Respuesta de la defensa inmune del camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei) ante una fluctuación de temperatura

Autores:

Zhenlu Wang ᵃ,ᵇ Jiang Zhouᵃ,ᵇ Junyi Liᵃ,ᵇ , Jixing Zouᵃ,ᵇ, **, Lanfen Fanᵃ,ᵇ *

ᵃ Facultad de Ciencias del Mar, Universidad de Agricultura del Sur de China, Guangzhou, 510642, República Popular China

ᵇ Laboratorio de Lingnan Modern Agriculture de Guangdong, Universidad de Agricultura del Sur de China, Guangzhou, 510642, PR China E n los últimos años, el cambio climático global ha causado más frecuentes eventos de temperatura extrema, ya sea calor o frío extremo [1]. Mientras que los investigadores han prestado mucha atención a la influencia de tales cambios de temperatura, pocos estudios han abordado el impacto de eventos climáticos extremos cortos. Sin embargo, estudios han encontrado que esos eventos de temperatura extrema afectan directamente el rendimiento fisiológico, crecimiento y supervivencia de plantas [2], animales [3] y seres humanos [4,5].

Como tal, la fluctuación de temperatura plantea considerables estímulos ambientales en condiciones de sistemas acuícolas. Los eventos climáticos extremos que incluyen un rápido cambio de temperatura ya han ya afectado a la industria acuícola [6]. El camarón blanco del Pacífico (Litopenaeus vannamei), también conocido como camarón blanco, es una de las especies más importantes de la acuicultura mundial. Debido a que esta especie se origina en los trópicos, L. vannamei muestra extrema vulnerabilidad al estrés por frío. Se ha reportado que L. vannamei exhibe signos fisiológicos de estrés por frío, como retraso del crecimiento, cese de nado y alimentación cuando la temperatura del agua disminuye, incluso L. vannamei podría morir después de una exposición a temperaturas por debajo de 13 °C [7-10]. Guangdong, China es una de las áreas principales de cultivo de L. vannamei. Sin embargo, según la data de las condiciones climáticas de 2017 a 2019 (Administración Meteorológica de China, www.cma.gov.cn ), hubo un cambio de temperatura diaria promedio de 7.32 °C en Guangdong durante los meses de invierno.

Este rápido cambio de temperatura ha amenazado el futuro de la industria del cultivo del camarón en China, y ha causado pérdidas económicas significativas. Estudios previos han demostrado que el camarón podría responder a través de una autorregulación después de una lesión por estresores ambientales, lo que incluye la fluctuación de temperatura [11,12]. Sin embargo, el mecanismo preciso de auto reparación en camarón debido a la fluctuación de temperatura requiere más estudios.

El intestino es un órgano vital en el camarón. Además de la digestión y absorción de nutrientes, el intestino también funciona para la inmunidad. Un estudio encontró que los niveles de expresión de varios

genes inmunes fueron alterados en el intestino del camarón Kuruma después de una infección por virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV) [13]. Además, una inyección de lipopolisacárido causó una variación significativa en la expresión de genes antibacterianos y de reconocimiento de patrones de patógenos en L. vannamei [14]. En comparación, los estudios ya han demostrado el estrecho vínculo entre la microbiota intestinal y el sistema inmune del huésped en mamíferos [15,16].

En años recientes, los estudios también encontraron una alta correlación entre la microbiota intestinal y el estado de salud del camarón [17,18]. Factores de estrés ambiental como cambios en el pH [19], la salinidad [20] y contaminantes como los sulfuros [21,22], pueden afectar directamente la composición bacteriana y la función inmune del intestino en L. vannamei. Sin embargo, la respuesta intestinal a la fluctuación de temperatura no está clara y debe ser más investigada.

En este estudio, se investigó la expresión génica de los factores del sistema de defensa inmune y la composición microbiana del intestino en L. vannamei. Estos resultados podrían proporcionar información valiosa sobre el mecanismo de L. vannamei durante la fluctuación de temperatura, protegiendo así al camarón del estrés por frío, en la acuicultura comercial.

