Avaliação in vitro da atividade citotóxica do sobrenadante proveniente de bactérias probióticas... by Inovação e Sustentabilidade em Saúde, Nutrição e Alimentos

ARTIGO TÉCNICO

1(1): 32-38 Maio 2022 Unisinos ISSN: 2764-6556

doi.org/10.4013/issna.2022.11.5

AUTORES Letícia De Mari Spiecker le_spiecker@hotmail.com Mestre em Nutrição e Alimentos, Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Alimentos, Universidade do Vale do Rio dos Sinos – São Leopoldo (RS).

Avaliação in vitro da atividade citotóxica do sobrenadante proveniente de bactérias probióticas em culturas de células de câncer In vitro evaluation of the cytotoxic activity of supernatant from probiotic bacteria in cancer cell cultures

Maria Eduarda da Cas mecdacas@yahoo.com.br Graduanda do Curso de Fisioterapia, Universidade do Vale do Rio dos Sinos – São Leopoldo (RS).

Thalita Bertol Sbeghen thalita.bertol@gmail.com Graduanda do Curso de Biomedicina, Universidade do Vale do Rio dos Sinos – São Leopoldo (RS).

Juliana de Castilhos * jdecastilhos@unisinos.br Professora do Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Alimentos, Universidade do Vale do Rio dos Sinos – São Leopoldo (RS). [*] Autor correspondente.

FLUXO DA SUBMISSÃO Submissão: 29/03/2022 Aprovação: 14/04/2022

CONTATO DA REVISTA Universidade do Vale do Rio dos Sinos. Instituto Tecnológico em Alimentos para a Saúde – itt Nutrifor. Av. Unisinos, 950, Cristo Rei. 93022-750, São Leopoldo, RS, Brasil. Contato principal: Prof. Dr. Valmor Ziegler. Universidade do Vale do Rio dos Sinos. Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Alimentos. E-mail: revistappgna@unisinos.br.

DISTRIBUÍDO SOB

RESUMO Estudos têm demonstrado resultados promissores quanto às propriedades anticancerígenas dos probióticos, correlacionando a microbiota intestinal disbiótica com diversas doenças, incluindo neoplasias malignas. Para realização do presente estudo, cepas probióticas foram cultivadas por 24 horas para obtenção do sobrenadante. Na sequência foram adicionadas concentrações de 10 a 80 µg/mL nas culturas de células Palavras-chave: tumorais para avaliação citotóxica pelo método MTT Citotoxicidade; ({brometo de (brometo de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il]câncer; probióticos; -2,5-difeniltetrazólio). Os resultados demonstraram anticancerígeno; que as cepas Streptococcus thermophilus MTH17CL396 microbiota e Lactobacillus paracasei DTA 93 apresentaram uma boa atividade citotóxica in vitro sobre as células Hep-G2 e MDA-MB-231, respectivamente. Entretanto, são necessários estudos adicionais para um melhor entendimento da atuação das bactérias intestinais sobre a saúde.

APLICABILIDADE A literatura tem demonstrado que os componentes da dieta e nutrição afetam a incidência, progressão e prevenção de neoplasias malignas. Dessa forma, o melhor entendimento da atuação de cepas probióticas intestinais interligadas ao câncer, é necessário para que se desenvolvam tratamentos adjuvantes, diminuindo os efeitos colaterais deletérios e potencializando as terapias convencionais.

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RESUMO GRÁFICO

[1] Introdução

tigar a atividade citotóxica de diferentes sobrenadantes de bactérias probióticas em culturas de células tumorais de diferentes linhagens

