Hình 1.5. Quy trình chiết cỏ ngọt theo John Donald Payzant

Giải ly cột bằng MeOH Dịch chiết nước Tủa với Ca(OH)2

Lọc loại tủa

Dịch lọc

Cô bớt dịch lọc

Cột trao đổi ion

Cột nhựa phân cực vừa >70% hỗn hợp steviol glycoside

Cô bớt dung môi dịch giải ly

Thu được rebaudioside tinh khiết trên 90% >90% hỗn hợp steviol glycoside

Làm lạnh để tủa Lọc tủa kết tinh lại nhiều lần thu được stevioside 95%

Dịch lọc

Kết tủa − Cô bớt dịch lọc − Thêm một ít nước

Hình 1.5. Quy trình chiết cỏ ngọt theo John Donald Payzant

Năm 2006, Kumar[93] đã phát triển một quy trình sản xuất stevioside từ lá cỏ ngọt. Trong quá trình này, bột nghiền bột của lá Stevia được chiết xuất với nước ở 50-120°C trong 0.25-4 giờ dưới áp suất 1-8 bar. Chiết xuất sau đó được trộn với calcium hydroxide đến pH 9.2 và xuất hiện tủa. Sau đó, lọc tủa và dịch lọc được cho qua cột nhựa trao đổi cation 36

mạnh, tiếp theo là một nhựa trao đổi anion yếu. Dịch thu được là hỗn hợp steviol glycoside hàm lượng 65%.

Năm 2011, Yang và cộng sự[94] đã phát triển một quy trình để thu hồi 99% rebaudioside A tinh khiết 99% từ lá cỏ ngọt. Lá được chiết bằng nước hoặc ethanol hoặc một hỗn hợp của hai ở 50-80°C trong khoảng 30 phút dưới áp suất cao trong khoảng 200-3000MPa. Dịch chiết được cô đặc bằng cách bốc hơi ở nhiệt độ cao, lọc và đi qua một lớp nhựa phân cực chọn lọc, steviol glycoside bị hấp thụ. Cột được giải ly bằng hỗn hợp ethanolnước thu được hỗn hợp steviol glycoside và rebaudioside A được tinh chế bằng cách kết tinh dung dịch giải ly thu được , thu được rebaudioside A tinh khiết 85%. Sau đó tiếp tục kết tinh lại nhiều lần cho đến khi rebaudioside A đạt độ tinh khiết 99%.

Một phương pháp để đạt được độ tinh khiết cao stevioside và rebaudioside A đã được đề xuất bởi Purakayastha (2010)[95] và Magomet (2011)[96]. Trong phương pháp này, lá cây đã được nung nóng ở 45-75°C bằng cách sử dụng nước (tỉ lệ lá:nước từ 1kg: 10 L) trong khoảng 1-6 giờ. Dịch chiết lọc được làm nóng đến khoảng 50°C trong 0.5-1.0 giờ bằng cách bổ sung canxi hydroxyd lên pH khoảng 10, lọc loại tủa và dung dịch được trung hòa bằng dung dịch sắt clorua trong khoảng 10-15 phút. Dịch thu được cho qua cột celite (một cột nhựa) để khử ion, và qua ba cột Amberlite để khử màu. Dung dịch được sấy phun và chứa khoảng 65% stevioside và 25% rebaudioside A. Cắn hòa tan trong methanol (ở 20-25°C trong 0.5-1.0 giờ có khuấy, tỉ lệ cắn:dung môi khoảng 1:5 (g:mL)). Làm lạnh để kết tinh, các tinh thể thu được sau lọc và sấy khô, đem phân tích khoảng 90% stevioside. Dung dịch lọc còn lại được cho bay hết methanol. Cắn thu được hòa tan trong ethanol (tỉ lệ 1:5 (g:mL), ở 40-45 ° C trong khoảng 30 phút, khuấy nhẹ). Chất kết tủa được lọc và sấy đạt được khoảng 90% rebaudioside A.

