trường

Bảng 3.9. Hàm lượng AST của một số chế phẩm chứa Thổ phục linh

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL trên thị trường Khối lượng TPL/viên (mg)

Hàm lượng AST trong dung dịch định lượng (ppm) Hàm lượng AST/viên (mg/viên)

T1 100 4,639 0,1819

T2 100 4,212 0,1630

T3 330 KPH (*) < 0,01 (**)

T4 650 KPH (*) < 0,02 (**)

T5 100 KPH (*) < 0,003 (**)

T6 100 KPH (*) < 0,003 (**) (*) KPH - Không phát hiện (< LOD 0,083 ppm trong dung dịch định lượng) (**) Ngưỡng hàm lượng tính từ lượng cân và KLTB viên Kết luận: Phương pháp đã được ứng dụng phân tích AST trên 5 mẫu chế phẩm chứa Thổ phục linh. Tuy nhiên, một số chế phẩm chứa Thổ phục linh không thấy xuất hiện pic của AST trên sắc ký đồ. Do vậy cần tiếp tục phân tích AST trên một số lượng mẫu chế phẩm lớn hơn.

3.5. Bàn luận 3.5.1. Về quy trình xử lý mẫu

- AST là một hợp chất hữu cơ có vòng benzen nên có khả năng hấp thu tốt tia UV-VIS vì vậy có thể phát hiện AST bằng detector UV – VIS. Độ ổn định của AST phụ thuộc vào nhiệt độ, pH và môi trường nên khi thực hiện các quy trình xử lý mẫu cần lưu ý để vấn đề này. - Về phương pháp chiết AST, trong Dược điển Việt Nam V đã có quy trình chiết HL trong vòng 1h với dung môi MeOH 60% [2]. Chúng tôi đã làm lại quy trình này trên mẫu thử. Nhận thấy các chế phẩm có chứa Thổ phục linh trên thị trường thường có dạng viên nang cứng, cao khô, cao lỏng,….nên khả năng chiết AST có thể sẽ dễ dàng hơn. Chúng tôi đã tiến hành chiết AST bằng phương pháp SA trên mẫu thử và các mẫu dược liệu thì được kết quả hàm lượng

