1.2.2. Nghiên cứu nước ngoài

− Cột sắc ký: Supelco LC-NH2 250x4.6mm, 5µ − Pha động: acetonitrile:nước tỉ lệ 10:30 − Tốc độ dòng: 1.5 mL/phút − Nhiệt độ buồng cột: 30oC − Đầu dò: PDA 2996 ở bước sóng 210nm

1.2.2. Nghiên cứu nước ngoài

1.2.2.1. Các nghiên cứu về phương pháp tách chiết và tinh chế các hợp chất steviol glycoside

Các kỹ thuật được sử dụng để thu được steviol glycoside có thể phân loại vào những hạng mục khác nhau, như dựa trên chiết dung môi [61, 62], hấp phụ sắc ký [63-66],trao đổi ion [67-69], kết tủa chọn lọc [70], phương pháp màng [67, 68, 71] và các chất lỏng siêu tới hạn

[72] .

Hầu hết các quy trình chế biến cỏ ngọt được tiến hành ở Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Brazil hoặc Paraguay. Quy trình chiết steviol glycoside từ lá cỏ ngọt phổ biến nhất bao gồm các bước sau:

− Ngâm lá trong nược ấm/nóng để hòa tan steviol glycoside − Lọc với chất trợ lọc, lấy dịch lọc − Loại dung môi bằng bay hơi chân không − Sử dụng nhựa trao đổi để thu được các phân đoạn steviol glycoside có nồng độ cao − Tinh chế trao đổi ion (đôi khi) − Bay hơi và sấy phun hoặc, ít phổ biến hơn, kết tinh để tạo bột/tinh thể.

Một số chế biến thứ cấp được thực hiện tại Nhật để cải thiện chất lượng hương vị. Quy trình trên giống với quy trình chiết đường thô từ mía[26] .

Phương pháp chiết dung môi

Dung môi hữu cơ thường được sử dụng để chiết xuất hợp chất tự nhiên từ thực vật, do tính chọn lọc của chúng đối với các thành phần hữu cơ. Các dung môi hòa lẫn vào nước, methanol, chloroform, n-butanol, ethanol và rượu béo đã được sử dụng để chiết xuất stevioside từ lá cỏ ngọt (Fumio 1980[73], Jackson và cộng sự, 2006[74]; Pol và Shigeji 29

1980[75], Tadaaki 1976[76], Tadashi và Masato 1995[77], Toyoshige và Usei 2002[78]). Stevioside và rebaudioside A được tinh chế thêm bởi quá trình kết tinh và kết tinh lại từ dung môi. Tuy nhiên, nhược điểm chính của các phương pháp này là sử dụng các hóa chất độc hại có hại cho sức khoẻ. Vì vậy, đa số các nghiên cứu sử dụng nước như một dung môi để chiết. Việc sử dụng nước và methanol làm phương tiện chiết xuất trong điều kiện áp suất được nghiên cứu bởi Pol (2007)[75] .

Trong một nghiên cứu, Chhaya[79] đã sử dụng cách tiếp cận có hệ thống để đánh giá các điều kiện tối ưu cho việc chiết xuất stevioside từ lá cỏ ngọt bằng phương pháp phản ứng bề mặt. Các điều kiện tối ưu để chiết là:

− Nhiệt độ 78 ° C − Thời gian đun nóng 56 phút − Tỉ lệ lá và nước 1:14 (w / v).

Dưới điều kiện này, chiết xuất stevioside là 10,5g / 100g lá khô Stevia. Cần lưu ý rằng các điều kiện trên liên quan đến giống cỏ ngọt của Ấn Độ, cần khảo sát lại khi sử dụng giống cỏ ngọt khác.

Phương pháp chiết siêu âm

Chiết stevioside bằng phương pháp này đầu tiên do Jaunak và cộng sự (2009). Họ đã tiến hành chiết bột lá cỏ ngọt sử dụng các dung môi khác nhau (nước, methanol, ethanol, hỗn hợp nhị phân của methanol-nước và ethanol-nước) trong một bồn siêu âm ở 35°C trong 30 phút. Dịch chiết được lọc và sấy khô thành bột (ở 50°C). Hàm lượng 4,2% đối với stevioside và 2,0% đối với rebaudioside A đối với hỗn hợp methanol-nước (80: 20) gần như tương đương với kết quả thu được bằng phương pháp thông thường (sử dụng methanol-nước làm dung môi với thời gian 12 giờ), tức là 6,04% stevioside và 1,2% rebaudioside A[26] .

