Algoritmo diagnostico

Metodiche di analisi e algoritmo diagnostico 43

il sequenziamento a RNA rappresenta un approccio ideale per l’identificazione de novo delle fusioni geniche trascritte. Le problematiche associate a questa metodica sono rappresentate dall’instabilità dell’RNA, soprattutto se ottenuto da campioni FFPE: la frammentazione dell’RNA dovuta alla fissazione in formalina può produrre un templato troppo piccolo per poter essere informativo nella preparazione delle librerie e/o nel sequenziamento. Le limitazioni dell’utilizzo delle metodiche NGS, e in particolare RNA-NGS, sono rappresentate pertanto dalle complessità logistica di produzione e interpretazione dei dati, dalla necessità di ottenere RNA di sufficiente quantità e qualità, dai costi e dall’elevato TAT. Presso l’Istituto Nazionale Tumori è attualmente utilizzato il pannello DNA/RNA Oncomine Comprehensive Assay Plus (TermoFisher), disegnato per identificare fusioni geniche, CNV, TMB e instabilità dei microsatelliti.

DNA-NGS in cfDNA (biopsia liquida)

Questa metodica permette la profilazione molecolare dei tumori metastatici, il monitoraggio della malattia residua minima e della recidiva molecolare, e l’identificazione di mutazioni di resistenza nei geni target durante un trattamento personalizzato.15 Analogamente a quanto accade per altri inibitori tirosin-chinasici, l’insorgenza di mutazioni dei geni NTRK, quali la mutazione puntiforme del dominio chinasico di TRKA/NTRK1 (p.G667C) e TRKC/NTRK3 (p.G696A), è associata a resistenza al trattamento con larotrectinib. Pertanto, la biopsia liquida può essere uno strumento efficace nel monitorare l’insorgenza delle mutazioni di resistenza alla terapia, soprattutto nei casi in cui l’esecuzione di un prelievo bioptico della recidiva sia complesso o potenzialmente dannoso. L’utilizzo della biopsia liquida ha ancora alcune limitazioni, relative in particolare alla sensibilità nell’identificare le mutazioni e, soprattutto, le fusioni geniche. La tecnologia Guardant360 può identificare mutazioni puntiformi dei geni NTRK1 e 3, ma solo le fusioni di NTRK1. Il pannello AVENIO Extended ctDNA copre esclusivamente le fusioni di NTRK1 e il pannello Oncomine Pan-Cancer Cell-Free (ThermoFisher) utilizza una singola libreria per identificare fusioni selezionate dei geni NTRK1 e NTRK3. Il pannello FoundationOne Liquid CDx interroga i geni della famiglia NTRK.

Le fusioni dei geni NTRK sono presenti in numerosi tumori, con una prevalenza alta in istotipi rari e molto bassa nei tumori più frequenti. Poiché la loro identificazione permette l’utilizzo di farmaci estremamente efficaci nei pazienti con tumore avanzato e metastatico, è essenziale stabilire un algoritmo diagnostico che permetta l’identificazione delle fusioni dei geni NTRK con elevata sensibilità e specificità. Sebbene sia ragionevole ipotizzare una certa variabilità nella strate-

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gia diagnostica in funzione dell’organizzazione e della tecnologia disponibile in ciascun laboratorio, le società scientifiche hanno elaborato specifiche linee-guida sulla base della distribuzione, sensibilità e specificità dei metodi disponibili. L’identificazione delle alterazioni dei geni NTRK è fortemente integrata con il modello più recente dell’oncologia di precisione, che si basa sull’azionabilità clinica delle alterazioni molecolari: in questo contesto, le metodiche e le procedure per identificare le fusioni di NTRK sono comprese nel contesto più generale della profilazione molecolare dei campioni clinici. Sebbene idealmente ogni paziente dovrebbe essere testato per la presenza di riarrangiamenti dei geni NTRK, nella pratica viene applicato un triage con algoritmi creati sulla base della prevalenza nota di fusioni nella popolazione oncologica esaminata. Ad esempio, nel Dipartimento di Patologia dell’Istituto Tumori, è stata creata una procedura ibrida, basata cioè sui modelli istologico e mutazionale agnostico. In breve: 1. i casi istologicamente sospetti per un istotipo ad alta prevalenza di fusione di

NTRK sono caratterizzati in prima istanza con FISH e, nel caso di positività e quando il Molecular Tumor Board ritenga potenzialmente possibile una terapia con larotrectinib o entrectinib, confermati con metodica RNA-NGS; 2. i casi per cui è prevista dalle linee-guida ESMO una caratterizzazione upfront con metodica NGS (ad esempio carcinoma polmonare, colangiocarcinoma) sono caratterizzati con un pannello ibrido RNA/DNA (vedi sopra) che interroga i geni NTRK1-3 e, se positivi, confermati con IHC; 3. i casi con bassa prevalenza di fusioni del gene NTRK, per i quali non è prevista un’analisi upfront RNA-NGS (ad esempio carcinoma mammario metastatico), su indicazione del Molecular Tumor Board sono caratterizzati con IHC per espressione di TRK e, se positivi, confermati con RNA-NGS.