câncer é uma patologia caracterizada por danos e acúmulos de mutações no material genético, mecanismo que culmina em multiplicações desordenadas das células teciduais. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OPAS/OMS) em 2020 ocorreram, aproximadamente, 10 milhões de mortes em decorrência de neoplasias malignas. Projeções para 2040 indicam que o número de novos casos poderá aumentar 29.5 milhões em comparação com 2020 (NIH National Cancer Institute, 2020). Estima-se que no Brasil o número de novos casos por ano, entre o período de 2020 e 2022, seja de 625 mil (INCA, 2020). O intestino humano abriga cerca de 100 trilhões de espécies de microrganismos, as quais integram a microbiota intestinal. Atualmente, sabe-se sobre a existência de uma relação simbiótica entre a microbiota e seu hospedeiro, que atua na manutenção de funções metabólicas, imunológicas e hormonais, quando em equilíbrio (BLASER, 2014; GOULET, 2015; SHARMA, 2019). A disparidade entre as populações colonizadoras, conhecida como disbiose, vem sendo associada a sintomatologia, ao metabolismo de quimioterápicos e aos processos carcinogênicos (GARRETT, 2015; KELLY et al., 2016; SHARMA, 2019). Estudos clínicos e experimentais desenvolvidos com microrganismos vivos, probióticos, demonstram ter efeitos promotores de saúde, principalmente no tratamento e prevenção de diferentes doenças, incluindo alguns tipos de cânceres (DE LEBLANC, 2014; PESSIONE; CIRRINCIONE, 2016; QIN et al., 2012; SHARMA, 2019; SUEZ et al., 2018; WU et al., 2013; ZMORA et al., 2018). Portanto, o presente estudo tem por objetivo inves-

[2] Metodologia [2.1] Obtenção das cepas probióticas Neste trabalho foram utilizadas cepas de Streptococcus thermophilus MTH17CL396 e TH982 e de Lactobacillus paracasei DTA 93, que foram gentilmente fornecidos pela Universidade de Pádua (Università degli Studi di Padova – UNIPD, Itália). As cepas de S. thermophilus MTH17CL396 e TH982 foram originalmente isoladas de queijo Tipo Fontina (Itália) e do queijo Mozzarella di Bufala (Itália), respectivamente. (TARRAH et al., 2018). A cepa de Lactobacillus paracasei DTA 93 foi isolada de fezes de crianças entre 7 e 21 dias, assistidas pelo Banco de Leite Humano (BLH), pela Unidade de Terapia Intensiva Neonatal (UTIN) do Instituto Fernandes Figueira da FIOCRUZ e pelo HMB do Hospital Estadual da Rocha Faria do Rio de Janeiro. Todas estas cepas já foram previamente descritas como cepas bacterianas com propriedades probióticas (GUERRA et al., 2018; TARRAH et al., 2018). A cepa Lactobacillus rhamnosus GG (ATCC 53103) foi incluída em todos os testes como cepa de referência para propriedades probióticas (TARRAH et al., 2018).

[2.2] Obtenção do sobrenadante das bactérias probióticas Foi realizado o cultivo das bactérias em meio ágar M17 (Difco, Estados Unidos) contendo 0,5% de lactose, sendo

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incubadas a 37ºC por 24 horas. Para armazenar as cepas foi preparado uma solução do cultivo com 20% (v/v) de glicerol, fracionadas em tubos criogênicos e armazenadas a - 80ºC. Cada cepa foi subcultivada três vezes no caldo M17 antes de seu uso para promover seu crescimento. Para a obtenção do sobrenadante das cepas probióticas, foi transferido assepticamente 1 mL da cultura descongelada, devidamente homogeneizada, para tubos de ensaio contendo 9 mL de caldo MRS (HiMedia, Estados Unidos) para L.paracasei DTA 93 e 9 mL de caldo M17 para L. rhamnosus GG e para as cepas de S. thermophilus. Posteriormente, as culturas foram incubadas a 37ºC por um período de 24 h a 48 h, sendo a viabilidade estimada pela contagem de colônias características de cada bactéria. Após esse período de incubação, o caldo foi centrifugado a 12.000 r.p.m. por 10 minutos e o sobrenadante foi coletado.

