Pesquisa de bactérias multirresistentes em efluente hospitalar em um hospital municipal da região... by Inovação e Sustentabilidade em Saúde, Nutrição e Alimentos

ARTIGO TÉCNICO

1(1): 57-64 Maio 2022 Unisinos ISSN: 2764-6556

doi.org/10.4013/issna.2022.11.8

AUTORES Gustavo da Luz Cunha gustavocunhafarm@gmail.com

Pesquisa de bactérias multirresistentes em efluente hospitalar em um hospital municipal da região metropolitana de Porto Alegre Research of multidrug-resistant bacteria in hospital effluent in a municipal hospital in the metropolitan region of Porto Alegre

Farmacêutico, Universidade do Vale do Rio do Sino - São Leopoldo (RS).

Natascha Bom nataschabom6@gmail.com Acadêmica do curso de Biomedicina, Universidade do Vale do Rio do Sino - São Leopoldo (RS).

Giovana Dalpiaz giovana.dalpiaz@gmail.com Biomédica, Universidade do Vale do Rio do Sino - São Leopoldo (RS).

Tanise Gemelli * tanise@plural-ict.org CEO do Instituto Plural - Instituição de Ciência, Tecnologia e Inovação - São Leopoldo (RS). [*] Autor correspondente.

FLUXO DA SUBMISSÃO Submissão: 25/03/2022 Aprovação: 26/04/2022

CONTATO DA REVISTA Universidade do Vale do Rio dos Sinos. Instituto Tecnológico em Alimentos para a Saúde – itt Nutrifor. Av. Unisinos, 950, Cristo Rei. 93022-750, São Leopoldo, RS, Brasil. Contato principal: Prof. Dr. Valmor Ziegler. Universidade do Vale do Rio dos Sinos. Programa de Pós-Graduação em Nutrição e Alimentos. E-mail: revistappgna@unisinos.br.

DISTRIBUÍDO SOB

RESUMO Os hospitais liberam quantidades significativas de efluentes contendo elevadas concentrações de compostos terapêuticos, e se não tratados, causam um impacto considerável sobre o ecossistema. A eliminação de antimicrobianos aos efluentes adjunto das matérias orgânicas contendo microrganismos pode favorecer o desenvolvimento de multirresistência microbiana. Essa propagação pode transforPalavras-chave: mar o esgoto municipal em reservatório para Tratamento de efluentes a seleção de bactérias multirresistentes, que são de grande relevância patogênica e causam hospitalares; microrganismos em efluentes hospitalares; importantes infecções em humanos. Com isso, descarte de antimicrobianos; buscamos avaliar a qualidade dos efluentes resistência microbiana hospitalares, em um hospital municipal da região metropolitana de Porto Alegre, no estado do Rio Grande do Sul, determinando as características de carga orgânica dos efluentes, analisando e identificando as características microbiológicas e verificando a resistência bacteriana frente aos antimicrobianos.

APLICABILIDADE Por conta da ausência de tratamento adequado para líquidos e efluentes hospitalares, os efluentes podem apresentar diversos microrganismos, patogênicos ou não, presentes nas fezes, urina e produtos de descartes quimioterápicos em pias e ralos. A presença de fármacos diversos em águas residuárias, entre eles os antimicrobianos, tem sido alvo de questionamentos e pesquisas nas áreas de saúde pública e ambiental devido, principalmente, ao potencial desenvolvimento de bactérias resistentes a antimicrobianos convencionais e sua conservação no meio ambiente.