La figura 3.3 illustra un caso di tumore miofibroblastico caratterizzato con metodiche IHC, FISH e RNA-NGS (Archer) presso l’Istituto Nazionale Tumori. Recentemente, il Translational Working Group e il Precision Medicine Group dell’ESMO hanno rilasciato un algoritmo per l’identificazione delle fusioni dei geni NTRK nei campioni clinici (figura 3.4).16

Qualora siano valutati istotipi con alta prevalenza di fusione dei geni NTRK, in cui l’identificazione della lesione è di fondamentale ausilio diagnostico e/o patognomonica, in teoria è consentito l’utilizzo di qualunque metodica, ma è sempre preferibile utilizzare FISH e RT-PCR. Quando invece le fusioni di NTRK sono analizzate in una popolazione non selezionata (modello agnostico), il metodo di elezione è rappresentato da DNA-NGS o RNA-NGS. In particolare, qualora l’RNA da analizzare sia ottimale dal punto di vista quantitativo e qualitativo, le metodiche RNA-NGS rappresentano il gold standard per lo screening. Qualora sia identificata la presenza di una fusione in uno dei geni NTRK con le metodiche descritte, è sempre opportuno effettuare anche un test IHC, al fine di confermare l’espressione della protein-chinasi chimerica, che rappresenta il reale bersaglio

A

Metodiche di analisi e algoritmo diagnostico 45

B

C

Esone: 5

ETV6

Esone: 10

NTRK3

Figura 3.3

Tumore miofibroblastico infiammatorio con (A) intensa positività nucleare per pan-TRK. Nel pannello B le cellule tumorali mostrano segnali di fusione del gene ETV6 (in rosso) con il gene NTRK3 (in verde). Nel pannello C è rappresentata schematicamente la fusione del gene ETV6 (esone 5) con il gene NTRK3 (esone 10) evidenziata mediante RNA-NGS (Fusion Plex Lung Cancer panel, Archer).

Campione da testare per la presenza di fusioni di NTRK

Come tecnica confermatoria utilizzare FISH, RT-PCR o RNA-NGS targeted con specifiche sonde per le fusioni di NTRK Sì Il tipo di tumore presenta un’elevata prevalenza di fusioni di NTRK? No

È disponibile una piattaforma per sequenziamento?

No Sì

Utilizzare IHC come metodo di screening

Utilizzare IHC per confermare l’espressione di proteine in caso di positività

Nessuna espressione TRK Individuazione dell’espressione di TRK

Utilizzare NGS come prima tecnica per identificare le fusioni di NTRK, considerando preferibilmente test RNA quando possibile

Figura 3.4

Schema del Translational Working Group e del Precision Medicine Working Group ESMO per l’identificazione delle fusioni dei geni NTRK1-3. Modificata da Marchiò et al.16

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farmacologico. In considerazione della scarsa diffusione delle metodiche NGS nei laboratori di patologia, può essere percorso un approccio combinato, che prevede come analisi frontline IHC e, in caso di qualsiasi segnale di positività, una conferma con DNA-NGS o RNA-NGS. L’approccio combinato (IHC -> NGS) è stato utilizzato con successo anche nel trial clinico registrativo STATRK. Questo approccio è relativamente affidabile in considerazione dell’alto valore predittivo negativo dell’IHC per NTRK nel predire la presenza di fusioni geniche.

A questo proposito, è necessario sottolineare l’importanza della creazione di reti di laboratori organizzate in un modello hub-spoke, nelle quali la valutazione IHC venga condotta nei centri locali seguendo specifici protocolli di analisi e interpretazione del dato, mentre l’analisi NGS venga centralizzata in istituti specializzati e dotati di Molecular Tumor Board accessibili da remoto agli oncologi e patologi locali che hanno in carico il paziente. Questo tipo di organizzazione deve essere basata su criteri logistici e modalità di analisi strutturati, che permettano l’esecuzione del ciclo di analisi e l’interpretazione dei dati in tempi adeguati. La procedura tecnica dei laboratori di patologia e delle loro reti deve comunque essere armonizzata con le esigenze cliniche: per questo motivo è essenziale che la strategia per l’identificazione delle fusioni dei geni NTRK, come più in generale l’oncologia di precisione, sia gestita da un Molecular Tumor Board che identifichi la popolazione da analizzare e la metodica più adeguata, anche tenendo in considerazione la disponibilità di materiale biologico e il timing dell’analisi. Al momento presente, infatti, la valutazione delle fusioni dei geni NTRK non viene effettuata upfront in tutti i pazienti con malattia metastatica. Alcune linee-guida, come ad esempio quella elaborata dal National Comprehensive Cancer Network (NCCN),17 hanno già incluso le fusioni dei geni NTRK tra i biomarcatori da valutare nei pazienti con malattia metastatica. Le linee-guida ESMO sottolineano come le fusioni di NTRK siano da ricercare in tutti i pazienti con malattia avanzata, indipendentemente dall’istotipo (approccio agnostico), in particolare in assenza di ulteriori biomarcatori azionabili e in età precoce.

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