Mycoplasma bovis al desnudo

Oihane Alzuguren Ramos, Licenciada en Veterinaria Cristina Baselga Julián, Graduada en Veterinaria y MSc Laura Gracia López, Licenciada en Veterinaria y MSc Lara Domínguez Estallo, Graduada en Biotecnología y MSc

Exopol Imágenes cedidas por las autoras

Contacto con las autoras: oalzuguren@exopol.com; crbaselga@exopol.com; lgracia@exopol.com; ldominguez@exopol.com

Resumen

Mycoplasma bovis es una bacteria implicada en diferentes cuadros clínicos en el ganado bovino, principalmente procesos respiratorios en terneros, mastitis en vacas, además de artritis, otitis y otras afecciones menos frecuentes como meningitis e infertilidad. Los factores predisponentes que favorecen la aparición de la enfermedad, junto con la baja eficacia de los tratamientos antibióticos y el difícil control de la transmisión del patógeno en las granjas, generan un porcentaje de animales crónicos que terminan siendo eliminados. Por todo ello, es imprescindible establecer un plan de control mediante diagnósticos periódicos para valorar los agentes implicados en los problemas observados de neumonías o mastitis, y poner en marcha medidas preventivas de manejo, higiene y profilaxis vacunal para mejorar la productividad de los animales, reduciendo el porcentaje de animales crónicos. En este artículo, hablaremos de las características de Mycoplasma bovis y las patologías asociadas a este agente, así como de la selección de muestras para su diagnóstico laboratorial y las medidas de control que podemos implantar en las explotaciones. Para ilustrar esta materia concluimos con la presentación de dos casos clínicos diagnosticados en Exopol.

Palabras clave: Mycoplasma bovis, procesos respiratorios, autovacunas, diagnóstico.

Abstract

Mycoplasma bovis naked

Mycoplasma bovis is a bacterium involved in different clinical syndromes in cattle, mainly respiratory processes in calves, mastitis in cows, as well as arthritis, otitis and another less frequent presentation such as meningitis and infertility. Predisponent factors that bring on the appearance of the disease, along with the low efficacy of antibiotic treatments and the difficulty controlling the pathogen transmission, generate a percentage of chronic animals that in the end must be eliminated. In consequence, it is essential to establish a control plan performing periodical diagnoses to assess the agents involved in those problems of pneumonia or mastitis and implementing handling, hygienic and vaccinal preventive actions to improve the productivity of the animals reducing the percentage of chronic ones. In this article, it is discussing the characteristics of Mycoplasma bovis and the pathologies associated with this agent, as well as the selection of samples for laboratory diagnosis, the control actions that can be implemented in farms, and it is also presented two clinical cases received and diagnosed in Exopol.

Keywords: Mycoplasma bovis, diagnosis, autovaccines, respiratory processes.

INTRODUCCIÓN

Mycoplasma bovis es una bacteria no zoonótica que genera pérdidas económicas sustanciales en el ganado bovino alrededor del mundo, siendo considerado un patógeno primario. Su capacidad de adhesión a las células epiteliales junto con su diseminación vía hematógena le permiten causar cuadros de neumonía, mastitis, artritis y otitis, y en menor frecuencia problemas reproductivos, meningitis, abscesos y endocarditis (5,6). Puede encontrarse en animales de cualquier edad, así como en cualquier sistema de producción, viéndose asociado, generalmente, a cursos crónicos y con frecuente falta de respuesta al tratamiento (5). Además, la existencia de portadores hace que esta bacteria pueda encontrarse en las mucosas del tracto respiratorio superior, digestivo, genital, en tejido articular y en la glándula mamaria de animales sanos, dificultando su control. Debido a que los signos clínicos asociados a Mycoplasma bovis no son específicos es necesario la realización de un diagnóstico clínico y laboratorial completo con el fin de descartar otros agentes y establecer un correcto tratamiento preventivo y correctivo.

