Atividade biológica e toxicidade frente à Artemia salina do acesso BGP 152 de Passiflora suberosa L

III - Artigos Científicos

Atividade biológica e toxicidade frente à Artemia salina do acesso BGP 152 de Passiflora suberosa L.

Glaucia L. P. L. Neco1, Anne R. Santana2, Danielle F. da Silva3, Diego M. da Costa4, Clayton Q. Alves5 , Hugo N. Brandão6 e Onildo N. Jesus7

Resumo

Os produtos naturais vêm revolucionando o tratamento de diversas patologias. As plantas medicinais têm sido ao longo dos anos o recurso mais empregado pelo homem no tratamento de enfermidades de todos os tipos. Diante desses dados e, sabendo da riqueza do gênero Passiflora devido a presença de metabólitos secundários bioativos, juntamente com relatos de diversas propriedades medicinais, faz-se indispensável à realização de pesquisas com diferentes espécies do gênero que avaliem a constituição química e atividades biológicas, como avaliação da inibição da acetilcolinesterase e letalidade frente à Artemia salina. Através da avaliação da atividade inibitória da Acetilcolinesterase, realizada pelo método de Ellman e colaboradores, foi possível verificar que o extrato clorofórmico (EC) apresentou baixa inibição, inferior a 30%, o extrato acetato de etila (EA) apresentou atividade moderada, com inibição de 33,56%, e os extratos bruto (EB) e hexânico (EH) não demonstraram atividade inibitória frente a enzima. Quanto à avaliação toxicológica, todo os extratos testados apresentaram toxicidade frente à Artemia salina nas concentrações de 1000, 500 e 100μg/mL. Em suma, esses resultados demonstram o potencial da espécie, sendo esse trabalho relevante para novos estudos com a espécie Passiflora suberosa. Palavras-Chave: acetilcolinesterase; Artemia salina; fitoquímica; Passiflora suberosa; toxicidade.

Abstract

(Biological activity and toxicity against Artemia salina from the BGP 152 accession of Passiflora suberosa.). Natural products have revolutionized the treatment of various pathologies. Medicinal plants have been, over the years, the most used resource by man in the treatment of all kinds of diseases. In view of these data and, knowing the richness of the genus Passiflora due to the presence of bioactive secondary metabolites, together with reports of various medicinal properties, it is essential to carry out research with different species of the genus that evaluate the chemical constitution and biological activities, such as evaluation of acetylcholinesterase inhibition and lethality against Artemia salina. Through the evaluation of the inhibitory activity of Acetylcholinesterase, carried out by the method of Ellman et a l., it was possible to verify that the chloroform extract (EC) showed low inhibition, less than 30%, the ethyl acetate extract (EA) showed moderate activity, with inhibition of 33.56%, and the crude (EB) and hexane (EH) extracts did not demonstrate inhibitory activity against the enzyme. As for the toxicological evaluation, all the extracts tested showed toxicity against Artemia salina at concentrations of 1000, 500 and 100μg/mL. In short, this work aims to show the diversity of metabolically active products produced by Passiflora suberosa, as well as their pharmacological potential. Keywords: acetylcholinesterase; Artemia salina; phytochemistry; Passiflora suberosa; toxicity

1 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: glaucialaisneco@hotmail.com 2 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: anneramosdesantana@gmail.com 3 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: dfsilva@uefs.br 4 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: diegocost@live.com 5 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: cqalves@uefs.com 6 Universidade Estadual de Feira de Santana, Av. Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, BA, Brasil. E-mail: hugo@uefs.com 7 Pesquisador da Embrapa Mandioca e Fruticultura, Rua Embrapa, s/n, 44380-000, Cruz das Almas, BA, Brasil. E-mail: onildo.nunes@embrapa.br

Introdução

O reino vegetal é responsável pela maior parcela da diversidade química conhecida e registrada na literatura. Medicamentos oriundos de espécies vegetais revolucionaram o tratamento de diversas patologias como as crônicodegenerativas (VIEGAS; BOLZANI; BARREIRO, 2006; NEWMAN; CRAGG, 2012; RODRIGUES, 2018). A doença de Alzheimer (DA) é umas das principais doenças neurodegenerativa descrita na literatura, que leva a uma desordem progressiva e crônica, na qual há um comprometimento de funções corticais, incluindo memória, raciocínio, orientação, compreensão, cálculo, capacidade de aprendizagem, linguagem e julgamento, caracterizada pela destruição de neurônios colinérgicos, sendo uma das principais causas de demência no mundo (HOLTZMAN; MORRIS; GOATE, 2011).