AST trong chiết HL có xu hướng thấp hơn chiết SA. Vì vậy, chúng tôi lựa chọn DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL phương pháp chiết SA để không ảnh hưởng đến độ ổn định của AST. - Về thời gian chiết: trong quá trình khảo sát xử lý mẫu, khi siêu âm lâu, bể siêu âm có thể nóng lên, làm tăng nhiệt độ mẫu khiến tăng tốc độ phân hủy của AST. Thể hiện sự giảm diện tích sau mỗi lần tiêm. Vì vậy cần lựa chọn thời gian chiết phù hợp và chú ý thay nước bể siêu âm nếu sử dụng kéo dài. - Quy trình chiết SA áp dụng chiết trong chế phẩm có chứa Thổ phục linh nhanh và thao tác đơn giản, ngoài ra cũng khắc phục được sự phân huỷ của AST do nhiệt độ, pH và môi trường trong quá trình chiết. 3.5.2. Về xây dựng và thẩm định phương pháp - Định lượng AST trong dược liệu Thổ phục linh đã có hướng dẫn trong Dược điển Việt Nam V, tuy nhiên trong chế phẩm ngoài Thổ phục linh còn chứa nhiều loại dược liệu khác nhau áp dụng phương pháp theo dược điển thì pic AST không tách được ra khỏi các pic còn lại trong mẫu. - Khi khảo sát trên các hệ dung môi khác thì nhận thấy với hệ pha động MeOH 60% : H2O = 38 : 62 thu được pic đẹp, tách tốt, thời gian lưu vừa phải và đặc biệt dung môi H2O dễ thực hiện, thuận tiện trong quá trình thực nghiệm. - Phương pháp được thẩm định theo hướng dẫn của AOAC 2013 đều đáp ứng các yêu cầu. - Ứng dụng phương pháp định lượng trên một số chế phẩm có dạng bào chế tương tự T1 trên thị trường. Tuy nhiên, một số chế phẩm chứa Thổ phục linh không thấy xuất hiện pic của AST, mặc dù một số chế phẩm có lượng cao khô trong viên tương ứng với Thổ phục linh khá cao. Do số lượng mẫu được áp dụng còn hạn chế, chưa thể có nhận định về chất lượng sản phẩm, nhưng đây có thể là gợi ý để hợp tác với các nhà sản xuất trong việc kiểm tra nguyên liệu đầu vào sản xuất theo tiêu chuẩn DĐVN V, đồng thời kiểm soát quy trình sản xuất tránh làm phân hủy hoạt chất.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Nghiên cứu này đã đạt được mục tiêu đề ra: Xây dựng và thẩm định đạt yêu cầu phương pháp phân tích AST trong chế phẩm chứa thổ phục linh bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). - Phương pháp xử lý mẫu bằng chiết siêu âm với MeOH 60% cho tỷ lệ thu hồi tốt, mẫu sau chiết tách tốt, định lượng được AST trong khoảng thời gian phân tích vừa phải, độ nhạy tốt, độ lặp lại và tính đúng bảo đảm khi thẩm định theo hướng dẫn của AOAC [8]. - Điều kiện sắc ký + Pha tĩnh: Cột Sunfire C18 (4,6 x 250 mm; 5 µm). + Pha động: Hỗn hợp MeOH 60% : H2O = 38 : 62 (v/v). + Tốc độ dòng: 1 ml/phút. + Bước sóng phát hiện: 291 nm. + Thể tích tiêm mẫu: 20 µl. + Chương trình chạy gradient như bảng 3.4. - Phương pháp đã được minh chứng tính khả thi trong xác định hàm lượng AST trong các mẫu thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứ Thổ phục linh đang bán trên thị trường. Kiến nghị Khi tiến hành ứng dụng phương pháp định lượng AST trong chế phẩm có chứa Thổ phục linh, đã khảo sát trên vài chế phẩm có dạng bào chế tương tự ngoài thị trường thì chỉ có một số mẫu có xuất hiện pic của AST, còn lại thì không. Do vậy cần tiếp tục phân tích AST trên một số lượng mẫu chế phẩm lớn hơn và cân nhắc đến hoạt chất khác làm cơ sở xây dựng tiêu chuẩn sản phẩm chứa Thổ phục linh.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Cương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn(2003), “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt nam”, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tập II trang 883-886. 2. Bộ Y Tế ( 2017), Dược điển Việt Nam V, Nhà Xuất Bản Y Học, Hà Nội, Tập II, tr 1344-1345. 3. Mai Hương (2013), “Nghiên cứu hoạt tính sinh học và thành phần hóa học trong rễ cây Thổ phục linh (SMILAX GLABRA ROXB.) của Việt Nam” , Luận văn thạc sĩ chuyên ngành sinh học thực nghiệm, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật. 4. Phạm Thị Hồng Minh, Nguyễn Quyết Tiến, Trần Thị Thanh Hằng, Phạm Hữu Điện (2010), “Nghiên cứu thành phần hóa học củ Thổ phục linh Smilax glabra Roxb. Trồng tại Thái Nguyên“, Tạp chí Khoa học, Trường ĐHSP Hà Nội Tập 55(6), tr.62-70. 5. Lê Ngọc Tân, Đỗ Mạnh Dũng, Phạm Văn Hiển, Nguyễn Trọng Điệp, Đăng Trường Giang, Vũ Bình Dương (2019), “Định lượng đồng thời astilbin và emodin trong bài thuốc GK1 bằng phương pháp HPLC”, Tạp chí Dược học, số 518 – trang 16-21. 6. Nguyễn Quốc Vượng, Vũ Văn Chiến, Nguyễn Thị Thu, Diệp Thị Lan Phương, Phạm Văn Cường, Châu Văn Minh (2013), “Khảo sát hàm lượng astilbin trong rễ cây thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) và bán tổng hợp alphitonin bằng phương pháp đồng phân hóa taxifolin”, Tạp chí Hóa học, T 51(2AB), 208-213. 7. Nguyễn Ngọc Xuân, Đào Văn Phan, Nguyễn Duy Thuần (2000), “Bước đầu nghiên cứu tác dụng hạ đường huyết của thổ phục linh (Smilax Glabra Roxb.) trên chuột nhắt”. Tạp chí Dược học, số 4, 12-16 và số 11, 18-21.

Tiếng Anh

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL 8. AOAC International (2013), “Appendix K: Guidelines for dietary supplements and botanicals”, AOAC Official Methods of Analysis, pp. 3-32. 9. Cai Y, Chen T, Xu Q (2003), “Astilbin suppresses collagen-induced arthritis via the dysfunction of lymphocytes”, Inflammation Research, 52, 334340. 10. Cai Y, Chen T, Xu Q (2003), “Astilbin suppresses delayed-type hypersensitivity by inhibiting lymphocyte migration”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 55, 691-696. 11. Chen T, Li J, Cao J, Xu Q, Komatsu K, Namba T.(1999), “A new flavanone isolated from Rhizoma Smilacis glabrae and the structural requirements of its derivatives for preventing immunological hepatocyte damage”, Planta Medica, 65, 56-59. 12. Chen T, Li, JX, Xu Q. (2000), “Phenylpropanoid glycosides from Smilax glabra”, Phytochemistry, 53, 1051-1055. 13. CHEN You-jun, ZHAO Rui-zhi, Zhao Ying, Lu Chuan-jian, “Simultameous determination of chlorogenic acid, peoniflorin, isofraxidin, ferulaic acid and astilbin in Yinxieling liquid extract by HPLC-PDA”, Chinese Traditional Patent Medicine 2010 Issue 9. 14. Cintra P, Bueno FC, Bueno OC, Malaspina O, Petacci F, Fernandes JB (2005), “Astilbin toxicity to leaf-cutting ant Atta sexdens rubropilosa (Hymenoptera :Formicidae)”, Sociobiology, 45,347-353. 15. Closa D, Torres M, Hotter G, Bioque G, Leon OS, Gelpi E, RoselloCatafau J. (1997), “Prostanoids and free radicals in Cl4C-induced hepatotoxicity in rats: Effect of astilbin”, Prostaglandins Leukotrienes and Essential Fatty Acids, 56, 331-334. 16. Du HZ, He XC, Nong H, Dong LS, Chen HB, Cal J, Li M, “UPLC and HPLC analysis on contents of astilbin and engeletin in dong medicine “sunlgaems” of Guizhou origin by QAMS”, China Journal of Chinese Materia Medica, 01 Aug 2015, 40(15):3115-3120.