realizado pelo método de MTT ({brometo de (brometo de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazólio) que é um teste colorimétrico utilizado para avaliar a viabilidade celular e o estado metabólico da célula. A viabilidade mitocondrial, e consequentemente, a viabilidade celular, é quantificada pela redução do MTT (que é um sal de coloração amarela e solúvel em água) à formazan (um sal de coloração arroxeada e insolúvel em água) pela atividade enzimática. Dessa maneira, a quantidade de formazan que foi formada, medida por espectrofotometria, é diretamente proporcional à atividade mitocondrial e ao número de células viáveis. As células Hep-G2 e MDA-MB-231 foram cultivadas separadamente em placas de 96 poços na concentração de 1x105 células/mL e incubadas por 24h a 37 °C em ambiente controlado de 5% de CO2. Após esse período, as culturas de células de câncer receberam diferentes concentrações do sobrenadante (10 – 80 µg/mL) e foram novamente incubadas, por 24h a 37°C e em 5% de CO2. O controle utilizado para evidenciar a morte celular foi uma solução de dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) na concentração de 3% (controle positivo) e para o controle de crescimento foi empregado apenas meio de cultivo (controle negativo). Ambos os controles, positivo e negativo, foram incluídos em cada placa em todos os experimentos. Após esse período de 24h, foi adicionado 20 µL de uma solução de MTT (5 mg/mL) em cada poço, sendo as placas incubadas, nas mesmas condições, por mais 2 h. Sucessivamente, foi retirado o meio de cultura das placas e adicionado 100 µL de DMSO (Sigma-Aldrich, Estados Unidos) em cada poço para dissolver os cristais de formazan. Após as placas foram colocadas em incubação a 37°C por mais 20 min e a absorvância do resíduo de MTT foi medida a um comprimento de onda de 570 nm, utilizando um leitor de microplacas (SpectraMax M5, Molecular Devices, Estados Unidos), contra o branco. Os valores de EC50, que se refere à concentração na qual uma droga, anticorpo ou toxina induz uma resposta na metade entre a taxa inicial e a máxima após um tempo especificado de exposição, foram calculados a partir do gráfico de absorvância contra diferentes concentrações do sobrenadante. Todos os experimentos foram realizados em triplicata.

[2.3] Liofilização do sobrenadante livre de células Após centrifugação e coleta, o pH do sobrenadante foi ajustado com uma solução de hidróxido de sódio (NaOH, Sigma, Brasil) 1N até que atingisse a faixa de 6,2 a 6,8. Os sobrenadantes foram filtrados por meio de membranas filtrantes em éster de celulose com 0,22 mm de poro e 25 mm de diâmetro (Millipore). Esse filtrado constitui o sobrenadante livre de células não concentrado, que foi então concentrado 20 vezes por liofilização (LIOTOP) e ressuspenso em solução tampão-fosfato de potássio 4mM (pH 7,0).

[2.4] Cultura das células de câncer As linhagens células tumorais utilizadas neste estudo foram de adenocarcinoma de mama MDA-MB-231 (ATCC® HTB-26™) e carcinoma hepatocelular Hep-G2 [HEPG2] (ATCC® HB-8065™). As células MDA-MB-231 e Hep-G2 foram cultivadas em meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium; Sigma-Aldrich, Estados Unidos), suplementado com 10% de soro bovino fetal inativado (Gibco BRL, Estados Unidos) e 1% de penicilina (10.000 UI/mL) e estreptomicina (10 mg/mL; Gibco BRL, Estados Unidos). Todas as culturas foram mantidas a 37 °C e com 5% de CO2. O monitoramento do crescimento celular foi realizado a cada 24 horas e, quando a monocamada celular atingia 90% de confluência, era realizada a manutenção da cultura celular com lavagem em tampão HBSS (Sigma-Aldrich) e solução de tripsina-EDTA (0,25%) (Gibco BRL, Estados Unidos).

[2.6] Análise estatística Todos os dados obtidos foram submetidos a análise de variância de uma via (ANOVA), seguida pelo teste post hoc de Dunnet, quando necessário, com intervalo de confiança de 95%. Os dados foram analisados pelo programa estatístico GraphPad Prism (versão 9.0) e o nível de significância foi estabelecido em P < 0,05.