Atualmente os inibidores das colinesterases (I-ChE) são os principais medicamentos utilizados para o tratamento específico da doença de Alzheimer, cujo uso baseia-se no pressuposto déficit colinérgico que ocorre na doença, visando o aumento da disponibilidade sináptica de acetilcolina, através da inibição das suas principais enzimas catalíticas, a acetil e a butirilcolinesterase. Os inibidores da colinesterase têm como resultado concentrações mais elevadas de acetilcolina, conduzindo a um acréscimo da comunicação entre as células nervosas, o que por sua vez pode, temporariamente, melhorar ou estabilizar os sintomas da demência (FERNANDES, 2017).

Contudo vale ressaltar a importância de novos métodos de tratamento para essa patologia que vem crescendo demasiadamente devido ao aumento da longevidade. Com isso, os produtos naturais apresentam-se como as melhores opções para encontrar moléculas potenciais, por serem adquiridas de fontes renováveis, além de servirem como estímulos terapêuticos poderosos e, também, como modelos para a síntese de moléculas derivadas que apresentem maior afinidade por certos sítios de ação (DRASAR; KHRIPACH, 2020). O reino vegetal contribui de forma volumosa para a síntese de moléculas com atividades farmacológicas, entretanto, mesmo as plantas sendo fontes naturais, não é sinônimo de inocuidade e devem ser realizados estudos toxicológicos para comprovar sua segurança (RAHMAN; PRATAMA, 2019). Posto isso, testes alternativos vêm sendo estudados, como a avaliação da toxicidade do composto vegetal frente a Artemia salina. Esse teste vem ganhando espaço dentro dos ensaios toxicológicos devido a sua rapidez, fácil reprodutibilidade e grande confiabilidade dos resultados (RAHMAN; PRATAMA, 2019). O teste com o microcrustáceo A. salina é uma metodologia extensamente utilizada na linha de pesquisa de produtos naturais para avaliar o potencial tóxico de extratos e substâncias isoladas. Ela é utilizada em testes de toxicidade aguda devido sua praticidade de manuseio e cultivo, por ser um método rápido e barato, aplicável como bioindicador em uma avaliação toxicológica pré-clínica (CARVALHO et al., 2009).

Estudos trazem correlação da toxicidade frente à A. salina, com atividades antifúngica, virucida, antimicrobiana, parasiticida, antimalárica entre outras (CARBALLO et al., 2002; MACRAE; HUDSON; TOWERS, 1988; SIQUEIRA et al., 1998; SOLIS et al., 1993; ZANI et al., 1995). Além da correlação com atividades farmacológicas, essa metodologia tem sido empregada como bioindicador em ecotoxicologia avaliando contaminantes presentes em águas e efluentes, como também indicador de toxicidade pela exposição a metais tóxicos, pesticidas, herbicida e toxinas fúngicas (COSTA, 2018; LHULLIER; HORTA; FALKENBERG, 2006).

O gênero Passiflora possui potencial químico para aplicação em diversas áreas. Estudos trás abordagens numerosas de atividades farmacologias atribuídas a esse gênero como capacidade antioxidante, antibacteriana, anti-hemolítica (BANDARA; PADUMADASA; PEIRIS, 2018), potencial citotóxico (AMARAL et al., 2019), efeito hipoglicemiante e hipolipidêmica (SUDASINGHE; PEIRIS, 2018), atividade antifúngica (NUNES, 2021), além de efeitos positivos para ação depurativas, sedativas e anti-inflamatórias (LOPES; TIYO; ARANTES, 2017), atividade antiulcerogênica (NETO, 2015).

Ação diurética, analgésica, efeitos positivos na aplicação em tratamentos de toxicodependentes, de obesidade, de algumas infecções e melhora em sintomas da menopausa (PERDOMO, 2016). Na medicina popular utilizada para diferentes enfermidades associada ao sistema nervoso como ansiedade, depressão e insônia (SILVA, 2020). Diante do exposto, o presente trabalho teve como finalidade avaliar a capacidade inibitória dos extratos brutos de Passiflora suberosa frente à enzima acetilcolinesterase, bem como seu potencial toxico frente ao microcrustáceo A. salina, contribuindo, assim, para o conhecimento científico desta espécie que tem sido pouco explorada do ponto de vista farmacológico.