17. Fei MJ, Wu XF, Xu Q (2005), “Astilbin inhibits contact DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL hypersensitivity through negative cytokine regulation distinct from cyclosporin A”, Journal of Allergy and Clinical Immunology, 116, 1350-1356. 18. Feng, H.; He, Y.; La, L.; Hou, C.; Song, L.; Yang, Q.; Wu, F.; Liu, W.; Hou, L.; Li, Y.; et al. “The flavonoid-enriched extract from the root of Smilax china L. inhibits inflammatory responses via the TLR-4-mediated signaling pathway. J. Ethnopharmacol. 2020, 256, 112785. 19. Fukunaga T, Miura T, Furuta K, Kato A. (1997), “Hypoglycemic effect of the rhizomes of Smilax glabra in normal and diabetic mice”, Biological & pharmaceutical bulletin, 20, 44-46. 20. Haraguchi H, Ohmi I, Fukuda A, Tamura Y, Mizutani K, Tanaka O, Chou WH. (1997), “Inhibition of aldose reductase and sorbitol accumulation by astilbin and taxifolin dihydroflavonols in Engelhardtia chrysolepis”, Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 61, 651-654. 21. Huang, L.; Deng, J.; Chen, G.; Zhou, M.; Liang, J.; Yan, B.; Shu, J.; Liang, Y.; Huang, H. “The anti-hyperuricemic effect of four astilbin stereoisomers in Smilax glabra on hyperuricemic mice.” J. Ethnopharmacol. 2019, 238, 111777. 22. Jiang JY, Xu Q (2003), “Immunomodulatory activity of the aqueous extract from rhizome of Smilax glabra in the later phase of adjuvant- induced arthritis in rats”, Journal of Ethnopharmacology, 85, 53-59. 23. Jiang JY, Wu FH, Lu JF, Lu ZH, Xu Q (1997), “Anti-inflammatory activity of the aqueous extract from RSG”, Pharmacological Research, 36, 309314. 24. Le Viet Duc, Vu Binh Duong, Trinh Nam Trung, Pham Thi Thanh Huong, “Quantitative study for determination of astilbin in Smilax Glabra by high performance liquid chromatography”, Journal of military pharmaco – medicine No7-2015. 25. LI, Lei; ZHANG, Hong-gui; QIAO, Yan-jiang,”HPLC determination

of astilbin and resveratrol in Smilax grabra Roxb”,Chinese Journal of DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Pharmaceutical Analysis, Volume 27, Number 5, 1 May 2007, pp. 654-656(3). 26. Moulari B, Pellequer Y, Lboutounne H, Girard C, Chaumont JP, Millet J, Muyard F (2006), “Isolation and in vitro antibacterial activity of astilbin, the bioactive flavanone from the leaves of Harungana madagascariensis Lam. ex Poir. (Hypericaceae)”, Journal of Ethnopharmacology, 106, 272- 278. 27. N. Q. Chien und G. Adam (1979),“Ueber die Inhaltsstoffe von Smilax glabra (Roxb.)”, Pharmazie, 34(12), 841-843. 28. PetacciF, Freitas SS, Brunetti IL, Khalil NM (2010), „„Inhibition of peroxidase activity and scavenging of reactive oxygen species by astilbin isolated from Dimophandra mollis (Fabaceae, Caesalpinoideac)“, Biological research, 43, 63-74. 29. Qing-Feng Zhang, Ying-Juan Fu, Zhan-Wang Huang, Xin-Cheng Shangguang, Yu-Xian Guo. “Aqueous Stability of Astilbin: Effects of pH, Temperature, and Solvent”, Journal of Agricultural and Food Chemistry 2013 61 (49), 12085-12091. 30. Sa F, Gao JL, Fung KP, Zheng Y, Lee SMY, Wang YT. (2008), “Anti- proliferative and pro-apoptotic effect of Smilax glabra Roxb. extract on hepatoma cell lines”. Chemico-biological interaction, 171, 1-14. 31. Shuo Xu, Ming-Ying Shag, Guang-Xue Liu, Feng Xu, Xuan Wang, Cheng-Chao Shou and Shao-Qing Cai (2013), „„ Chemical constituents from the Rhizomes of Smilax glabra and Their Antinucrobial Activity“, Molecules, 18, 5265-5287. 32. Tewtrakul S, tharat A, Rattanasuwan P (2006), “Anti-HIV-1 proteaseand HIV-1 integrase activities of Thai medicinal plants known as Hua-KhaoYen”, Journal of Ethnopharmacology, 105, 312-315. 33. Thabrew MI, Mitry RR, Morsy MA, Hughes RD. (2005), “Cytotoxic effects of a decoction of Nigellasativa, Hemidesmus indicus and Smilax glabra on human hepatoma HepG2 cells”, Life sciences, 77, 1319-1330. 34. Tran Van Loc, Tran Van Chien, Tran Duc Quan, Pham Thi Ly, Trinh

