Supresión del síndrome de heces blancas en el camarón blanco del Pacífico, Litopenaeus vannamei, usando lisozima de clara de huevo de gallina

Autores:

Weerapong Woraprayoteᵃ, Laphaslada Pumpuangᵃ, Surapun Tepaamorndechᵃ, Kallaya Sritunyalucksanaᵇ, Metavee Phromsonᵇ, Waraporn Jangsutthivorawatᵇ, Saharuetai Jeamsripongͨ, Wonnop Visessanguanᵃ,*

ᵃ Grupo de Investigación de Ingredientes Funcionales e Innovación Alimentaria, Centro Nacional de Ingeniería Genética y Biotecnología (BIOTEC), 113 Parque Científico de Tailandia, Phahonyothin Road, Pathum Thani 12120, Tailandia

ᵇ Grupo de Investigación de Biotecnología de Acuicultura Integrativa, BIOTEC, 113 Parque Científico de Tailandia, Phahonyothin Road, Pathum Thani 12120, Tailandia

ͨ Unidad de Investigación en Seguridad Alimentaria Microbiana y Resistencia a los Antimicrobianos, Departamento de Salud Pública Veterinaria, Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad de Chulalongkorn, 39 Henri-Dunant Road, Pathumwan, Bangkok 10330, Tailandia

wonnop@biotec.or.th E l camarón blanco del Pacífico, Litopenaeus vannamei, es el peneido más cultivado en el mundo (The Fish Site, 2018). Sin embargo, infecciones y enfermedades que incluyen vibriosis luminosa, síndrome de necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) y síndrome de heces blancas (WFS), han deteriorado cultivos de camarón. Brotes de WFS han sido reportados frecuentemente en Tailandia, siendo el responsable de una pérdida del 10 al 15% de la producción de camarón (Sriurairatana et al., 2014). La enfermedad puede ser detectada por la presencia de fibras de heces blancas (Sriurairatana et al., 2014; Mastan, 2015). El camarón infectado exhibe un exoesqueleto suelto y un hepatopáncreas e intestino pálido. Como consecuencia, la tasa de supervivencia y el rendimiento del crecimiento del camarón se reduce drásticamente.

El Enterocitozoon hepatopenaei (EHP), un parásito microsporidiano en el hepatopáncreas del camarón (Tangprasittipap et al., 2013), ha sido propuesto como la causa de WFS (Ha et al., 2013; Tang et al., 2016). El camarón con WFS colectado en campo mostró en gran medida, infección por EHP. Sin embargo, cuando se experimentó la infestación con EHP, el camarón no demostró los síntomas de WFS (Tangprasittipap et al., 2013). Un incremento de riqueza de vibrios también fue reportado en camarón con WFS (Somboon et al., 2012). La cantidad de vibrios incluyendo V. vulnificus, V. fluvialis, V. parahaemolyticus, V. alginolyticus, V. minicus, V. cholera y V. damselae en la hemolinfa e intestino de camarón con WFS, fue dos veces más alta que en camarones sanos (Somboon et al., 2012). Por lo tanto, se especuló que la infección por vibrio puede contribuir al desarrollo del WFS.

Los antibióticos se han aplicado prevalentemente para tratamientos de infecciones bacterianas en acuicultura. El aumento de resistencia a los antibióticos en bacterias patógenas es una gran preocupación en todo el mundo debido a que el uso profiláctico de antibióticos continúa (Holmström et al., 2003; Chomwong et al., 2018). Se ha demostrado que alternativas de bioseguridad, administración de probióticos y otra suplementación de aditivos, previenen y suprimen brotes de enfermedades. Para controlar el WFS en camaroneras, se ha aplicado tradicionalmente sal ácida orgánica para eliminar un patógeno WFS desconocido, cuando se observa la presencia de fibras fecales blancas. Un informe previo observó que un aditivo con amplia actividad bactericida contra Vibrio, Photobacterium, Flavobacterium y Tenacibaculum podría disminuir la gravedad de los brotes de WFS (Chong et al., 2017). La actividad antimicrobiana contra los vibrios puede ser principalmente responsable de la supresión de WFS debido a la abundancia de vibrio en camarón con WFS.

La lisozima se considera una alternativa potencial de antibióticos. La enzima muestra la actividad lítica que hidroliza los enlaces β- (1, 4) entre el ácido N-acetilmurámico y la N-acetilglucosamina de peptidoglucano en bacterias Gram-positivas (Cunningham et al., 1991). La lisozima se encuentra en una amplia gama de fluidos y tejidos biológicos

(Liburdi et al., 2014). La lisozima de la clara de huevo de gallina (HEWL) se ha utilizado en alimentos y piensos debido a su amplia actividad antimicrobiana (Abeyrathne et al., 2013). Se ha demostrado que la suplementación de lisozima disminuyó la cantidad de colonización e infección por patógenos en animales (Ivanovska et al., 1996; Abdel-Latif et al., 2017; Liu et al., 2010). La lisozima también mostró actividad inmunoestimulante (Barman et al., 2013). Una dieta que contiene lisozima eleva la respuesta inmune previniendo una infección de Aeromonas hydrophilia en cangrejo (Chen et al., 2014). Además, una inyección de lisozima en la trucha arcoíris promovió la actividad inmune y tasa de supervivencia cuando se puso a prueba con A. salmonicida (Siwicki et al., 1998). Sin embargo, la suplementación de lisozima para aliviar enfermedades infecciosas no se ha dilucidado en camarón.