CARACTERÍSTICAS MICROBIOLÓGICAS

Mycoplasma bovis es una especie de micoplasma que afecta a la especie bovina, aunque también es posible aislarla en pequeños rumiantes. Se trata de una bacteria que carece de pared celular, lo que le convierte en un patógeno muy resistente a las condiciones ambientales. También le proporciona resistencia natural a antibióticos como las penicilinas y algunos betalactámicos (1, 2, 6). A su vez, la ausencia de síntesis de ácido fólico hace que no sea sensible a las sulfamidas (1, 2). En estudios in vitro, se ha observado un incremento en la resistencia a las tetraciclinas y las nuevas generaciones de macrólidos, considerados hasta ahora efectivos frente a Mycoplasma bovis (1, 6, 7). Además, su gran capacidad de variación antigénica le permite evadir con éxito la respuesta inmunitaria del hospedador (10) (figura 1). La principal vía de transmisión de Mycoplasma bovis es la horizontal. Frecuentemente, los terneros lactantes se infectan con la toma de calostro y leche

Figura 1. Mycoplasma bovis cultivado en Eaton’s.

de vacas portadoras o enfermas. El contagio también se produce a través del contacto directo con fluidos corporales, como secreciones nasales y fómites contaminados, siendo la vía habitual en cebaderos de terneros. En el caso de las vacas lecheras la infección habitual de la glándula mamaria es a través del personal y el material contaminado durante el ordeño. También ha sido descrita la transmisión a vacas, a través de la inseminación artificial con semen contaminado, aunque esta vía es poco frecuente (6).

PRESENTACIÓN Afección respiratoria

Mycoplasma bovis es uno de los patógenos implicados en el complejo respiratorio bovino (CRB), en el que suelen participar simultáneamente agentes de naturaleza vírica (BVD, IBR, virus sincitial, Parainfluenza-3 y coronavirus) y bacteriana (Pasteurella multocida, Mannheimia haemolytica, Histophilus somni y Mycoplasma bovis). La forma respiratoria es más frecuente en animales de cebo, pues existen muchos factores predisponentes como situaciones de estrés (transporte, mezcla de animales de distintos orígenes y alta densidad), estacionalidad y explotaciones de gran tamaño con flujo continuo de animales (10). Los signos clínicos observados son fiebre, disnea, depresión, descarga nasal y tos. La bronconeumonía caseonecróticas es la lesión característica (figura 2), no obstante, se han descrito lesiones fibrinosupurativas asociadas. Sin embargo, es poco frecuente observar estas lesiones como únicas en el pulmón, ya que suelen aparecer otros patógenos del CRB como Mannheimia haemolytica causando lesiones fibrinosas (6). Para el diagnóstico laboratorial del CRB se deben analizar muestras procedentes de vías respiratorias bajas. Cuando existen muertes en la granja es recomendable realizar la necropsia para valorar las lesiones macroscópicas y obtener un diagnóstico presuntivo. En estos casos, el envío del pulmón completo o de zonas lesionadas sería lo recomendable. En animales vivos, se pueden tomar lavados broncoalveolares o hisopos nasales profundos, siendo recomendable seleccionar animales con signos clínicos recientes y que no hayan recibido tratamiento antibiótico previo (figura 3). En el ganado adulto, es necesario realizar los lavados transtraqueales, debido a que se necesitan unas sondas más largas para llegar a pulmón.

Afección auricular

La otitis causada por M. bovis es más frecuente en terneros de cebo con neumonía crónica. La bacteria provoca lesiones supurativas y caseosas a nivel de oído medio y bulla timpánica, y en ocasiones avanza al oído interno y los nervios periféricos llegando a causar lesiones en el sistema nervioso que cursan con cuadros meningíticos. Los signos clínicos asociados son fiebre, inflamación del oído con exudado seroso o purulento, oreja caída, sacudidas y ladeo de cabeza debido a una otitis dolorosa. Cuando existen también lesiones a nivel del sistema nervioso puede observarse torneo y parálisis facial. (6, 9, 10). Para confirmar la etiología del proceso se tomarán hisopos auriculares de animales vivos. Es recomendable valorar la presencia de agentes complicantes del resto de procesos.