Thi Thuy, Tran Van Sung (2007), “ Isolation of dihydrokaempferol 3-O-α-lDẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL rhamnopyranoside and astibin from the Similax glabra roots and their transformation into auronols”, Vietnamese Academy of Science and Technology, 45(3A), 138-141. 35. Zang Qing-Feng, Zhang Zhongrong, Cheung Hon-yeung (2008), “Literature Review of Rhizoma Smilax glabra” Hong Kong Pharmaceutical Journal, 15(2), 68 – 71. 36. Zang Qing-Feng, Zhang Zhongrong, Cheung Hon-yeung (2009), “Antioxydant activity of Rhizoma Smilacis glabrae Extracts and its key constituent-astilbin”, Food Chemistry, 115, 297-303. 37. Vijayalakshimi A and at all (2011), “Antioxydant anticonvulsant activity of asstilbin, a flavonoid glycoside from Rhizome of Smilax China Linn. J”, Pharmacy Research, 4(3), 561-563. 38. Wang J, Zhao Y, Xu Q (2004), “Astilbin prevents concanavalin Ainduced liver injury by reducing TNF-alpha production and T lymphocyte adhesion”, Journal of Pharmacy and Pharmacology, 56, 495-502. 39. Xiangpei Zhao, Licheng Guo, Hongli Teng, “HPLC analysis of astilbin from the rhizome of the traditional zhuang medicine “Gaeulanghauh”(2016), Biotechnology and Medical Science, pp.410-413. 40. Xiao-dan Wang, Min-xin Meng, Ling-bo Gao, Ting Liu, Qiang Xu, Su Zeng (2009), “Permeation of astilbin and taxifolin in CaCo-2 cell and their effects on the P-gp”, Internationnal Journal of Pharmaceutics, 378, 1-8. 41. Xinyu Zhao, Ruyi Chen, Yueyue Shi, Xiaoxi Zhang, Chongmei Tian and Daozong Xia, “Antioxidant and Anti-Inflammatory Activities of Six Flavonoids from Smilax Glabra Roxb”, Molecules,2020 Nov 13;25(22):5295. 42. Xu Q, Wang R, Xu L, Jiang J (1993), “Effects of RSG on cellular and humoral immuneresponses” Chin J Immunol, 9, 39-42. 43. Xu Q, Wu FG, Cao JS, Chen T, Jiang JY, Saiki I, Koda A. (1999), “Astilbin selectively induces dysfunction of liver-infiltrating cells - novel protection from liver damage”, European Journal of Pharmacology, 377, 93-

100. DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL 44. Yan R, Xu Q (2001), “ Astilbin selectively facilitates the apoptosis of interleukin-2-dependent phytohemagglutinin-activated Jurkat cells”, Pharmacological Research, 44, 135-139. 45. Yi YJ, Cao ZZ, Yang DL, Cao Y, Wu YP, Zhao SX. (1998), “Studies on the chemical constituents of Smilax glabra”, Acta Pharmaceutica Sinica, 33, `873-875. 46. Yi YJ, Cao ZZ, Yang WH, Hong WQ, Cao Y, Leng ZK. (1995), “Chemical studies of Smilax glabra (III). Isolation and indentification of smiglanin from smilax glaba”, Acta Pharmaceutica Sinica, 30, 718-720. 47. Yuan JZ, Li W, Koike KZ, Chen YJ, and Nikaido T. (2003), “Phenolic glycosides from rhizomes of smilax glabra”, Heterocycles, 60, 16331637.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL PHỤ LỤC Phụ lục 1: Sắc ký đồ độ phù hợp hệ thống ….................................................PL-2 Phụ lục 2: Chổng phổ mẫu thử với pic trong sắc ký đồ chuẩn ......................PL-8 Phụ lục 3: Độ tinh khiết của thử..................................................................... PL-9 Phụ lục 4. Sắc ký đồ độ đúng ở các mức nồng độ .......................................PL-10 Phụ lục 5. Sắc ký đồ của LOD và LOQ....................................................... PL-19 Phụ lục 6. Sắc ký khảo sát phương pháp chiết .............................................PL-20 Phụ lục 7. Sắc ký độ khảo sát số lần chiết ...................................................PL-22 Phụ lục 8. Bài báo khoa học .........................................................................PL-23

Phụ lục 1: Sắc ký đồ độ phù hợp hệ thống

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Lần 1

Lần 2

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL

Lần 3

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL

Lần 4

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL

Lần 5

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL

Lần 6

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL

Phụ luc 2: Chổng phổ mẫu thử với pic trong sắc ký đồ chuẩn

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Chồng phổ AST

Phụ lục 3: Độ tinh khiết của thử

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Độ tinh khiết của thử T1

Phụ lục 4. Sắc ký đồ độ đúng ở các mức nồng độ

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL 5ppm – 1

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL 5ppm - 2

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL 5ppm – 3

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL 10ppm - 1

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL 10ppm – 2

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL 10ppm - 3

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL 15ppm – 1

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL 15ppm – 2

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL 15ppm - 3

Phụ lục 5. Sắc ký đồ của LOD và LOQ

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL LOD LOQ

Phụ lục 6. Sắc ký đồ khảo sát phương pháp chiết

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL VKN - HL VKN – SA TT - HL TT – SA

