Recuperación del cultivo de boniato Necesidad del saneamiento de las plantas frente a virus Consuelo Penella, Jose I. Marsal, Anna Villalba, Andrea González-Martínez, Miguel Morard, Ana Crespo-Sempere, María R. Albiach-Martí y Ángeles Calatayud
ValGenetics S.L. Centro de Citricultura y Producción Vegetal, Departamento de Horticultura. Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)
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Recuperación del cultivo de boniato Necesidad del saneamiento de las plantas frente a virus Consuelo Penella1*, Jose I. Marsal2, Anna Villalba1, Andrea González-Martínez1, Miguel Morard1, Ana Crespo-Sempere1, María R. Albiach-Martí1, Ángeles Calatayud2 * cpenella@valgenetics.com 1
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ValGenetics S.L. Centro de Citricultura y Producción Vegetal, Departamento de Horticultura. Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA)
Índice 1. Introducción .............................................................................................................................. 1 2. Metodología .............................................................................................................................. 3 3. Logros obtenidos en el proyecto IVACE PIDI-CV 2020 .............................................................. 5 4. Perspectivas de futuro .............................................................................................................. 6
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Recuperación del cultivo de boniato
1. Introducción El boniato o batata (Ipomoea batatas Lam.) es originario de la zona tropical sudamericana donde fue extendido a Asia por los navegantes españoles y portugueses. El boniato es actualmente considerado como uno de los cultivos alimenticios más importantes en el mundo. Se cultiva en más de 100 países, siendo Asia la principal zona productora. En Europa la producción y consumo de boniato está en plena expansión. Esta dinámica se ha trasladado a España, donde actualmente se cosechan más de 62.000 toneladas, siendo el productor mayoritario de boniato en Europa, alcanzando un 65% de la producción total europea (FAOSTAT, 2018), seguido de Portugal, Italia y Grecia. Este cultivo tropical posee una amplia base genética, gran variabilidad y potencial de mejora principalmente en su zona de origen (Figura 1). El boniato es una especie que presenta autoincompatibilidad floral, por lo que la única vía para producir frutos es la polinización cruzada. Además, en las zonas donde el clima no es tropical o semi-tropical, no forman flores, por lo que la multiplicación vegetativa se hace necesaria en la propagación de estas plantas (Miguel, 2017). La multiplicación vegetativa del boniato provoca a lo largo de los ciclos de cultivo la acumulación progresiva de patógenos en los materiales utilizados para su propagación y como consecuencia se produce un deterioro de la sanidad vegetal y en ocasiones una degeneración del material vegetal.
Figura 1. Detalle de la variabilidad de colores en algunos cultivares de boniato. De izquierda a derecha: 1-3 clon 3, 4: boniato tipo “California”, 5: Beauregard, 6-7: Blanco
El número de patógenos que afectan al cultivo del boniato es muy amplio, sin embargo, los virus son los que causan más pérdidas en el rendimiento del cultivo, afectando indistintamente a la raíz y a las hojas. En general, los síntomas observados en planta pueden ser leves cuando están afectados por una única especie viral, pero lo más común es encontrarse infecciones virales mixtas de distintas especies virales, las cuales generalmente ocasionan efectos deletéreos sinérgicos que son devastadores. En este sentido, diversas especies virales del género Potyvirus1, 1
Potyvirus: es el mayor género de virus fitopatógenos de la familia Potyviridae. El genoma consiste en una cadena de ARN lineal monocatenario de sentido positivo de un tamaño alrededor de 9700nt, encapsidado en viriones flexuosos y filamentosos con una longitud de 680–900 nm. Muchas de sus especies virales tienen un estrecho rango de huéspedes, pero otras muestran un amplio rango de huéspedes y pueden infectar a más de 30 especies distintas de plantas. Producen enfermedades económicamente importantes principalmente en hortícolas y frutales (ICTV, Virus Taxonomy 2020).