37

Phương pháp tính chế bằng sắc kí và hấp phụ:

Lựa chọn tách một chất từ chất lỏng thường có thể dùng phương pháp hấp phụ. Các hợp chất có tính đặc thù cao có thể được tách một cách chọn lọc bằng các quá trình sắc ký. Sắc ký là một phương pháp phổ biến để phân tách và phân tích các hỗn hợp phức tạp.

Năm 2011, Chiang[97] và cộng sự đề xuất phương pháp tách rebaudioside A bằng sắc ký trong đó hỗn hợp steviol glycoside chứa stevioside (38%), rebaudioside A (42%) và các glycoside khác (20%) được hòa tan trong hỗn hợp nước-ethanol. Dung dịch được đưa qua cột nhựa với tỷ lệ cụ thể. Dịch giải ly chứa 69% rebaudioside A, 31% stevioside và các glycoside khác; 93% tổng số rebaudioside A nạp vào cột đã được tinh chế. Sử dụng cột phát triển, một dòng có chứa stevioside và rebaudioside A cũng có thể được phân chia.

Một bằng sáng chế của Hoa Kỳ (Yang và các cộng sự, 2011)[94] đã tiết lộ một quy trình trong đó rebaudioside A trong cỏ ngọt bằng cách sử dụng nhựa phân cực trong sắc ký cột silica gel và sử dụng dung môi thích hợp. Sau đó, thu được tinh thể rebaudioside A.

Năm 2012, Liu và cộng sự[98] đề xuất một phương pháp tách sắc ký giữa hai STEVIOL GLYCOSIDE, stevioside và rebaudioside A. Những ưu điểm của phương pháp này là nó đơn giản, nhanh và hiệu quả về chi phí. Việc tách và tách cả hai glycosides được thực hiện trong một cột đơn và một bước. Một hỗn hợp gồm 41% stevioside và 35,8% rebaudioside A hòa tan trong dung dịch ethanol được đưa lên trên cột sắc ký đặc biệt bao gồm một thành phần đặc biệt của nhựa polyme polymetacrylate / DVB có chức năng chịu áp suất cao đến khoảng 1500 psi. Cột được rửa bằng áp suất trung bình (dưới 300psi) với dung môi methanolacetone với tốc độ 4-5 mL / phút. Các phân đoạn của stevioside và rebaudioside A được thu thập lại và sau đó kết tinh. Lọc tính thể thu được stevioside và rebaudioside có độ tinh khiết 98% độ tinh khiết với mỗi chất.

Sự hấp phụ chọn lọc trên zeolit X và A đã được nghiên cứu với cỏ ngọt và được báo cáo bởi Moraes và Machado (2001)[99]. Nghiên cứu này kết luận rằng CaX Zeolite có hiệu quả hơn trong việc làm rõ sự trích xuất của Stevia trong nước nóng. Cả zeolit bột và hạt đều gần như hiệu quả. Các điều kiện điều trị tối ưu là zeolit 40% (g/g), thời gian tiếp xúc 60 phút ở 30°C. Thu được độ tinh khiết 70%. Zeolite tái sử dụng cũng cho thấy hiệu suất tương đương. Các tác giả cũng tiến hành thí nghiệm cột liên tục cho thấy sử dụng

38

tốc độ dòng chảy 30 L/ngày, có thể tinh chế cỏ ngọt bằng cách sử dụng zeolite lên đến khoảng 60% trong 11 giờ.

Năm 2009, Rajab [100] đã phát triển một quy trình gồm hai bước để làm trong và tinh chế dịch chiết. Lá cỏ ngọt khô được đun sôi với nước (tỷ lệ lá:nước 1 kg: 5 L) trong 3 giờ và lọc dịch chiết xuất. Tiếp theo, dịch chiết được xử lý bằng 10% than hoạt tính trong 20 phút. Dịch chiết được và than hoạt tính được trộn với nước sôi trong 10 phút và lọc để thu hồi stevioside. Lặp lại quá trình này ba lần. Trong quá trình này, một số lượng chlorophyll, phenol và carotenoid đã được loại bỏ. Trong bước tiếp theo, dịch chiết vàng được xử lý với 5% celite và khuấy trong 20 phút. Ly tâm dịch chiết không màu ở tốc độ 12.000 vòng / phút trong vòng 15 phút và dung dịch nước sạch được thu hồi và lưu trữ. Dịch thu được đem sấy khô (nhiệt độ đầu vào 180°C, nhiệt độ đầu ra 95°C, áp suất 500 psi) để có bột màu trắng. Nồng độ cuối cùng của Stevioside là 11,6%.