Bằng sáng chế Trung Quốc (Ruihua và cộng sự, 2010)[80] cũng mô tả sự hỗ trợ siêu âm trong quá trình chiết xuất lá cỏ ngọt. Bột stevioside 85-98% được sản xuất bằng cách sử dụng các phương pháp khác nhau (keo tụ, lọc, hấp thụ, khử màu, cô đặc và sấy phun) sau khi chiết siêu âm.

30

Phương pháp chiết bằng vi sóng

Một số lợi thế chiết xuất bằng vi sóng (MAE) giúp nó cạnh tranh với các quy trình thông thường khác. Đây là những phương pháp tách nhanh hơn, giảm sử dụng dung môi và tinh chế nhanh hơn. MAE của stevioside và rebaudioside A lần đầu tiên được báo cáo bởi Jaitak et al. (2009)[81]. Trong nghiên cứu này, việc chiết xuất lá cỏ ngọt bằng nước, methanol, ethanol và hỗn hợp nhị phân methanol-nước và etanol-nước được tiến hành với sự hiện diện của lò vi sóng ở các mức công suất khác nhau trong khoảng từ 20 đến 160W với thời gian chiết 30 giây đến 5 giây ở nhiệt độ 10-90°C. Kết luận rằng sản lượng stevioside (8,64%) và rebaudioside A (2,34%) cao hơn so với phương pháp truyền thống (6,54% và 1,20%). Công suất 80W, 50°C và thời gian 1 phút cho kết quả tối ưu. Dung môi nước:methanol (80:20) là môi trường chiết tốt nhất với sự hỗ trợ vi sóng mức tới mức cao nhất.

Phương pháp tinh chế bằng các chất tạo phức:

Để khắc phục việc sử dụng các hoá chất độc hại và thiết bị chậm, chuyên dụng và đắt tiền như sắc ký và trao đổi ion, các chất tạo phức đôi khi được sử dụng để loại các thành phần không mong muốn / tạo thành phức hợp với các chất này, dẫn đến sự loại bỏ dễ dàng hơn.

Kumar (1986)[70] đã đề xuất một quy trình chiết stevioside có sử dụng chất tạo phức. Trong đó lá đã được nghiền nhỏ thành kích thước mong muốn và được chiết xuất với nước nóng ở 60-80°C trong 2-5 giờ. Dịch chiết nước được cho tạo phức với axit carboxylic, chẳng hạn như axit citric, để loại bỏ vật liệu kim loại, protein hoặc màu tạo thành ở khoảng pH 2-4. Hỗn hợp được khuấy khoảng 1-2 giờ ở nhiệt độ 30-80°C và lọc qua celite (chất trợ lọc). Độ pH của dung dịch kết quả tăng lên 10-13 bằng cách sử dụng canxi oxit hoặc canxi hydroxit, được đun nóng trong khoảng từ 35-80oC trong 1-2 giờ và làm lạnh đến nhiệt độ phòng với sự khuấy chậm. Dung dịch này được lọc lại bằng diatomit để loại bỏ các prôtêin, chất màu,… Các dung dịch đã được khử màu sau đó được trung hòa bằng axit cacboxylic hữu cơ như axit citric. Dịch lọc chiết với dung môi như n-butanol bão hòa. Lớp nước sau đó được làm lạnh đến 5-12°C trong 8-14 giờ để lấy tinh thể stevioside đem lọc và sấy khô. Hiệu suất của quá trình là 7.5%.

31

Năm 1990, Giovanetto[68] trong một nghiên cứu về quy trình chiết cỏ ngọt đã sử dụng canxi hydroxit cho vào dịch chiết nước để tạo tủa loại bỏ các hợp chất không mong muốn.

Deji (2009) đã phát minh ra một phương pháp cải tiến để chiết xuất stevioside bao gồm các bước sau:

− Chiết hoàn lưu với nước − Keo tụ bằng đất sét biến tính − Vi lọc − Hấp thụ bằng nhựa ADS-4 và -7 − Dịch giải ly được cô đặc bằng cô quay chân không

Những thuận lợi của quá trình này là: tốc độ nhanh và độ tinh khiết cao (lên đến 90%); các vật liệu nhạy nhiệt không bị phá hủy; Thông lượng cao, và có thể được thực hiện một quá trình liên tục.