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RESUMO GRÁFICO

[1] Introdução

talar é um relevante ponto de discussão, uma vez que estimam um uso diário de 400 a 1200 litros/dia leito. Este grande consumo, em relação à média domiciliar (100 litros/dia), contribui para a geração de grandes volumes de efluentes nestas instituições. (GAUTAMA et al., 2007; EMANNUEL et al., 2009). Dentre os setores hospitalares que mais geram resíduos líquidos de maior relevância destacam-se a lavanderia, os expurgos, onde é realizada a limpeza de diversos materiais, clínicas médicas, unidades de tratamento intensivo, pronto socorro e laboratórios de análises clínicas. As características destes efluentes são mais complexas e podem ser nocivas podendo conter a presença de microrganismos patogênicos, antibióticos, desinfetantes, umectantes, surfactantes e agentes de limpeza, causando maiores complicações no tratamento biológico e apresentando riscos aos ecossistemas aquáticos onde serão lançados. (CONAMA, 2009). Esses contaminantes expelidos por pacientes ou encontrados em materiais que são lançados diretamente no esgoto, são de relevância patogênica e causam importantes infecções em humanos, como as bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae e os cocos Gram–positivos. Os constituintes da família Enterobacteriaceae, Escherichia coli, Klebsiella spp. Enterobacter spp., Salmonella spp., são caracterizados por serem bacilos Gram-negativos e geralmente se localizam no intestino (NACHIMUTHU et al., 2021). O descarte incorreto de antimicrobianos em ralos e pias quando inutilizados, associado a eliminação das excretas de pacientes contendo microrganismos patogênicos ou não, favorece a exposição genética a baixas concentrações de diferentes antimicrobianos. Essa conjugação é responsável pela evolução da resistência bacteriana encontrada nos efluentes hospitalares, no

Brasil possui 12% das reservas de água doce do planeta, perfazendo 53% dos recursos hídricos da América do Sul. Contudo, a má gestão dos recursos hídricos é apontada como um dos grandes problemas relacionados a qualidade e o tratamento de água, se agravando devido à crise hídrica que o país vem enfrentando. (BRASIL, 2018). É um direito de toda população ter um ambiente equilibrado ecologicamente, de uso comum, assim como, de forma coletiva, devemos preservar e defender para que as gerações seguintes tenham acesso a água de qualidade e ao meio ambiente como um todo. O poder público deve assegurar que esse direito seja cumprido, controlando a produção, comercialização e o emprego de técnicas e substâncias que podem apresentar riscos e interferirem na qualidade de vida das pessoas e do meio ambiente. (CONSELHO NACIONAL DO MEIO AMBIENTE (CONAMA), 2005). Diversas fontes de contaminação impactam na má qualidade da água, como hormônios endógenos, hormônios sintéticos, fármacos de diversas composições, cafeína, nano materiais, bactericidas, inseticidas, herbicidas, produtos de limpeza e de higiene pessoal, protetores solares, produtos de cloração e ozonização de águas, entre outros. Juntos esses contaminantes agravam o problema e tornam mais desafiador a missão de proteger o meio ambiente. (BRASIL, 2018). Ainda é possível destacar como um grande problema de saúde pública e um dos mais importantes meios de poluição, o despejo de efluentes hospitalares, diretamente e sem nenhum tipo de tratamento prévio nos esgotos públicos. (BIROSOVA et al., 2020; BRASIL, 2014). O excesso no consumo de água em ambiente hospi-

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esgoto municipal e nas estações de tratamento de esgoto, que se transformam em reservatórios de seleção de bactérias resistentes e multirresistentes. (ZHANG et al., 2020). Segundo Vecchia (2009), mesmo com a importância de um tratamento adequado para esse problema ambiental, e alguns progressos elaborados para a melhoria de um sistema adequado para o despejo dos resíduos sólidos nos serviços de saúde. O Brasil e o Rio Grande do Sul não possuem legislação própria sobre a padronização e a emissão dos efluentes hospitalares em esgotos públicos. (VECCHIA, 2009). Desta forma, o objetivo deste trabalho é avaliar a qualidade dos efluentes hospitalares, em um hospital municipal da região metropolitana de Porto Alegre, no estado do Rio Grande do Sul.