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así como la especie Sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV) del género Crinivirus2, son particularmente importantes a nivel económico. Además, cabe destacar los daños ocasionados por la especie viral Sweet potato leaf curl virus (SPLCV) del género Begomovirus3 el cual, aunque no causa síntomas foliares en la mayoría de los genotipos, puede reducir el rendimiento de cultivares como es el caso de la variedad Beauregard con un 30% a pesar de la ausencia de síntomas (Karyeija et al., 2000, Clark y Hoy, 2006). El Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) mantiene una colección de clones de boniato que se reproduce periódicamente mediante esquejes o ramas seleccionadas pero que a lo largo de los años están sufriendo un deterioro de la sanidad vegetal que afecta su producción y calidad. Está demostrado que el método más eficiente y económico para la limpieza de virus en el boniato es el cultivo in vitro de tejidos de meristemos apicales (FAO, 2013). Los trabajos de saneamiento realizados en el IVIA durante 2019-2020 de algunos de los clones de boniato con más interés desde el punto de vista del sector productivo llevaron a una mejora en la productividad de las plantas. A través del proyecto IVACE PIDI-CV 2020, la empresa ValGenetics junto con el IVIA están llevando a cabo una labor de investigación centrada en el desarrollo de un nuevo sistema integral de diagnóstico sanitario, caracterización molecular, saneamiento y mejora del cultivo del boniato a través de los siguientes objetivos: 1) 2) 3) 4) 5)
Caracterización fenotípica de variedades cultivadas de boniato, mantenidas en el banco de germoplasma del IVIA y otras que puedan ser de interés para el agricultor. Determinación mediante diversas técnicas, rápidas y fiables, de la presencia de patógenos en las variedades seleccionadas, en especial virus y bacterias. Saneamiento de variedades seleccionadas y producción de planta libre de virus. Manejo y multiplicación del material vegetal sano en condiciones de cuarentena hasta la cesión del mismo al agricultor con garantías sanitarias. Evaluación agronómica y de la calidad de los boniatos de los clones saneados en campo.
El cumplimiento de estos objetivos del proyecto IVACE PIDI-CV 2020 ha permitido el desarrollo de metodologías eficaces de diagnóstico de patógenos de cultivo de boniato y la evaluación agronómica de las plantas saneadas. La puesta a punto de las herramientas biotecnológicas en este cultivo es de vital importancia para apoyar la creciente demanda de plantas de boniato por parte del sector agrícola, consiguiendo de este modo contribuir de manera sostenible a la 2
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Crinivirus: es un género de virus fitopatógenos de la familia Closteroviridae. El genoma puede ser lineal o bipartito. Es decir, algunas especies de Crinivirus están compuestas por una sola cadena de ARN lineal monocatenario de sentido positivo de una longitud sobre 17.600 nucleotidos(nt) y otras por dos cadenas de ARN de alrededor de 7,500 nt cada una. Los Crinivirus bipartitos se encapsidan por separado en partículas filamentosas y flexuosas de700-900 nm de longitud. Estos virus infectan principalmente a huéspedes herbáceos y hortícolas (ICTV, Virus Taxonomy 2020) 3 Begomovirus: es un género de virus fitopatógenos de la familia Geminiviridae. El genoma es circular compuesto de ADN. La mayoría de los Begomovirus posee un genoma bipartito, es decir separado en dos cadenas de ADN que se encapsidan en distintas partículas icosaédricas de 15-22 nm en diámetro. Ambos segmentos son requeridos para que la enfermedad sea sintomática en los huéspedes vegetales, los cuales son alrededor de 200 especies. Este género de virus es conocido a nivel a mundial por las pérdidas económicas que contrae a múltiples cultivos tales como tomates y cucurbitáceas (ICTV, Virus Taxonomy 2020).
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mejora de protección de los cultivos, obteniendo como resultado un mejor rendimiento y calidad, lo que tiene un impacto positivo en la rentabilidad las explotaciones agrícolas de boniato.
2. Metodología El material vegetal seleccionado en estos ensayos fueron tres clones de boniato: un clon del boniato tradicional valenciano tipo “Blanco”, y otros dos clones de carne anaranjada tipo “California” y “Málaga”. La selección se realizó en base a la demanda del mercado (productores y consumidores) y a la disponibilidad de variedades presentes en el banco de germoplasma del IVIA. Se tomó muestra de las plantas madre y se realizó un primer muestreo para determinar los virus presentes en el material de partida. La idea principal fue recurrir a la puesta a punto de técnicas de PCR específicas, a nivel de especie o grupo, de cada uno de los virus descritos. En el método PCR se emplea un par de cebadores4 para reconocer zonas