Materiales y métodos Condiciones experimentales del cultivo y del camarón Se recolectaron camarones experimentales de una granja comercial en Panyu (Guangdong, China). El camarón fue transportado de inmediato al laboratorio y aclimatado en tanques de 500 L de agua de mar con aireación diluida al menos 1 semana antes de comenzar los experimentos. La salinidad fue de 5 ‰ y la temperatura fue de 28 ± 1 °C. Se suministró alimento comercial para camarón (Haida Feed, China) en una proporción del 5% de su peso corporal dos veces al día. Estas condiciones fueron consistentes en condiciones de la finca comercial.

Tratamiento Después de la aclimatación, un total de sesenta camarones sanos (4.59 ± 0.5 g) fueron separados al azar en tres tanques réplica (60 × 40 × 35 cm), con veinte camarones por tanque. Todos los camarones utilizados en el estudio estaban en etapa de muda. La temperatura del agua se disminuyó de 28 °C a 13 °C, durante el transcurso de 2 días (7.5 °C/d) y luego se volvió a calentar a 28 °C con la misma velocidad. Durante el tratamiento, los cambios en la temperatura del agua se controlaron mediante el uso de una incubadora climática artificial (Laifu, China), y la dieta del camarón experimental fue consistente con el período de aclimatación.

Colección de muestras En cada punto de temperatura (C: 28 °C, T: 13 °C y R: 28 °C después del calentamiento de temperatura), se recolectaron los intestinos de seis camarones de cada tanque para ser agrupados en una muestra. Y luego cada muestra fue dividida en dos para el ensayo de expresión génica y el ensayo microbiano, de manera separada. Las muestras se congelaron en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C para la extracción total de ARN y ADN microbiano.

Ensayo de expresión génica El ARN total se extrajo de los intestinos usando el agente ARNiso Plus (Takara, Japón) siguiendo las instrucciones del fabricante. La calidad del ARN se evaluó mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1.0% y la concentración fue probada por mySPEC (VWR, EE. UU.). El ARN total fue purificado y la primera cadena del ADNc se sintetizó usando ReverTra Ace® PCRq RT Master Mix con ADNg Remover (TOYOBO, Shanghai), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El sistema CFX Connect TM en tiempo real (BIO-RAD) se utilizó para detectar la expresión relativa de genes. Los métodos fueron los mismos que en nuestro estudio anterior [23], detalles y primers se muestran en la Tabla S1.

Ensayo microbiano intestinal El ADN microbiano total se extrajo usando el kit FastDNA® SPIN para suelo (MP Biomedicals, Shanghai) siguiendo el protocolo del fabricante. La calidad total del ADN se evaluó mediante electroforesis en gel agarosa al 1.0% y la concentración se probó usando un espectrofotómetro Nanodrop ND 2000 (Thermo Scientific, EE. UU.). Las regiones hipervariables V3–V4 del gen bacteriano 16S ARNr se amplificaron con primers 338F y 806R (Tabla S1). La PCR se realizó con TransStart® FastPfu DNA Polymerase (TRAN, Beijing) con un sistema termociclador de PCR (GeneAmp 9700, ABI, EE. UU.). Los productos resultantes de la PCR fueron extraídos de un gel de agarosa al 2% y adicionalmente purificados usando un Kit de extracción de gel de ADN AxyPrep (Axygen Biosciences, EE. UU.) y cuantificados utilizando QuantiFluorTM-ST (Promega, EE. UU.). Los amplicones purificados se agruparon en muestras equimolares y secuenciadas en pares en una plataforma Illumina MiSeq (Illumina, San Diego, EE. UU.), según el protocolo estándar de Majorbio BioPharm Technology Co. Ltd. (Shanghai, China).

Análisis estadístico Para la expresión génica, la data estadística y los gráficos fueron realizados por GraphPad Prism 7.0. Se analizaron las diferencias entre poblaciones con una prueba t. Se consideró una diferencia significativa P < 0.05. Para el análisis microbiano intestinal, se agruparon unidades taxonómicas operativas (OTU) con una similitud de 97% usando UPARSE (versión 7.1 http://drive5. com/uparse/ ) y las secuencias quiméricas fueron identificadas y removidas usando UCHIME. Se analizó la taxonomía de cada secuencia del gen 16S ARNr por un algoritmo clasificador RDP (http://rdp.cme.msu. edu/ ). El análisis de diversidad alfa (Chao, ACE, Shannon, Simpson y la cobertura) se calcularon utilizando el software Mothur. Las mediciones de diversidad beta se calcularon como se describe. Otros análisis de microbiota intestinal se realizaron utilizando el paquete de software R.