Este estudio tuvo como objetivo determinar el efecto de la suplementación de HEWL sobre la abundancia de vibrio y la expresión de genes involucrados en el sistema inmune y antioxidante en el camarón blanco del Pacífico. Supusimos que la suplementación de HEWL disminuiría el número de vibrios mientras promovía la expresión de genes inmuno y antioxidantes que resultan en resistencia a la infección por vibrio y por brote del WFS. El efecto antimicrobiano de HEWL se investigó in vitro e in vivo. Se determinó que el nivel óptimo de HEWL se aplicaba como un agente antivibrio e inmunoestimulante en camarón. El efecto de la suplementación de HEWL sobre la tasa de supervivencia de camarón con infección por Vibrio y del WFS fue examinado. Este estudio proporcionaría una nueva estrategia utilizando suplementación de HEWL para evitar el uso de antibióticos y prevenir pérdidas de producción de camarón por enfermedades infecciosas, especialmente WFS.

Materiales y métodos Inhibición in vitro de HEWL contra Vibrio spp. La HEWL se obtuvo de Ovofoodtech Co., Ltd. La inhibición de HEWL contra vibrios patógenos se evaluó in vitro. Se detalla los Vibrio spp. en la Tabla 1. Todas las bacterias fueron previamente aisladas del camarón infectado. La inhibición del crecimiento se determinó usando microdilución de caldo de ensayo según el Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (Instituto de Normas Clínicas y de Laboratorio (CLSI), 2012). La concentración inhibitoria mínima (MIC) se definió como la más baja concentración de la sustancia que impide el crecimiento visible del patógeno. La MIC de HEWL se comparó con los de las sales orgánicas incluyendo citrato de sodio (Merck, Alemania) y acetato de sodio (Sigma, ESTADOS UNIDOS).

Dietas y suplementación de HEWL Thai Union Feedmill Pub Co., Ltd. proporcionó una dieta comercial que contenía 35% de proteína, y se utilizó como dieta base en este estudio. La fuente de proteínas de la dieta fue la harina de pescado y soya. Las dietas con HEWL suplementado se prepararon recubriendo la dieta base con HEWL a 0.005 (HEWL0.005), 0.025 (HEWL0.025), 0.125 (HEWL0.125) y 0.625 (HEWL0.625) g/kg de dieta. Brevemente, el HEWL se disolvió por completo en 50 ml de agua destilada (DW) y se roció sobre 1 kg de dieta. La dieta base se roció con 50 ml de DW y se usó como dieta control (CON). Los pellets se secaron al aire a temperatura ambiente durante 45 minutos para tener un 10% contenido de humedad y fueron almacenados a 4 °C hasta su uso.

Colecta de tejidos y camarón Las postlarvas de camarón blanco del Pacífico (PL) 12 se aclimataron en dos tanques de fibra de vidrio de mil litros. Veinte camarones fueron recolectados al azar para detectar la infección del patógeno usando un kit de prueba de PCR IQ2000 (GeneReach Biotechnology Corp., Taiwán). El virus del síndrome de la mancha blanca, virus de la cabeza amarilla, virus de la necrosis infecciosa hipodérmica y hematopoyética, virus del síndrome de Taura y E. hepatopenaei no se detectaron en PL12 utilizado en este estudio. Los camarones fueron transferidos al azar a 5 grupos alimentados con CON, HEWL0.005, HEWL0.025, HEWL0.125 o HEWL0.625 (n = 4 acuarios/grupo con 15 camarones/acuario) como se muestra en Fig. 1A. Los tratamientos de dietas fueron asignados a los acuarios completamente al azar. La calidad del agua fue monitoreada diariamente y mantenida de la siguiente manera: pH 7.5 a 8.5, DO > 5 mg/l, temperatura 28 a 30 °C, y salinidad a 15 ppt. Los camarones fueron alimentados 4 veces al día durante 12 semanas. La tasa de alimentación fue aproximadamente del 10% del peso corporal total. Se cosecharon camarones en la etapa subadulta y muda. El desempeño de crecimiento también se midió durante la cosecha. Los camarones fueron anestesiados en hielo antes de la colecta de tejidos. Tracto gastrointestinal (GI) que contiene intestino medio y posterior, y el hepatopáncreas, se disecó asépticamente.

El tracto gastrointestinal (GI) se usó inmediatamente o se almacenó a -80 °C para la cuantificación de abundancia de Vibrio y ensayo de actividad antimicrobiana,

Tabla 1.- Concentración inhibitoria mínima (MIC) de HEWL, citrato de sodio y sodio acetato contra Vibrio spp. aislado de camarón infectado.

N / A.; sin actividad antimicrobiana a 50 mg/ml de sales ácidas.

respectivamente. El hepatopáncreas se congeló rápidamente y se mantuvo a -80 °C para el análisis de expresión génica. Todos los estudios en animales se realizaron de acuerdo a las Guías del Instituto Nacional de Salud para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales, aprobados por el Comité de BIOTEC Institucional de Cuidado y uso Animal (BT-Animal 17/2560).

