Metodiche di analisi e algoritmo diagnostico
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il sequenziamento a RNA rappresenta un approccio ideale per l’identificazione de novo delle fusioni geniche trascritte. Le problematiche associate a questa metodica sono rappresentate dall’instabilità dell’RNA, soprattutto se ottenuto da campioni FFPE: la frammentazione dell’RNA dovuta alla fissazione in formalina può produrre un templato troppo piccolo per poter essere informativo nella preparazione delle librerie e/o nel sequenziamento. Le limitazioni dell’utilizzo delle metodiche NGS, e in particolare RNA-NGS, sono rappresentate pertanto dalle complessità logistica di produzione e interpretazione dei dati, dalla necessità di ottenere RNA di sufficiente quantità e qualità, dai costi e dall’elevato TAT. Presso l’Istituto Nazionale Tumori è attualmente utilizzato il pannello DNA/RNA Oncomine Comprehensive Assay Plus (TermoFisher), disegnato per identificare fusioni geniche, CNV, TMB e instabilità dei microsatelliti. DNA-NGS in cfDNA (biopsia liquida) Questa metodica permette la profilazione molecolare dei tumori metastatici, il monitoraggio della malattia residua minima e della recidiva molecolare, e l’identificazione di mutazioni di resistenza nei geni target durante un trattamento personalizzato.15 Analogamente a quanto accade per altri inibitori tirosin-chinasici, l’insorgenza di mutazioni dei geni NTRK, quali la mutazione puntiforme del dominio chinasico di TRKA/NTRK1 (p.G667C) e TRKC/NTRK3 (p.G696A), è associata a resistenza al trattamento con larotrectinib. Pertanto, la biopsia liquida può essere uno strumento efficace nel monitorare l’insorgenza delle mutazioni di resistenza alla terapia, soprattutto nei casi in cui l’esecuzione di un prelievo bioptico della recidiva sia complesso o potenzialmente dannoso. L’utilizzo della biopsia liquida ha ancora alcune limitazioni, relative in particolare alla sensibilità nell’identificare le mutazioni e, soprattutto, le fusioni geniche. La tecnologia Guardant360 può identificare mutazioni puntiformi dei geni NTRK1 e 3, ma solo le fusioni di NTRK1. Il pannello AVENIO Extended ctDNA copre esclusivamente le fusioni di NTRK1 e il pannello Oncomine Pan-Cancer Cell-Free (ThermoFisher) utilizza una singola libreria per identificare fusioni selezionate dei geni NTRK1 e NTRK3. Il pannello FoundationOne Liquid CDx interroga i geni della famiglia NTRK.
Algoritmo diagnostico Le fusioni dei geni NTRK sono presenti in numerosi tumori, con una prevalenza alta in istotipi rari e molto bassa nei tumori più frequenti. Poiché la loro identificazione permette l’utilizzo di farmaci estremamente efficaci nei pazienti con tumore avanzato e metastatico, è essenziale stabilire un algoritmo diagnostico che permetta l’identificazione delle fusioni dei geni NTRK con elevata sensibilità e specificità. Sebbene sia ragionevole ipotizzare una certa variabilità nella strate-