Resultados Expresión génica del sistema de defensa inmune Durante la fluctuación de temperatura, las expresiones relativas de los genes de mucina (Muc) que incluyen Muc-1, Muc5B y Muc-19 permanecieron estables. Sin embargo, en comparación con el grupo C, las expresiones de Muc-3A y Muc-5AC aumentaron significativamente en los grupos T y R, mientras que Muc-17 aumentó significativamente en el grupo R (Fig. 1A).

Para los genes relacionados con la apoptosis, la expresión del inhibidor de la proteína de apoptosis (IAP) aumentó después del enfriamiento y luego disminuyó después del recalentamiento. Asimismo, p53 mostró una tendencia similar con IAP. Sin embargo, la expresión de Casp3 mostró lo contrario (Fig. 1B).

Para el reconocimiento de patrones de genes patógenos y antibacterianos relacionados, las expresiones del receptor 4 como peaje (TLR), inmunodeficiencia (IMD) y la profenoloxidasa (proPO) disminuyeron significativamente después de enfriamiento. Después del aumento de temperatura, la expresión de TLR, IMD, lisozima (Lys) y proPO aumentaron significativamente, sin embargo, no hubo diferencia significativa en la expresión de proPO entre los grupos C y R (Fig. 1C).

Para los genes relacionados con antioxidantes, la expresión de choque térmico proteína 70 (HSP70), metalotioneína (MT) y ferritina (Fer) aumentó significativamente después de enfriarse. Después de la recuperación de temperatura, la expresión de estos genes disminuyó significativamente y la expresión de HSP70 y Fer regresó a casi el nivel observado en el grupo C (Fig. 1D).

Análisis microbiano intestinal Data sobre las características de la secuenciación microbiana Se ha aceptado ampliamente que la microbiota intestinal está estrechamente relacionada con las funciones intestinales. En este estudio, la composición microbiana intestinal en L. vannamei se investigó durante el flujo de temperatura. Se obtuvo un total de 423,646 secuencias de alta calidad de nueve muestras pertenecientes a los tres grupos de estudio (C, T y R). El análisis de cada muestra de los índices de diversidad alfa, la cobertura, Shannon, Simpson, Chao y de Ace se muestran en la Tabla 1.

La secuenciación completa se estimó utilizando la cobertura. La cobertura comunitaria de cada muestra excedió el 99.83%, lo que indica que las secuencias identificadas representan la mayoría de las bacterias en cada muestra. La diversidad de la comunidad se midió por los índices de Shannon y Simpson. No hubo diferencias

Fig. 1. Expresión relativa de genes relacionados con el sistema de defensa inmune durante la fluctuación de temperatura. Los niveles relativos de expresión de ARNm de genes de mucina (A), Genes relacionados con la apoptosis (B), reconocimiento de patrones de patógenos y genes relacionados antibacterianos (C) y genes relacionados con antioxidantes (D) se compararon con el grupo C. Las barras representan la media ± S.D. (n = 3) El nivel de significación se calculó mediante la prueba t. Las barras con letras diferentes indican diferencia estadística (p < 0.05).

Tabla 1. - Diversidad alfa de la microbiota intestinal durante la fluctuación de temperatura

significativas entre los grupos C, T y R. (Fig. 2A y B). Para cuantificar la riqueza de la comunidad, se utilizaron los índices Chao y Ace. En el grupo R, ambos índices mostraron disminuciones significativas en comparación con el grupo C (P < 0.05) (Fig. 2C y D).

Para el análisis de diversidad beta, Análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en distancias binarias-jaccard, se realizó para detectar las relaciones entre microbios entre las diferentes muestras. Los resultados indicaron que los grupos C y T poseían composiciones similares de microbios, mientras que el grupo R era diferente de los grupos C y T (Fig. 3). Diferencia en las comparaciones de la comunidad bacteriana Como se muestra en la Fig. 4A, el Phylum dominante en los tres grupos fueron Proteobacterias y Firmicutes. La abundancia relativa de Proteobacterias disminuyó gradualmente mientras que Firmicutes aumentó gradualmente durante el proceso de fluctuación de temperatura.

