Bảng 3.3. Kết quả khảo sát số lần chiết

10 phút, lấy dịch đem ly tâm. Hút một lượng dịch bằng xylanh lọc qua màng lọc DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL 0,45 µm vào lọ đựng mẫu thu được dịch T1-1 chiết lần 1. Gạn phần dịch còn lại trong ống nghiệm, thu phần cắn, rửa sạch nhiều lần bằng MeOH 60%. Thêm tiếp 3 ml MeOH 60%, tiến hành siêu âm tương tự lần 1, thu được dung dịch T12 chiết lần 2. Làm tiếp với 2 ml MeOH 60% thu được dịch T1-3 chiết lần 3. Tiến hành sắc ký các mẫu chiết, đánh giá hiệu suất và lựa chọn số lần chiết. Kết quả được tổng hợp dưới bảng 3.3 và phụ lục 7. Bảng 3.3. Kết quả khảo sát số lần chiết Lần chiết

Khối lượng (mg) Thời gian lưu ( phút) Diện tích pic (mAU.s) Hàm lượng (%, kl/kl) Lần 1

126,1 20,191 197,1 0,0296

Lần 2 (-) (-) (-)

Lần 3 (-) (-) (-) (-): không phát hiện pic của AST Kết quả cho thấy, sau lần chiết 1 siêu âm 10 phút thì hầu như Astilbin đã được chiết hết và đạt hàm lượng là 0,0296%. Tiến hành chiết lần 2 và lần 3 thì không thấy xuất hiện pic của astilbin trên sắc ký đồ nữa. Do đó, lựa chọn chiết 1 lần siêu âm 10 phút là phù hợp nhất. Như vậy, quy trình xử lý mẫu được xây dựng như hình 3.1: Tháo bỏ lớp vỏ nang cứng của 20 viên chế phẩm, trộn đều và nghiện mịn phần bột, sau đó cân chính xác khoảng 0,1250 g bột trên (tương ứng với khoảng 0,0250 g dược liệu thổ phục linh) vào bình định mức 10,0 ml. Thêm dung môi MeOH 60% vừa đủ định mức, lắc đều rồi đem siêu âm 10 phút. Sau 10 phút lấy bình ra khỏi bể siêu âm. Lấy một lượng dịch đem ly tâm. Hút dịch sau khi ly tâm bằng xylanh rồi lọc qua màng lọc 0,45 µm vào lọ đựng mẫu, thu được dung dịch thử dùng để định lượng astilbin trong chế phẩm.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Hình 3.1. Sơ đồ quy trình xử lý mẫu 3.2. Khảo sát điều kiện sắc ký Theo hướng dẫn của Dược điển Việt Nam V về định lượng astilbin trong dược liệu Thổ phục linh, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện đấy trên chế phẩm T1 như sau: - Cột C18 (25 cm x 4,6 mm; 5μm). - Bước sóng phát hiện 291nm. - Tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm 20μl. - Hệ pha động MeOH 60% : acid acetic băng 1% ( 39:61). Sắc ký đồ thể hiện trong hình 3.2 Tháo lớp vỏ nang cứng của chế phẩm Nghiền bột của 20 viên chế phẩm Cân chính xác khoảng 0,125 g bột chế phẩm đã nghiền Định mức vừa đủ 10ml bằng MeOH 60% Lắc xoáy đều bằng máy Siêu âm 10 phút Ly tâm lạnh 5 phút Lấy dịch bằng xylanh, lọc qua màng 0,45 µm

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Hình 3.2. Sắc ký đồ khảo sát theo điều kiện sắc ký của Dược điển Việt Nam V a) Chuẩn AST; b) Mẫu thử T1 Kết quả nhận thấy pic AST không tách được khỏi các chất khác trong chế phẩm. Tiến hành khảo sát thêm trên 2 hệ pha động khác: 1) MeOH 60% : H3PO4 0,1%; 2) MeOH 60% : H2O với các tỉ lệ khác nhau. Qua quá trình khảo sát thu được ở hệ pha động MeOH 60% : H2O (38:62), pic AST tách tốt, dung môi thông dụng, dễ thực hiện trong quá trình thực nghiệm (Hình 3.3). Tuy nhiên, các thành phần khác trong chế phẩm lưu giữ tốt trên cột nên thời gian phân tích tương đối dài. Vì vậy, để đẩy hết phần tạp còn lại trong mẫu nhanh hơn, căn cứ vào thời gian lưu của các tạp trên sắc ký đồ, kết hợp chạy gradient để đẩy hết phần tạp còn lại trong mẫu, chương trình gradient như bảng 3.4.