interesse do estudo, e semeadas em ágar MacConkey, ágar Sangue, ágar Cromoclin® e ágar CLED. Todas as culturas foram incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC por 24 horas. Após o período de incubação, os isolados foram analisados e novamente submetidos à coloração de Gram, para confirmação da pureza do crescimento. Para identificação bacteriana o perfil metabólico dos isolados foi traçado. As provas bioquímicas de catalase, uréia, citrato, oxidação, fermentação, SIM (motilidade), INDOL, TSI (tríplice açúcar) e bile esculina, foram realizadas a partir dos cultivos em diferentes meios de cultura (Ágar MacConkey, Ágar Sangue, Ágar Cromoclin®, Ágar CLED). (Gemelli et al, 2020). A avaliação do perfil de susceptibilidade aos antimicrobianos foi dada a partir do teste de difusão em disco, conhecido como antibiograma. (Gemelli et al, 2020). Após a incubação, uma porção da colônia de cada isolado avaliado foi suspensa em solução salina estéril 0,85% com turvação correspondente a 0,5 da escala de McFarland (1,5 x 108 UFC/mL). Após a suspensão, com auxílio de swab estéril, os respectivos isolados foram semeados em placas de Petri de 150 mm contendo ágar Mueller – Hinton. A sensibilidade aos antimicrobianos foi avaliada pela técnica de Difusão em Placas com os antibióticos: ampicilina, amicacina, amoxicilina+clavulanato, ceftazidima, cefalotina, cefepime, cefoxitina, cefuroxima, ciprofloxacino, gentamicina, meropenem, sulfazotrim. As placas foram incubadas a 36°C ± 1ºC, pelo período de 18 a 24 horas, e o diâmetro dos halos de inibição de crescimento foi medido e classificado como sensível, intermediários e resistente, de acordo com os pontos de corte para Enterobacteriaceae conforme Tabela 3 disponível pelo fabricante dos antibióticos Laborclin. Para os isolados de Klebsiella sp. foi realizado o teste de beta-Lactamase de Espectro Estendido (ESBL), avaliada através do método de duplo disco difusão: para testar a cepa frente a dois discos de antibióticos, um contendo a cefalosporina de terceira geração e o outro, disposto a 20 mm de distância, contendo o inibidor de beta-lactamase (amoxicilina + ácido clavulânico). O aparecimento de uma “zona fantasma” ou o alargamento do halo de inibição da cefalosporina, confirma a produção de ESBL. A pesquisa de ESBL é indicada para confirmação da presença das enzimas para fim de controle epidemiológico. (BRASIL, 2013).

[2] Materiais e métodos [2.1] Pontos de coleta As coletas ocorreram em um hospital municipal na região metropolitana de Porto Alegre, no mês de setembro de 2019. Foram realizadas coletas de água do esgoto em dois pontos distintos: o primeiro ponto foi na saída para o esgotamento sanitário que antecede a junção com o esgoto público (amostra bruta), e o segundo ponto foi da chegada da água do sistema de abastecimento municipal coletado em torneira previamente higienizada com álcool 70%. As amostras foram coletadas em frascos de vidro de 1L previamente esterilizados e identificados, sendo conduzidas sob refrigeração até o Laboratório de Microbiologia da Universidade do Vale do Rio dos Sinos - UNISINOS, onde foram imediatamente processadas. Processamento das amostras As amostras passaram por duas etapas distintas de identificação. A primeira com isolamento bacteriano meio de cultivo sólido Ágar Nutriente, onde foram transferidos 0,6 mL de cada amostra coletada, em seguida plaqueadas. A segunda etapa é composta pelo enriquecimento bacteriano em Caldo Nutriente. Em cada caldo foi transferido uma alíquota de 1 mL das respectivas amostras e homogeneizados. Todas as amostras foram incubadas em estufa bacteriológica a 37ºC por 24 horas. Após o crescimento, os caldos de cultivo foram diluídos até a concentração de 10-8, em solução salina 0,85%. Em seguida todas as diluições foram plaqueadas em ágar nutriente e incubada novamente em estufa bacteriológica a 37ºC por 24 horas. Em seguida, para classificação das colônias, realizou-se a análise macroscópica a fim de identificar os diferentes tipos de colônias de acordo com as propriedades morfológicas, e a avaliação microscópica através da coloração de Gram. Posteriormente, foram selecionadas as colônias com características microscópicas de

