1 diagnostico leucemias agudas

Diagnóstico Molecular de Leucemias Agudas

Pedro Horna, M.D.

Hematopatólogo Senior Associate Consultant Mayo Clinic, Rochester, Minnesota ©2016 MFMER | slide-1

Diagnóstico Integrado de Leucemias Agudas Aspirado de médula osea • Frotis (Wright-Giemsa) • Sección de coágulo (hematoxilina-eosina) • Citoquímica • Citometría de flujo • Análisis cromosómico convencional • FISH • Estudio de mutaciones genéticas

Biopsia de médula ósea • Impresión en slide (Wright-Giemsa) • Sección de biopsia decalcificada (hematoxilina-eosina) • Imunohistoquímica

Muestra de sangre periférica • Frotis (Wright-Giemsa) • Muestra alternativa al aspirado para estudios auxiliares.

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Evaluación Inicial de Leucemias Agudas

Morfología + Citoquímica + Citometría de Flujo (STAT)

Leucemia aguda promielocítica

Leucemia mieloide aguda (no promielocítica)

Leucemia T linfoblástica aguda

Leucemia B linfoblastica aguda

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Leucemias Agudas

Otros Diagnósticos a Considerar • Leucemias crónicas de alto grado • Sindromes mielodisplásticos o mieloproliferativos (<20% blastos) • Blastos pueden ser <20% en: t(8;21), inv(16), PML-RARA, inv(3), t(6;9) • Leucemias agudas raras: • Leucemia aguda de lineage ambiguo • Leucemias aguda eritroide, megacarioblástica o basofílica • Panmielosis aguda con mielofibrosis • Leucemia linfoblástica de células NK • Malignidades linfoides de células maduras con apariencia blastoide: • • • •

Linfoma de Burkitt Linfoma B difuso agresivo Linfoma blástico de células del manto Leucemia agresiva de células NK (EBV+)

• Condiciones reactivas o regenerativas con blastosis • Neoplasias no hematopoieticas con apariencia blastoide

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Leucemia aguda promielocítica Morfología: Nucleo bilobado, gránulos citoplasmáticos primarios, mutiples bastos de Auer.

Leucemia mieloide aguda (no promielocítica) Morfología: Variable, blastos grandes indiferenciados o con diferenciación granulocítica, monocítica u otro. A veces displasia

Leucemia B linfoide

Leucemia T linfoide

Morfología: Variable, blastos generalmente pequeños, sin evidencia de diferenciación.

Morfología: Variable, blastos generalmente pequeños, sin evidencia de diferenciación.

Citoquímica: Mieloperoxidasa (+/-) Esterasa no específica (+/-)

Citoquímica: Mieloperoxidasa (-),

Citoquímica: Mieloperoxidasa (-),

Citometría de Flujo: Variable expresión de antígenos mieloides, megacariocíticos o eritroides: CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD33, CD41, CD64, CD61

Citometría de Flujo: CD19(+)

Citometría de Flujo: CD3 citoplasmático (+) CD7(+)

Bastones de Auer, infrequentes pero diagnosticos.

Citoquímica: Mieloperoxidasa (+)

Citometría de Flujo: CD34(-) HLADR(-) CD117(+) MPO(+) CD13(+) CD33(+) CD11b(-) CD11c(-)

La mayoría CD10(+), immunglobulina (-) Expressión variable de antígenos de inmadurez TdT, CD34

FISH / Citogenética: t(15;17)(q24;q22) or variantes

FISH / Citogenética: Variable

FISH / Citogenética: Variable

Expresión variable de antígenos de inmadurez TdT, CD34, CD1a, CD99

FISH / Citogenética: Variable

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Leucemia Aguda Promielocítica PML-RARA o ?-RARA •

Prognóstico favorable.

•

Ante sospecha, tratar inmediatamente con ATRA para prevenir coagulopatía.

•

Citometría de flujo:

•

•

•

•

MPO(++), CD117(+), HLA-DR(-), CD34(-), side scatter (+).

•

CD11b(-), CD11c(-).

Estudios confirmatorios: •

FISH de fusion para PML-RARA.

•

FISH de sepraración para v-RARA

•

RT-PCR para PML-RARA

Translocationes PML-RARA: •

t(15;17)(q22;q12);PML-RARA

•

Translocaciones complejas entre PML, RARA y un cromosoma addicional.