Actividad antimicrobiana de HEWL en dietas y tracto gastrointestinal del camarón La dieta suplementada con HEWL y CON se mezcló con el agua de cultivo (10% p/v) a 50 rpm, 30 ± 2 °C durante 1 h. La muestra fue centrifugada a 10,000 × g durante 10 min, y secada a 50 °C para obtener 10% de contenido húmedo. La dieta se pulverizó y se mezcló con 0.3%. (v/v) ácido fórmico a 200 rpm, 25 °C durante 18 h. Las dietas suplementarias sin incubación de agua también se utilizaron para determinar la actividad antimicrobiana. El tracto GI del camarón se homogeneizó en solución salina esterilizada (0.85% de NaCl, 10% p/v). Todos los lisados extraídos de la dieta y del tracto GI se colectaron por centrifugación a 15.000 × g a 4 °C durante 10 min. La actividad antimicrobiana se evaluó como se describió anteriormente (Shugra, 1952), y se reporta como unidad (U)/g de dieta o tejido. Una unidad de enzima se definió como un ΔA 450 de 0.001/min a pH 6.25, 25 °C. El cultivo liofilizado de Micrococcus lysodeikticus ATCC 4695 (Merck, Alemania), se usó como sustrato para determinar el efecto de la actividad antimicrobiana de HEWL.

Abundancia de Vibrio en el tracto gastrointestinal del camarón El tracto GI del camarón se homogeneizó en solución salina esterilizada (1.5% NaCl). Se determinó la abundancia total de vibrio en el tracto gastrointestinal del camarón utilizando el método de recuento de placas. El homogenizado se diluyó y se colocó en placas de agar tiosulfato citrato bilis sacarosa (TCBS, Difco, Francia), un medio selectivo para Vibrio spp. El cultivo se incubó a 35 ± 2 °C durante 24 h según las instrucciones del fabricante. Las colonias verdes y amarillas encontradas en el agar TCBS se registraron como la abundancia total de vibrio y se expresó como log CFU/g de tejido. El color de la colonia indica una capacidad de utilización de sacarosa que podría usarse para predecir

Fig. 1. Diagrama esquemático del cultivo de camarón utilizando suplementos HEWL. El camarón blanco del Pacífico PL12 se aclimató y analizó para detectar contaminación de patógenos. (A) Los camarones se distribuyeron aleatoriamente en 5 grupos alimentados con CON, HEWL0.005, HEWL0.025, HEWL0.125 o HEWL0.625. Cada grupo contenía 4 acuarios con 15 camarones/acuario. Los camarones fueron alimentados durante 12 semanas, y cosechados en la etapa subadulta. Se midió también el rendimiento del crecimiento. El tracto GI del camarón se utilizó para calificar la actividad antimicrobiana y abundancia de vibrio. Se recolectó hepatopáncreas de camarón para el análisis de expresión génica. (B) Los individuos se distribuyeron aleatoriamente en 3 grupos alimentados con CON, HEWL0.125 o HEWL0.625. Cada grupo contenía 3 acuarios con 15 camarones/acuario. Los camarones fueron alimentados por 4 semanas. Se utilizó el hepatopáncreas de camarón para el análisis de expresión génica antes de realizar una prueba de ensayo de vibrio. Los camarones restantes fueron utilizados en la prueba de ensayo para controlar la tasa de supervivencia.

especies de vibrio encontradas en TCBS. Los vibrios positivos de sacarosa contienen V. cholerae y V. alginolyticus, mientras que las cepas negativas de sacarosa son V. harveyi, V. parahaemolyticus y V. fischeri.

Expresión génica relacionada al sistema inmune y antioxidante El hepatopáncreas se homogeneizó en reactivo GENEzol TM (Geneaid Biotech Ltd., Taiwán). El lisado celular se usó para el aislamiento de ARN de acuerdo con al protocolo del fabricante. Las muestras de ARN fueron tratadas con DNasa I (Thermo Scientific, Lituania) según instrucciones del fabricante. La pureza y calidad del ARN extraído y la ausencia del ADN se verificó utilizando electroforesis en gel de agarosa. Uno microgramo de ARN se convirtió en ADNc utilizando iScript TM Reverse Transcripción Supermix (BIO-RAD, EE. UU.), y se diluyó con doble DW antes de ser usado. La expresión génica se realizó por duplicado. Se adoptaron primers específicos de estudios previos para

la detección de genes relacionados con el sistema inmune, incluyendo la enzima profenoloxidasa (ppo), serina proteasa (sp), proteína de unión lipopolisacárido y β-1, 3-glucano (lgbp) y genes relacionados con antioxidantes que incluyen, superóxido dismutasa (sod), tiorredoxina (trx) y ferritina (fer) (Ji et al., 2009; Yang et al., 2015; Wang et al., 2009; Zhou et al., 2010). La expresión de actina-β (Actb) se utilizó como control interno. El nivel de expresión relativo de cada gen objetivo fue calculado utilizando el método 2 -ΔΔCT (Schmittgen y Livak, 2008).

