determinação do estágio de uma doença, b) para a monitoração da resposta a uma terapia

ou c) para indicar a exposição a fatores ambientais em organismos vivos. Assim, as descrições em a) e b) são frequentemente resumidas como “biomarcadores de efeito” e a última como “biomarcadores de exposição”. Na Tabela 1 são descritos determinados biomarcadores com grande relevância para a saúde dos suínos e a exposição às micotoxinas.

Pesquisas na estratégia para rações

Em experimentos de rações, os biomarcadores podem ser uma importante ferramenta para explorar o efeito de uma estratégia para a ração pesquisada e, em conformidade, determinar o seu potencial para aplicação comercial numa fase inicial. Serve também, preferencialmente, para investigar a exposição a micotoxinas e seus efeitos. Muitas investigações que utilizam a análise de biomarcadores necessitam de amostras de urina e/ou fezes. Obter amostras adequadas implica a utilização de instalações com equipamento especial, como o Centro para Nutrição Animal Aplicada (CAN) da BIOMIN em Tulln, na Áustria — um dos sete centros a nível global na rede de Centros para Nutrição Animal Aplicada.

Tabela 1. Biomarcadores selecionados nos suínos Processo

Biomarcador

Amostra

Inflamação

Proteína de fase aguda: haptoglobina

Soro

Ácido siálico total (TSA)

Soro

Neopterina

Fezes

Mieloperoxidase (MPO)

Soro/fezes

Lesão nos enterócitos do intestino delgado

Proteína de ligação de ácidos graxos intestinal (I-FABP)

Soro/fezes

Estresse oxidativo

Catalase

Soro

Superóxido dismutase

Soro

Glutationa redutase

Soro

Relação esfinganina/esfingosina

Sangue/tecido

Inflamação no intestino delgado

Efeito fumonisina B1 Exposição a fumonisina B1

Fumonisina B1

Sangue/urina/fezes

Efeito zearalenona

Conjugados de ácido glicurônico

Urina/fezes

Exposição a zearalenona

Zearalenona e respectivos metabólitos

Sangue/urina/fezes

Adaptado de Niewold (2015), Kataria (2012) e Baldwin (2011)

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PD Drª. Silvia Wein Líder da Equipe de Desenvolvimento de Experimentos em Rações

Figura 1. Gaiolas metabólicas no Centro para Nutrição Animal Aplicada em Tulln. A) Vista frontal e lateral com comedouros e bebedouros na porta da frente B) Vista interior com piso ripado, área de recolha com telas e bandejas.

A

B

Fonte: BIOMIN

CAN da BIOMIN em Tulln

O centro em Tulln é composto por uma estação de alimentação, dois compartimentos equipados com 12 gaiolas metabólicas e um compartimento adicional com quatro gaiolas com piso ripado revestido com plástico. Dependendo do conceito de alojamento, dos critérios do experimento e do tamanho dos animais utilizados, podem ser alojados, no máximo, 96 suínos nos dois compartimentos com gaiolas metabólicas. Nas gaiolas com piso, a capacidade máxima é de 24 suínos com um peso corporal até 30 kg.

A Figura 1 ilustra a disposição de uma gaiola metabólica utilizada no nosso CAN em Tulln. Os suínos podem movimentar-se livremente num piso ripado revestido com plástico. Por baixo do piso encontram-se duas telas que irão recolher todo o material fecal expelido pelo suíno. Por baixo das telas existe um tabuleiro em aço inoxidável que efetua a drenagem para o centro e permite a recolha de toda a urina produzida durante o dia.

Uma revista da BIOMIN

Conhecimento gerado

Estas gaiolas metabólicas permitem uma grande variedade de investigações vanguardistas em organismos vivos, incluindo a análise de biomarcadores, a digestibilidade dos nutrientes e a retenção de nutrientes.

Ao recolher a urina e as fezes separadamente, o metabolismo e a excreção de moléculas (por ex., micotoxinas e respectivos metabólitos) podem ser estudados. O impacto de uma estratégia para a ração sobre a inflamação ou o estresse oxidativo pode ser monitorado analisando-se os respectivos fluidos corporais (sangue, saliva, urina) ou fezes.

Conhecendo a quantidade de ração dada todos os dias e a composição dos nutrientes da ração, pode ser calculada a ingestão total de nutrientes. A digestibilidade e a quantidade de nutrientes retidos nos tecidos corporais ou de nutrientes perdidos podem também ser calculadas.

A excreção total de nutrientes nas fezes e na urina pode ser estimada e as estratégias nutricionais podem ser avaliadas.