•

Inserciones submicroscópicas de RARA en PML

PML RARA

Translocationes variantes de RARA: •

t(11;17)(q23;q12);ZBTB16-RARA

•

t(5;17)(q35;q12);NPM1-RARA

•

t(17;17)(q35;q11);STAT5B-RARA ©2016 MFMER | slide-6

Leucemias Mieloides Agudas con Translocaciones de Subunidades de “Core Binding Factor” t(8;21)(q22;q22); RUNX1(CBFα)-RUNX1T1 • Leucemia con maduración granulocítica.

• Inclusiones cytoplasmáticas rosa-salmón.

• Bastones de Auer solitarios, largos y delgados.

inv16 o t(16;16)(p13.1;q22); CBFβ-MYH11 • Leucemia con maduración myelomonocítica.

• Eosinófilos inmaduros atípicos con gránulos metacromáticos

•

Relativamente buen prognóstico

•

Mutaciones en KIT, exones 8 y 17, confieren mal prognóstico

•

inv16 puede ser difícil de detectar por cariotipo convencional ©2016 MFMER | slide-7

Leucemias Agudas con Translocaciones de MLL / KMT2A (11q23) •

Se han descrito mas de 120 diferentes translocaciones involucrando MLL y varios otros genes.

•

Las translocaciones mas frecuentes son: •

t(4;11) AF4-KMT2A, generalmente con fenotipo de leucemia aguda B linfoblástica.

•

t(9;11) AF9-KMT2A, generalmente con fenotipo de leucemia myeloide aguda con diferenciación monocítica.

Meyer C, et al. Leukemia 2013;27:2165

• t(4;11) y t(9;11) detectables por cariotipo convencional.

• 30% de otras translocationes de 11q23 son submicroscópicas y requieren FISH de separacíón de MLL para ser detectadas.

• Leucemias con translocacion de MLL son de prognóstico desfavorable.

• t(9;11) es considerada separadamente como leucemia de riesgo intermedio.

MLL

Normal

MLL translocado ©2016 MFMER | slide-8

Otras Leucemias Mielodes Agudas en Población Pediátrica Leucemia mieloide aguda (megacarioblástica) con t(1;22) (p13;q13); RBM15-MKL1 •

La mayoría de casos en los primeros 6 meses de vida.

•

Blastos con differenciación megacariocítica, positivos para CD41 y CD61.

•

Visceromegalia, fibrosis medular.

Mielopoiesis anormal transitoria en síndrome de Down

Leucemia mieloide asociada a síndrome de Down

•

10% de neonatos con sindrome de down.

•

1-2% de ninos con sindrome de Down menores de 5 años.

•

Blastos con diferenciación megacariocitica.

•

50% de cases con diferenciación megacariocítica

•

Puede mostrar visceromegalia, basofilia, displasia.

•

Displasia, fibrosis medular.

•

La mayoría se resuleve espontaneamente en 3 meses.

•

Mutaciones en GATA1.

•

20% eventualmente desarrollan leucemia mieloide aguda.

•

Generalmente precedido de citopenia refractoria pediátrica (blastos <20%).

•

Mutaciones en GATA1.

•

Relativamente buen prognóstico en ninos menores de 3-5 años

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Otras Leucemias Mieloides Agudas con Translocaciones Recurrentes

t(6;9)(p23;q34); DEK-NUP214

inv(3)(q21q26.2) o t(3;3)(q21;q26.2); GATA2, MECOM

•

Basofilia

• Trombocitosis, megacariocitos monolobados.

•

Niños y adultos

• Adultos • De novo ó precedido de síndrome mielodisplástico

•

Mielodisplasia multilineage.

•

Alteraciones detectables por cariotipo convencional.

•

Prognostico desfavorable

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Leucemias Mieloides Agudas con Cambios Relacionados a Mielodisplasia (OMS 2016) •

Prognóstico desfavorable.

•

Clasificación de la OMS (2016) considera:

•

–

Previo síndrome myelodisplástico o mieloproliferativo que progresa con ≥ 20% blastos.

–

Displasia en >50% células en ≥ 2 lineages. (excepto en mutaciones de NPM1 y mutaciones bialélicas de CEBPA).