En comparación con el grupo C, la abundancia relativa de Bacteroidetes se redujo significativamente en el grupo R (P < 0.05). Comparando taxonómicamente a nivel de Clase con el grupo C, la abundancia relativa de Alphaproteobacteria y Bacteroidia

disminuyó significativamente en el grupo R (P < 0.05) (Fig. 4B, Tabla S2).

Predicción funcional de la microbiota Las funciones presuntivas de la microbiota intestinal fueron graficadas usando PICRUSt. Los genes predichos se clasificaron alineándolos a la base de datos KEGG (Tabla S3). Los 20 mejores identificadores de rutas KEGG se agrupan en cuatro categorías principales: metabolismo, procesamiento de información genética, procesamiento de información ambiental y procesos celulares (Fig. 5). Entre estos, las funciones predictivas relacionadas con el “transporte de membrana”, que pertenece a la categoría de procesamiento de información medioambiental, fue la función más enriquecida.

La abundancia relativa disminuyó significativamente a 12.24% en el grupo R cuando se lo comparó con los grupos C (14.08%) y T (14.11%). En la categoría metabolismo, el “metabolismo de los aminoácidos” se redujo significativamente después de enfriamiento, de 11.81% en el grupo C a 10.42% y 10.18% en los grupos T y R, respectivamente.

La abundancia relativa de la “motilidad celular” también disminuyó en el grupo R. Sin embargo, en la categoría de procesamiento de información genética, las funciones predictivas relacionadas con la “replicación y reparación” y “traducción”, incrementaron significativamente después de recuperación de la temperatura, de 6.12% al 3.77% en el grupo C a 8.02% y 5.42% en el grupo R, respectivamente. Estas predicciones funcionales ayudaron a comprender la influencia de la fluctuación de temperatura en L. vannamei.

Correlación entre genes bacteriano intestinales y defensa inmune Se analizó la correlación entre la expresión génica del sistema de defensa inmune y la abundancia relativa (a nivel de Phylum) de bacterias intestinales en base al coeficiente de correlación de Pearson (Fig. 6). La abundancia relativa de Proteobacterias, Patescribacterias y Bacteroidetes fue correlacionada negativamente con algunos de los genes Muc. La abundancia de Patescribacteria fue correlacionada

Fig. 2. Gráficos de cajas de diversidad y riqueza de la microbiota intestinal en L. vannamei durante la fluctuación de temperatura. A: índice de diversidad de Shannon; B: índice de diversidad de Simpson; C: estimador Chao1; D: estimador ACE. Los límites superior e inferior de cada cuadro muestran los percentiles 75 y 25, respectivamente. Las líneas negras dentro de cada cuadro representa la mediana. Los extremos indican los valores mínimos y máximos. *se refieres a P < 0.05.

Fig. 3. Análisis de coordenadas principales (PCoA) basado en distancias binarias-jaccard.

positivamente con la expresión de Casp3, TLR e IMD. La abundancia de Bacteroidetes se correlacionó positivamente con la expresión de TLR e IMD. La abundancia de Firmicutes se correlacionó positivamente con la expresión de Muc-3A, Muc-17 y Mn/ Zn SOD. Discusión Sistema de defensa inmune durante la fluctuación de temperatura La temperatura es un factor ambiental significativo en la acuicultura. Estudios previos mostraron que el estrés por frío puede causar ciertos efectos en L. vannamei, tanto a nivel genético como tisular [23,24]. Se ha mostrado que L. vannamei puede reparar lesiones intestinales después de una exposición prolongada a un pH bajo [25]. Sin

Fig. 4. Abundancia relativa de microbiota intestinal en L. vannamei durante la fluctuación de temperatura. A: nivel de Phylum; B: nivel de Clase; C: diagrama de barras ANOVA unidireccional en el nivel de Phylum para Bacteroidetes; D: diagrama de barras ANOVA unidireccional a nivel de Clase para Alphaproteobacteria y Bacteroidia. * Se refiere a P < 0.05.

Fig. 5. Comparación de KEGG de las funciones bacterianas en L. vannamei durante la fluctuación de temperatura.