[3] Resultados [3.1] Perfil bioquímico dos isolados bacterianos A partir do crescimento de colônias nos meios MacConkey, Sangue e CLED, foram escolhidas as colônias com maior crescimento que apresentam diferentes mor-

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fologias macroscópicas. Três isolados com crescimento acima de 100.000 UFC foram selecionadas e identificadas como: A, C e F. Realizada a triagem microscópica identificou-se que os três isolados se apresentavam como bactérias Gram-negativas. Os resultados estão disponíveis na Tabela 1 e foram classificados e identificados conforme as diretrizes do Manual de Detecção e Identificação de Bactérias de Importância Médica, disponibilizado pela ANVISA. (ANVISA, 2004). Perfil de susceptibilidade a antimicrobianos entre os isolados bacterianos encontrados no efluente hospitalar A espécie Klebsiella oxytoca apresentou ausência de

crescimento em torno dos discos com cefoxitina, amoxicilina + clavulanato, cefalotina, cefuroxima, cefepime, sulfazotrim e ampicilina indicando resistência a estes, e obteve crescimento bacteriano para os antibióticos ciprofloxacino, gentamicina e amicacina indicando assim, sensibilidade para estes (Figura 1A). Para a K. oxytoca o teste confirmatório de ESBL, resultou em positivo, onde é notório um aumento no halo de inibição e presença de halo fantasma no antibiótico de classe das cefalosporinas, confirmando que a amoxicilina + ácido clavulânico auxilia na inibição da bactéria adjunto a ceftazidima e cefotaxima ambos com atividade β-lactâmica.

TABELA 1 Tabela 1 – Testes bioquímicos utilizados com os três isolados selecionados Testes bioquímicos utilizados com os três isolados selecionados

Testes Bioquímicos

Amostras (isolados) A

Indol

Catalase

Bile esculina

Oxidação

Fermentação

SIM

H2S

TSI

lactose +

Citrato

Ureia

MO diagnosticado

+: positivo; -: negativo

Klebsiella oxytoca Roseomonas spp. Serratia rubidaea

LEGENDA: +: positivo; -: negativo

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Para a espécie Serratia rubidaea foi observado ausência de crescimento em torno dos discos de cefoxitina, amoxicilina + clavulanato e cefalotina, indicando resistência a estes, e obteve crescimento bacteriano frente a ciprofloxacino, gentamicina, cefepime, meropenem, sulfazotrim, ampicilina e amicacina indicando assim, sensibilidade para estes (Figura 1B). Para gênero Roseomonas sp. houve ausência de crescimento em torno dos discos de cefoxitina, amoxicilina + clavulanato, cefalotina, cefuroxima, sulfazotrim e ampicilina indicando resistência a estes, e obteve crescimento bacteriano para os antibióticos amicacina, ciprofloxacino, cefepime e gentamicina indicando assim, sensibilidade para estes (Figura 1C). Em relação a susceptibilidade dos antibióticos testados, foi observado que os três isolados bacterianos se mostraram resistentes a cefoxitina, amoxicilina + clavulanato e cefalotina, e sensível aos antibióticos, ciprofloxacino, gentamicina e amicacina, e uma similaridade no perfil intermediário quanto ao antibiótico ceftazidima.