Afección mamaria

Las mastitis por M. bovis, aunque poco frecuentes en España (14), causan generalmente una acusada disminución de la producción láctea. También pueden aparecer mastitis clínicas (observando más de un cuarterón afectado con inflamación, enrojecimiento y alteración de la leche), aunque es más frecuente la presencia de mastitis subclínicas, con un aumento del recuento de células somáticas (CS). Las lesiones observadas en la glándula mamaria son fibrinosupurativas o caseosas. Al ser un patógeno altamente contagioso y de difícil curación normalmente las vacas afectadas son eliminadas del rebaño. El cuadro mastítico suele presentarse junto con signos de artritis y respiratorios, afectando a todas las edades y estados productivos, incluso novillas y vacas en secado (10). El diagnóstico laboratorial se realiza en muestras de leche de animales con signos de mastitis. El análisis de muestra de tanque sirve para realizar la monitorización de la enfermedad en explotaciones endémicas o para el control de una explotación indemne.

Afección articular

Las artritis causadas por este patógeno son menos frecuentes que los procesos anteriores, apareciendo nuevamente junto con signos respiratorios en terneros o mastitis en vacas de leche. Los signos clínicos que se observan suelen ser articulaciones inflamadas y con presencia de dolor a la palpación. Las lesiones descritas son artritis fibrinosupurativa y tenosivitis (6, 10). Las muestras de líquido articular obtenido del animal vivo o tejido articular de animal necropsiado son las adecuadas para el diagnóstico de M. bovis.

Otras afecciones

Mycoplasma bovis también se encuentra implicado con menor frecuencia en otros procesos: ■ Oculares. Su implicación en la queratoconjuntivis infecciosa bovina es poco habitual, pero se ha descrito la relación entre un proceso respiratorio y la posterior afección ocular en terneros (10). ■ Problemas reproductivos: causando infertilidad y abortos en vacas, y vesiculitis seminal en toros (10). ■ Afección de órganos sistémicos: también se han descrito casos de endocarditis, miocarditis fibrinonecróticas (10) y lesiones del mismo tipo en hígado y riñón causadas por un cuadro septicémico de M. bovis (9).

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

Es posible orientar la identificación de Mycoplasma spp. en función de la especie animal y del proceso patológico presente en la explotación, pudiendo seleccionar diferentes técnicas diagnósticas.

Cultivo microbiológico

El aislamiento de micoplasmas, considerados gérmenes fastidiosos, requiere de medios específicos para su crecimiento: Hayflick’s, PPLO modificado y Eaton’s (6). Las placas de agar son incubadas en atmósfera húmeda a 37 °C durante al menos 7-10 días (3). Estas son revisadas en un microscopio estereoscópico o con un objetivo de bajo alcance, pudiendo observar las características microcolonias en forma de “huevo-frito” (3). Estas colonias son recogidas e inoculadas en caldo de cultivo. El crecimiento de micoplasma producirá una turbidez en el medio líquido (o cambio de color, en caso de que el medio lleve un reactivo indicador de cambio de pH, como el rojo fenol). Este proceso se realizará repetidas veces con el fin de obtener una cepa pura. Esta técnica, aun siendo el gold standard (6), requiere de condiciones específicas y personal cualificado. A menudo será necesaria una identificación más precisa mediante otras técnicas, como técnicas moleculares, pruebas bioquímicas, difusión en gel de agar, etc. (3), para confirmar la especie de micoplasma presente en el cultivo microbiológico.

Técnicas moleculares

Las técnicas basadas en ensayos de PCR a tiempo real (qPCR) han aumentado la sensibilidad y especificidad de los métodos utilizados hasta el momento en el diagnóstico de Mycoplasma bovis (1,6). Además, han sido desarrolladas para la detección de esta bacteria, tanto en las muestras problema (pulmón, leche, hisopos articulares o auriculares, etc.), como en los aislamientos de Mycoplasma spp. Asimismo, permite la detección de una menor concentración de Mycoplasma spp. y la presencia de bacterias no viables para el cultivo microbiológico. La elaboración de kits de qPCR capaces de distinguir diferentes especies de micoplasmas en una sola muestra, hace que sea una de las técnicas de relevancia (3) y sea de gran utilidad a la hora de valorar las especies presentes en una misma muestra.