Fig. 6. Correlación entre los genes relacionados con el sistema de defensa inmune y la abundancia relativa (a nivel de Phylum) de bacterias intestinales en L. vannamei durante fluctuación de temperatura. El coeficiente de correlación está representado por diferentes colores (rojo: correlación positiva; azul: correlación negativa). * Se refiere a P < 0.05 y **se refiere a P < 0.01. (Para la interpretación de las referencias a color en esta figura, se remite al lector a la versión web de este artículo).

embargo, el mecanismo de auto reparación del intestino en L. vannamei durante la fluctuación de temperatura, aún requiere más estudio. En este estudio, la expresión de TLR, IMD y proPO en el intestino disminuyó significativamente después del enfriamiento. La barrera intestinal del camarón sirve como la primera línea de defensa del huésped contra la infección por patógenos. Estudios previos han demostrado que la expresión de proPO, Toll e IMD en el intestino de L. vannamei disminuyó después de la inyección de lipopolisacárido [26].

Las respuestas humorales del camarón son una parte importante del sistema de defensa inmune del camarón [27]. Entre la diversa gama de respuestas inmunes humorales, uno de los métodos inmunes más efectivos en invertebrados contra la infección por patógenos es la síntesis de la melanina por el sistema proPO [28].

El sistema proPO es responsable de cicatrizar heridas y de atrapar los parásitos, así como matar microbios [29,30]. Del mismo modo, las rutas e IMD se consideran dos vías inmunes principales de señalización involucradas en la recuperación inmune del camarón ante bacterias patógenas e infecciones virales [31,32]. Los resultados de este estudio indican que el estrés por frío puede reducir la capacidad del camarón para detectar y eliminar patógenos. Varios genes Muc, genes relacionados con la antiapoptosis y genes relacionados antioxidantes mostraron una expresión significativamente mayor después del enfriamiento. Una capa de mucosa cubre el epitelio del intestino, desempeñando un rol vital en la protección del intestino ante factores ambientales [33]. La mucina, una clase de proteína altamente glucosilada, es el principal componente orgánico de la capa de mucosa que funciona manteniendo la función de barrera mucosa y reparación de epitelios dañados [34,35].

La proteína p53 puede ser activada en respuesta a diferentes tipos de estrés. Estudios previos encontraron que la expresión de p53 en L. vannamei aumentó después de la exposición a hipoxia, cadmio, o ensayos de pH. La mortalidad acumulada aumentó en gran medida en camarón silenciado por p53 expuestos a estas tensiones [36,37].

Además, los genes relacionados con antioxidantes regulados al alza, como HSP70, que actúan en respuesta al estrés ambiental, pueden resultar teniendo una mayor fuerza activación del mecanismo de defensa del organismo [38]. Todos estos resultados mencionados, mostraron que, para mantener la homeostasis durante el tiempo de fluctuación de la temperatura, el camarón puede movilizar su sistema de defensa inmune a través de la regulación positiva de la expresión de genes Muc, los genes relacionados a la anti-apoptosis y genes relacionados con antioxidantes. Sin embargo, el estrés por frío aumentó el riesgo de infección por patógenos al mismo tiempo. En este estudio, después de recuperar la temperatura a 28 °C, la mayoría de los niveles de expresión génica mostraron una tendencia a recuperarse a niveles normales (C). Este fenómeno confirmó la capacidad de auto reparación en L. vannamei. El aumento continuo de las expresiones de genes Muc puede ayudar al camarón para reparar el daño intestinal.

Cambios en la comunidad bacteriana durante la fluctuación de temperatura Es conocido que una microbiota intestinal sana es responsable en gran medida, de recuperar la salud general del huésped. Un estudio anterior encontró que la temperatura fría puede alterar la microbiota cecal independientemente de la alimentación en Lasiopodomys brandtii [39]. En este estudio, la riqueza comunitaria disminuyó significativamente después del recalentamiento, y la comunidad bacteriana fue también alterada durante la fluctuación de temperatura.

Estudios anteriores encontraron que los miembros de los Bacteroidetes se han asociado en particular con enfermedades metabólicas humanas [40]. Las Dysbacteria

a menudo se caracterizan por un aumento de bacterias anaerobias facultativas (p. ej., Bacilli) y, al mismo tiempo, una disminución de bacterias anaeróbicas como la Bacteroidia [41]. En este estudio, la abundancia relativa de Bacteroidetes a nivel de Phylum, y Bacteroidia a nivel de Clase, disminuyó significativamente durante la fluctuación de temperatura.

