Impatto sui metodi di identificazione di fusioni di NTRK

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

noma, il carcinoma del colon-retto, il tumore bilio-pancreatico e molti altri presentano una prevalenza media sotto l’1% (circa 0,3%).22 Nonostante ciò, recenti studi hanno dimostrato che queste fusioni si identificano con maggior frequenza in lesioni prive di altri driver oncologici, come ad esempio le mutazioni dei geni RAS e RAF, o in un contesto somatico di alta instabilità microsatellitare per i carcinomi del colon.23-25 Questo tipo di informazione, unito all’approvazione agnostica dei farmaci a bersaglio molecolare indirizzati contro le fusioni dei geni NTRK, può influenzare significativamente le metodiche e gli algoritmi diagnostici di identificazione dei pazienti potenzialmente candidabili al trattamento con TRK-inibitori.

Le fusioni geniche possono essere identificate sulla base di differenti molecole, a partire dal DNA tramite analisi di sequenza o ibridazione fluorescente in situ (FISH), passando per l’RNA analizzabile tramite sequenziamento o metodiche di PCR quantitativa associata alla retro-trascrizione (qRT-PCR) per arrivare alla valutazione del prodotto peptidico con l’immunoistochimica.

Immunoistochimica

Questa metodica che sfrutta il legame antigene-anticorpo può essere utilizzata per identificare l’espressione di proteine TRK (riarrangiate o meno). Esistono anticorpi specifici per le proteine TRKA e TRKB, o anticorpi pan-TRK che identificano antigeni comuni tra le tre differenti proteine.13 26 27 Questi ultimi sono i più utilizzati perché permettono uno screening dei tre geni con una sola reazione. Diversi parametri permettono di valutare la qualità della reazione. L’utilizzo di controlli positivi è imperativo vista la scarsa espressione di TRK in tessuti dell’adulto (figura 1.2). In tale contesto si possono utilizzare linee cellulari tumorali portatrici di fusioni note (ad esempio linee KM-12, MO91 e CUTO-3.29) oppure campioni di tessuto nervoso o campioni di appendice che presentino delle terminazioni neuronali periferiche.28 29

L’espressione di proteine TRK chimeriche nelle cellule tumorali varia dal nucleo, al citoplasma e alla membrana citoplasmatica (figura 1.1).8 Per quanto riguarda la localizzazione del segnale di positività, vi sono evidenze riguardo a una certa specificità associata al tipo di partner genico,27 30 31 tuttavia il solo risultato di immunoistochimica non può essere utilizzato come diagnosi definitiva della presenza di un riarrangiamento a carico di uno dei geni NTRK. Sebbene la maggior parte degli studi abbia dimostrato una sensibilità molto elevata (vicina al 100%) e una buona specificità,27 30 31 una quota di campioni tumorali che risultano positivi in immunoistochimica non presenta una fusione di NTRK. La

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Core di TMA come controllo esterno

Campione di tessuto cerebrale Espressione fisiologica delle proteine TRK

Linea cellulare KM12 Espressione della proteina TRKA chimerica codificata dal gene di fusione TPM3-NTRK1

Figura 1.2 Esempi di espressione delle proteine TRK evidenziati da reazioni di immunoistochimica su

tessuti. In questi esempi è stato utilizzato un anticorpo pan-TRK su sezioni di tessuti fissati in formalina e inclusi in paraffina. È messo in evidenza un controllo esterno dato da un core di tessuto effettuato con TMA (Tissue Micro-Array), che possono anche essere multipli. Esempi di controlli positivi utilizzabili nella pratica clinica sono campioni di tessuto cerebrale (in alto), dove è presente espressione fisiologica delle proteine TRK anche nel tessuto dell’adulto. In alternativa, si possono utilizzare linee cellulari di tumori che presentano una fusione a carico di uno dei geni NTRK: in questa immagine è messa in evidenza la colorazione citoplasmatica nella linea cellulare di carcinoma del colon KM12 (fusione in-frame TPM3-NTRK1).

presenza di over-espressione di queste proteine è solo suggestiva della presenza di riarrangiamenti a carico dei geni, che necessitano di una validazione strutturale,26 pertanto l’immunoistochimica deve essere utilizzata come un approccio “a doppio step”, dove ogni campione identificato come positivo viene valutato dal punto di vista molecolare per confermare o meno la presenza di una fusione genica a carico di uno dei tre geni NTRK.

Una problematica associata all’approccio immunoistochimico è la presenza di positività diffusa nel tessuto nervoso, e quindi in patologie tumorali di derivazione neuronale. Stesso scenario si ha nelle lesioni tumorali che presentano una differenziazione neuroendocrina. In tali contesti l’uso dell’immunoistochimica non è consigliato perché non sarebbe un efficace screening, identificando troppe lesioni positive e potenzialmente portatrici di fusione. Infine, sempre riguardo alla performance di tale metodica, si è notato come fusioni che coinvolgono i partner di NTRK3 presentino una localizzazione nucleare e una colorazione sostanzialmente più debole rispetto al segnale intenso e citoplasmatico dei riarrangiamenti dei geni NTRK1/2,27 31 con un più alto tasso di reazioni falso positive.