[2.5] Ensaios de viabilidade e citotoxidade celular

[3] Resultados e interpretações O objetivo do estudo foi de avaliar a atividade citotóxica do sobrenadantes de diferentes cepas de bactérias

O teste para avaliação da atividade antitumoral foi

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com propriedades probióticas em linhagens de células ao controle (EC50 = 35,17 ± 5,35 μg/mL), é necessária cancerígenas. As cepas utilizadas no presente estudo uma dose muito maior do sobrenadante de Streptococcus têm potencial tecnológico de acordo com estudos ante- thermophilus MTH17CL396 para causar citotoxicidade riores (TARRAH et al., 2018; VENDRAMIN et al., 2017). celular (EC50 = 81,74 ± 0,13 μg/mL). Já quando comSendo assim, estas cepas foram testadas para atividade paramos o controle de Lactobacillus rhamnosus GG citotóxica contra células de adenocarcinoma de mama com os sobrenadantes das outras cepas probióticas, MDA-MB-231 e carcinoma hepatocelular Hep-G2 como thermophilus TH982 (EC50 = 43,61 126 apresentou atividade citotóxica contrausando a linhagens de Streptococcus células Hep-G2 (EC50 = 350,5 ± 23,35 Lactobacillus rhamnosus GG como cepa de referência. ± 15,3 μg/mL; P = 0,586) e Lactobacillus paracasei DTA 127 μg/mL; Tabela 1). Os resultados demonstraram que alguns sobrena- 93 (EC50 = 30,34 ± 10,47 μg/mL; P = 0,586), não obtidantes das cepas probióticas utilizadas, foram signifi- vemos resultado estatisticamente significativo, porém cativamente citotóxicas para as de células Hep-G2 [F(3,9) mesmo assim, estasapenas duas cepas probióticas apresentaram 128 Na linhagem células cancerígenas MDA-MB-231, o sobrenadante de = 595,7], P < 0,0001. O sobrenadante de Streptococcus atividade citotóxica, sendo que a cepa de Lactobacillus 129 Streptococcus thermophilus MTH17CL396 apresentou significativa quando quando thermophilus MTH17CL396 teve um efeito citotóxico paracasei DTAdiferença 93 apresenta maior citotoxicidade significativo (EC50 = 9,93 ± 0,62 μg/mL;) sobre o cres- comparada as demais. (Tabela 1). 130 comparado ao controle = 10,47], = 0,0038. desse ser significativo, isso cimento de células Hep-G2 em [F(3,8) comparação comP as OsApesar resultados do dado presente estudo também revelaram mesmas células tratadas com o controle Lactobacillus que o efeito antiproliferativo é dependente 131 não significa que o sobrenadante tem potencial citotóxico, pois comparado ao controle (EC50 =da dose, rhamnosus GG (EC50 = 60,01 ± 0,24 μg/mL; P = 0,0006). conforme já descrito por Plessas e cols. (2017), que tam132 quando 35,17 comparamos ± 5,35 μg/mL), é necessária umacom dose maiorLactobacillus do sobrenadante de Streptococcus Porém, as células tratadas o muito bém usou rhamnosus GG como referência. sobrenadante de Streptococcus thermophilus TH982 com Além disso, o tratamento de células de adenocarcinoma 133 thermophilus MTH17CL396 para causar citotoxicidade celular (EC 50 = 81,74 ± 0,13 μg/mL). o controle, não observamos diferenças significativas na colorretal Caco-2 com L. paracasei K5 inibiu a prolifecitotoxicidade (EC50 = 61,56 ± 2,90 μg/mL; P = 0,99). ração celular de uma maneira dependente das do tempo e 134 Já quando comparamos o controle de Lactobacillus rhamnosus GG com os sobrenadantes Além disso, neste presente estudo, o sobrenadante de da dose, sendo que os efeitos antiproliferativos pare135 outras cepas DTA probióticas, como Streptococcus thermophilus TH982 (ECda = 43,61 de ± apoptose 15,3 Lactobacillus paracasei 93 foi o que menos apresen- cem ser mediados através via 50 indução tou atividade citotóxica contra a linhagens de células modulação da expressão de proteínas da família Bcl-2 136 (EC50 μg/mL; P = 0,586) e Lactobacillus paracasei DTA 93 (EC50et=al., 30,34 ± 10,47 μg/mL; P = 0,586), Hep-G2 = 350,5 ± 23,35 μg/mL; Tabela 1). (PLESSAS 2017). Na linhagem de células cancerígenas MDA-MB-231, Nosso estudo comparou duas dessas de S. ther137 não obtivemos resultado estatisticamente significativo, porém mesmo assim, estas duascepas cepas apenas o sobrenadante de Streptococcus thermophilus mophilus (MTH17CL396 e TH982) isoladas por Tarrah e MTH17CL396 apresentou diferença significativa quando sendo cols. (2018), de queijos produzidos 138 probióticas apresentaram atividade citotóxica, que aprovenientes cepa de Lactobacillus paracasei na Itália comparado ao controle [F(3,8) = 10,47], P = 0,0038. Ape- e demonstrou que é necessária uma quantidade bem DTA ser 93 significativo, apresenta maior quando comparada as demais. (Tabela 1).isolada do queijo Tipo sar139 desse dado issocitotoxicidade não significa que o inferior do sobrenadante da cepa sobrenadante tem potencial citotóxico, pois comparado Fontina (Streptococcus thermophilus MTH17CL396) para 140 Tabela 1 - EC50 dos sobrenadantes de diferentes cepas probióticas contra as células Hep-G2 e 141