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6 ferramentas para medir a modulação da microbiota intestinal e o desempenho intestinal A microbiota intestinal e a integridade intestinal determinam a saúde intestinal de um animal e são importantes para avaliar o seu estado de saúde geral.

Por Gertrude Wegl, Cientista, Theresa Kaschubek, Pesquisadora Associada, e Drª. Elisabeth Mayer, Líder de Equipe de Pesquisa em Biologia Celular

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importância de um intestino saudável é cada vez mais reconhecida como a chave para sistemas de produção modernos, principalmente por se relacionar com a redução de antibióticos e com o melhoramento do bem-estar do animal. O intestino é a primeira linha de defesa do organismo: um equilíbrio suficiente da microbiota intestinal benéfica e uma barreira intestinal estreita protege os animais contra agentes patogênicos e toxinas. O trato gastrointestinal atua como uma interface entre a dieta, o hospedeiro e a microbiota intestinal e desempenha um papel evidente no estado de saúde de um animal (Figura 1). A dieta, incluindo a ração e os aditivos para rações, constitui um importante fator que afeta a composição e a atividade dos microrganismos intestinais e o desempenho intestinal.

A nossa pesquisa

Os pesquisadores e cientistas do Centro de Pesquisas da BIOMIN utilizam uma variedade de diferentes métodos para caracterizar a microbiota intestinal e as substâncias que melhoram a saúde intestinal em geral.

Neste artigo, analisamos três métodos moleculares para avaliar a microbiota intestinal que permitem análises de amostras ex vivo e três modelos baseados em culturas de células para o desempenho intestinal que simulam o intestino/epitélio in vitro. Os primeiros representam um grande avanço para analisar as comunidades bacterianas e permitem-nos analisar mais atentamente a composição e a diversidade da microbiota, assim como a quantidade de determinados grupos bacterianos. Os últimos permitem a replicação de infecções e o rastreio de substâncias benéficas sem prejudicar os animais, utilizando linhagens celulares de animais específicas, por ex., a linhagem celular epitelial do intestino porcino (IPEC-J2).

Figura 1. Interação entre dieta, hospedeiro e microbiota intestinal — fatores que influenciam o ecossistema intestinal e contribuem para a saúde e doença.

O trato gastrointestinal — Interface entre: Dieta

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n

• Nutrientes • Aditivos • Fatores nutricionais

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Hospedeiro

Microbiota

• Camada da mucosa intestinal • Epitélio intestinal • Sistema imunológico

• Bactérias comensais • Bactérias transitórias (incluindo agentes patogênicos)

Papel importante na Saúde

Homeostase

Perturbação

Doença

Fonte: Adaptado de Conway, 1994

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6 ferramentas para medir a modulação da microbiota intestinal e o desempenho intestinal

O trato gastrointestinal atua como uma interface entre a dieta, o hospedeiro e a microbiota intestinal e desempenha um papel evidente no estado de saúde de um animal.

Figura 2. Análise de agrupamentos demonstrando semelhanças nos perfis de comunidade DGGE 16S rRNA de amostras fecais de suínos alimentados com diferentes aditivos.

Fonte: BIOMIN

Eletroforese em gel de gradiente desnaturante

A eletroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) elabora um perfil geral da comunidade microbiana e pode processar rapidamente um grande número de amostras intestinais ou fecais.

A DGGE baseia-se na amplificação de um gene específico, normalmente 16S rRNA utilizado como marcador molecular, e na separação das diferentes variantes do gene na amostra da comunidade por eletroforese em gel desnaturante. Após a coloração, as diferenças no sequenciamento do gene resultam no surgimento de padrões de banda característicos no gel, denominados “impressões digitais”. A DGGE permite a comparação de comunidades microbianas através da análise de agrupamentos dessas impressões digitais, o que pode ser utilizado para monitorar os efeitos dos aditivos para rações na diversidade e dinâmica da microbiota fecal dos animais (Figura 2).

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Perfil do microbioma intestinal baseado no sequenciamento

Para obter uma informação detalhada sobre a composição bacteriana, o sequenciamento do produto da amplificação baseado em 16S rRNA permite a identificação da toda a comunidade microbiana numa amostra até ao nível da espécie. O DNA total da amostra é amplificado, em primeiro lugar, por PCR utilizando oligonucleotídeos 16S rRNA e utilizando adaptadores e códigos de barras específicos, muitas amostras podem ser combinadas em uma só execução de sequenciamento. Os produtos de amplificação da PCR são, por consequência, acoplados a partículas esféricas e carregados em chips para sequenciamento descartáveis.