bacterianos submetidos à identificação bioquímica, onde foram identificados três microrganismos diferentes, Klebsiella oxytoca, Serratia rubidaea e Roseomonas sp. O gênero Klebsiella spp. é caracterizado como bactéria oportunista, causadora de infecções nosocomiais, como pneumonia e infecções sanguíneas (SILVEIRA et al., 2018). A gravidade da resistência de K. oxytoca a múltiplos fármacos é urgente, pois evidências apontam que ela apresenta uma maior resistência a medicamentos quando em comparação com K. pneumoniae e principalmente pela capacidade de produzir enzimas ESBL, que hidrolisam o anel β-lactâmico em antimicrobianos. Esse patógeno apresenta resistência múltipla a drogas, já tem sido reportado em estudo que 72% de isolados de K. oxytoca apresentaram resistência a gentamicina, amicacina e ceftriaxona e 58% foram resistentes ao imipenem, meropenem, ciprofloxacina e ao aztreonam (SINGH et al., 2016). Este estudo corrobora com o presente estudo, onde foi identificada a multirresistência da klebsiella oxytoca. A espécie Serratia rubidaea, é a menos descrita do gênero Serratia sp é encontrada principalmente no solo, na água e nos alimentos. O isolamento deste microrganismo a partir de amostras clínicas é raro, mas pode causar infecções oportunistas em pacientes gravemente doentes. Quando identificada em amostras clínicas, a S. rubidaea é amplamente isolada de amostras do trato respiratório, feridas na pele, fezes e bile. (LITTERIO; MIRTA et al., 2012; SEKHSOKH et al., 2007; YAO, Xue et al., 2016). Conforme estudo de Abreu et al., (2010), a presença de bactérias Gram-negativas em efluente do Hospital Universitário de Maringá no Estado do Paraná, foi identificada em 19 isolados, dos quais 6 isolados bacterianos eram pertencentes ao gênero Klebsiella sp, dois isolados de E. coli, dois isolados de Yersinia sp.; quatro isolados de Serratia sp.; dois isolados de Hafnia

[4] Interpretação A resistência bacteriana impacta diretamente a saúde pública, sendo uma preocupação de alta prioridade para a OMS (OMS, 2017). Mediante a necessidade do controle de germes multirresistentes, encontrados majoritariamente em ambiente hospitalar, é necessário compreender como melhorar esse cenário. Os efluentes hospitalares são despejados diretamente no meio ambiente, sem tratamento prévio, gerando um ambiente contaminado por microrganismos e também antibióticos, promovendo um potencial de adaptação bacteriana e resistência aos antimicrobianos. No presente estudo, após análises, obteve-se cinco isolados

FIGURA 1 Antibiogramas dos isolados

LEGENDA: (A) antibiograma do isolado A - Klebsiella oxytoca; (B) antibiograma do isolado F - Serratia rubidaea; (C) antibiograma do isolado C - Roseomonas sp.

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sp.; dois isolados de Citrobacter sp. (ABREU et al., 2010). O gênero das Roseomonas sp. é classificado como bactéria Gram negativas de crescimento lento. Yu et al., (2016) analisou duas hemoculturas, com a utilização de sequenciamento de gene 16S rRNA para Roseomonas sp. A presença foi relacionada a dois casos de bacteremia e após isolamento das amostras obteve-se o diagnóstico de R. mucosa do sangue venoso. Os pacientes foram tratados com associação de cefalosporina e metronidazol e vancomicina e carbapenem, após três dias de terapia combinada, ambos apresentaram melhora do quadro e receberam alta. Dados esses que demonstram a boa susceptibilidade do gênero Roseomonas sp. ao tratamento com antibióticos. (YU et al., 2016). No presente estudo os três isolados apresentaram perfil intermediário em relação ao mesmo antibiótico, os isolados K. oxytoca e Roseomonas sp. também apresentaram o mesmo perfil em relação ao antibiótico meropenem, e o isolado Serratia sp. mostrou-se sensível. Nos isolados K. pneumoniae e K. oxytoca foram observadas resistência a carbapenêmicos. Conte et al., (2017) e colaboradores avaliaram a ocorrência de resistência a β-lactâmicos e a quinolonas em isolados de E. coli e K. pneumoniae de amostras de esgoto hospitalar e água de rios. Dos 152 isolados testados, 132 eram resistentes a beta-lactâmicos de acordo com os testes de difusão em ágar com disco. Mais de 60% dos isolados foram resistentes à ceftazidima. (CONTE et al., 2017). Verificamos também que os três isolados foram resistentes ao antibiótico Amoxicilina + Clavulanato, enquanto que somente a K. oxytoca e Roseomonas sp., foram resistentes à ampicilina. O mesmo foi observado por Matos (2017) que avaliou a suscetibilidade antimicrobiana em isolados bacterianos de amostras de água e de efluentes líquidos em três hospitais no município de Novo Hamburgo/RS. No Hospital Municipal, foram avaliados 12 isolados, destes 12 isolados, observou-se maior resistência para o antimicrobiano ampicilina. Já no Hospital Regina dos 15 isolados, 80% apresentaram resistência a ampicilina. Contudo, no Hospital Unimed, avaliaram 17 isolados, destes, foi observada maior resistência para os antimicrobianos, ampicilina (29,41%), cefotaxima (29,41) e amoxicilina + clavulanato (29,41%). (MATOS, 2017). Observamos também que os três isolados bacterianos apresentaram perfil de resistência aos antibióticos Cefoxitina, Amoxicilina + Clavulanato e Cefalotina, e sensibilidade aos antibióticos, Ciprofloxacina, Gentamicina e Amicacina. De acordo com Rodrigues et al. (2016) a Ciprofloxacina é frequentemente prescrita para tratar