Weiping và Zhou (1999)[82] mô tả một quy trình để chiết xuất các STEVIOL GLYCOSIDE:

− Chiết cỏ ngọt trong nước nóng hoặc dung dịch ethanol trong 1-3 giờ − Dịch chiết được trộn với một dung dịch bão hoà của canxi hoặc nhôm hydroxyd và trộn đều trong 1-3h, kết tủa các chất không mong muốn − Dịch lọc cho qua một cột hấp phụ trung tính, nó hấp thụ các glycosid − Giải ly cột bằng dung dịch ethanol để làm sạch các glycosid − Dịch giải ly bằng ethanol được cho qua cột kiềm thứ hai, nơi các chất không mong muốn được hấp phụ, thu được dung dịch ethanol với glycosid tinh khiết. − Sau đó, dung dịch được sấy phun hoặc cô quay bằng chân không ở 50°C và thu được bột rắn, khoảng 80% độ tinh khiết.

Abelyan và cộng sự (2010)[83] đã phát minh ra một phương pháp để trích xuất stevioside và rebaudioside A độ tinh khiết cao từ nhà máy:

− Chiết cỏ ngọt với nước ở 50-60 ° C trong khoảng 1-6 giờ. − Tăng hiệu suất chiết bằng cách bổ sung enzym pectinase (2g / L)

32

− Dịch lọc được kết tủa bằng canxi hydroxit ở khoảng 50°C trong khoảng 1 giờ đến pH khoảng 10,0 và làm mát đến nhiệt độ môi trường xung quanh − Keo tụ dung dịch với bentonit (2-3 g / l) − Dịch lọc trộn với ethanol ở khoảng 50°C trong khoảng 30 phút); Tủa đã được loại ra và bột chứa khoảng 84% rebaudioside A − Dịch thu được cho qua một cột nhựa trao đổi ion sau khi đó bay hơi ethanol, cô đặc và làm khô. Cắn thu được chứa stevioside tinh khiết 93%.

Một loạt các bằng sáng chế của Nhật Bản có sẵn để sử dụng các chất tạo phức khác nhau để tinh chế chiết xuất cỏ ngọt. Một số trong đó bao gồm việc sử dụng thiếc chloride, thiếc sulfate, axit stannic,…, các muối Ca và Fe khác nhau (Shinichi và cộng sự, 1980[84]), và sử dụng CaCl2 và Ca(OH)2 (Kotaro Và Tokuo 1987[85], Taku và Yukio 1983[86], Yukio và cộng sự, 1983[87]).

Phương pháp trao đổi ion:

Trao đổi ion là một quá trình trong đó tạp chất tích điện âm và nó được loại bỏ khỏi dòng nước bằng các chất nhựa tích điện dương[88]. Năm 1973, Persinos[89] đã nộp một bằng sáng chế về sản xuất stevioside từ nhà máy Stevia. Cây và lá đã được sấy khô và nghiền nhỏ trộn với canxi cacbonat và nước và hỗn hợp được giữ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 20 giờ. Sau đó, chất cặn được lọc, sau đó cô quay loại bớt dung môi và quy trình được lặp lại hai lần. Dịch lọc được trộn với Amberlite IR-120 nhựa trao đổi ion. Chất kết tủa gồm nhựa đã được lọc. Dịch lọc được khử ion bằng cách cho qua hai cột nhựa trao đổi ion (Amberlite IR-120(+) và Duolite A4 (-)). Tập trung dịch qua cột để qua đêm ở 50°C. Cô dịch thu được cắn, sau đó hòa tan trong methanol và làm lạnh đến 5°C để có được tinh thể stevioside. Tăng độ tinh khiết bằng cách kết tinh lại nhiều lần.