Năm 2002, Rongfu Shi[101] và các đồng nghiệp đã tổng hợp các chất hấp phụ polyme bằng cách đưa vào nhóm amoni thành vật liệu hấp phụ nhựa thông thường tinh chế các hợp chất steviol glycoside. Kết quả của thí nghiệm đã kết luận rằng khả năng hấp phụ các hợp chất steviol glycoside giảm và hiệu quả khử màu tăng vì nồng độ của nhóm amoni bậc bốn trong chất hấp phụ tăng. Cơ chế hấp phụ và khử màu cũng đã được đề xuất[101] .

Một số phương pháp khác

Năm 1997, Liu[102] trích stevioside từ lá cỏ ngọt khô với methanol nóng. Họ cũng nghiên cứu dịch chiết của steviol glycoside, như rebaudioside A, rebaudioside C, và dulcoside A bằng cách chiết xuất chất lỏng dưới tới hạn (Sub FE). Phương pháp đơn giản Sub FE hiệu suất nhỏ được phát triển và hiệu xuất hơn 88% dịch chiết thu được bằng cách sử dụng methanol.

Một số nghiền cứu tinh chế steviol glycoside bằng công nghệ màng, có thể được sử dụng ở nhiệt độ phòng dẫn đến không có sự thay đổi pha; không có hóa chất được thêm vào; nó rất dễ dàng để mở rộng quy mô [103]. Như vậy, công nghệ đã được sử dụng rộng rãi để xử lý nước táo, nước mosambi nước ép lựu, nước ép cà rốt…[103]. Có khá nhiều bằng sáng chế sử dụng công nghệ màng. Năm 1990, Fuh và Chiang sử dụng muối vô cơ và màng siêu lọc giảm khối lượng phân tử (MWCO) 25,000 và 100,000 Da để tinh chế 39

stevioside, sau đó thẩm thấu ngược và sử dụng trao đổi ion, 45% stevioside thu hồi sau siêu lọc[67]. Năm 2000, Zhang và Kumar[71] sử dụng màng vi lọc, sau đó dùng màng siêu lọc, cuối cùng dùng màng lọc nano để lọc sạch dịch chiết cỏ ngọt[71]. Năm 2007, Sliva và Bergamasco đã dùng Zeolite hiệu chỉnh (NaX) trước khi lọc bằng màng vi lọc, lọc sạch xấp xỉ 80-100% dịch chiết cỏ ngọt với màng kích cỡ khe lọc thay đổi và áp suất vận hành khác[104]. Năm 2009, Reis sử dụng màng vi lọc ceramic đê lọc dịch chiết Cỏ ngọt. Một nghiên cứu khác bởi , so sánh sự khác nhau sử dụng màng PES may đo và thương mại trong lọc sạch stevioside[105] .

Phương pháp Accelerated Solvent Extraction (ASE) là công nghệ chiết tự động sử dụng ở nhiệt độ và áp suất cao thực hiện trong thời gian ngắn. Nhiệt độ cao dẫn đến khả năng hòa tan tốt hơn chất phân tích, tốc độ khuếch tán nhanh hơn, độ nhớt dung môi thấp hơn và sự suy yếu các tương tác chất tan – chất dính. Áp suất cao cho phép làm việc với các dung môi dạng lỏng trên điểm sôi của chúng và tăng tốc quá trình chiết tổng thể [106] . Cuối cùng, so với phương pháp thông thường khác, tự động hóa, hiệu suất chiết, độ thu hồi cao và thu được sản phẩm trong thời gian ngắn [107] .