–

Alteraciones cromosómicas asociadas a síndrome mielodisplástico

Excluye neoplasias mieloides asociadas a terapia.

Miesner M, et al. Blood 2010;116:2742.

Arber DA, et al. Blood 2016;127:2391

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Mutaciones en Leucemias Mieloides Agudas •

•

~50% de casos de leucemia aguda mieloide no tienen alteraciones cromosómicas recurrentes de significado prognóstico.

Estudios de sequenciamiento genético de nueva generación han detectado mutaciones en un número limitado de genes (20-30), en >95% de leucemias mieloides agudas.

Señales de transducción • FLT3 • N-RAS/K-RAS • C-KIT Señales de diferenciación • NPM1 • CEBPA • MLL • RUNX1 Regulación epigenética • DNMT3A • IDH1/2 • ASXL1 • TET2 Genes supresores de tumores • TP53 • WT1

Patel JP, et al. NEJM 2012;366:1079 ©2016 MFMER | slide-12

Mutaciones Prognósticas en Leuciemia Aguda Myeloide Favorable

Desfavorable

CEPBA biallelico

KIT, exones 8 y 17, en t(8;21)

NPM1 (sin FLT3-ITD)

FLT3-ITD (niveles <25%, 25-50%, >50%) RUNX1

IDH2 R140Q TP53

KMT2A-PTD WT1 TET2 ASXL1 DNMT3A IDH1 R132 IDH2 R172

Arber DA, et al (WHO 2016, supplemental material) Blood 2016; 127:2391 ©2016 MFMER | slide-13

EVALUACIÓN PROGNÓSTICA DE LEUCEMIAS MIELOIDES AGUDAS DE-NOVO RIESGO

FAVORABLE

CARIOTIPO ANORMAL • t(15;17)

• mutaciones de CEBPA biallelicas

• inv(16) o t(16;16) sin mutacion en KIT

• Mutacion en NPM1 en la ausencia de mutaciones en FLT3-ITD

• t(8;21) sin mutation en KIT

INTERMEDIO I

INTERMEDIO II

• inv(16) or t(16;16) con mutacion en KIT

RESPUESTA A 7+3 • Remision completa: 80-90% • Recidiva: 35-40%

• Remision completa: 50-80%

• t(8;21) con mutation en KIT

• Otras mutaciones o mutaciones no detectables

• t(9;11)

• Mutacion en FLT3-ITD

• Remision completa: 40-60%

• Otras anormalidades cromosomicas

• inv(3) o t(3;3) • t(6;9)

DESFAVORABLE

CARIOTIPO NORMAL

• -5q, -7q, cariotipo complejo

• Recidiva: 50-60%

• Recidiva: 70-80%

• Mutaciones en p53

• Remision completa: <50%

• Mutaciones en RUNX1

• Recidiva: >90%

• Otras mutaciones

• Leucemias agudas con cambios asociados a mielodisplasia.

• Otras translocationes de 11q23

• Acute Myeloid Leukemia. NCCN Guidelines 2016. www.nccn.org • Estey, EH. Acute myeloid leukemia: 2014 update on risk stratification and management. Am J Hematol 2014;89:1064 • Dohner H, et al. Diagnosis and management of acute myeloid leukemia in adults: recommendations from an international expert panel, on behalf of the European LeukemiaNet. Blood 2010;115;453.

• Patel JP, et al. Prognostic Relevance of Integrated Genetic Profiling in Acute Myeloid Leukemia. NEJM 2012;366:1079.

• Grossman V, et al. A novel hierarchical prognostic model of AML solely based on molecular mutations. Blood 2012;120:2963. ©2016 MFMER | slide-14

Diagnóstico de Leucemia Aguda T Linfoblástica en Masa Mediastinal

CD3 CD4

CD7

CD7

CD4

CD45

TdT

CD45

CD34

CD8

Linfoma/leucemia T linfoblástica

CD8

CD3

Timocitos benignos

CD34 TdT NOTCH1-ICD

CD5

CD5 LMO2

NOTCH1-ICD

LMO2

Jevremovic D, et al. Am J Clin Pathol 2016 145:180 Jegalian AG, et al. Am J Surg Pathol 2015 39:565 ©2016 MFMER | slide-15

Factores Prognósticos en Leucemia Aguda T linfoblástica Leucemia de Precursor T Temprano •