conservadas del genoma viral (ADN o ARN) de la muestra y definir la región de este material genético que será amplificada, en este caso, de los diferentes virus del boniato. Para ello se diseñaron cebadores de cada uno de los patógenos que venían descritos en la bibliografía como los virus que más afectaban al cultivo del boniato. Concretamente se ha desarrollado la metodología necesaria para detectar las especies virales SPCSV, SPLCV y las especies del género Potyvirus más importantes que afectan al boniato anteriormente mencionadas mediante diversas tecnologías basadas en PCR. En primer lugar, se creó una colección de muestras positivas y negativas que se utilizaron como controles en las técnicas de PCR. Su manejo siempre se realizó de forma escrupulosa para minimizar así el riesgo de infecciones cruzadas. Los controles positivos y negativos se mantuvieron a -20 o -80ºC para evitar la pérdida de viabilidad o la degradación de su material genético. La siguiente medida realizada, fue comprobar la especificidad de dichos cebadores ya que, a pesar de tratarse de cebadores descritos en artículos científicos, no siempre son específicos, y requieren ser revisados mediante estudios bioinformáticos y modificados adecuadamente para asegurarse una alta especificidad con cada uno de los virus estudiados (Figura 2). Por tanto, se verificó el correcto funcionamiento de los cebadores diseñados y se ensayaron diferentes concentraciones de cebadores para determinar los programas de PCR que presentaron mejores resultados en cuanto a repetitividad y reproducibilidad. Además, paralelamente se iniciaron las labores de saneamiento del material vegetal de boniato mediante cultivo in vitro. Las metodologías de eliminación completa o ¨curación¨ de todos los patógenos presentes en una planta (saneamiento vegetal in vitro) se fundamenta en el cultivo de meristemos apicales, desde el aislamiento efectivo del ápice hasta el desarrollo de una planta completa enraizada. Para ello, mediante un microscopio binocular se procedió al aislamiento de 4
Cebador: Un cebador (también denominado iniciador, oligonucleótido o primer) es una secuencia corta de ADN de cadena simple que se utiliza en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En el método PCR se emplea un par de cebadores para hibridar con el ADN diana (el que se quiere amplificar para detectar la presencia del ADN que se está analizando) y definir la región que será amplificada. Normalmente se necesitan dos cebadores, para indicar el inicio y el fin de la amplificación
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ápices caulinares (aproximadamente entre 0,2-0,4 mm) en una cabina de flujo laminar, y cultivándolos en el medio apropiado hasta la obtención de la planta completa (Figura 3). Estas plantas procedentes del cultivo in vitro se aclimataron y se mantuvieron en el invernadero de cuarentena. Se tomaron muestras para garantizar el estado sanitario de las mismas, y una vez comprobado, se procedió a la multiplicación vegetativa de los tres clones seleccionados.
Figura 2. Detalle de electroforesis en gel de agarosa de una PCR convencional en búsqueda de muestras infectadas con Sweetpotato leaf curl virus. De izquierda a derecha se observa L (marcador de pesos moleculares), M1-M9 (muestras del campo de ensayos) y C+ (control positivo). En este caso, M1 y M3 resultaron ser las únicas muestras negativas para el virus analizado
Figura 3. Esquema del procedimiento del cultivo de meristemos de boniato para la obtención de planta sana
Una vez conseguidas las suficientes plantas saneadas, se realizó un ensayo agronómico empleando, de cada uno de los tres clones, plantas madre sin sanear y plantas saneadas por ValGenetics. El ensayo de campo se distribuyó con bloques al azar, con 10 plantas por bloque y tres repeticiones (total=30 plantas/clon/tratamiento), evaluando así un total de 180 plantas de boniato (Figura 4). Se tomaron en campo distintas muestras de cada uno de los clones saneados y no saneados para confirmar la efectividad de las técnicas de diagnóstico puestas a punto. Durante el proceso de validación, se comprobó la especificidad de los cebadores y sondas mediante la secuenciación de los productos de PCR obtenidos, asegurando así la ausencia de contaminación cruzada debida a la posible presencia de múltiples microorganismos en las muestras de campo. Por otro lado, se realizó una evaluación agronómica teniendo en cuenta la producción comercial de cada uno de los clones, y comparando los valores obtenidos con las plantas saneadas frente a las no saneadas.
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Figura 4. Detalle de la recolección del ensayo agronómico realizado en las instalaciones del IVIA
Todos los datos obtenidos fueron tratados mediante un análisis de la varianza ANOVA multifactorial, considerando como variables el tipo de clon y el tratamiento (planta saneada y no saneada).