MDA-MB-231 utilizando o ensaio MTT. TABELA 1

EC50 dos sobrenadantes de diferentes cepas probióticas contra as células Hep-G2 e MDA-MB-231 utilizando o ensaio MTT

142 Linhagem

Sobrenadante

EC50 ± DP (µg/mL)

Streptococcus thermophilus TH982

61,56 ± 2,9

Streptococcus thermophilus MTH17CL396

9,93 ± 0,62*

Lactobacillus paracasei DTA 93

350,5 ± 23,35

Lactobacillus rhamnosus GG

60,01 ± 0,25

Streptococcus thermophilus TH982

43,61 ± 15,3

MDA-MB-

Streptococcus thermophilus MTH17CL396

81,74 ± 0,13

231

Lactobacillus paracasei DTA 93

30,34 ± 10,47*

Lactobacillus rhamnosus GG

35,17 ± 5,35

Hep-G2

143 LEGENDA: DP = desvio padrão, MDA-MB-231 = células de adenocarcinoma de mama, Hep-G2 = células de carcinoma hepatocelular.

144

*P < 0,05 quando= comparado controle célulasaode adenocarcinoma de mama, Hep-G2 = Legenda: DP = desvio padrão, MDA-MB-231

145

células de carcinoma hepatocelular. *P < 0,05 quando comparado ao controle.

146 147

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Os resultados do presente estudo também revelaram que o efeito antiproliferativo é

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apresentar atividade citotóxica in vitro em carcinoma hepatocelular quando comparado aos outros sobrenadantes. Já o sobrenadante da cepa isolada da Mozzarella di Bufala (Streptococcus thermophilus TH982) é mais citotóxico para a linhagem celular de adenocarcinoma de mama, embora não tenha havido uma diferença estatisticamente significativa quando comparado ao grupo controle. Isso pode ser explicado devido ao fato de as condições de maturação e conservação dos dois queijos seja totalmente diferente, e portanto, suas bactérias podem apresentar diferentes metabolismos. No estudo de Escamilla, Lane e Maitin (2012) os sobrenadantes de Lactobacillus casei e Lactobacillus rhamnosus GG demonstraram prevenir a invasão das células de câncer de cólon, sugerindo que o sobrenadante probiótico tem substâncias bioativas anti-metastáticas que podem participar na diminuição da atividade celular in vitro (ESCAMILLA; LANE; MAITIN, 2012). Além disso, sobrenadantes de Lactobacillus rhamnosus e Lactobacillus crispatus também possuem efeito citotóxico em células tumorais do tipo HeLa, no entanto, apenas o tratamento com o sobrenadante de Lactobacillus rhamnosus é relativamente efetivo em células HT-29 (NOURI et al., 2016). Ademais, o mesmo trabalho demonstrou que essas bactérias poderiam afetar apenas as células tumorais de HeLa, mas não as células não tumorais do tipo MRC-5, pois o mesmo sobrenadante não teve efeitos adversos quando testados nestas células normais. Os pesquisadores sugerem a presença de uma substância diferente de lactato nos sobrenadantes das cepas de L. rhamnosus que pode ter como alvo específico as células cancerígenas HT-29 e HeLa, mas não as células normais (NOURI et al., 2016). Sendo assim, as cepas de Lactobacillus e Streptococcus podem estimular respostas positivas para a saúde, pois ambas possuem propriedades anticarcinogênicas envolvidas na produção de células natural killer (NK) para regular a progressão de tumores. Além disso, as secreções metabólicas produzidas por Streptococcus thermophilus estão ligados à diminuição do dano ao DNA e, portanto, ao câncer (KUMAR et al., 2010). Sadegui-Aliabadi e cols. (2014) observaram a influência dos sobrenadantes de Lactobacillus plantarum A7 e Lactobacillus rhamnosus GG em três diferentes concentrações (2,5, 5 e 10 mg/mL) na viabilidade de células de adenocarcinoma de cólon humano (HT-29). A concentração de 10 mg/mL demonstrou uma diferença significativa na viabilidade das células HT-29 entre os grupos de sobrenadantes de L. plantarum A7 e L. rhamnosus GG quando comparados com o grupo controle (SADEGHI-ALIABADI et al., 2014). Em um outro estudo, a administração de Lactobacillus rhamnosus GG em células de câncer gástrico e de cólon apresentou efeito antiproliferativo em altas concentrações e reduziu pela metade a viabilidade celular nas linhas celulares de câncer de colorretal (DLD-1) e câncer gás-