Rendimiento del crecimiento Se registró el rendimiento del crecimiento, el aumento de peso (WG), ganancia diaria promedio (ADG), factor de conversión alimenticia (FCR) y tasa de supervivencia de los camarones. Todos los parámetros de crecimiento fueron calculados de la siguiente manera: WG (%) = 100 × (W f -W i )/W i ADG (g/día) = (W f -W i )/d FCR = FI/(W f -W i ) Supervivencia (%) = N f /N i × 100 donde W f y W i son el peso final e inicial (g) del camarón, respectivamente, d es el tiempo de alimentación (días), FI es la ingesta de alimento (g), N f y N i son el número final e inicial de camarones, respectivamente (n = 4 acuario/grupo de dieta).

Ensayo experimental con V. harveyi Como se muestra en la Fig. 1B, los camarones PL 12 se distribuyeron aleatoriamente en 3 grupos, CON, HEWL0.125 y HEWL0.625 (n = 3 acuarios/grupo con 15 camarones/acuario). Después de 4 semanas de alimentación, camarones de cada grupo fueron colectados y para nuevamente analizar su nivel de expresión génica relacionada al sistema inmune y antioxidante, como se describe en el numeral 2.6 antes del ensayo experimental. Los camarones restantes fueron transferidos a una prueba de ensayo de vibrio (Balcázar et al., 2007). Se cultivó V. harveyi AQVH01 en caldo de tripteína de soya suplementado con 1.5% NaCl a 37°C durante 24 h. El cultivo bacteriano se centrifugó a 7000 × g, 4 °C durante 10 min, y se lavó con solución salina tamponada con fosfato (pH 7.2). Los camarones se sumergieron con el patógeno en el agua de cultivo a 10 7 UFC/ml durante 24 h, transferidos al sistema de agua clara, y alimentados con CON dos veces al día. La tasa de supervivencia se registró 5 días después del ensayo

Suplementación de HEWL en camarón con WFS Los camarones se cultivaron en estanques de tierra en una granja ubicada en Suphanburi, Tailandia. La densidad de siembra fue de 1.56 × 10 5 camarones/HA en estanques de tierra. Solo se llenaba de agua los estanques para reponer la pérdida de agua por evaporación. No hubo tratamiento ni recambio de agua. Durante el período de cultivo, se usaron seis estanques que mostraron fibras fecales blancas a las 6 semanas de cultivo, para determinar el efecto de HEWL0.125 en WFS. Los estanques de camarón con WFS fueron alimentados aleatoriamente con HEWL0.125 o CON (n = 3). Después de alimentarse durante 5 días, si los signos del WFS permanecieron y la tasa de supervivencia fue inferior al 50%, se cosecharon los camarones de acuerdo con las prácticas generales de la granja. Sin embargo, los camarones eran cosechados a las 12 semanas como término de cultivo, cuando no se observaba el WFS. La incidencia y recurrencia del WFS se observó durante todo el estudio. Se registró la tasa de supervivencia y el ADG del camarón.

Análisis estadístico La data se presenta como media ± error estándar (S.E.). Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) de una vía para determinar las diferencias entre grupos. La prueba de rango múltiple de Duncan se calculó para identificar diferencias entre dos grupos cuando se detectaron niveles significativos. Se usó la prueba t de Student para determinar diferencias en la actividad microbiana, rendimiento de crecimiento, análisis de expresión génica y la tasa de supervivencia en camarón con brote del WFS. La tasa de incidencia (IRR) se realizó para determinar la tasa de supervivencia en el ensayo con Vibrio. Las diferencias se consideraron significativas a p < 0.05.

Resultados Inhibición de HEWL en crecimiento de Vibrio Se observó MIC de HEWL contra V. alginolyticus, V. harveyi y V. parahaemolyticus de 0.40 a 3.12 mg/ml (Tabla 1). Mientras, los representantes de sales ácidas orgánicas utilizadas en las camaroneras, el citrato de sodio y el acetato de sodio, no tuvieron ningún efecto sobre la inhibición del crecimiento de Vibrio examinada en este estudio. Para garantizar la estabilidad de HEWL mezclado con una dieta que generalmente se suministraba bajo agua, se determinó la actividad antimicrobiana en las dietas de suplementos HEWL antes y después de la incubación con agua de cultivo. La actividad antimicrobiana de HEWL0.005 y HEWL0.025 no fue significativamente diferente que la de CON tanto en el pre y postincubación con agua. Sin embargo, la actividad de HEWL0.125 y HEWL0.625 fue sustancialmente mayor que el de CON en ambas condiciones (Tabla 2). HEWL0.625 mostró mayor actividad in vitro que otros. No se observaron diferencias significativas en el pre y postincubación con agua. Estos resultados sugirieron que el HEWL exhibió actividad antivibrio in vitro

Tabla 2. - La actividad antimicrobiana en la dieta suplementada con HEWL antes y después de cubicación en agua de cultivo de camarones durante 1 h.

Estadísticamente significativo en comparación con CON en la misma dieta y condición de incubación. No se observaron diferencias estadísticamente significativas antes y después de la incubación en el cultivo de agua dentro del mismo nivel suplementario. n = 3 por grupo.

y la dieta suplementada con HEWL ≥ 0.125 g/kg, mostró actividad antimicrobiana independiente a la exposición del agua de cultivo.