Năm 1987, Adduci[90] báo cáo cách chiết stevioside bằng ba bước chính: trích nước nóng và sự khử màu bằng điện phân và sau đó trao đổi ion. Độ tinh khiết của stevioside đạt được 70-80% và năng suất khoảng 10%. Nhiệt độ chiết nước là 90-100°C. Điện phân được thực hiện bằng cách sử dụng dòng điện dòng 30 Ampe trong 2 giờ bằng cách bổ sung 0,02M HCl / lít dịch chiết. Lọc hỗn hợp và điện phân lần thứ hai được thực hiện trong khoảng 20-30 phút theo các điều kiện hoạt động ở trên. Sau khi lọc thu được dung dịch có màu vàng, sau đó cho dịch qua một cột nhựa trao đổi ion hỗn hợp bao gồm

33

Amberlite MB-1 (Amberlite IR-120 (+) và Amberlite IRA-401 (-)). Trong dịch đi ra, có một dung dịch trong suốt với độ dẫn điện nhỏ hơn 50 S/m. Cắn thu được sau khi cô quay dung dịch đó không có vị hậu, có thể kết luận đó là rebaudioside A.

Bằng sáng chế Hàn Quốc[91] có một phương pháp trong đó dịch chiết được cho qua cột nhựa trao đổi ion tích điện dương (Diaion SKIB) và sau đó cho qua cột nhựa tích điện âm (Amberlite IRA-904). Trong phương pháp này, thu được một hỗn hợp các steviol glycoside. Một quy trình được cấp bằng sáng chế của cùng một công ty bao gồm việc xử lý dịch chiết nước với canxi clorua và sau đó đi qua cột nhựa phân cực vừa Amberlite XAD-7. Giải ly cột bằng methanol và được tinh chế bằng sắc ký cột. Stevioside được tinh chế tiếp bằng cách kết tinh với methanol. Tuy nhiên, trong phương pháp này, cả hóa chất, canxi clorua và methanol, đều độc hại. Phép sắc ký cột cũng không khả thi về mặt thương mại. Trong một bằng sáng chế khác[92], chiết xuất nước đã được xử lý bằng nhựa anion thì stevioside thu được có độ tinh khiết thấp. Trong các bằng sáng chế khác ở Nhật Bản, tinh chế stevioside bằng nhựa trao đổi ion không cần thiết (Toyoshige 1984).

Năm 1990, Giovanetto[68] công bố một phương pháp, trong đó dịch chiết nước được ly tâm và sau đó xử lý bằng canxi hydroxit. Dịch đã được lọc tủa được tinh chế bằng cách sử dụng nhựa trao đổi ion tích điện âm (Dowex 50 W và Rohm và Haas IRA 120,…) và ion tích điện dương (Dowex WGR, Dowex MWA-1,Rohm và Haas IR4B,…). Có thể lặp lại nhiều lần, sau đó cô dung dịch thành cắn, chứa 75% stevioside.

Năm 1999, Payzant[69] đề xuất một quy trình trao đổi ion hai bước để làm sạch steviol glycoside từ lá cỏ ngọt. Tính năng nổi bật của phương pháp này là tách từng steviol glycoside riêng ra khỏi hỗn hợp của chúng. Trong bước đầu tiên của phương pháp này, chiết lá cỏ ngọt bằng nước. Sau khi chiết, dịch lọc được loại tạp bằng cách tủa với Ca(OH)2. Tiếp theo, lọc loại tủa rồi cho dịch lọc qua một loạt các loại nhựa trao đổi ion để loại bỏ các axit hữu cơ, muối vô cơ, các chất phenol, protein,… Dung dịch thu được có chứa hỗn hợp 70% steviol glycoside. Thu hồi dung môi, thu được bột khô được hòa tan trong nước và được đưa đi qua một lớp nhựa Amberlite XAD-7 (nhựa không phân cực). Steviol glycoside và tạp dầu gây ra vị đắng được hấp thụ trong lớp nhựa, các glycoside không ngọt và tạp chất carbohydrate không bị hấp phụ. Cột được giải ly bằng dung dịch methanol, sau đó cô quay thu được 95% steviol glycoside. Cắn hòa tan vừa 34

đủ với methanol khan, sau đó làm mát thu được kết tinh stevioside, lọc lấy tính thể. Dịch lọc được đun nóng và làm mát sau đó để cho kết tủa thu được rebaudioside A. Chất này có thể tinh chế tiếp bằng cách hòa tan với methanol và đưa nó vào một loạt các bước đun nóng và làm mát để độ tinh khiết cuối cùng của rebaudioside A lên tới 95%. Quy trình có ưu điểm:

− Quy trình đơn giản − Ứng dụng được trong công nghiệp − Sản phẩm thu được có độ tinh khiết cao

35