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RIARRANGIAMENTI DEL GENE NTRK NEI TUMORI SOLIDI

FISH

La metodica di ibridazione in situ fluorescente è applicata per la determinazione di altri prodotti di fusione in ambito diagnostico, tra i quali i riarrangiamenti dei geni ALK, ROS1 e RET. La metodica si basa sull’utilizzo di sonde break-apart, cioè sonde che cadono su uno dei geni target del test diagnostico che risultano in un unico segnale fluorescente in situazioni di mancato riarrangiamento o in segnali separati in caso di fusione genica.32 33 La positività del test è definita se i segnali vengono identificati in almeno il 10-15% delle cellule analizzate.32 34 La metodica FISH, così come l’IHC, non permette l’identificazione del partner di fusione. La metodica FISH può avere un ruolo nei contesti di fusione ETV6-NTRK3 patognomonica di quelle rare istologie citate, mentre è sconsigliato l’utilizzo come metodica di screening perché vi sarebbe la necessità di effettuare analisi in parallelo per ogni singolo gene (NTRK1/2/3) per ciascun caso con un alto carico di lavoro.

qRT-PCR

La metodica di PCR quantitativa associata alla retro-trascrizione si basa sulla formazione di cDNA in vitro partendo dall’RNA estratto dalla sezione in analisi. La metodica permette di individuare le reali fusioni dei geni NTRK1/2/3 e i partner ad essi associati, ma solo per il numero e il tipo di fusioni definite a priori. Questo impedisce l’individuazione di fusioni con partner non noti o associate a punti di rottura alternativi.35 La qRT-PCR si è rivelata essere piuttosto sensibile e specifica nell’ambito delle fusioni dei geni NTRK1/2/3, con un numero minimo necessario di molecole alterate molto basso. Come nel caso della FISH, l’impiego della PCR quantitativa può essere legato all’identificazione di fusioni note in patologie ad alta prevalenza, oppure come metodo ortogonale di validazione della IHC,36 tenendo però in considerazione che le multitarget RT-PCR disponibili permettono di identificare solo fusioni note definite a priori nel disegno dei primer. L’approccio con qRT-PCR riduce l’informatività spaziale della fusione, così come la sua reale espressione, ed è inoltre strettamente dipendente dalla qualità dell’acido nucleico (RNA) estratto dal campione, solitamente molto frammentato in campioni d’archivio.

Sequenziamento massivo parallelo basato su pannelli genici targeted a RNA L’acido nucleico “RNA” può essere substrato di metodiche di analisi di fusione più ampie. In particolare, per i geni di fusione sono stati sviluppati pannelli genici per il sequenziamento di nuova generazione (next generation sequencing, NGS) o sequenziamento massivo parallelo (massive parallel sequencing, MPS). Sebbene metodiche di valutazione dell’RNA totale siano state applicate,37 l’au-

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mentata fattibilità metodologica dei pannelli multigenici mirati ha incrementato la loro diffusione.38 Tali pannelli si basano su protocolli di preparazione dei campioni che si differenziano in: • metodiche a cattura, nelle quali sonde specifiche catturano e arricchiscono le sequenze dei geni selezionati;39 40 • metodiche ad ampliconi, basate su PCR multiple.41 42

In questo ultimo protocollo sono stati sviluppati protocolli ad ampliconi standard, che amplificano e sequenziano solamente le regioni predefinite e, in caso delle fusioni, solo i riarrangiamenti noti, e metodiche con PCR ad ancora (AMP) che permettono l’individuazione di partner di fusioni a priori non noti tramite l’utilizzo di adattatori semi-funzionali.43 In particolare, quest’ultima chimica di preparazione del campione è stata impiegata in studi sia su casistiche retrospettive che su ampie coorti prospettiche, le quali hanno dimostrato che le metodiche di sequenziamento a RNA richiedono materiale di partenza di alta qualità, testato e controllato per i parametri di quantità e frammentazione.44 Metodiche e chimiche differenti richiedono input eterogenei: questo suggerisce di modulare il tipo di approccio alla tipologia di campione, al fine di selezionare il corretto work-flow di analisi. Oltre alle caratteristiche preanalitiche, è importate definire quale sia il reference range, cioè il numero e il tipo di fusioni identificabili con un saggio.

Sequenziamento massivo parallelo basato su pannelli genici targeted a DNA

Tutte le metodiche che sfruttano il DNA come molecola bersaglio per l’individuazione di fusioni geniche si basano su protocolli di preparazione del campione a cattura, che sfruttano l’abilità di esche molecolari nel catturare regioni specifiche del genoma.45 Tali metodiche, che richiedono spesso un input di DNA molto elevato, hanno dato origine a pannelli specifici molto diffusi nello studio delle patologie tumorali. Tra questi, il pannello di MSK-IMPACT permette la valutazione simultanea di SNVs, indel, CNV e fusioni di circa 400 geni onco-relati.31 Per quanto riguarda i geni NTRK1/2/3, il pannello copre alcune regioni introniche ed esoniche dei geni NTRK, anche se la dimensione di numerosi introni, superando il limite massimo catturabile dalle sonde (circa 25 kb), non è analizzabile. Questo aumenta il rischio di risultati falsi negativi per regioni non catturate e di conseguenza non coperte. Inoltre, l’identificazione di un riarrangiamento a livello genomico non rappresenta una prova certa della reale espressione del potenziale prodotto di fusione.46

Tecnologia NanoString

La tecnologia NanoString si basa sulla lettura di un codice fluorescente digitale, la cui chimica lavora tramite coppie di sonde, e permette la misurazione di-