infecções do trato urinário no Brasil. (OSIŃSKA et al., 2016). Esse antibiótico é excretado inalterado na urina e nas fezes e permanece adsorvido no lodo, mesmo após o processamento em estações de tratamento de águas residuais (ETARs), diante do exposto esperava-se que os isolados bacterianos apresentassem resistência a esse antibiótico, dados esses comprovados por Matos (2017) observou resistência ao antibiótico ciprofloxacina. Contudo, no nosso estudo não observamos essa resistência nas amostras testadas. Os ambientes aquáticos que recebem grandes quantidades de águas residuais urbanas, resíduos animais e efluentes hospitalares são um veículo para a disseminação de organismos resistentes à antibióticos. (DOLEJSKA et al., 2011; ZHANG et al., 2020). Os EH representam uma fonte importante de resistência à antibióticos ambientais, devido à alta prevalência e risco de propagação de bactérias resistentes em contextos clínicos. (VAZ-MOREIRA et al., 2016). Em sua maioria os medicamentos são excretados de forma inalterada no meio ambiente, o que é motivo de preocupação em relação ao meio e a saúde pública, pois os resíduos de antibióticos no ambiente aquático vêm crescendo cada vez mais. (WRIGHT, 2007; KEMPER, 2008).

[5] Considerações finais Com isso, algumas medidas podem ser tomadas a fim de reduzir o risco de ocorrência de bactérias resistentes à antibióticos no meio ambiente. Uma das estratégias amplamente difundidas é o uso racional de antibióticos a fim de controlar a resistência microbiana. No entanto, quando falamos de um ambiente hospitalar é primordial delinear novas estratégias relacionadas principalmente ao gerenciamento do resíduo gerado após o uso e aplicação desses antibióticos, uma vez que esse gerenciamento pode ser negligenciado pelos profissionais da saúde. Associado a essas medidas é fundamental desenvolver novos e eficazes processos de tratamento de água nos efluentes hospitalares, antes de serem lançados no meio ambiente, visando minimizar a evolução de germes multirresistentes. É fundamental que se estabeleça um pré-tratamento eficiente e que diminua a carga microbiológica desses resíduos, reduzindo assim os gastos com a utilização de métodos para a eliminação total desses microrganismos, diminuindo custos com medicina curativa e doenças que podem ser adquiridas pela má qualidade da água.

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REFERÊNCIAS

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INOVAÇÃO E SUSTENTABILIDADE EM SAÚDE, NUTRIÇÃO E ALIMENTOS

V. 1 - Nº 1

MAIO 2022