CITOMETRÍA DE FLUJO EN SINDROMES MIELODISPLÁSICOS
Dra. Daniela Lens
Laboratorio de Citometría y Biología Molecular. Hospital de Clínicas. Universidad de la República. Uruguay
Definición ¨
Conjunto heterogéneo de desórdenes clonales de la hematopoyesis caracterizados por: ¤ Hematopoyesis
inefectiva ¤ Células displásicas en MO y SP ¤ Citopenias de una o mas líneas ¤ Progresión variable a AML
Diagnรณstico en SMD
SMD: Aportes del Inmunofenotipo Diagnostico, clasificación y pronóstico SMD. Se basa en clínica, citomorfologia y citogenética
Eficiencia limitada en casos específicos (ICUS)
Necesidad de redefinir criterios.
DESAFIOS DE CF Utilidad de CF es aún limitada en SMD: Múltiples alteraciones en diferentes líneas ¨ Necesidad de disponer de patrones de referencia de maduración para cada línea a estudiar. ¨ Requiere de operador experimentado ¨ Elevado tiempo de análisis ¨
¨
Necesidad de nuevos ensayos multivariados
CF en MDS ¨
¨
No existen marcadores de displasias específicos Las alteraciones IF en cada línea hematopoyética a estudiar se basan en la búsqueda de n Alteración
de los patrones característicos de la maduración para cada línea
n Alteración
cuantitativas de los compartimentos de progenitores mieloides y linfoides
n Presencia
¨
de marcadores asincrónicos o infidelidad de línea
Análisis de CF en MDS ¨
Compartimentos a estudiar ¤ Progenitores
mieloides
¤ Neutrófilos ¤ Monocitos ¤ Eritroblastos ¤ Progenitores
linfoides
Progenitores en MDS
Matarraz et al. Leukemia 2008
Cambios fenotípicos durante la diferenciación normal MYELOBLAST
PROMYELOCYTE
MYELOCYTE
METAMYELOCYT
BAND/ NEUTROPHIL
CD15
CD13
CD13
CD64
MPO
103
CD65
CD33
CD35 CD11b 102
CD16 101
CD34 HLA-DR
CD117
CD54
CD10
Alteraciones IF para el dx de MDS
Alteraciones IF para el dx de MDS
Extensa batería de marcadores Elevado tiempo de análisis Subjetividad del operador en el análisis
Scores
Hematologica 2013
Score de Wells (2003)
Score: 0-1: normal - leve 2-3: moderado 4-9: displasia severa
Wells, DA et al. Blood 2003;102:394
Ogata Score: parรกmetros estudiados 1. % Mlb CD34+ sobre cel. nucleadas 2. % Progenitores B 34+ en las cel. CD34+
3. Ratio MFI CD45 de Li / Mlb CD34+ 4. Ratio SSC Gr/Ly Ogata et al., Blood, 2006; Ogata et al., Haematologica, 2009;
Ogata Score ¨
¨
ELNet WG propuso 2012 score para SMD de bajo grado: CD34 (My & B-prec), CD45, SSC. Sensib. ~75% Especif. ~90% Fue validado en trabajo internacional y ha sido reportado como de significado pronóstico. Recomendado por ELN como screening en SMD y de utilidad clínica
Estudio multicĂŠntrico ELNet: learning cohort
Ogata et al., Blood, 2006; Ogata et al., Haematologica, 2009; Della Porta et al., [ELNet] Haematologica 2012; Feb7
Estudio multicĂŠntrico ELNet: validation cohort
Ogata et al., Blood, 2006; Ogata et al., Haematologica, 2009; 29 Della Porta et al., [ELNet] Haematologica 2012; Feb7
Ogata Score
Sensibilidad=70% Especificidad =92%
Ogata et al., Blood, 2006; Ogata et al., Haematologica, 2009;
Ogata Score Ejemplo % CD34+ Mbl = 1% (0) % prec. B = No se observan (1) MFI CD45 Ly/My = 9.9 (1) MFI SSC Gr/Ly=7.8 (0) Score = 2 probable SMD
N= 440 . SMD 92, NMP 47, SMD/NMP 14. Controles
Ogata Score >2 had 92.5% positive predictive value for MDS/MDS-MPN diagnosis. Negative predictive value for MDS/MDS-MPN was 83% for scores under 3 and 88% for scores under 2. No se observa relaciĂłn entre alteraciones citogenĂŠticas y el score
RED score
Mathis S. Leukemia 2013; 27:1981-19
Patrones de displasia por CF myeloid blasts
granulocytes
monocytes
(maturing myeloid cells) increased percentage abnormal granularity* abnormal expression** of CD45 abnormal expression of CD34 abnormal expression of CD117 abnormal expression of CD13 abnormal expression of CD33 abnormal expression of HLA-DR expression of CD11b expression of CD15 expression of lineage infidelity markers CD5, CD7, CD19 or CD56
decreased myeloid/lymphoid ratio (<1) abnormal granularity* abnormal expression of CD45 abnormal CD11b/CD13 pattern abnormal CD16/CD13 pattern abnormal expression of CD15 abnormal expression of CD33 expression of HLA-DR expression of CD34 asynchronous shift to the left