3. Logros obtenidos en el proyecto IVACE PIDI-CV 2020 En el Proyecto IVACE PIDI-CV 2020 se han obtenido lo siguientes logros: -
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Se ha puesto a punto y testado la composición de los medios de cultivo para el crecimiento de las plantas en cultivo in vitro desde el aislamiento de los meristemos hasta la obtención de la planta completa. Estas metodologías contemplan medios y condiciones de cultivo específicos para cada variedad o especie de planta. Así, la composición de cada medio de cultivo se fue adecuando a las necesidades de cada genotipo, pero tratando de consensuar en lo posible los medios, tiempos y condiciones de cultivo para facilitar el manejo de material vegetal en el laboratorio. Se han desarrollado una batería de pruebas de diagnóstico rápido para detectar los principales virus fitopatógenos en boniato. A la vista de estos resultados, podemos afirmar que los laboratorios de ValGenetics pueden diagnosticarlos de manera rápida, específica, sensible y reproducible, mediante tecnologías basadas en la PCR. En lo que respecta al análisis fitopatológico de las muestras objeto de este estudio, SPLCV se detectó en un 30% de las muestras, las especies virales del género Potyvirus en un 1.8% y SPSCV en un 4,87% de las muestras analizadas en campo. En términos generales, se han puesto a punto distintas técnicas que engloban una metodología integral para extrapolar la multiplicación de planta saneada de boniato a gran escala. Además, este trabajo científico se ha realizado mediante la colaboración de una entidad pública como es el IVIA, y una entidad privada, ValGenetics S.L. Es importante destacar que se dispone de una batería de técnicas de diagnóstico de patógenos para comprobar la sanidad del material vegetal en cualquier momento y para cualquier tipo de tejido vegetal de boniato. El saneamiento vegetal junto con el control fitopatológico ha permitido la recuperación del cultivo de boniato. Estas variedades saneadas se controlan con la multiplicación
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vegetativa posterior en invernaderos de cuarentena, con el fin de verificar la sanidad del material vegetal entregado al agricultor. Los resultados obtenidos del ensayo agronómico ponen de manifiesto los cuantiosos beneficios desde el punto de vista productivo del saneamiento de plantas. Los rendimientos fueron superiores para todos los clones saneados ensayados en comparación con los clones no saneados (testigos) (Figura 5). Para cada una de las variables estudiadas se ha realizado un análisis de la varianza (ANOVA) y se ha considerado que existían diferencias significativas para p≤0.05, es decir, en todos los casos estudiados. Los valores medios de rendimiento observados para los diferentes clones fueron para el “Blanco” (5.22 kg/m2 vs 1.87 kg/m2 de la planta no saneada), “California” (5.11 kg/m2 vs 2.11 kg/m2) y “Málaga” (4.15 kg/m2 vs 2.07 kg/m2). Así, el efecto de sanear las plantas se materializó en un incremento de más del doble de la producción obtenida en todos los casos estudiados.
Figura 5. Producción comercial de los clones “Blanco”, “California” y “Málaga de las plantas testigo o no saneadas o testigo (verde) y de las plantas saneadas (azul)
Queda patente con la consecución del presente proyecto que disponer de plantas saneadas, es decir, libres de patógenos es una pieza clave para asegurar unos índices elevados de producción y por tanto la generación de riqueza en el sector agrario.
4. Perspectivas de futuro Continuaremos con la colaboración entre el IVIA y ValGenetics con la finalidad de: -
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Seguir estudiando los efectos de los diferentes virus sobre la planta de boniato. Caracterizar la calidad organoléptica y nutricional de los diferentes clones de boniatos como valor añadido a su comercialización. Identificar parámetros fisiológicos sensibles a la afección de los virus en la parte aérea de las plantas de boniato que faciliten su identificación.
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Estudiar el fondo genético de las diferentes entradas de la Colección del material vegetal de boniatos del IVIA. Estos estudios tendrán diversas aplicaciones, tales como evitar duplicidades en el Banco de germoplasma, tener a punto una técnica disuasoria de lucha anti-fraude y también para asistir a futuros programas de mejora.
En este proyecto cabe resaltar que es un ejemplo claro de cómo un centro de investigación, IVIA y una empresa biotecnológica de I+D+i, ValGenetics aunando esfuerzos, pueden lograr resultados palpables para la mejora de un cultivo agrícola que redunde en una mayor diversificación y mayor rentabilidad para el agricultor.
Bibliografía Clark, C.A.; Hoy M.W. (2006). Effects of common viruses on yield and quality Beauregard sweetpotato in Louisiana. Plant Disease, 90: 83-88. FAOSTAT. (2018). Food and Agriculture Organization of the United Nations. FAO Statistical Programme of Work. http://www.fao.org/faostat/es/#home FAO (2013). Material de propagación de calidad declarada. Protocolos y norma para cultivos propagados vegetativamente. ISBN: 978-92-5-306425-0 Karyeija R.F., Kreuze J.F., Gibson R.W., Valkonen P.T. (2000). Two serotypes of sweetpotato feathery mottle virus in Uganda and their interaction with resistant sweetpotato cultivars. Phytopathology, 90(11): 1250-5. Miguel A. (2017). Boniato. Cultivos hortícolas al aire libre. Cajamar Caja Rural. ISBN: 978-8495531-82-7, https://publicacionescajamar.es/uploads/cultivos-horticolas-al-airelibre/02-cultivos-horticolas-al-aire-libre.pdf.
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