Actividad antimicrobiana de HEWL in vivo en camarón blanco del Pacífico Era importante determinar la presencia de actividad HEWL durante transición en el tracto gastrointestinal del camarón. Primero examinamos la actividad antimicrobiana de HEWL después de que las dietas suplementarias se ingirieron en el tracto gastrointestinal. Como se muestra en la Fig. 2A, la actividad antimicrobiana en el tracto GI de camarón alimentado con HEWL0.005 y HEWL0.025 fue similar al de CON. A diferencia del camarón alimentado con HEWL0.125 y HEWL0.625 que mostró actividad en el tracto gastrointestinal a 2160 y 3880 U/g de tejido, respectivamente.

La actividad encontrada en HEWL0.125 y HEWL0.625 fue significativamente más alta que el de CON. Además, la abundancia de vibrio en el tracto gastrointestinal del camarón se cuantificó utilizando placas de contaje TCBS. Los resultados demostraron una disminución significativa en número total de vibrio en el tracto gastrointestinal de camarón alimentado con HEWL0.125 y HEWL0.625 en comparación con CON (Fig. 2B). El grado inhibitorio contra la abundancia de vibrio de HEWL0.125 fue comparable a la de HEWL0.625. También observamos que HEWL0.125 y HEWL0.625 mostraron una disminución en la formación de colonias verdes en lugar de colonias amarillas formando vibrios. Estos resultados sugirieron el efecto de HEWL en la supresión de Vibrios sacarosa negativos, en el tracto gastrointestinal.

Efecto de HEWL en la expresión génica relacionada con el sistema inmunitario y antioxidante Examinamos el efecto de la suplementación de HEWL sobre la expresión génica relacionada a la inmunidad y antioxidantes en camarón. Se investigó la expresión génica relacionada con el sistema inmune en el hepatopáncreas debido a que el hepatopáncreas está involucrado en la digestión de los alimentos y la absorción de nutrientes en el camarón. Como se muestra en la Fig. 3A, HEWL0.125 estimuló

Fig. 2. Actividad antimicrobiana en el tracto gastrointestinal del camarón. El tracto GI se recogió de camarón alimentado con CON, HEWL0.005, HEWL0.025, HEWL0.125 o HEWL0.625 durante 12 semanas, y se homogeneizó en solución salina esterilizada. (A) La actividad antimicrobiana en lisados de tejidos se determinó en función de la actividad lítica a Micrococcus lysodeikticus ATCC 4695. La actividad antimicrobiana se expresó como U/g de tejido. Una unidad de la enzima se definió como un ΔA 450 de 0.001/min. La data es la media ± S.E., n = 5 por grupo. Las diferentes letras indican diferencias estadísticamente significativas. (B) La abundancia de vibrio en el tracto gastrointestinal del camarón. Los lisados de tejidos se diluyeron y se incubaron en agar TCBS para el cultivo de vibrio. Se registró la presencia de colonias verdes y amarillas. Las colonias de vibrio total fueron la suma de las colonias verdes y amarillas. La data es la media ± S.E., n = 10 por grupo. Las diferentes letras indican diferencias estadísticamente significativas. (Para la interpretación de referencias de color de esta leyenda de la figura, se refiere al lector a la versión web de este artículo)

considerablemente la ppo y expresión de sp en comparación con otros. La expresión de ARNm de ppo y sp fue 5.88 y 17.33 regulación ascendente, respectivamente, en HEWL0.125 en comparación con CON. Sin embargo, lgbp no fue significativamente elevado por la suplementación de HEWL. También investigamos la expresión de genes sod, trx, y fer como la actividad antioxidante involucrada en el mecanismo de defensa contra la infección por patógenos. De acuerdo con la expresión del gen relacionado con el sistema inmune, HEWL0.125 mostró un aumento sustancial en su expresión génica relacionada a antioxidantes (Fig. 3B). Las expresiones de Sod, trx y fer fueron 5.16, 3.30- y 16.71 veces mayor, respectivamente, en HEWL0.125 en comparación con CON. Nuestra data indica que la suplementación de HEWL0.125 promueve en gran medida, mecanismos inmunes y antioxidantes del camarón a un nivel de expresión génica.

Efecto de la suplementación de HEWL en el rendimiento del crecimiento del camarón Se analizó el efecto de la suplementación de HEWL en el rendimiento del crecimiento. Nuestros resultados proporcionaron evidencia de que la suplementación con HEWL no mostró cambios significativos en la tasa de supervivencia y ningún parámetro en rendimiento de crecimiento incluyendo WG,

ADG y FCR entre grupos (Tabla 3). También observamos que el camarón alimentado con suplementos de HEWL no tenía signos de anomalías graves, sugiriendo que no hay efectos adversos de HEWL sobre el camarón.