decreased/increased number as compared to lymphocytes abnormal granularity* abnormal expression of CD45 abnormal expression of CD14 abnormal CD11b/HLA-DR pattern abnormal expression of CD13 abnormal expression of CD33 abnormal expression of CD36 abnormal expression of HLA-DR expression of CD34
expression of lineage infidelity markers CD5, CD7, CD19
expression of lineage infidelity markers CD5, CD7, CD19
over expression of CD56
over expression of CD56
Loosdrecht AA van de, Westers TM, et al., Blood 2008;111:1067-1077; Wells D, et al., Blood 2003:102
Flow Cytometric Scoring System (FCSS) score 0 1 2
3 4 +1 +2 +3 +4
definition no FC aberrancies in either subpopulation analyzed - a single aberrancy in either granulocytes or monocytes - a single aberrancy in both granulocytes and monocytes or … - two or three aberrancies in either granulocytes and monocytes or … - expression of CD34 or lineage infidelity markers on either granulocytes or monocytes - four or more aberrancies in either granulocytes and monocytes - two or three aberrancies in both granulocytes and monocytes - - - - -
decreased myeloid/lymphoid ratio (<1) normal percentage of myeloid blasts (<5%) with flow cytometric aberrancies increased percentage of abnormal myeloid blasts (5-10%) increased percentage of abnormal myeloid blasts (11-20%) increased percentage of abnormal myeloid blasts (>20%)
total flow score of: 0-1: normal-mild 2-3: moderate 4-9: severe
Alta sensibilidad y alta especificidad Reproducibilidad ? Loosdrecht AA van de, Westers TM, et al., Blood 2008;111:1067-1077; Wells D, et al., Blood 2003:102; Cutler J, et al., Cytometry 2011
FCSS y Clasificaciรณn WHO2008 (n=261; controls: n=55)
01-04-2012
n=59
n=29
n=82
n=34
n=57
n=41
n=14
Van de Loosdrecht and Westers et al., Blood, 2008
FCSS y dependencia a la transfusiรณn
myeloblasts either: CD5 (o), CD7 (o) or CD56 (o) positive
In part published: Loosdrecht AA van de, Westers TM et al., Blood 2008;111
INFORME DE CF DE SMD La CF no es suficiente para diagnosticar una MDS. Se recomienda realizar informe integrado con resto de tests diagnรณsticos
PATRONES DE MADURACIÃ&#x201C;N MIELOIDE UTILIZANDO ESTRATEGIA EUROFLOW
Estandarización en Citometría de Flujo
MUESTRA
DATOS PACIENTE Pregunta a responder
TUBOS A REALIZAR
PANELES Abs & PROTOCOLOS MARCACIÓN
ADQUISICIÓN DATOS CITÓMETRO
ANÁLISIS DATOS
INFORME
RESULTADO
Citometría estandarizada
Estandarización equipo y reactivos
Estandarización paneles y procedimientos
Estandarización análisis
Patrones de maduraciรณn neutrรณfilica
Diferenciaciรณn a neutrรณfilo (tubo AML1)
van der Velde. ESCCA 2012
Cambios fenotípicos durante la diferenciación a neutrófilo MYELOBLAST
PROMYELOCYTE
MYELOCYTE
METAMYELOCYT
BAND/ NEUTROPHIL
CD15
CD13
CD13
CD64
MPO
103
CD65
CD33
CD35 CD11b 102
CD16 101
CD34 HLA-DR
CD117
CD54
CD10
Patrรณn de maduraciรณn mieloide
Bases de datos de referencia de maduraciรณn a neutrรณfilo en MO Normal
N=23
Maduraciรณn a neutrรณfilo en MO Normal vs MO reactiva Overlayed Normal vs reactive BM
Overlayed Normal vs reactive BM
Overlayed Normal vs MDS BM
+3SD
+10SD
-3SD
-10SD
Otras utilidades de la CF en SMD
PRONOSTICO
RESPUESTA A EPO
RESPUESTA A HIPOMETILANTES
Hay correlación con IPSS y R-IPSS Hay correlación con grupos según WHO
La aberrancia en marcadores mieloides y score elevado se asoció con mayor dependencia tranfusional y peor pronóstico
Utilidad pronรณstica de la CF
Kern et al: Clinical utility of multiparamenter FC in the diagnosis of 1013 patients with MDS. Cancer 2010; 116 (19)
CF y dependencia transfusional en MDS
Score pronรณstico para MDS
CF y MDS WHO 2008 â&#x20AC;?Immunophenotyping of MDS may be of diagnostic/ prognostic utility (in the future)â&#x20AC;?
Conclusiones ¨
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2016: No ha mejorado el concepto de la aplicabilidad de la CF en MDS Nuevos scores diagnósticos y pronósticos estandarizados en MDS podría ser un gran aporte para mejorar la aplicabilidad de la CF en MDS. El desarrollo de nuevos softwares que posibiliten el análisis automático podría mejorar sustancialemente el análisis