trico (HGC-27) (ORLANDO et al., 2009). Além disso, o uso do probiótico Lactobacillus rhamnosus GG induz a ativação de macrófagos, a produção de óxido nítrico por macrófagos e aumenta significativamente a produção do fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), que pode ser citotóxico ou citostático para células tumorais (BERTKOVA et al., 2010; SWITZER et al., 2011). Em um outro estudo, Gammalat e cols. (2016) demonstraram que o Lactobacillus rhamnosus GG induziu a apoptose e reduziu a expressão de várias proteínas angiogênicas e inflamatórias em ratos com câncer de cólon, demonstrando que a administração de L. rhamnosus GG pode desempenhar um papel na prevenção da tumorigênese por meio de inibição da angiogênese e da inflamação (GAMALLAT et al., 2016). As pesquisas também se estendem a outros tipos de neoplasias além do trato gastrointestinal (TGI), como por exemplo, Aghazadeh et al. (2017) demonstrando que a toxicidade celular foi significativa a partir dos metabólitos secretados de Acidobacter syzygii em linhagens de células de câncer bucal em comparação aos resultados com as cepas de Lactobacillus acidophilus. Para os L. acidophilus, a indução de apoptose nas células cancerígenas de câncer bucal foi superior a 89% e em células normais foram menores que 7%. Interessantemente, a indução de apoptose tardia por A. syzygii foi maior do que por L. acidophilus (63,7% e 2,4% respectivamente) (AGHAZADEH; POURALIBABA; YARI KHOSROUSHAHI, 2017).

[4] Considerações finais É importante reconhecer que medidas dietéticas e comportamentais têm influência direta na diminuição do risco de desenvolvimento do câncer. Certamente, múltiplas razões, a saber, dietas desequilibradas, consumo de tabaco e álcool, diminuição da atividade física e exposição a tóxicos ambientais, baixa escolaridade, baixa renda e status socioeconômico, são consideradas para a incidência e progressão do câncer. Ferramentas de intervenção dietética podem ser uma estratégia emergente e segura na prevenção do câncer. O manejo da microbiota intestinal pela alteração da dieta parece ser a maneira mais eficaz e econômica de reduzir o risco de câncer, e, portando, o uso de probióticos e seus sobrenadantes pode ser uma alternativa bastante promissora na interferência da oncogênese e progressão tumoral. No entanto, essa área do conhecimento ainda está nos estágios iniciais e mais pesquisas são necessárias para melhor desenvolver este conhecimento.

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REFERÊNCIAS

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INOVAÇÃO E SUSTENTABILIDADE EM SAÚDE, NUTRIÇÃO E ALIMENTOS

V. 1 - Nº 1

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