Tipado y secuenciación

El tipado y secuenciación de Mycoplasma bovis se realiza sobre los aislamientos bacterianos realizando una tipificación multilocus de secuencias (MLST). La MLST es una técnica de epidemiología molecular que permite la tipificación bacteriana mediante la identificación de polimorfismos tras una amplificación y secuenciación de varios fragmentos conservados (habitualmente 7) de entre 300700 pares de bases, diferentes para cada especie bacteriana. A cada secuencia de estos genes de mantenimiento se le asigna un número particular, constituyendo un perfil alélico o tipo de secuencia (en inglés, sequence type, ST) (13). Este estudio aporta información sobre la relación entre las cepas y la evolución que pueden tener tanto a nivel de granja como de región, pudiendo valorar la inclusión de nuevas cepas y con ello la repercusión que pueda conllevar (6).

Estudio serológico

El estudio serológico está basado en la presencia de anticuerpos específicos frente a Mycoplasma bovis en suero. Esta técnica nos permite realizar estudios de prevalencia y epidemiología de los rebaños, contribuyendo a la elaboración de programas de bioseguridad y control de la enfermedad (10). Además, se trata de una técnica utilizada para el diagnóstico de animales infectados. La seroconversión comienza a los

Figura 3. Lavados broncoalveolares de terneros mamones recogidos en tubos estériles.

Resultados estadísticos en Exopol

La figura muestra el porcentaje de casos positivos a M. bovis mediante PCR y/o cultivo microbiológico analizados en Exopol en los últimos 5 años. El 41 % de las muestras respiratorias analizadas (pulmones, lavados broncoalveolares y, en menor proporción, hisopos nasales) fueron positivas a este patógeno, siendo frecuente la concomitancia con otros agentes del CRB. En cuanto a las mastitis, solo un 5 % de las muestras recibidas presentaban positividad frente a este patógeno. Este porcentaje confirma su baja implicación en problemas de mastitis. Sin embargo, su erradicación en las granjas positivas es complicada. En los casos articulares la positividad a micoplasma es baja (10 %), pudiendo ser debido al análisis de casos individuales con artritis de origen no infeccioso o a la dificultad en la toma de muestras. En un 60 % de los casos de otitis analizados se detectó la presencia de esta bacteria, aunque el número de casos analizados es bajo y puede resultar no significativo, este patógeno parece importante y se debe considerar en el diferencial de las artritis.

Porcentaje de casos positivos a Mycoplasma bovis recibidos en los últimos 5 años en Exopol, diferenciado por procesos (2017-2021).

60 %

41 %

5 % 10 %

Respiratorio (N = 1.643) Mastitis (N = 860) Articular (N = 21) Otitis (N = 5)

10-14 días posinfección y puede permanecer en valores elevados durante varios meses (6, 10). Esto complica el diagnóstico, ya que la presencia de un animal seropositivo puede deberse tanto a una infección reciente, y por tanto, causa del problema presente en la explotación, como indicar un contacto previo con el agente sin ser en ese momento la causa del problema. Otras técnicas que permiten la detección de Mycoplasma bovis en tejido infectado como la inmunohistoquímica (IHQ) o la hibridación in situ (ISH) son más laboriosas y costosas por lo que se utilizan menos en el diagnóstico de rutina y más en investigación.

