Cómo ayuda la Citrometría de flujo al diagnóstico de los SMD – Dra. Mariela Lens

CITOMETRÍA DE FLUJO EN SINDROMES MIELODISPLÁSICOS

Dra. Daniela Lens

Laboratorio de Citometría y Biología Molecular.

Hospital de Clínicas. Universidad de la República. Uruguay

Definición ¨

Conjunto heterogéneo de desórdenes clonales de la hematopoyesis caracterizados por: ¤ Hematopoyesis

inefectiva ¤ Células displásicas en MO y SP ¤ Citopenias de una o mas líneas ¤ Progresión variable a AML

Diagnรณstico en SMD

SMD: Aportes del Inmunofenotipo Diagnostico, clasificación y pronóstico SMD. Se basa en clínica, citomorfologia y citogenética

Eficiencia limitada en casos específicos (ICUS)

Necesidad de redefinir criterios.

DESAFIOS DE CF Utilidad de CF es aún limitada en SMD: Múltiples alteraciones en diferentes líneas ¨ Necesidad de disponer de patrones de referencia de maduración para cada línea a estudiar. ¨ Requiere de operador experimentado ¨ Elevado tiempo de análisis ¨

¨

Necesidad de nuevos ensayos multivariados

CF en MDS ¨

¨

No existen marcadores de displasias específicos Las alteraciones IF en cada línea hematopoyética a estudiar se basan en la búsqueda de n Alteración

de los patrones característicos de la maduración para cada línea

n Alteración

cuantitativas de los compartimentos de progenitores mieloides y linfoides

n Presencia

¨

de marcadores asincrónicos o infidelidad de línea

Análisis de CF en MDS ¨

Compartimentos a estudiar ¤ Progenitores

mieloides

¤ Neutrófilos ¤ Monocitos ¤ Eritroblastos ¤ Progenitores

linfoides

Progenitores en MDS

Matarraz et al. Leukemia 2008

Cambios fenotípicos durante la diferenciación normal MYELOBLAST

PROMYELOCYTE

MYELOCYTE

METAMYELOCYT

BAND/ NEUTROPHIL

CD15

CD13

CD13

CD64

MPO

103

CD65

CD33

CD35 CD11b 102

CD16 101

CD34 HLA-DR

CD117

CD54

CD10

Alteraciones IF para el dx de MDS

Alteraciones IF para el dx de MDS

Extensa batería de marcadores Elevado tiempo de análisis Subjetividad del operador en el análisis

Scores

Hematologica 2013

Score de Wells (2003)

Score: 0-1: normal - leve 2-3: moderado 4-9: displasia severa

Wells, DA et al. Blood 2003;102:394

Ogata Score: parรกmetros estudiados 1. % Mlb CD34+ sobre cel. nucleadas 2. % Progenitores B 34+ en las cel. CD34+

3. Ratio MFI CD45 de Li / Mlb CD34+ 4. Ratio SSC Gr/Ly Ogata et al., Blood, 2006; Ogata et al., Haematologica, 2009;

Ogata Score ¨

¨

ELNet WG propuso 2012 score para SMD de bajo grado: CD34 (My & B-prec), CD45, SSC. Sensib. ~75% Especif. ~90% Fue validado en trabajo internacional y ha sido reportado como de significado pronóstico.

Recomendado por ELN como screening en SMD y de utilidad clínica

Estudio multicĂŠntrico ELNet: learning cohort

Ogata et al., Blood, 2006; Ogata et al., Haematologica, 2009; Della Porta et al., [ELNet] Haematologica 2012; Feb7

Estudio multicĂŠntrico ELNet: validation cohort

Ogata et al., Blood, 2006; Ogata et al., Haematologica, 2009; 29 Della Porta et al., [ELNet] Haematologica 2012; Feb7

Ogata Score

Sensibilidad=70% Especificidad =92%

Ogata et al., Blood, 2006; Ogata et al., Haematologica, 2009;

Ogata Score Ejemplo % CD34+ Mbl = 1% (0) % prec. B = No se observan (1) MFI CD45 Ly/My = 9.9 (1) MFI SSC Gr/Ly=7.8 (0) Score = 2 probable SMD

N= 440 .

SMD 92, NMP 47, SMD/NMP 14.

Controles

Ogata Score >2 had 92.5% positive predictive value for MDS/MDS-MPN diagnosis.

Negative predictive value for MDS/MDS-MPN was 83% for scores under 3 and 88% for scores under 2.

