Dermatoonkoloji Gündemi - EPİDERMAL DENEYSEL MODELLER; ALTERNATİF HAYVAN MODELLERİ

EPİDERMAL DENEYSEL MODELLER; ALTERNATİF HAYVAN MODELLERİ Yrd. Doç. Dr. Sibel Berksoy Hayta Cumhuriyet Üniversitesi Tıp Fakültesi Dermatoloji Anabilim Dalı Sivas

İÇERİK DENEY HAYVANI KULLANIMI ‘Kullansakta mı yayınlasak, kullanmasakta mı yayınlasak?’

ALTERNATİF MODELLER SOLUCAN: Caenorhabditis elegans SİNEK: Drosophila melanogaster BALIK: Danio rerio

DENEY HAYVANI KULLANIMI • Medikal teknolojinin gelişimi ve araştırmalar • Fare, rat, hamster, tavşan • Balık, kuş, amfibi, pirimat türleri kedi, köpek, domuz • 2001, Almanya 2.13 milyon • 2009, Amerika 1.131 milyon • 2011, İngiltere 3.71 milyon* • Türkiye ? *Saudi Pharmaceutical Journal 2015:23;223–9.

Deney hayvanı kullanımı • Rölatif olarak uzun ömür • Yüksek maliyet • Genom haritalarının tam olarak bilinmemesi DEZAVANTAJLARI

Kullansakta mı yayınlasak, kullanmasakta mı yayınlasak?

“Canlı bir hayvanı incelemek üzere kesip ona zarar verdiğimde, içimde, kaba ve sarsak, elle anlatılamaz derecede, sanatsal bir mekanizmayı parçaladığımı söyleyen acı bir sitem duyarım. Ancak gerçek uğruna, insanlık yararına buna katlanırım.”

Ivan PAVLOV (Fizyolojinin Prensi)

ALTERNATİF MODELLER • Etik problemler • Hayvanların deneylerde kullanımını azaltmak için alternatif metodlar • Alternatif organizmalar, hücre ve doku kültürleri, bilgisayar modelleri • Avantajları: • Verimli zaman kulanımı • Daha az insan gücü kullanımı • Az maliyet

Alternatif örnek organizmalar

Prokaryotlar • Escherichia coli • Bacillus subtilis • Caulobacter crescentus

Tek hücreliler • Dictyostelium discoideum Funguslar • Neurospora crassa • Saccharomyces cerevisiae • Schizosaccharomyces pombe • Aspergillus nidulans

Vertebrasızlar

• Moleküler ve genetik çalışmalar • Hücresel farklılaşma çalışmaları

• Moleküler ve genetik çalışmalar

• Genetik çalışmalar, sirkardian ritim ve metabolik düzenleme çalışmaları • Moleküler ve genetik çalışmalar

• Amphimedon queenslandica • Aplysia sp./sea slug

• Caenorhabditis elegans * • Drosophila melanogaster* • Hydra/Cnidaria

Vertebralılar • Danio rerio/zebrafish*

• Evrim, gelişimsel biyoloji ve karşılaştırmalı genomik çalışmalar • Nörobiyoloji • Genetik gelişim çalışmaları • Genetik ve nöroloji araştırmaları • Rejenerasyon ve morfogenez sürecinin anlaşılması

VERTEBRASIZLAR • Caenorhabditis elegans • Drosophila melanogaster • Yara iyileşmesi • Hücre yaşlanması • Programlanmış hücre ölümü • Toksikoloji

Avantajları: • Kısa yaşam süresi • Küçük boyut, basit anatomi • Çok sayıda oluşları • Daha az etik problem • Ucuz maliyet Dezavantajları: • Gelişmemiş organ sistemleri • Adaptif immün sistemlerinin olmaması

Caenorhabditis elegans • • • • • • • •

Ilıman bölgelerde toprakta serbest olarak yaşayan Apatojen 1 mm, şeffaf Beslenme E.coli suşu OP50 Hermafrodit ve erkek iki cinsiyet Ökoryotik nematod Genom baz dizisi tanımlanan ilk çok hücreli 1965 yılında model organizma

Caenorhabditis elegans • 6 kromozom, 20.000 gen • Genlerin % 80'inin insanda homologları tanımlanmış • Olgunlaşma süreci 2-3 gün • Ortalama yaşam süresi 2-3 hafta

C. elegans yaşam döngüsü

Genes Dev. 2008:22(16); 2149-65.