CONTROL Y PREVENCIÓN

Desde 1970, los científicos ya reportaban la falta de respuesta de Mycoplasma bovis frente al tratamiento antibiótico para las mastitis, continuando con este problema a día de hoy (10). La falta de vacunas con efectividad contrastada en EE. UU. y registradas en Europa (1, 6, 13), junto con el incremento de la resistencia a los antibióticos, hacen que el control y prevención de esta bacteria sea necesaria, aunque ardua. En diversos países como Australia, Irlanda y Finlandia, se han establecido planes de control y erradicación. Para ello, las medidas se centran en el control del calostro y leche cruda, distanciamiento de los animales, aislamiento de los enfermos, o incluso el sacrificio de estos últimos (6). La monitorización de la granja analizando leche de tanque es otra de las medidas a tener en cuenta, ya que se trata de una manera sencilla de analizar el estatus sanitario de la explotación. Debido a la falta de respuesta a los antibióticos, su estudio se vuelve imprescindible para la selección del medicamento más efectivo. Con la realización de estudios de sensibilidad antibiótica mediante pruebas de concentración mínima inhibitoria (MIC) se ha observado una mejor respuesta a tilmicosina y espectinomicina. En cuanto a las tetraciclinas se han observado valores elevados de MIC, es decir, una mayor resistencia adquirida frente a este antibiótico. Todo ello lleva a plantearse las autovacunas como herramienta para hacer frente a Mycoplasma bovis. Las autovacunas son vacunas inactivadas realizadas específicamente para una unidad epidemiológica y con cepas aisladas de animales enfermos de esa misma granja. Mediante diversos estudios (11,12) se ha observado que la aplicación de las autovacunas lleva a una mejora en la disminución de lesiones en pulmón en matadero, disminución en el uso de antibióticos y una mayor tasa de recuperación de los animales, así como una reducción en las muertes o aparición de nuevos animales con signos respiratorios de Mycoplasma bovis. La eficacia de las mismas se ha puesto en entredicho en múltiples ocasiones, pero bajo la experiencia y el respaldo de estudios científicos publicados, pueden llegar a ser una gran herramienta de control frente a este microorganismo dada la falta de métodos de prevención y corrección que actualmente existen, especialmente en la UE. Si unimos esta herramienta a la secuenciación y tipificación de las cepas, podremos saber si la cepa circulante en el momento del análisis es una nueva cepa que ha entrado en la granja y podremos completar la autovacuna para mejorar la inmunidad del rebaño e ir mejorando esos índices que se ven mermados por Mycoplasma bovis.

Figura 4. Pulmón de ternero con presencia de congestión, consolidación y necrosis.

CASOS CLÍNICOS

A continuación, presentamos dos casos clínicos de Mycoplasma bovis analizados en Exopol:

Caso clínico 1

Cebadero de terneros con presencia de signos respiratorios en animales a los 10 días de llegada a la explotación. Presentan tos, disnea, fiebre y algunos de ellos, lagrimeo y otitis supurativa. Se reciben muestras de pulmón e hisopos de tráquea y bronquios. Las muestras de pulmón recibidas presentan una intensa congestión, con marcada consolidación y áreas de necrosis multifocales (figura 4). Mediante el cultivo microbiológico se consigue el aislamiento de Pasteurella multocida e Histophilus somni y Mycoplasma spp. Los resultados de las técnicas moleculares (qPCR) se muestran en el cuadro 1. Mediante el estudio anatomopatológico se observan lesiones macroscópicas que se corresponden histológicamente con una neumonía exudativa de tipo catarral purulenta, con presencia de amplias áreas de necrosis por caseificación en la luz de algunos bronquios de mayor tamaño. Estas lesiones son compatibles con un proceso de origen bacteriano (figura 5). Los resultados indican un proceso respiratorio causado por el virus sincitial (BRSV) y Mycoplasma bovis como posibles agentes primarios y P. multocida e H. somni como secundarios. Es recomendable revisar las medidas preventivas y de bioseguridad de la explotación, pues los animales crónicos mantienen la transmisión de Mycoplasma bovis a los animales más jóvenes que llegan a la granja.

Caso clínico 2

Explotación de vacas de leche con reducción de la producción de leche y RCS elevado (500.000 CS/ml). No se han detectado otros síntomas concomitantes. Se reciben 9 leches individuales con altera-

Cuadro 1. Caso clínico 1. Resultados de diagnóstico obtenidos por técnicas moleculares (qPCR).