Resistencia al Vibrio en camarón alimentado con HEWL Como se encontró un aumento en el número de vibrios en camarón con WFS, evaluamos el efecto de HEWL0.125 y HEWL0.625 en la resistencia al vibrio en camarón antes de una investigación en camarón WFS. Antes de una prueba de ensayo, HEWL0.125 nuevamente aumentó la expresión de ppo y sp (Fig. 4A), y sod, trx y fer (Fig. 4B) en comparación con CON. Después del ensayo con Vibrio, los camarones eran luminiscentes, indicando un signo de infección por Vibrio como se muestra en la Fig. 4C. Todos los grupos tuvieron una disminución en la tasa de supervivencia después de 5 días de prueba (Fig. 4D). El análisis estadístico utilizando IRR señaló que la tasa de supervivencia de HEWL0.125 (66.67%) y HEWL0.625 (66.67%) fue significativamente mayor que la de CON (16.67%). A pesar de que HEWL0.125 demostró el profundo efecto sobre el sistema inmune y estimulación del gen antioxidante, las tasas de supervivencia no fueron diferentes en el camarón que se alimentó con ambas dietas. Estas observaciones sugieren que el efecto de HEWL en la resistencia al vibrio se debió en gran medida a la actividad antivibrio.

Efecto de la suplementación de HEWL en la supresión del WFS Como HEWL0.125 podría retener significativamente la acción antimicrobiana cuando se mezcla con el balanceado, se suprime el número de vibrios en tracto gastrointestinal del camarón, mejora la expresión del gen relacionado con el sistema inmuno y antioxidante, y mejora la tasa de supervivencia contra la infección por vibrio, nosotros pensábamos hipotéticamente que la suplementación de HEWL0.125 contribuiría con efectos beneficiosos contra un brote de WFS. El HEWL0.125 y CON fueron introducidos en estanques de tierra a las 6 semanas cuando se detectaba heces blancas y fibrosas. Después de 5 días de alimentación, la presencia de materia fecal blanca permaneció presente en camarón alimentado con CON (Fig. 5A). En contraste,

Fig. 3. Efecto de la alimentación suplementada con HEWL sobre la expresión génica. El hepatopáncreas se recogió de camarón alimentado con CON, HEWL0.005, HEWL0.025, HEWL0.125 o HEWL0.625 durante 12 semanas. El ARN total se aisló, se convirtió en ADNc y se usó en PCRq. La reacción de PCR se realizó por duplicado usando un PCRq basado en SYBR. El Actb se utilizó como control interno. (A) Expresión de genes relacionados con el sistema inmunitario, ppo, sp y lgbp, y (B) Expresión de genes relacionados con antioxidantes, sod, trx y fer. Los valores son la media ± S.E., n = 5 por grupo. Las diferentes letras indican diferencias estadísticamente significativas. la suplementación HEWL0.125 no mostró materia fecal blanca. La recurrencia también no fue observada hasta el final del estudio. Estos resultados fueron encontrados consistentemente en todos los estanques entre los dos tratamientos. Aunque ambos grupos fueron cosechados en diferentes momentos debido a prácticas de la granja, la tasa de supervivencia y ADG se pudieron comparar. Los resultados mostraron que la tasa de supervivencia (Fig. 5B) y ADG (Fig. 5C) de camarón alimentado con HEWL0.125 fueron significativamente mayores a los del control. Tomados en conjunto, nuestra data sugiere que la suplementación con HEWL suprimió la presencia de materia fecal blanca y aumenta la tasa de supervivencia y ADG de camarón con WFS. Discusión La HEWL se ha utilizado para disminuir la colonización de patógenos mientras mejora el estado inmune tanto en el ganado como en la acuicultura (Ivanovska et al., 1996; Abdel-Latif et al., 2017; Liu et al., 2010; Barman y col. 2013; Chen et al., 2014; Siwicki et al., 1998; Oliver y Wells, 2015; Nyachoti et al., 2012; Ragland y Criss, 2017; Deng et al., 2011). A nuestro conocimiento, este es el primer informe que utiliza la HEWL como suplemento alimenticio en camarón. Encontramos que la HEWL mostró actividad antivibrio y expresión regulada por aumento de genes inmunes y antioxidantes en camarón. Es importante destacar que el uso de suplementos HEWL mejoró la tasa de supervivencia del camarón con vibriosis luminosa y con WFS. Nuestros hallazgos

Tabla 3.- Rendimiento del crecimiento y tasa de supervivencia (%) de camarón alimentado con CON, HEWL0.005, HEWL0.025, HEWL0.125 y HEWL0.625 durante 12 semanas.

WG, ADG y FCR fueron ganancia de peso, ganancia diaria promedio y factor de conversión alimenticia, respectivamente.

sugieren que la suplementación con HEWL proporcionó los efectos beneficiosos para camarón contra enfermedades infecciosas.

La lisozima (tipo c) de invertebrados ha sido previamente identificada en camarón (Kaizu et al., 2011). La lisozima (tipo c) ha sido ampliamente estudiada en camarón debido a su expresión significativa en hemocitos y células linfoides innatas (Ji et al., 2009; Kaizu et al., 2011; Qiao et al., 2013; Koiwai et al., 2016; Yao et al., 2008). Estas celdas facilitan la fagocitosis para eliminar patógenos invasores. La HEWL también fue clasificada como tipo c (Wu et al., 2019). La secuencia de aminoácidos de la lisozima tipo c del camarón muestra un 61% de similitud con la HEWL. En general, la lisozima tiene mayor actividad inhibiendo el crecimiento de bacterias Gram-positivas que bacterias Gram-negativas (Cegielska- Radziejewska et al., 2008a). La enzima hidroliza el β-1, 4-glicosídicos enlazados con peptidoglucano de bacterias Gram-positivas (Callewaert y Michiels, 2010). Sin embargo, la HEWL tiene otro modo de acción al ser depositada dentro de la membrana externa de bacterias Gram-negativas (Derde et al., 2013). Como resultado, la estructura de la membrana es interrumpida conduciendo a una muerte celular bacteriana. Por lo tanto, la HEWL que suprime a vibrios gram-negativos, puede ser algo posible como se lo demuestra en este estudio.