Caenorhabditis elegans • Büyüme ve üreme için: • Nemli bir çevre, oda sıcaklığı, atmosferik oksijen

• Rutin manipülasyonları için • Petri kapları, 6X–50X büyütme sağlayan alttan ışıklandırmalı stereo mikroskop

Caenorhabditis elegans • Epidermisin farklılaşması, embriyogenez döneminde • Aktin mikrofilament, mikrotubulüs ve sitoplazmik ara filament • Epidermisin bazal yüzeyinde bazal lamina • Laminin, tip IV kolajen • C. elegans melanin üretme kapasitesine sahip çok sayıda tironisinazları kodlar • C. elegans kütikülunda melanin tespit edilmiş

Caenorhabditis elegans

a) YetiĹ&#x;kin vĂźcudunun kesiti

(b) Bazal laminanin biyogenezi Wiley Interdiscip Rev Dev Biol 2012 ;1(6):879-902.

Caenorhabditis elegans • Epidermal katmanının primer işlevi ‘bariyer’ • Doğal bağışıklık, patojenlere karşı aktif ve pasif savunma • Endokrin-ekzokrin sekresyon • Mekano duyarlılık • Yara iyileşmesi • İyonik hemostaz • Metabolik depolanma • Selüler debrisin fagositozu • Sinir sisteminin gelişimi ve işlevi

Caenorhabditis elegans • • • • • • • • • •

Sperm + yumurta= Embriyo AVANTAJLARI yüksek doğurganlık (300-350 yavru) Hücre sayısının sabit olması Şeffaf, gelişimsel aşamalarının takip edilebilirliği Hücre farklılaşması ve hücre çoğalmasının varlığı Hayat döngüsü kısa, hızlı sonuç Genomu küçük ve biliniyor Ekonomik , kolay idame, uzun süreli stok Yumurtalar zor şartlara dayanıklı Bir molekülün etkisini tüm organizma üzerinde gözleyip analiz etme avantajı

Caenorhabditis elegans • İlaç toksikoloji, yaşlanma, yaşam süresi • Berksoy Hayta ve ark. 2014 • Tosun ve ark. 2015 • Özpınar ve ark. 2014

• Yara iyileşmesi • Hengirmen ve ark. 2015

• Oksidatif stres • Üreme • Nörolojik gelişim

Caenorhabditis elegans • Fizyoloji /tıp alanında Nobel Ödülü; • 2002, Brenner S, Horvitz HR ve Sulston J

• C. elegans’ta organ gelişiminin genetiği ve apoptozisin keşfi

• 2006, Fire A ve Mello CC

• C. elegans’ta RNA interferansının keşfi

• Kimya alanında Nobel Ödülü; • 2008, Chalfie M

• C. elegans‘ta yeşil floresanslı protein uygulamaları

Bir yaşlanma modeli olarak C.elegans bireylerinde stronsiyum ile ortaya çıkan değişiklikler* • Stronsiyuma maruz bırakılan C. elegans’ ların kontrol grubuna göre • Yaşam sürelerinde doz artışına bağlı olarak bir artış olduğu • Fiziksel gelişimin doza bağlı olarak azaldığı • Dakikadaki farenks pompalma sayısının doza bağlı olarak azaldığı • Stronsiyumun Ca2+ ile yarışmacı bir molekül olarak, Ca2+’nın yerine geçerek hücre içi Ca2+ artışını engelleyerek ve metabolizmayı yavaşlatarak hücre yaşam süresini arttırabileceği düşünülebilir • Stronsiyum insanlarda yaşlanma üzerine pozitif etki yapabilir *Berksoy Hayta ve ark. 2014

Bir yaşlanma modeli olarak C.elegans bireylerinde kalsinörin inhibisyonu ile ortaya çıkan değişiklikler* • Kalsiyum kanallarının deri yaşlanması üzerindeki rolüne dair bilgiler • Kalsinörin inhibisyonunun C. elegans bireylerinde yaşam süresini uzattığı bilinmekte • Siklosporine maruz bırakılan C. elegans’ların kontrol grubuna göre • Yaşam sürelerinde doz artışına bağlı anlamlı bir artış • Fiziksel gelişimde doz artışına bağlı anlamlı derecede azalma • Kalsinörin inhibisyonu, C. elegans’ların gelişimsel sürecini yavaşlatır ve yaşam süresini uzatır • Kalsinörin inhibitörleri, insanlarda yaşlanma üzerine olumlu etki yapabilir *Tosun ve ark. 2015

Bir yara iyileşme modeli olarak C.elegans bireylerinde stronsiyum ile ortaya çıkan değişiklikler* • Stronsiyum içerikli cam biyomateryallerin antioksidan etki yoluyla yara iyileşmesine olumlu katkıda bulunabileceği bilinmekte • Mikro enjektör ile C. elegans’ların anüs altı kuyruk bölgesinde yara • Travmaya uğramış nematodların yaşam sürelerinin doğal olarak azalır • Stronsiyum uygulanan deney gruplarında yaşam süresi açısından kontrol grubuna göre olumsuz bir değişim gözlenmemiştir • Stronsiyumun yara iyileşmesi üzerinde pozitif veya negatif bir etkisi olmamıştır *Hengirmen ve ark. 2015