Pestivirus (BVD) IBR

BRSV

Parainfluenza 3

Coronavirus bovino

Mycoplasma bovis Histophilus somni Bibersteinia trehalosi Pasteurella multocida Mannheimia haemolytica Pool de muestras

Neg.

Neg.

Positivo (Cq 21)

Neg.

Neg.

Positivo (Cq 22)

Positivo (Cq 26)

Neg.

Positivo (Cq 29)

Neg.

ción de la coloración y una muestra de leche de tanque. Mediante el cultivo microbiológico se aisló Streptococcus uberis en varias muestras de leche. Mediante el estudio de sensibilidad antibiótica se observó que esta bacteria presentaba buena sensibilidad a varios antibióticos: ampicilina, cloxacilina, penicilina, trimetoprim-sulfametoxazol, amoxicilina-clavulánico, cefalotin, eritromicina, rifaximina, cefquinoma y marbofloxacina. Los resultados de las técnicas moleculares (qPCR) se muestran en el cuadro 2. La detección mediante qPCR de Mycoplasma bovis nos indica la presencia de este agente en la explotación. El análisis individual de las muestras permitirá localizar las vacas infectadas para su posterior eliminación, ayudando al control de la enfermedad. Por otro lado, el aislamiento de Streptococcus uberis debe tenerse en cuenta a la hora de implementar medidas de control y prevención de procesos mamarios.

Figura 5. Caso clínico 1. Bronquiolos con presencia de amplias áreas de necrosis por caseificación. Fuente: Micros Veterinaria.

Cuadro 2. Caso clínico 2. Resultados de diagnóstico obtenidos por técnicas moleculares (qPCR).

Mycoplasma bovis Prototheca spp Staphylococcus aureus Streptococcus agalactiae Streptococcus uberis Pool de leches

Positivo (Cq 22)

Neg. Tanque

Positivo (Cq 29)

Neg.

Neg.

Neg.

Positivo (Cq 26)

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Aksoy A (2021) An overview: mycoplasma bovis; Research and reviews in agriculture, forestry and aquaculture sciences 2. Arcangioli MA, et al. (2021) Large-size fattening calves lots fed with automatic milk feeders may have an increased risk for Mycoplasma bovis infection spread and for antibiotic use; Animals 3. Bryan Markey, Finola Leonard, Marie Archambault, Ann Cullinane y Dores Maguire (2013) Clinical Veterinary Microbiology; Elsevier 4. García-Galán, A, et al. (2021). Importance and Antimicrobial Resistance of Mycoplasma bovis in Clinical Respiratory Disease in Feedlot Calves; Animals 5. Kanda T, et al. (2019) M. bovine endocarditis associated with Mycoplasma bovis.; J. Comp. Pathol 6. Katarzyna Dudek, et al.(2020) Mycoplasma bovis infections-Ocurrence, diagnosis and control; Pathogens 7. Klein U, et al. (2019) New antimicrobial susceptibility data from monitoring of mycoplasma bovis isolated in Europe; Veterinary Microbiology 8. Levisohn S, et al. (2004) Diagnosis of a mixed mycoplasma infection associated with a severe outbreak of bovine pinkeye in you calves; J. Vet Diagn Invest 9. Maeda T, et al. (2003) Mycoplasma bovis associated suppurative otitis media and pneumonia in bull calves; J. Comp. Path. 10. Maunsell FP, et al. (2011) Mycoplasma bovis infections in cattle; J Vet Intern Med 2011 11. Nicholas RAJ, et al. (2019) Effects of an inactivated vaccine for bovine mycoplasmosis on calves naturally affected with Mycoplasma bovis; Animal Husbandry, Dairy and Veterinary Science 12. Nicholas RAF, et al. (2002) An experimental vaccine for calf pneumonia caused by Mycoplasma bovis: clinical, cultural, serological and pathological findings; In Vaccine 13. Register KB, et al. (2020) Comparison of two multilocus sequence typing schemes for mycoplasma bovis and revision of the PubMLST reference method; American Society for Microbiology 14. www.solomamitis.com