La presencia de actividad de la HEWL jugó un papel clave contra la infección patógena (Chen et al., 2014; Cegielska-Radziejewska et al., 2008b). Nosotros demostramos que una dieta HEWL ≥ 0.125 g/kg mostró actividad antimicrobiana en el agua de cultivo cuando se mezcla con alimento. Era posible que la enzima pueda unirse a la matriz dietética. Como resultado, la actividad podría retenerse bajo el agua. Se realizó una hora de incubación con el cultivo en agua debido al hecho de que la ingesta de alimento del camarón ocurre dentro de ese tiempo. De nuevo, HEWL ≥ 0.125 g/kg de dieta demostró la actividad antimicrobiana y una reducción en el número de vibrios en el tracto gastrointestinal. Estos resultados demostraron que la dieta de HEWL ≥ 0.125 g/kg mostró actividad antimicrobiana tanto in vitro como in vivo. También descubrimos que HEWL0.125 y HEWL0.625 suprimieron de manera similar la abundancia de Vibrio.

La HEWL0.125 puede ser adecuado para suprimir el número de vibrios en el tracto gastrointestinal del camarón. La supresión de la abundancia de vibrio fue el posible resultado de una disminución en el número de colonias verdes en lugar de colonias amarillas formando vibrios. El color de las colonias depende de utilización de sacarosa de especies de vibrio sin asociación de patogenicidad (Kobayashi et al., 1963). Vibrios incluyendo V. parahaemolyticus y V. harveyi no pueden utilizar sacarosa y muestran colonias verdes en TCBS (Kobayashi et al., 1963; Farmer et al., 2003). Un despliegue en colonias verde de vibrio en GI de camarón estaba de acuerdo con la actividad in vitro que muestra el crecimiento de V. harveyi Vh1 y V. parahaemolyticus Vp1, el plásmido de toxina AHPND y 5HP fueron inhibidos por HEWL.

La suplementación con lisozima podría estimular las respuestas inmunes y aumentar la supervivencia durante la infección bacteriana (Chen et al., 2014; Ragland y Criss, 2017). Detectamos un efecto similar de la suplementación de HEWL en la estimulación de la expresión de genes inmunes relacionados. Se proponía que la lisozima rompía las células bacterianas liberando una pared celular componente, peptidoglucano (Cerenius et al., 2008). Se sabe que el peptidoglucano activa la fenoloxidasa de la profenoloxidasa en artrópodos (Liu et al., 2011; Lee et al., 2004). Cambios en las piscinas de zimógeno podría afectar la expresión génica de sus elementos de acción convirtiendo enzimas (Boggs et al., 2018; Blanchette et al., 1997). Además, el peptidoglucano se usó para promover la actividad fenoloxidasa en Penaeus monodon (Pan et al., 2015). Se requiere investigación subyacente para dilucidar mecanismos. En este estudio, HEWL0.125 activó la expresión de ppo y sp de una manera específica de dosis, pero no tenía efecto sobre el de lgbp. En cambio, la HEWL0.625 no pudo aumentar notablemente la expresión regulada de ppo, sp y lgbp en comparación con la HEWL0.125. Una sobredosis del inmunoestimulante puede provocar estimulación crónica y agotamiento del sistema inmune (ApinesAmar y Amar, 2013). El ppo es la forma inactiva de la fenoloxidasa convertida en la enzima activa durante la infección.

La fenoloxidasa implica la producción de melanina que se une a la superficie de microorganismos extraños conduciendo a una aglutinación microbial (Amparyup et al., 2013). Informes previos demostraron que P. monodon era más susceptible a la infección por Vibrio cuando se redujo la expresión de ppo (Amparyup et al., 2009; Charoensapsri et al., 2009). Por otro lado, las funciones de Sp la activación de fenoloxidasa. La enzima divide Ppo a fenoloxidasa (Amparyup et al., 2013). Se observó alteración de la expresión sp cuando Fenneropenaeus chinensis se infectó con vibrios (Ren et al., 2009). Nuestros hallazgos indicaron que la suplementación con HEWL mejoró la expresión génica del camarón relacionada con el sistema inmune, especialmente en la producción de fenoloxidasa.