Drosophila melanogaster (Meyve sineği) • 4 kromozom, 14.000 gen • İnsan hastalıklarına sebep olan genlerin %75’i sinek ile fonksiyonel olarak uyumlu • Protein dizisinin % 50’si memeli ile homolog • Uzaya giden ilk hayvan türü • Olgunlaşama süreci 9 gün • Ortalama yaşam süresi 2 ay

Drosophila melanogaster yaşam döngüsü

Drosophila melanogaster • Nörodejeneratif hastalıklar, yaşlanma ve oksidatif stres, diyabet, kanser, ilaç bağımlılığı • Yara iyileşmesi • Carvalho et al. 2014, Burra et al. 2013…

• UVC’nin etkileri

• Baden et al. 1996

• Bazal membran yapısının incelenmesi • Mayer et al. 1998

• Isı şok proteinleri • Holland et al.1993

• Sjogren ve SLE otoantikorları

• Fattal et al. 2015, McCauliffe et al. 1990

• Apokrin sekresyon • Farkas et al. 2014

Drosophila melanogaster • Yara iyileşmesinde; • Lezyon üzerinde içeri mikroorganizma girişini engellemek veya kan kaybını engellemek için tıkaç oluşumu • Tıkaç kan hücrelerinden oluşan melaninden zengin bir yapı olarak olgunlaşır • Hasar bölgesinde 6 saat içinde tıkaç oluşumu ve 48. saat sonunda skar gelişimi ile birlikte komplet reepitelizasyonun gelişimi gösterlimiş* *Curr Biol 2013:18;2224-32.

VERTEBRALILAR • Danio rerio (Zebrafish)

Danio rerio • • • • • • •

Sazangiller (Cyprinidae) familyasında, Asya 2-4 cm, popüler bir akvaryum balığı Klonlanmış ilk vertabralı Olgunlaşma 3 ay, ortalama yaşam 2-3 yıl 25 kromozom ve gen yapısı bir kısmı tanımlanmış İnsan genlerinin %70’i zebrafish genleri ile benzer Beyin, sindirim sistemi, kas, damar ve doğal bağışıklık sistemi insan ile yüksek düzeyde fizyolojik homoloji

Danio rerio • Nöral krest orjinli melanositleride içeren pigment hücre sistemine sahip • Pigmente hastalıkların patoloji ve biyolojisinin anlaşılması için potansiyel hedef • Embriyo fertilizasyon sonrası 7. gün şeffaf • Melanin sentez inhibitörleri ile 9-14. gün

Danio rerio yaşam döngüsü

Danio rerio • • • • • •

Post fertilizasyon (pf) 1. gün dermis ve epidermis Pf 32.saat bazal membran Pf 48. saat lamina lucida ve lamina densa Epidermal alanda hücreler arası spikül benzeri mikro köprüler Dermal alanda fibroblastik hücreler içeren kollejenöz stroma Pf 6.gün iyi sınırlanmış epidermis ve dermis yapısı, BMZ varlığı ve hemidesmozamal yapılar ile adult*

*J Invest Dermatol. 2011;131(3):565-71

Danio rerio • • • • • • • •

Gen yapıları memeli gen yapısına ile benzer Yüksek doğurganlık (50-100 yavru) Embriyolarının transparan görünümü Hızlı gelişim süreci AVANTAJLARI Kolay beslenme Kısa yaşam süresi Küçük boyut Gen ekspresyonlarına kolay manipülasyon olanağı

Danio rerio • • • • • • • • • •

Biyoloji Onkoloji Toksikoloji Reprodüktif çalışmalar Teratoloji Genetik nörobiyoloji Kök hücre çalışmaları Evrim teorisi Çevre bilimleri çalışmaları Davranışsal hastalıklar

Danio rerio • • • • • • • • •

Yara iyileşmesi, reepitelizasyon (Richardson et al. 2013) Epidermal frajilite (Postel et al. 2013) Epidermal adezyon mekanizmaları (Has et al. 2011) Melanoma (Lister et al. 2013) Vitiligo (Shin et al. 2013) Pigmentasyon hastalıkları (Kım et al. 2012) Skuamöz hücreli karsinom (Ochoa-Alvarez et al. 2015) İhtiyozis (Frank et al. 2010) Epidermolizis bülloza (Kım et al. 2010)

SONUÇ

ÇALIŞMA SİZİN…

TEŞEKKÜR EDERİM drberksoy@gmail.com sberksoy@cumhuriyet.edu.tr