1.2.2.2. Các phương pháp định lượng các hợp chất steviol glycoside

Trước đây từ rất lâu trên thế giới, đã có rất nhiều phương pháp có sẵn để xác định độ ổn định và độ tinh khiết của rebaudioside A và stevioside, và các phương pháp đó đã được áp dụng cho các mẫu cỏ ngọt trồng ở các khí hậu và các nước khác nhau, cũng như những đồ uống và thực phẩm chứa những chất ngọt đó [1, 4, 108]. Các phương pháp cơ bản định tính và định lượng cho chất làm ngọt cỏ ngọt được phân loại trước đây dựa trên sự xác định màu, phương pháp enzyme sử dụng enzyme hesperidinase thô, phương pháp sắc kí khí-lỏng (GLC), sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC), sắc kí bản mỏng (TLC)/phép đo tỉ trọng [1]. Năm 1977, H. Sugisawa cùng đồng nghiệp đã định lượng stevioside bằng cách ứng dụng phương pháp màu Carr-Price, phản ứng tạo màu xanh lam với thuốc thử SbCl3/cloroform, đo E ở bước sóng 524 nm[109]. Trước đây có một phương pháp được công bố về stevioside, rebaudiana A và steviolbioside trong trích ly cỏ ngọt thương mại, nó sử dụng điện di mao mạch ở chế độ mixen (MEKC) [110]. Một cách tiếp cận khác là phân tích định lượng stevioside trong lá cỏ ngọt sử dụng phương pháp phổ phản xạ hồng ngoại gần [111]. Dần dần, các phương pháp phân tích liên quan đến stevioside,

40

rebaudioside và chất ngọt tương tự, các sản phẩm phân hủy và chuyển hóa không yêu cầu dẫn xuất hóa học.

Ngày nay, có một vài phương pháp xác định nồng độ glycoside, xác định các hợp chất đa glycoside, một vài glycoside phức tạp trong cây cỏ và ngũ cốc như sắc kí khí [103] , quang phổ hồng ngoại, quang phổ khối lượng [10], cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) , HPLC,… Trong đó, phương pháp đơn giản nhất, phổ biến nhất và hiệu quả nhất là HPLC, còn được sử dụng để xác định hợp chất trong cỏ ngọt ở những vùng địa lý khác nhau[24]. Trong tài liệu khoa học, chỉ ra nhiều cách xác định stevioside, rebaudioside A và steviol như thủy phân men & dò hóa chất, GC, TLC áp suất dư, đo tỉ trọng, HPLC và điện di mao dẫn [22]. Mô hình quang phổ hồng ngoại gần (NIR) đã được thiết lập để đo trực tiếp nồng độ các stevioside glycoside (rebaudioside A và stevioside) trong lá S. rebaudiana Bertoni. Mô hình này có thể được áp dụng để đo nồng độ rebaudioside A và stevioside trong lá lá S. rebaudiana Bertoni, và giải quyết được vấn đề giá cao và vận hành phức tạp trong các phương pháp trong phòng thí nghiệm hiện nay [112] .

Phương pháp LC-TOF định tính đã được dự kiến để đánh giá các hợp chất steviol glycoside [18] cùng với phương pháp HPTLC được phê chuẩn cùng với thiết bị dò tỷ trọng[113] và phương pháp NIRS cho việc định lượng steviol glycosides [114]. Trước đây, một phương pháp xác định bán định lượng các hợp chất steviol glycoside được thực hiện bằng phương pháp khối phổ ion hóa tia điện không thấm [115] . Đối với định lượng steviol năm 2009 Minne thực hiện phương pháp RP-LC với đầu dò fluorometric sau khi dẫn xuất bởi một sản phẩm phụ coumarin.

Cuối cùng, phương pháp định lượng syevioside phổ biến nhất, được sử dụng rộng rãi nhất là HPLC với cột Silicagel pha đảo C18. Điều kiện vận hành cột:

− Nhiệt độ thường − Hệ dụng môi giải ly acetonitrile:nước tỉ lệ 80:20 − Tôc độ dòng: 1µm/mL − Đầu dò UV-vis 210nm

41