Material e Métodos

Coleta e identificação do material vegetal

A coleta das partes aéreas do acesso BGP 152 de Passiflora suberosa ocorreu na cidade de Cruz das Almas - Bahia, na Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária (EMBRAPA) Mandioca e Fruticultura, e a exsicata foi depositada no Herbário do Departamento de Biologia da UFRB (campus Cruz das Almas) identificada como HURB 18340. Posteriormente, o material vegetal foi encaminhado para o Laboratório de Extração de Produtos Naturais (LAEX) no Horto Florestal da Universidade Estadual de Feira de Santana. A autorização de acesso ao patrimônio genético vegetal foi obtida junto ao Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (A4B0455).

Preparo dos extratos

O material coletado foi submetido à secagem em estufa a 45±3°C, por 5 dias, até o peso constante. Após a secagem, esse material foi moído em liquidificador industrial e, em seguida, submetido a extração por maceração em metanol, com troca do solvente extrator a cada 5 dias por 5 vezes consecutivas. Os filtrados obtidos foram concentrados em evaporador rotativo sob pressão reduzida, com banho em temperatura de 50±3°C. Após obtenção do extrato metanólico seco, uma alíquota foi retirada para a realização das análises subsequentes, sendo que a massa restante submetida à partição líquido-líquido, utilizando solventes de diferentes polaridades (hexano, clorofórmio e acetato de etila) para obtenção dos respectivos extratos.

Avaliação da atividade inibitória da Acetilcolinesterase

O teste foi realizado pelo método de ELLMAN et al. (1961) com adaptações (RHEE et al., 2001). Utilizando uma microplaca placa de 96 poços, foram adicionados 140 µ L de tampão fosfato (pH 7) somado com albumina (0,1%) em todos os poços, seguidamente acrescentando 20 µ L da enzima acetilcolinesterase (AChE) tipo VI-S obtida de Electroparaus electricous (Sigma-Aldrich®) diluída (0,15 U/mL) e 20 µ L dos extratos teste, na concentração de 1000 µ g/mL dissolvidas em etanol, incubado por 10 minutos a temperatura de 37 ± 1 C°. Após esse período, adicionou-se 10 µ L do reagente de Ellman (DTNB) (10 mM) e, por fim, 10 µ L do reagente iodeto de acetiltiocolina (14 mM). A leitura das absorbâncias foi realizada em leitor de microplacas Multiskan™ GO 3.2 a 405 nm nos tempos de 0 e após 30 minutos de reação. O padrão comercial utilizado como controle positivo a Eserina (fisiostigmina) 500 µ M, como controle negativo ou branco utilizado foi o etanol 10%.

A porcentagem de inibição foi calculada, conforme a Equação: %IAChE = (������ − ������) / ������ �� 100. Em que, %IAChE é a porcentagem de inibição da AChE, ΔAb é a diferença de absorbância do branco no tempo de 10 minutos e no tempo inicial, enquanto ΔAi é a diferença de absorbância do inibidor (padrão ou amostra) no tempo de 10 minutos e no tempo inicial.

Teste de letalidade frente à Artemia salina

O teste foi fundamentado no método elaborado por MEYER et al. (1982) e adaptado por SERRANO, ORTEGA e VILLAR (1996). No experimento foram utilizados ovos do microcrustáceo Artemia salina, onde esses foram incubados