La abundancia de bacilos también aumentó al mismo tiempo. Estos resultados indicaron que la fluctuación de temperatura alteró la comunidad bacteriana del intestino y puede haber aumentado la oportunidad de enfermedades intestinales.

La abundancia relativa de Alphaproteobacteria también disminuyó significativamente durante la fluctuación de temperatura. Muchos factores ambientales pueden afectar la abundancia relativa de Bacteroidetes y Alphaproteobacteria en L. vannamei [42–46], por lo tanto, los mecanismos de cambio detallados de estas comunidades bacterianas requieren más estudios.

Muchos estudios previos sobre variaciones de la comunidad bacteriana se centraron sobre los efectos de la invasión patogénica. Por ejemplo, la exposición a Vibrio alteró la composición de la microbiota en el camarón tigre negro [47] y L. vannamei [48]. La infección por el WSSV cambió la composición de la microbiota en L. vannamei al afectar funciones de la microbiota intestinal. Específicamente el “transporte de membrana” y la “motilidad celular” disminuyeron significativamente, y la “replicación y reparación” y “traducción” aumentaron significativamente [49] Las presuntas funciones de la microbiota intestinal fueron ilustradas en este estudio por PICRUSt, y se encontró la misma tendencia de cambio durante la etapa de fluctuación de temperatura.

Además, se analizaron las funciones predictivas de metabolismo de la microbiota. En general, la fermentación es uno de los principales factores procesos metabólicos de comunidades microbianas intestinales al proporcionar fuentes de nutrientes para su anfitrión [50]. La mayoría de los miembros de Firmicutes y Bacteroidetes han demostrado que están involucrados en la fermentación [51]. En humanos, se ha reportado que la abundancia de Bacteroidetes está correlacionada positivamente con los genes relacionados al enriquecimiento del metabolismo de carbohidratos [52].

Los estudios también han encontrado que una mayor tasa Firmicutes/Bacteroidetes se relaciona con un mejor rendimiento de crecimiento en camarón, indicando que Firmicutes podría ayudar al almacenamiento de energía, y Bacteroidetes podría ayudar en el metabolismo energético [53].

En el estudio, funciones predictivas de “metabolismo de aminoácidos”, “metabolismo de carbohidratos” y el “metabolismo energético” disminuyeron después del enfriamiento. Asimismo, la relación Firmicutes/Bacteroidetes aumenta continuamente durante el flujo de temperatura. Estos resultados infirieron que la microbiota intestinal de L. vannamei, particularmente Firmicutes y Bacteroidetes, podrían contribuir a la regulación del metabolismo para conservar energía durante cambios de temperatura.

Correlación entre bacterias intestinales y genes inmunes Estudios recientes mostraron que la función de barrera intestinal es fuertemente influenciada por una bacteriana residente [54]. En el camarón L. vannamei sano, existen bacterias patógenas beneficiosas y oportunistas en el intestino. Sin embargo, en condiciones de estrés, L. vannamei tiende a albergar más bacterias patógenas oportunistas, que son capaces de causar enfermedades [55].

El coeficiente de correlación de Pearson mostró que los cambios en la expresión de Muc-3A, Muc-5AC y Mn/Zn-SOD se correlacionaron positivamente con la abundancia de Firmicutes, indicando que los miembros de Firmicutes podrían contribuir al sistema de respuesta inmune en el camarón. Esto incluyó los genes Muc y los genes relacionados con antioxidantes. Consistentemente, la expresión regulada de algunos genes Muc fueron correlacionadas negativamente con la abundancia de Proteobacterias, Patescribacteria y Bacteroidetes, indicando que la disminución de estas bacterias pueden estimular la inmunidad del moco.

Estudios previos mostraron que la relación Firmicutes: Bacteroidetes ha sido implicada en la predisposición a estados de enfermedad [56]. Del mismo modo, un cambio en la expresión de Casp3, TLR y de IMD se correlacionó positivamente con la abundancia de Patescribacteria y Bacteroidetes, lo que indica que estos organismos podrían contribuir facilitando la identificación de patógenos, así como la expresión de genes antibacterianos y relacionados con la apoptosis después del estrés por frío.

Sin embargo, no está claro si los cambios en la comunidad bacteriana fueron una causa o consecuencia de alteraciones en genes relacionados con la regulación del sistema inmune. Por lo tanto, este mismo mecanismo exacto requiere de más investigación•

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