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL T1 - HL T1 - SA

Phụ lục 7. Sắc ký đồ khảo sát số lần chiết

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Chiết lần 1 Chiết lần 2 Chiết lần 3

Phụ lục 8. Bài báo khoa học

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL

Determination of astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL using high-performance liquid chromatography Tran Nguyen Ha1, Hoang Thi Thuy Linh1, Vu Ngan Binh1 , Nguyen Thi Thanh Nhai2, Phi Van Toan3, Pham Thi Thanh Ha11 1Hanoi University of Pharmacy, Hanoi, Vietnam 2Hai Duong Central College of Pharmacy, Hai Dương, Vietnam 3Hanoi University of Science and Technology, Hanoi, Vietnam (Received: 03/05/2021; Accepted: 07/06/2021) Abstract Smilax glabra rhizoma has been used in traditional medicine remedies for the treatment of joint pain and inflammation, and recently, has been presented in dietary supplements for supporting arthritis and gout treatment. In the 5th Vietnamese Pharmacopoeia, astilbin was chosen as a chemical marker for the quality control of Smilax glabra as herbal medicine. A high performance liquid chromatographic (HPLC) method was established for the qualitative and quantitative determination of of astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra. Ultrasonic extraction with methanol 60% was used for astilbin extraction from herbal products. HPLC analysis was performed with a C18 column and a mobile phase consisting of methanol and water in gradient mode, with UV detection at 291 nm. The method was validated according to AOAC International’s requirements with high specificity and precision. Keywords: Astilbin, Smilax glabra, dietary supplement, high performance liquid chromatography, HPLC. 1. INTRODUCTION Smilax glabra rhizoma (Smilax glabra Roxb.) is a plant that grows wildly in the mountainous areas in Vietnam. For a long time, in Chinese and Vietnam Traditional Medicines, Smilax glabra rhizoma has been used in many remedies to treat diseases of tendons, parasitic worms, ulcer, detoxification, anti-inflammatory, treatment of leptospirosis, dermatitis, syphilis, brucellosis, acute bacterial dysentery [i]. Modern medicine also shows that Smilax glabra rhizoma’s root contains astilbin (AST), which plays an important role in reducing uric acid in the blood by inhibiting the activity of the enzyme xanthine oxidase and 1Corresponding author: Tel 0904882288 Email: thanhha.pham@gmail.com

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL

increasing the expression of metabolites uric acid secretion [2], and also has the effect of reducing the inflammatory response through inhibition of inflammatory mediators [3]. In addition to the fact that Smilax glabra rhizoma presents in pharmaceuticals, it also presents in dietary supplements which are widely used without a doctor's prescription. Therefore, quantifying AST in dietary supplements to control product quality becomes necessary.

In Vietnam, there are some studies about chemical components [ii iii], biological activity [ii-iii] qualitative and quantitative methods of Smilax glabra rhizoma [iii]. In Vietnamese Pharmacopoeia V, AST has been selected as a marker in both qualitative and quantitative criteria for Smilax glabra rhizoma as a medicinal herb [Error! Bookmark not defined.]. There are some publications of quantitative methods of AST in Smilax glabra rhizoma, which utilized high-performance liquid chromatography (HPLC) [iv , Error! Bookmark not defined.]. However, there has not been any method to determine AST in supplement products from Smilax glabra rhizoma. Therefore, this study aims to develop a quantitative method to determine astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma by HPLC.

2. MATERIALS AND METHODS

2.1. Materials

AST standard was purchased from Biopurify Phytochemicals (China) (98%, Lot.No. PRF9022741); Smilax glabra rhizoma standard material was obtained from National Institute of Drug Quality Control (Vietnam) (SKS: CV 0116035.01); 5 samples of dietarysupplements (code from T1 to T5) which are preparations in the form of hard capsules containing dried medicinal herbs including Nanocare, Khuong Thao Dan, Goutcare, Vien gout Tam Binh, Vuong Thao Kien Cot. Among those samples, the T1 sample was used as the matrix sample to develop the quantitative method.

2.2. Equipment and chemicals

An Agilent 1200 series Gradient HPLC with diode-array detection (DAD), Agilent Chemstation software (Agilent, Us) was used for the separation, qualitative and quantitative determination of AST. Methanol (MeOH) of HPLC grade and other chemicals at analytical grade were obtained form Merck, Germany.

2.3. Methods

Method development: We conducted the extraction solvent selection, and other extraction parameters. Based on some references, we optimized liquid chromatography conditions such as components of mobile phases, and gradient program.