em aquário com água do mar artificial, dissolvendo 19g de sal marinho em 5L de água mineral. O aquário foi dividido em duas partes, com divisória de isopor, que possuía pequenos orifícios para permitir a passagem dos nauplii de A. salina entre os diferentes lados. A menor parte do aquário foi revestida com papel alumínio para impedir a entrada de luz, enquanto a maior parte foi iluminada com o auxílio de uma lâmpada incandescente de 60W, para que os nauplii recém eclodidos migrassem para a luz e pudessem ser recolhidos com maior facilidade. A oxigenação do aquário foi realizada com bomba de ar apropriada. Os ovos de A. salina foram adicionados à parte escura do aquário para eclosão e, após 24h, dez nauplii recém-eclodidos foram coletados com auxílio da pipeta Pasteur e adicionados a tubos de ensaios contendo os extratos bruto, hexânico, clorofórmico e acetato de etila, nas concentrações de 1000, 500 e 100 µ g/mL, com volume de 5mL, por 24 horas e, após esse intervalo, foram contados os nauplii sobreviventes. Os ensaios foram realizados em triplicata. Para confiabilidade do teste, houve a realização concomitante de um teste em branco, utilizando apenas água. A porcentagem da letalidade frente à Artemia salina (%LAS) das amostras foram determinados pela fórmula %LAS = (n° de mortos no teste – n° de mortos no branco / n° de sobreviventes no branco) x 100. Sendo considerado ativo o extrato que apresentar a Concentração Letal Média (CL50) menor que 1000µ g de extrato.

Análise estatística

As análises passaram por tratamento estatístico descritivo, sendo as metodologias realizadas em triplicata. Os resultados foram expressos pela média ± desvio padrão. Para os testes foi utilizada a regressão linear, sendo considerados valores de R2≥0,99. As análises estatísticas foram realizadas por meio de análise de variância (ANOVA), utilizando o teste de Tukey e o teste de Scott-Knott para a comparação das médias obtidas, através do programa SISVAR® versão 5.7. Valores de p<0,05 foram considerados como indicativos de significância.

Resultados e Discussão

Os testes de avaliação da atividade inibitória da enzima Acetilcolinesterase foram realizados com os extratos Bruto (EB), hexânico (EH), clorofórmico (EC) e de acetato de etila (EA) das partes aéreas de P. suberosa (tabela 1).

Tabela 1. Atividade inibitória da Acetilcolinesterase dos extratos de Passiflora suberosa

EXTRATOS (10mg/mL) Média das absorbâncias em 30 minutos % Inibição

ESERINA EB EH EC EA 0,27±0,16 a 2,43±0,25 b 2,59±0,32 b 2,15±0,18 c 27±0,06 d 100,00 a 0,01 b 0,01 b 27,16 c 33,56 d

Variáveis identificadas com uma letra minúscula comum não diferem em nível de significância de 5%. Estatística realizada: ANOVA e Teste Scott-Knott (p<0,05). Fonte: Autora (2022).

VINHUTA (2007) classifica atividade do teste de inibição da Acetilcolinesterase potente quando a inibição da enzima é maior que 50%, inibição moderada de 50% a 30% e baixa atividade quando a inibição é inferior a 30%. Assim, avaliando os resultados observados para os extratos de P. suberosa BGP 152, é possível verificar que o extrato clorofórmico apresentou baixa atividade, com porcentagem de inibição da enzima inferior a 30%, e o extrato em acetato de etila apresentou atividade classificada como moderada, com inibição de 33,56%. Os extratos, bruto e hexânico, não apresentaram atividade inibitória frente à enzima. Entretanto, os valores de inibição dos extratos foram insatisfatórios para o cálculo do CE50, não alcançando valores estatísticos para a realização desse cálculo.

LIMA et al. (2018) realizaram ensaios de atividade anticolinesterásica com resíduos de maracujá (P. edulis), e observaram baixo poder de inibição (10%). MELO FILHO et al. (2018), em testes realizados com o extrato de P. foetida, obtiveram 96,46% de inibição da enzima AChE para esta espécie na concentração máxima de 10 mg/mL, utilizando como padrão eserina e galantamina, com 91,93% e 94,36%, respectivamente. Os resultados do teste de letalidade sugerem que todos os extratos de P. suberosa apresentaram toxicidade frente ao microcrustáceo A. salina (Tabela 2).

Tabela 2. Potencial da letalidade frente à A. salina dos extratos de P. suberosa

Concentração EB EH EC

1000 µ g/mL 100±0,02b 100±2,54b 100±1,21b

EA

100±1,21b

500 µ g/mL 100±0,32b 94,44±2,20b 100±0,05b

100±2,20b 100 µ g/mL 89,16±1,80b 63,33±4,41a 100±0,81b 97,50±2,88b Variáveis identificadas com uma letra minúscula comum não diferem em nível de significância de 5%. Estatística realizada: ANOVA e Teste Scott-Knott (p<0,05). Fonte: Autora (2022).