Utilizando, por ex., o Illumina Miseq como plataforma de sequenciamento, podem esperar-se 5 a 10 GB de dados de sequenciamento (aprox. 10 a 15 milhões de leituras de sequenciamento, dependendo da profundidade do sequenciamento) em amostras complexas. A avaliação bioinformática inclui o processamento de leituras não tratadas e de agrupamentos de sequências relacionadas.

Esses agrupamentos de leituras de sequenciamento semelhantes são designados por unidades taxonômicas operacionais (operational taxonomic units, OTU). A identificação microbiana é conseguida comparando-se as sequências em bases de dados de referência baseadas em 16S (por ex., RDP II ou Silva).

Reação em cadeia da polimerase quantitativa

Para a informação quantitativa sobre o grupo bacteriano ou o nível da espécie, pode ser utilizada a reação em cadeia da polimerase (qPCR) em tempo real utilizando oligonucleotídeos (tendo como alvo o gene 16S rRNA ou outros marcadores genéticos). Permite a identificação direta dos efeitos da dieta sobre as bactérias benéficas e prejudiciais. Além disso, pode ser utilizada para detectar especificamente cepas probióticas, como Lactobacillus reuteri, no trato gastrointestinal.

Ensaio antioxidativo

O potencial antioxidativo dos fitogênicos na IPEC-J2 é avaliado utilizando-se 2',7'- dicloro-dihidrofluoresceína-diacetato (DCFH-DA) que tem capacidade para se incorporar nas células e se tornar fluorescente após a exposição a espécies reativas de oxigênio (ERO). As ERO são induzidas por estimulação

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Gertrude Wegl, Cientista, Theresa Kaschubek, Pesquisadora Associada, e Drª. Elisabeth Mayer, Líder de Equipe de Pesquisa em Biologia Celular

Figura 3. Três ensaios de cultura de células utilizados para investigar as propriedades antioxidativas (A) e anti-inflamatórias (B) das substâncias de teste de fitogênicos, bem como para estudar a integridade da barreira epitelial (C) numa linhagem celular epitelial do intestino suíno (IPEC-J2).

A Ensaio antioxidativo

B Ensaio anti-inflamatório TNF-α

H 2O 2

Luminescência Membrana da célula

C Ensaio TEER Voltímetro Toxinas, agentes patogênicos Membrana apical Inserto Transwell

Fitogênicos

Citoplasma

Citoplasma

DCFH-DA Núcleo

H 2O 2

ERO

Fitogênicos DCF

Fator de transcrição NF-кB

Gene repórter

Membrana basolateral Junções estreitas Membrana microporosa

Fonte: BIOMIN

com H2O2 e determinadas através da medição da fluorescência, diretamente proporcional à quantidade de ERO intracelular. Substâncias de teste de fitogênicos potentes podem combater a produção de ERO, indicada pela diminuição de fluorescência (Figura 3A). A redução do estresse oxidativo auxilia o desempenho do animal.

Ensaio anti-inflamatório

Para rastrear a atividade anti-inflamatória das substâncias de teste de fitogênicos na IPEC-J2, os níveis do fator de transcrição pró-inflamatório NF-κB são monitorados através do ensaio baseado na luminescência do gene repórter NF-κB. As células são transfectadas com o vetor repórter NF-κB e pré-incubadas com fitogênicos.

Seguido pela ativação do NF-κB através de estimulação com a citocina pró-inflamatória TNF-α, o potencial das substâncias de teste para atenuar a inflamação induzida por TNF-α é determinado pela medição da luminescência, diretamente proporcional à quantidade de NF-κB ativada

Uma revista da BIOMIN

(Figura 3B). Com a redução da inflamação, os animais podem canalizar mais energia para o crescimento.

Ensaio TEER

O ensaio de resistência elétrica transepitelial (TEER) (Figura 3C) é um modelo de cultura de células para avaliar a função da barreira intestinal in vitro. Assim sendo, a IPEC-J2 é introduzida em insertos Transwell com uma membrana porosa imitando as membranas apical (luminal) e basolateral (sangue) do intestino.

Após 8 dias de diferenciação, a resistência ôhmica entre os dois compartimentos é medida, indicando o caráter intacto do epitélio intestinal. A redução do valor de TEER é um marcador precoce de perturbação da barreira epitelial. O modelo TEER proporciona a oportunidade de avaliar o efeito das micotoxinas na integridade da barreira intestinal e de efetuar o rastreio de substâncias bioprotetoras com capacidade para combater esses efeitos negativos.

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