Method validation: We validated the method according to the guideline of AOAC International Appendix K [ v ] with some criteria of selectivity, system suitability,

calibration curve, limit of detection (LOD), limit of quantification (LOQ), accuracy, and DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL precision. To test the applicability of the method, we have quantified AST in several commercially available dietary supplements with Smilax glabra rhizoma as one of the main ingredients. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. Develop the quantitative method of astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma 3.1.1. Investigation of chromatographic conditions We investigated the chromatographic conditions for quantifying AST in Smilax glabra rhizoma referring to Vietnamese Pharmacopoeia V, the conditions were as follow: C18 column (250 × 4.6 mm i.d.; particle size 5 μm), detection wavelength of 291 nm, a flow rate of 1 mL/min, injection volume of 20 μL, a mobile phase of methanol (MeOH) - 1% acetic acid in water (39 : 61, v/v). The results showed that the AST peak could not be separated from the product matrix. We, then, investigated two other mobile phase systems: a) MeOH - 0.1% H3PO4 in water; b) MeOH - H2O with different ratios. Consequently, the mobile phase of MeOH - H2O (38 : 62, v/v) gave the best separation of AST peak, and easily implement in the experiment. However, the other compounds in the matrix had a relatively strong interaction with the column so the total analysis time last relatively long. Based on the retention time of interferences in the matrix, to quickly remove them, the gradient program of MeOH - H2O was as follows: 0 - 23 min (38 : 62, v/v); 23.1 - 32 min (85 : 15, v/v); 32.1 - 37 min (38 : 62, v/v). 3.1.2 Investigate extraction method of astilbin in dietary supplement containing Smilax glabra rhizome T1 sample was firstly extracted follow the method in the Vietnamese Pharmacopoeia V. An amount of sample equivalent to 0.8 g Smilax glabra rhizome was weighed, then it was conducted reflux extraction in 100 mL of 60% MeOH. However, the extraction of astilbin in dietary supplements is considered easier compare to the extraction from Smilax glabra rhizome herbal. Thus, T1 sample was extracted in 60% MeOH with the support of ultrasonic for ten minutes (AST is soluble in this solvent). The amount of AST in the T1 sample extracted by two methods was reported in Figure 1.

1 DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Figure 1. Amount % of astilbin in T1 sample, Smilax glabra rhizoma standard material (VKN), and commercial product (TT) extracted by reflux extraction (HL) and ultrasonic (SA) For the same sample extracted with two methods, the amount of AST extracted by SA tended to be higher than that of HL method. The research of Qing-Feng Zhang’s group (2013) showed that astilbin can be decomposed by temperature from 45°C; at the temperature of 55°C, t1/2 was about 2.5 hours [vi]. Our research group verified this result by an experiment. After 30 minutes of heating the AST standard solution to 50°C, the concentration reduced significantly. In the HL extraction method, the temperature of methanol was about 70°C. Thus, the reason for the low efficiency of HL extraction was thermal decomposition. Therefore, the SA extraction method was selected to extract AST from dietary supplements. Our research group also compared the HL extraction method according to the Vietnamese Pharmacopoeia V and SA extraction method for raw material of Smilax glabra rhizoma. The samples were Smilax glabra rhizoma standard material (VKN sample) obtained from the National Institute of Drug Quality Control (Vietnam) and the commercial one (TT sample). The results (Figure 1) showed that the amount of AST in samples extracted by the SA method was higher than that of the HL method. 3.1.3. Investigate extraction time T1 sample was extracted by the SA method with different ultrasonic times in 5, 10, 20, 30 minutes, then analyzed by HPLC-DAD. The result of ultrasonic for ten minutes increase 7.1% compared to ultrasonic for five minutes. After ultrasonic 20 minutes, the amount of AST barely increased or increased insignificantly compared with the result of ultrasonic ten minutes. Ultrasonic 30 minutes showed a tendency to decrease AST. Although there was no heating process, after 20 minutes of ultrasonic, the temperature of the extraction solution 0.019

0.040 0.035 0.034 Amount (%w/w) 0.010 0.015 0.020 0.025 0.030 0.005 0.000 T1-HL T1-SA

1.091 1.421 0.262

1.60 1.40 Amount (%w/w) 0.60 0.80 1.00 1.20 0.391 0.40 0.20 0.00 VKN-HL VKN-SA TT-HL TT-SA

started to increase, and after 30 minutes of ultrasonic, the temperature of the solution was DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL greater than 50°C. Thus the amount of AST decreased when increasing the ultrasonic time by thermal decomposition. In conclusion, to save time and avoid decomposition of AST, the extraction time with ultrasonic was ten minutes. 3.1.4. Investigate number of extractions Sample T1 was extracted three times, the solvent volumes were 5 mL, 3 mL, and 2 mL, respectively, and each time was extracted by ultrasonic for ten minutes with 60% MeOH. The result of HPLC-DAD analysis showed that after the first extraction, most of AST was extracted, and the amount was 0.0296% (w/w). Extraction solutions of the second and the third time did not show any signal of AST in the chromatogram. Therefore, extraction one time with ten minutes of ultrasonic was the most suitable. Finally, the extraction method was as follows: weighing an amount of sample equivalent to 50 mg Smilax glabra rhizoma, extracting the sample with 5 mL of 60%MeOH for ten minutes, centrifuging the solution, filtering the solution through a 0.45 μm membrane, injecting 20 μl of the extraction solution into HPLC-DAD system. 3.2. Method validation 3.2.1. Specificity Simultaneous analysis of four samples including blank, standard, test sample, and standard addition test sample (spiked sample) obtained the results shown in Figure 2. In the chromatogram of standard solution, AST’s peak appeared at 19.9 min (Figure 2b), and it did not show in Figure 2a (balnk sample). In the chromatograms of test sample (Figure 2c) and spiked sample (Figure 2d), there was a peak appeared at the same retention time (tR) of AST. The corresponding AST peak in the sample and the spiked sample was performed overlaid with the standard AST peak, giving a spectral superposition factor > 0.99. The purity of the AST peaks in the sample and spiked sample also reached > 0.999. Thus the method has specificity for AST.

DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Figure 2. Chromatogram of blank (a), standard solution (b), test sample (c), and standard addition sample (d) 3.2.2. Systematic suitability Analysis of six replication of 10 ppm AST standard solution were recorded the retention time and peak area. The results showed that the relative standard deviation (RSD) of the retention time is 0.7% (< 2%), of the peak area is 1.8% (< 2%). These figures meet the requirements of AOAC 2013. 3.2.3. Calibration curve A series of AST standard solutions with actual concentrations of 1.077 ppm, 2.152 ppm, 5.380 ppm, 10.76 ppm; 16.14 ppm, and 21.52 ppm were prepared, then analyzed with the selected conditions. The regression equation (y = 30.513x - 30.663) showed a good correlation between the peak area and the corresponding analyte concentration with the correlation coefficient r = 0.997, which meets the requirements of AOAC 2013. 3.2.3. Repeatability T1 sample was weighed six times with a mass of about 0.125 g. These samples were extracted ten minutes with 60% MeOH, then analyzed. We conducted this experiment twice with different analysts on different days to calculate the average. On the first day, the average amount of AST was 0.0353% w/w, RSD 1.50%. On the second day, the average amount of AST was 0.0361% w/w, RSD 1.37%. The repeatability was acceptable with RSD for the amount of AST was 1.83%, the average amount of AST was 0.0357% w/w. 3.2.4. Accuracy The accuracy of the method was determined by the following experiment: Adding an amount of AST standard to T1 sample such that the amount of AST in the extraction solution has a concentration range of 5 to 20 ppm; at each concentration, performing three replications.

The concentration of AST in the samples was determined from the calibration curve. The DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL results were presented in Table 1. The recovery was from 103.01% - 106.45%; RSD < 8% meets AOAC 2013 regulations with a content of 0.01% (RSD < 6% at 0.1%, w/w). Table 1. Result of recovery experiments Sample

Addition concentration (ppm) Recovery concentration (ppm) Recovery (%) Average RSD (%)

(%)

1 2.152 2.229 103.61 103.01 1.35 2 2.152 2.327 108.12 3 2.152 2.094 97.29 4 7.532 7.738 102.73 106.45 1.67 5 7.532 8.075 107.21 6 7.532 8.241 109.41 7 12.91 13.31 103.04 105.80 2.10 8 12.91 13.73 106.33 9 12.91 13.95 108.04 3.2.5. Limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ)

AST standard solution was prepared at a concentration of 0.083 ppm. The ratio of AST’s signal S and noise N (S/N) was 3.5. Thus, 0.83 ppm can be accepted as the LOD, and 0.25 ppm can be the LOQ.

So far, the developed method was validated fully according to AOAC 2013, and suitable to quantitatively determine AST in Smilax glabra rhizoma dietary supplements.

3.3. Feasibility of the method

To test the feasibility of the developed method, the above procedure was applied for the quantification of AST in several dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma on the market. The results were presented in Table 2. The results showed that the AST content has been determined in 2 samples of the Smilax glabra rhizoma dietary supplements. In the remaining four samples, there was no peak corresponding to the retention time of AST. It means that other ingredients in the products do not have peaks that affect the quantification of AST. This proves the feasibility of the method when applied to real samples.

Some products containing Smilax glabra rhizoma did not show the peak of AST, although these products were assumed to have a high content in tablets. Due to the limited number of samples applied, it is not possible to comment on product quality, but this can be a suggestion to cooperate with manufacturers in testing input materials for production according to Vietnamese Pharmacopoeia V, and controlling the production process to avoid decomposition of active ingredients.

Table 2. Amount of AST in some Smilax glabra rhizoma dietary supplements DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Sample Mass of a tablet (mg)

Concentration of AST in extraction solution (μg/mL)

Amount of AST in a tablet (mg/tablet)

T1 100 4,639 0.1819 T2 100 4,212 0.1630 T3 330 ND (*) ND (*) T4 650 ND (*) ND (*) T5 100 ND (*) ND (*) T6 100 ND (*) ND (*) (*) ND - Not detected (< LOD 0.08 μg/mL in extraction solution)

4. CONCLUSION

The study has developed a method for the quantification of astilbin in dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma by high-performance liquid chromatography with a UV detector at 291 nm and simple mobile phases. The method of sample treatment by ultrasonic extraction with 60% methanol gives a high recovery, acceptable separation in the moderate analysis time, high sensitivity, repeatability, and accuracy meeting the AOAC guidelines [9]. The method has proven feasibility in determining AST content in commercial dietary supplements containing Smilax glabra rhizoma.