Durante la eliminación de patógenos

invasores, se producen especies reactivas de oxígeno (ROS) en exceso (Ji et al., 2011). Las ROS deben ser eliminada por el sistema antioxidante (Ren et al., 2010; Tassanakajon et al., 2013). La HEWL0.125 aumentó la expresión de genes relacionados con antioxidantes incluyendo sod, trx y fer. El SOD es una enzima antioxidante que elimina las ROS durante una infección en camarón (Ji et al., 2011). Un aumento en la expresión sod se encontró de manera similar en pollos de engorde alimentados con lisozima (Abdel- Latif et al., 2017). El Trx es un disulfuro reductasa que actúa como un electrón donante. La proteína funciona en el mantenimiento celular durante el estado redox del tiol/disulfuro (Ren et al., 2010). El trx está asociado con la respuesta inmune en camarón debido a su regulación positiva durante la infección (Ren et al., 2010). Fer, una proteína de almacenamiento de hierro, participa en la desintoxicación y en la respuesta de defensa del huésped. Una inyección de ferritina en camarón mejora significativamente los niveles inmunes y resistencia contra el virus del síndrome de la mancha blanca (Ruan et al., 2010). Nuestra data demostró que HEWL0.125 reguló la expresión de sod, trx y fer resultando probablemente en el incremento de la actividad antioxidante en camarón.

Los vibrios son bacterias comensales que se encuentran en el camarón y sus hábitats. Un incremento de vibrios patógenos conduce a brotes de enfermedades (Xiaojing et al., 2016; Biju y Gunalan, 2016). El WFS es una enfermedad del camarón asociada con el aumento de vibrios, pero con un patógeno causante aún por ser identificado. Por lo tanto, evaluamos el efecto de HEWL en camarón afectado por vibrio y camarón con WFS en el laboratorio y la granja, respectivamente. Nuestros resultados demostraron que la suplementación de HEWL0.125 y HEWL0.625 pueden promover la resistencia a la vibriosis. El efecto de HEWL en la resistencia a la infección por vibrio probablemente fue el resultado de la actividad antivibrio en HEWL ya que HEWL0.625 no podía estimular el sistema inmunitario y expresión de genes antioxidantes, pero aún así pudo mejorar la supervivencia del camarón infectado por Vibrio. Sin embargo, la HEWL0.125 fue elegida debido a aspectos económicos en una producción a gran escala

Fig. 4. Efecto de la suplementación con HEWL sobre la infección de vibrio. El camarón fue alimentado con CON, HEWL0.125 o HEWL0.625 durante 4 semanas. El hepatopáncreas se recolectó para el análisis de expresión génica antes de una prueba de ensayo de vibrio. El ARN total se aisló, se convirtió en ADNc y se usó en PCRq. La reacción de PCR se realizó por duplicado utilizando un PCRq basado en SYBR. El Actb se utilizó como control interno. (A) Expresión de genes relacionados con el sistema inmunitario, ppo, sp y lgbp, (B) Expresión de genes relacionados con antioxidantes, sod, trx y fer. Los valores son la media ± S.E., n = 5 por grupo. Los camarones restantes se sumergieron en cultivo de V. harveyi AQVH01 a 10 7 UFC/ml y se transfirieron al sistema de agua clara. La tasa de supervivencia se registró 5 días después de la exposición. (C) Representación camararones que mostraban luminiscencia como signo de infección después de 24 h de inmersión en cultivo de vibrio. (D) La tasa de supervivencia relativa (%) de camarón infectado se registró antes y después de la prueba durante 5 días. n = 6 por grupo. Las diferentes letras indican diferencias estadísticamente significativas.

y una habilidad inmune y estimulación genética antioxidante. Se observa que la suplementación de HEWL0.125 disminuyó la concentración de materia fecal blanca en camarón con WFS e inhibió la recurrencia de la enfermedad hasta el término del cultivo. Demostramos que la tasa de supervivencia y el ADG de camarón con WFS alimentado con HEWL0.125 fue sustancialmente más alta que los del control. Fuera posible que HEWL suprimió la sobrepoblación de vibrio y/o al patógeno de WFS desconocido, mientras estimulaba la expresión de genes relacionados con el sistema inmunitario y

antioxidante en el camarón, incentivando la desaparición del WFS.

En conclusión, la suplementación con HEWL mostró actividad antimicrobiana in vitro contra vibrios patógenos aislados de camarón infectado. El efecto antimicrobiano contra vibrios también se observó en tracto gastrointestinal de camarón. Identificamos que HEWL0.125 fue el más efectivo en estimular el nivel de expresión de genes relacionados con el sistema inmunitario y antioxidante en el hepatopáncreas del camarón. La suplementación de HEWL0.125 promovió resistencia a la infección por vibrio y de WFS. Estos resultados sugieren que la suplementación de HEWL fue un método efectivo para evitar el tratamiento con antibióticos en acuicultura para suprimir el WFS en el camarón blanco del Pacífico.

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Fig. 5. Efecto de la suplementación de HEWL en WFS. El camarón se cultivó en estanques de tierra y el WFS fue observado después de 6 semanas de cultivo. Los camarones alimentados con CON o HEWL0.125 durante 5 días. (A) Imagen representativa de heces blancas y fibrosas encontradas en camarones alimentados con CON y HEWL0.125. La materia fecal blanca está señalada con flechas. n = 3 estanques/grupo. (B) Tasa de supervivencia relativa (%) de camarón con WFS alimentado con CON o HEWL0.125. (C) ADG de camarones con WFS alimentados con CON o HEWL0.125. El camarón alimentado con CON se cosechó a las 7 semanas ya que el WFS se mantuvo y la tasa de supervivencia fue inferior al 50%. Mientras que el camarón alimentado con HEWL0.125 fue cosechado luego de un cultivo a tiempo completo, 12 semanas, ya que la materia fecal blanca había desaparecido.