7.3.5 Isolierung, Identifikation und Analytik von Multifidolen in Hopfen

Dieses Forschungsprojekt wurde von der Wissenschaftlichen Station für Brauerei München e.V. für die Jahre 2020 und 2021 mit 10.000, - € gefördert. Die Quercetin- und Kämpferolglykoside als auch die Multifidole kommen im Hopfen in relativ hohen Konzentrationen vor, sind wegen ihrer Polarität gut wasserlöslich und haben niedrige Geschmacksschwellenwerte. Die Tab. 7.2 zeigt die Geschmacksschwellenwerte dieser Verbindungen nach Dr. M. Biendl und S. Cocuzza (Hartharze, Hopfenrundschau International, 2016/2017, 60 -68).

Tab. 7.2: :Geschmacksschwellenwerte von niedermolekularen Polyphenolen des Hopfens und Prozentsatz der Biere, bei denen dieser überschritten wird.

niedermolekulare Polyphenole Quercetin-3-glukosid Kämpferol-3-glukosid

Geschmacksschwellenwert in mg/l 0,9 0,5 Kämpferol-3-(malonyl)hexosid 2,7 Co-Multifidolglukosid 1,8 Prozentsatz der Biere über den Geschmacksschwellenwert 86 95 1 54

Insgesamt wurden 88 Biere untersucht. Die Multifidolglukoside sind auch pharmakologisch interessant, da sie entzündungshemmende Eigenschaften besitzen (Bohr, G., Gerhäuser, C., Knauft, J., Zapp, J., Becker, H.: „Anti-inflammatory Acylphloroglucinol Derivatives from Hops (Humulus lupulus), J. Nat. Prod. 2005, 68, 1545-1548). Das Ziel dieses Projektes war zunächst, eine geeignete Probenvorbereitung und Analysenmethode für die Multifidolglukoside zu erarbeiten. Dann sollten von den wichtigsten Hopfensorten quantitative Analysen durchgeführt werden. Zur Extraktion der Multifidole hat sich eine Mischung von Methanol Wasser (90:10) bestens bewährt. 5 g gemahlener Hopfen werden mit 50 ml Lösungsmittel im Ultraschallbad 15 Min. extrahiert. Dann wird durch einen Faltenfilter filtriert und noch einmal mit einem Spritzenfilter Nylon, Porengröße 0,23 µm, ø 33 mm von der Firma Roth. 5 ml des Filtrats werden in einen 10 ml Meßkolben gegeben, dann werden 1 ml Standard hinzugefügt und auf 10 ml aufgefüllt. Für die HPLC-Analyse werden die Proben in 1,5 ml Vials abgefüllt.

Die HPLC-Analytik wird mit dem HPLC-System Accela 10000 von der Firma Thermo Scientific durchgeführt. Als analytische Säule wird die Säule EC 125/2 Nucleodur 100-3 C18 von der Firma Macherey-Nagel verwendet. Die Abb. 7.16 zeigt die Probenvorbereitung und die HPLC-Analyse.

Abb. 7.16: Probenvorbereitung und HPLC-Analyse der Multifidole

Die Analytik erfolgt mit einem Gradientenprogramm: Lösungsmittel A: H2O:Methanol (90:10), Lösungsmittel B: Methanol Gradientenprogramm:

Zeit in Min. LM A LM B Fluss

0 100 0 900 µl/Min. 30 0 100 900 µl/Min. 31 100 0 900 µl/Min.

Die Detektionswellenlänge ist 280 nm. Das Co-Multifidolglukosid eluiert bei 6,4 Min. und Flavon bei 16,6 Min. (Abb. 7.17).

Abb. 7.17: Chromatogramm Co-Multifidolglukosid – Flavon

Die Abb. 7.18 zeigt die UV Spektren des Co-Multifidolglukosids und von Flavon.

Abb. 7.18: UV-Spektren des Co-Multifidolglukosids und von Flavon

Abb. 7.19: chemische Struktur von Flavon

Das Co-Multifidolglukosid hat bei 280 nm ein Absorptionsmaximum und Flavon bei 300 nm. Flavon absorbiert jedoch auch bei 280 nm noch sehr gut und ist deshalb als Sekundärstandard geeignet. Auch kommt Flavon (Abb. 7.19) im Hopfen nicht natürlich vor und kann somit als interner oder externer Standard eingesetzt werden. Dr. Wietstock von der TU Berlin hat das Co-Multifidolglukosid aus Hopfen mit präparativer HPLC in 96 % Reinheit isoliert. Dann wurden die Response-Faktoren bei der Wellenlänge 280 nm bestimmt. Das Verhältnis der Response-Faktoren von Co-Multifidolglukosid zu Flavon beträgt ziemlich genau 1:3.

Für die Analytik werden 100 mg Flavon in 50 ml Methanol:Wasser (90:10) aufgelöst. Dann wird 1:10 verdünnt . Dieser Standard wird für die Analytik benutzt.

Die Abb. 7.20 zeigt Ergebnisse wichtiger Hopfensorten der Erntejahre 2019 und 2020. Die Sorten haben sehr unterschiedliche Gehalte. Den größten Co-Multifidolglukosidgehalt weist Herkules auf und den kleinsten Hersbrucker Spät. Im Jahr 2020 waren die Multifidolgehalte insgesamt etwas geringer, es hat sich jedoch gezeigt, dass die Sortenunterschiede gut reprozierbar sind. Der Co-Multifidolgehalt scheint also auch genetisch festgelegt zu sein. Das Erntejahr 2021 soll über das Projektende hinaus auch noch analysiert werden, sodass dann dreijährige Ergebnisse vorhanden sind. Es besteht jedoch keine Korrelation zu den alpha-Säurengehalten. Manche Sorten mit hohen alpha-Säurengehalten wie Herkules oder Polaris haben einen eher geringeren Co-Multifidolglukosidgehalt. Andere Sorten wie Saphir mit geringem alpha-Säurengehalt haben einen hohen Co-Multifidolglukosidgehalt.

0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 Co-Multifidol-glukosid in %, 2019, 2020

Abb. 7.20: Comultifidolglukosidgehalte in wichtigen Hopfensorten der Erntejahre 2019 und 2020