REFERENCES

[1]. D. H. Bich, D. Q. Chung, B. X. Cương, N. Thuong Dong, D. T. Dam, P. V. Hien, V. N.

Lo, P. D. Mai, P. K. Man, D. T. Nhu, N. Tap, and T. Toan, “Medicinal plants and animals in Vietnam,” Hanoi: Science and Technology Publisher, vol.2, pp. 883-886, 2003.

[2]. L. Huang, J. Deng, G. Chen, M. Zhou, J. Liang, B. Yan, J. Shu, Y. Liang, and H. Huang,

“The anti-hyperuricemic effect of four astilbin stereoisomers in Smilax glabra on hyperuricemic mice,” Journal of Ethnopharmacology, vol. 238: 111777, 2019. [3]. C-L. Lu, Y-F. Zhu, M-M. Hu, D-M. Wang, X-J Xu, C-J. Lu, and W. Zhu, "Optimization of astilbin extraction from the rhizome of Smilax glabra, and evaluation of its antiinflammatory effect and probable underlying mechanism in lipi-polysaccharide-induced

RAW264.7 macrophages", Molecules, vol. 20, no. 1, pp. 625-644, 2015. [4]. M. Huong, “Research on biological activities and chemical compositions in the roots of

Smilax glabra rhizoma (SMILAX GLABRA ROXB.) in Vietnam, ” Master's Thesis in

Experimental Biology, Institute of Ecology and Biological Resources, 2013.

[5]. P. T. H. Minh, N. Q. Tien, T. T. T. Hang, and P. H. Dien, “Research on the chemical DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL composition of the Smilax glabra Roxb. grown in Thai Nguyen,” Journal of Science, Hanoi National University of Education, vol 55, no. 6, pp. 62-70, 2010. [6]. T. T. T. Van, V. V. Chien, P. T. Hang, P. V. Cuong, N. Q. Vuong, Antioxidant activity of extracts and astilbin from the root of Smilax glabra of Vietnam, Malaysian Journal of Chemistry, 17, 12-19, 2015. [7]. Pharmacopoeia Council - Ministry of Health, Vietnam Pharmacopoeia V, Medicine Publisher, vol. II, pp. 1344-1345, 2017. [8]. L. V. Duc, V. B. Duong, T. N. Trung, and P. T. T. Huong, “Quantitative study for determination of astilbin in Smilax glabra by high performance liquid chromatography,” Journal of Military Pharmaco-Medicine, vol. 7, pp. 8-12, 2015. [9]. AOAC International, “Appendix K: Guidelines for dietary supplements and botanicals”, AOAC Official Methods of Analysis, pp. 3-32, 2013. [10]. Qing-Feng Zhang, Ying-Juan Fu, Zhan-Wang Huang, Xin-Cheng Shangguang, Yu-Xian Guo, "Aqueous Stability of Astilbin: Effects of pH, Temperature, and Solvent", Journal of Agricultural and Food Chemistry, 61 (49), 12085-12091, 2013. Xây dựng phương pháp định lượng Astilbin trong thực phẩm bảo vệ sức khỏe có chứa thổ phục linh bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Trần Nguyên Hà1, Hoàng Thị Thuỳ Linh1, Vũ Ngân Bình1 , Nguyễn Thị Thanh Nhài2, Phí Văn Toàn3, Phạm Thị Thanh Hà1, 2 1Trường Đại học Dược Hà Nội, Việt Nam 2Trường Cao đẳng Dược Trung ương Hải Dương, Hải Dương, Việt Nam 3Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, Hà Nội, Việt Nam Tóm tắt Thổ phục linh (Smilax glabra Roxb.) là một dược liệu được sử dụng trong nhiều bài thuốc cổ truyền về gân cốt, chống viêm, và gần đây cũng được sử dụng trong các thực phẩm bảo vệ sức khoẻ hỗ trợ điều trị viêm khớp và điều trị gout. Để kiểm soát chất lượng dược liệu Thổ phục linh, astilbin là hoạt chất được lựa chọn làm chất đánh dấu trong Dược điển Việt Nam V. Phương pháp định tính và định lượng astilibin trong sản phẩm bảo vệ sức khỏe chứa

Thổ phục linh sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã được xây dựng trong nghiên cứu này. DẠY KÈM QUY NHƠN OFFICIAL Astilbin trong chế phẩm được chiết siêu âm bằng methanol 60%, phương pháp định lượng HPLC sử dụng cột C18, pha động gồm methanol và nước theo chế độ gradient, phát hiện với UV tại bước sóng 291 nm. Các tiêu chí thẩm định phương pháp được thực hiện đầy đủ theo hướng dẫn của AOAC 2013 cho kết quả tin cậy. Từ khóa: Astilbin, Smilax glabra, Thổ phục linh, thực phẩm bảo vệ sức khỏe, sắc ký lỏng hiệu năng cao, HPLC.