Não foi possível determinar os valores de CL50 através da equação por regressão linear, devido a quantidade insuficiente de massa da amostra, porém pelos resultados da % LAS encontrados na tabela 2, sugere que todos os extratos de P. suberosa apresentaram toxicidade frente A. salina. Pois, segundo a classificação de MEYER et al. (1982 apud RIBEIRO et al., 2014) que estabeleceram uma relação entre o grau de toxicidade e a dose letal média (CL50) apresentada por extratos de plantas sobre A. salina, onde %LAS acima 1.000µ g/mL, estes, são considerados atóxicos. NGUTA et al. (2011), classificam amostras com valores de CL50 inferiores à 100µ g/mL como altamente tóxicos para o microcrustáceo, valores entre 100 e 500µ g/mL são moderadamente tóxicos, entre 500 e 1000µ g/mL são suavemente tóxicos e acima de 1000µ g/mL atóxicos. Então, de acordo com essa segunda classificação, todos os extratos podem ser considerados altamente tóxicos, pois estatisticamente mostraram letalidade superior à 50% na menor concentração testada, indicando que o CL50, desses extratos são inferiores a 100 µ g/mL. BANDARA, PADUMADASA e PEIRIS (2018) avaliaram a capacidade toxicológica do extrato metanólico e aquoso frente ao microcrustáceo A. salina da espécie Passiflora suberosa, o teste revelou que tanto o extrato metanólico quanto o extrato aquoso foram capazes de exibir efeitos tóxicos com valores de CL50 em 60,3 e 309 µ g/mL, respectivamente, utilizando como controle positivo dicromato de potássio e água do mar com DMSO como controle negativo. A atividade tóxica exibida pelo extrato aquoso foi cerca de cinco vezes e meia mais potente do que o extrato de metanólico.

RAHMAN et al. (2011), realizaram o bioensaio com a espécie P. foetida, apresentando CL50 40µ g/mL para o extrato etanólico. Já ASADUJJAMAN et al. (2014), realizaram o teste com o extrato etanólico de P. foetida e obteve o valor de CL50 80μg/mL. Estudos realizados por RIPA et al. (2009) com a espécie P. edulis apresentaram CL50 de 11,17µ g/mL para o extrato em éter de petróleo das folhas e 6,89µ g/mL para o extrato do caule, 7,91µ g/mL para o extrato clorofórmio de folha e 6,63µ g/ mL para o extrato de clorofórmio do caule. Nesse teste o valor do CL50 dos extratos teve como padrão positivo Sulfato de vincristina que apresentou CL50 5,68µ g/mL. Na literatura é descrito que substâncias de extratos de plantas com CL50<100µ g/mL são consideradas muito ativo comparando a substâncias camptotecina e sulfato de vincristina, substâncias essas utilizadas para o tratamento de algumas neoplasias (SCHRIPSEMA; DAGNINO; GOSMANN, 2007; HARADA, 2009). Assim, o teste de letalidade frente à Artemia salina é um ensaio abrangente, sendo empregado como bioindicador avaliando diversos tipos de contaminantes presentes em águas, utilizado em avaliação de toxicidade aguda relacionados

a extratos de plantas e indicativo preliminar para avaliação de diversas atividades biológicas (LIMA, 2011; ANDRADE, 2017).

Conclusão

A espécie P. suberosa é pouco explorada em comparação com outras espécies do gênero. Sendo assim impulsionou o estudo do espécimen P. suberosa BGP 152. Os testes de atividades biológicas realizados com seus extratos mostraram baixa atividade inibitória da enzima Acetilcolinesterase pelo método escolhido. O teste de toxicidade evidenciou que todos os extratos são tóxicos ao microcrustáceo Artemia salina, apontando uma melhor atividade para o extrato clorofórmico. Esses resultados podem justificar outros estudos de atividades biológicas envolvendo essa espécie, a continuidade do fracionamento até possivelmente o isolamento e identificação dos componentes químicos presentes nos extratos e, além disso, ampliar o conhecimento científico dessa espécie já conhecida, porém pouco explorada no meio científico.

Agradecimentos

Às agências CNPq, FAPESB e CAPES pelo apoio financeiro.

Referências

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