No se observa relaciĂłn entre alteraciones citogenĂŠticas y el score

RED score

Mathis S. Leukemia 2013; 27:1981-19

Patrones de displasia por CF myeloid blasts

granulocytes

monocytes

(maturing myeloid cells) increased percentage abnormal granularity* abnormal expression** of CD45 abnormal expression of CD34 abnormal expression of CD117 abnormal expression of CD13 abnormal expression of CD33 abnormal expression of HLA-DR expression of CD11b expression of CD15 expression of lineage infidelity markers CD5, CD7, CD19 or CD56

decreased myeloid/lymphoid ratio (<1) abnormal granularity* abnormal expression of CD45 abnormal CD11b/CD13 pattern abnormal CD16/CD13 pattern abnormal expression of CD15 abnormal expression of CD33 expression of HLA-DR expression of CD34 asynchronous shift to the left

decreased/increased number as compared to lymphocytes abnormal granularity* abnormal expression of CD45 abnormal expression of CD14 abnormal CD11b/HLA-DR pattern abnormal expression of CD13 abnormal expression of CD33 abnormal expression of CD36 abnormal expression of HLA-DR expression of CD34

expression of lineage infidelity markers CD5, CD7, CD19

expression of lineage infidelity markers CD5, CD7, CD19

over expression of CD56

over expression of CD56

Loosdrecht AA van de, Westers TM, et al., Blood 2008;111:1067-1077; Wells D, et al., Blood 2003:102

Flow Cytometric Scoring System (FCSS) score 0 1 2

3 4 +1 +2 +3 +4

definition no FC aberrancies in either subpopulation analyzed - a single aberrancy in either granulocytes or monocytes - a single aberrancy in both granulocytes and monocytes or …

- two or three aberrancies in either granulocytes and monocytes or …

- expression of CD34 or lineage infidelity markers on either granulocytes or monocytes - four or more aberrancies in either granulocytes and monocytes - two or three aberrancies in both granulocytes and monocytes - - - - -

decreased myeloid/lymphoid ratio (<1) normal percentage of myeloid blasts (<5%) with flow cytometric aberrancies increased percentage of abnormal myeloid blasts (5-10%) increased percentage of abnormal myeloid blasts (11-20%) increased percentage of abnormal myeloid blasts (>20%)

total flow score of: 0-1: normal-mild 2-3: moderate 4-9: severe

Alta sensibilidad y alta especificidad Reproducibilidad ?

Loosdrecht AA van de, Westers TM, et al., Blood 2008;111:1067-1077; Wells D, et al., Blood 2003:102; Cutler J, et al., Cytometry 2011

FCSS y Clasificaciรณn WHO2008 (n=261; controls: n=55)

01-04-2012

n=59

n=29

n=82

n=34

n=57

n=41

n=14

Van de Loosdrecht and Westers et al., Blood, 2008

FCSS y dependencia a la transfusiรณn

myeloblasts either: CD5 (o), CD7 (o) or CD56 (o) positive

In part published: Loosdrecht AA van de, Westers TM et al., Blood 2008;111

INFORME DE CF DE SMD La CF no es suficiente para diagnosticar una MDS. Se recomienda realizar informe integrado con resto de tests diagnรณsticos

PATRONES DE MADURACIÃ&#x201C;N MIELOIDE UTILIZANDO ESTRATEGIA EUROFLOW

Estandarización en Citometría de Flujo

MUESTRA

DATOS PACIENTE Pregunta a responder

TUBOS A REALIZAR

PANELES Abs & PROTOCOLOS MARCACIÓN

ADQUISICIÓN DATOS CITÓMETRO

ANÁLISIS DATOS

INFORME

RESULTADO

Citometría estandarizada

Estandarización equipo y reactivos

Estandarización paneles y procedimientos

Estandarización análisis

Patrones de maduraciรณn neutrรณfilica

Diferenciaciรณn a neutrรณfilo (tubo AML1)

van der Velde. ESCCA 2012

Cambios fenotípicos durante la diferenciación a neutrófilo MYELOBLAST

PROMYELOCYTE

MYELOCYTE

METAMYELOCYT

BAND/ NEUTROPHIL

CD15

CD13

CD13

CD64

MPO

103

CD65

CD33

CD35 CD11b 102

CD16 101

CD34 HLA-DR

CD117

CD54

CD10

Patrรณn de maduraciรณn mieloide

Bases de datos de referencia de maduraciรณn a neutrรณfilo en MO Normal

N=23

Maduraciรณn a neutrรณfilo en MO Normal vs MO reactiva Overlayed Normal vs reactive BM

Overlayed Normal vs reactive BM

Overlayed Normal vs MDS BM

+3SD

+10SD

-3SD

-10SD

Otras utilidades de la CF en SMD

PRONOSTICO

RESPUESTA A EPO

RESPUESTA A HIPOMETILANTES

Hay correlación con IPSS y R-IPSS Hay correlación con grupos según WHO

La aberrancia en marcadores mieloides y score elevado se asoció con mayor dependencia tranfusional y peor pronóstico

Utilidad pronรณstica de la CF

Kern et al: Clinical utility of multiparamenter FC in the diagnosis of 1013 patients with MDS. Cancer 2010; 116 (19)

CF y dependencia transfusional en MDS

Score pronรณstico para MDS

CF y MDS WHO 2008 â&#x20AC;?Immunophenotyping of MDS may be of diagnostic/ prognostic utility (in the future)â&#x20AC;?

Conclusiones ¨

¨

¨

2016: No ha mejorado el concepto de la aplicabilidad de la CF en MDS Nuevos scores diagnósticos y pronósticos estandarizados en MDS podría ser un gran aporte para mejorar la aplicabilidad de la CF en MDS. El desarrollo de nuevos softwares que posibiliten el análisis automático podría mejorar sustancialemente el análisis