5-10% de casos de leucemia aguda T linfoblástica

•

Cytometría de Flujo:

•

•

CD1a(-)

•

CD8(-)

•

Uno o mas marcadores de inmadurez o mieloides: CD34, CD117, HLA-DR, CD13, CD33, CD11b, CD65

Mutaciones de neoplasias myeloides: •

FLT3, DNMT3A, IDH1/IDH2, NRAS/KRAS, RUNX1

Mutaciones Prognósticas •

•

Favorables •

Mutaciones en NOTCH1 / FBXW7 (60%)

•

Deleciones homozygotas de 9p21-22 CDKN2A/2B

Desfavorables •

Mutaciones de neoplasias myeloides

•

Ausencia de delecion bi-allelica de TCRG

•

Delecion 17p P53

•

LOH 6q16

Coustan-Smith E, et al. Lancet Oncol 2009;10:147 Van Vlierberghe P, et al. Blood 2013;122:74 Trinquand A, et al. JCO 2013;31:4333

Bonn BR, et al. Blood 2013;121:3153 Grossmann V, et al. Haematologica 2011;96:1874 ©2016 MFMER | slide-16

Diagnóstico de Leucemia Aguda B linfoblástica •

La citometría de flujo es una herramienta escencial para diagnostical leucemia aguda B linfoblástica

•

El diagnóstic diferencial es hyperplasia bengina de precursores B

Leucemia aguda B linfoblastica

SSC

CD20

Hyperplasia benigna de precursores B

CD10

CD34

CD34

FSC

CD22

CD20

McKenna RW, et al. Blood 2001;98:2498 ©2016 MFMER | slide-17

Evaluación Prognóstica en Leucemia aguda B linfoblástica Estudios de FISH

Mal Prognóstico t(9;22)(q34;q11.2); BCR-ABL1

RUNX1

ETV6

t(v;11q23); MLL-v iAMP21 (misma prueba que para ETV6-RUNX1) Hypodiploidia (<44 chromosomas) (CEP 4,10,17)

Normal

iAMP21

t(12;21)

Buen prognóstico t(12;21)(p13;q22); ETV6-RUNX1 t(1;19); TCF3-PBX1 Hyperdiploidia (51-65 chromosomas) (CEP 4, 10, 17)

Otros t(5;14); IL3-IGH eosinofilia

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Leucemia B Linfoblástica “BCR-ABL-like” Un subgrupo de casos con kariotipo no específico posee un perfil genético y prognóstico desfavorable similar a cases con t(9;22);BCR-ABL1 Perfil de expresión genética similar a BCR-ABL1 Den Boer, NL, et al. Lancet Oncol 2009;10:125

Test no estandarizado. del17p12.2 IKZF1 (“ikaros”)

Mullighan C, et al. NEJM 2009;360:470.

Asociado a BCR-ABL y “BCR-ABL-like” Detección por SNP array (costoso).

Detección for FISH? Translocaciones de tyrosin kinasas detectadas por sequenciamiento de nueva generación mRNA Roberts KG, et al. NEJM 2014;371:1005.

“Foundation One” y otros.

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Citología: frotis de sangre y aspirado + Citometría de Flujo (STAT)

Leucemia aguda promielocítica FISH: t(15;17) PCR: PML-RARA FISH: v-RARA Cariotipo

Leucemia mieloide aguda (no promyelocítica) Cariotipo FISH: 11q23, inv16 NGS: KIT, NPM1, FLT3-ITD, CEBPA, RUNX1

Leucemia T linfoblastica aguda

Leucemia B linfoblastica aguda

Citometría de flujo (cortical vs. precursor T temprano)

FISH: t(9;22), v-11q23, t(12;21), t(1;19), t(5;14), CEP2,10,17 FISH: del IKZF1 (…)

FISH: t(8;21), inv3/t(3;3), t(6;9), t(1;22) -5q, -7q, -20q, -17p

NGS: NOTCH, FBXW7 DNMT3A, IDH1/2, RUNX1 K/N-RAS

NGS: RUNX1, TET2, ASXL1, DNMT3A, P53, MLL-PTD, PHF6…

SNP array: del17p, del9p21-22, LOH6q16, DBA TCRG

SNP array Sequenciamiento de mRNA para translocaciones de tirosin kinasas.

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