Estudios moléculares en los SMD : valor diagnostico y pronostico Raphaël Itzykson Hôpital Saint-Louis, Paris, Francia
Mutaciones somaticas en los SMD Splicing
Señalización Gen
Frequencia
SF3B1
15-30%
TET2
15-25%
ASXL1
10-20%
RUNX1
5-15%
TP53
5-10%
DNMT3A
5-10%
N-/K-RAS
5-10%
SRSF2
5-10%
U2AF1
5-10%
BCOR/L1
5-6%
ZRSR2
5%
EZH2
3-7%
JAK2
3-4%
SRSF2
RAS
EZH2
Exon 2
U2AF1
JAK2 ZRSR2
Epigenetica
ASXL1
A
NH2
TET2
N N
O
IDH
DNMT3A
SF3B1 Factores de transcripción
RUNX1 TP53 BCOR/L1
logR
Eventos oncogenéticos AA, BB AB
111 genes séqusecuenciados en 838 pacientes BAF
BCOR DNMT3A CBL CUX1 ZRSR2 SFRS2 RUNX1 STAG2 NRAS IDH2 TP53 ASXL1 U2AF1
TET2 IDH1 EZH2 JAK2
SF3B1
Co−occurring
RA
25
RARS RARS−T Odds ratio
c
Complex del(20q) del(17) del(12) +8 del(7q) del(5q) Rearr chr3
Nombre de pa:ents avec muta:on(s)
Mutaciones somáticas en un 80% de los casos
RCMD RCMD−RS
OR=1
RAEB 5q− CMML MDS−MPN MDS−U
0.1 Mutually exclusive
MDS−AML
q<0.1
* Splicing
* Chromatin
* Transcription
q<0.05
* DNA methylation
* Signalling
* Other
q<0.01
Figure 1
Papaemmanuil E et al. Blood. 2013 Nov 21;122(22):3616-27
Clonal Architecture of MDS
Walter NEJM 2012
Recurent inter-pathway coopera8vity
Haferlach Leukemia 2014
Spliceosome muta8ons in MDS
U2 U1
SF1
U4
SF3B1
U2AF65
U2AF35
U6
U5
Hotspot subs:tu:ons: gain of func:on?
SRSF2
U1
Func8onal consequences of spliceosome muta8ons
Gain of func8on
Alterna8ve splice sites in 5’ or 3’
AAUAAA
AAUAAA AAUAAA
Dominant nega8ve
Alterna8ve polyadenyla8on sites
AAUAAA
AAUAAA
AAUAAA AAUAAA
Loss of func8on
Intron Reten8on
AAUAAA
AAUAAA
AAUAAA
TAG / TAA / TGA
“Nonsense mediated mRNA decay”
Junc:on complexes exon – exon
Eg. Przychodzen Blood 2013
A case of intron reten8on
Park Mol Cell 2016
Therapeu8c targe8ng of splice muta8ons
Lee Nature Med 2016
Func8onal consequences of SF3B1 muta8ons
Obeng Cancer Cell 2016
Muta8ons aï¬&#x20AC;ec8ng DNA methyla8on Cytosine NH2
NH2
CH3
DNMT3A
N N
5-methylcytosine
N O
N
O
Isocitrate
IDH1 /2 2-OG
COH3
TET2
NH2 N N
O
5-hydroxymethylcytosine
Itzykson Leukemia 2013
Muta8ons aï¬&#x20AC;ec8ng the histone machinery
Ac5ve
Repressive
EED
JARID2 SUZ12
PR-DUB BAP1
ASXL1
PRC1
BMI1
H2AK119 Ub
H3K4
HATs
H3K27 me3
EZH2
PRC2
MLL
UTX/ KDM6A
H3K4 me3
H2AK119
HDACs
H3K27
Ac
Corelaciones genotipo - fenotipo • SF3B1 : Ringed Sideroblasts (RARS, RARS-T…) • SRSF2, TET2, ASXL1 : more frequent in CMML • JAK2 : Thrombocytosis • RUNX1 : thrombocytopenia • TP53 : complex karyotypes • 5q- syndromes (20-25%; sub-clonal)
Next-generation sequencing (NGS) en comparación con el método de Sanger
Mas rapido Mas barato (si secuencia varios genes) Mas sensible (subclón ~5% vs. 20%) Mas exhaustivo Les consumidor de ADN cobertura
Whole Genome Sequencing
Targeted Resquencing
profundida
Whole Exome Sequencing
Limitaciones del NGS Tecnicas Technicas de enriquecimiento Elección del secuenciador Pruebas automatizadas Almacenamiento de datos
Analiticas Insercion/suprecion (incluso FLT3, MLL) GC-rich, homopolymers (eg. CEBPA)
Interprétacion SNV non recurrentes Concordancia de los 4 softwares de predicción: 19% ADN germinal ?
Subclones Sangre vs. MO Concordancia … en Sanger1 1. Mohamedali AM et al. Blood. 2013 Jul 25;122(4):567-70 Marceau-Renaut A et al. Hématologie 2013;19 (2):112-22
Valor del NGS en clinica Valor diagnรณstico?
Valor pronostico ?
Valor teranรณstico ?
caso clínico n°1 86 anos Anémia macrocitica antigua Hemograma Leucocitos : 7,58 x109/L (neutrofilos : 5,51 ; linfocitos 1,24 ; monocitos 0,61) Hemoglobina : 9,4 g/dL, VCM : 105,7 fL , reticulocitos : 117,5 x109/L Plaquetas : 283 x109/L Anisocitosis, poiquilocitosis - algunas con punteado basofilo
Aspirado de MO Blastos : 1%, hiperplasia de las lineas granulocitica y megacariocitica
Citogenetica : 46,XY Folates, B12 Normales EPO : 213 U/L Haptoglobina < 0,2 g/L Ausensia de celulas HPN ; Prueba de antiglobulina directa negativa ; electroforesis de la Hb normal
Estomatocitosis adquirida ? Estomatocitosis confirmada en ektacytometria
Adquirida ? Ausensia de la mutacion PIEZO11
1. Konstantopoulos K et al. Med Oncol Tumor Pharmacother. 1992;9(4):213-4
NGS
NGS
Caso 1 : pregunta La mutacion de JAK2 orienta asia un SMPC El perfil molecular es compatible con un ‘CHIP’ El perfil molecular permite el diagnostico de SMD El perfil molecular indica un tratamiento con EPO El perfil molecular es de alto riesgo, una alo-TPH debe ser organisada 21
AB
JAK2 y SMD BAF
BCOR DNMT3A CBL CUX1 ZRSR2 SFRS2 RUNX1 STAG2 NRAS IDH2 TP53 ASXL1 U2AF1
TET2 IDH1 EZH2 JAK2
Co−occurring
SF3B1
SMD
Complex del(20q) del(17) del(12) +8 del(7q) del(5q) Rearr chr3
c
RA
25
RARS
Odds ratio
RARS−T RCMD RCMD−RS
JAK2
OR=1
RAEB 5q− CMML MDS−MPN MDS−U
0.1 Mutually exclusive
MDS−AML
q<0.1
* Splicing
* Chromatin
* Transcription
q<0.05
* DNA methylation
* Signalling
* Other
Figure 1
q<0.01
SMD/SMP : ARSI-T 1% 43% 4% 86% 22
Papaemmanuil Blood 2013, Broseus Leukemia 2014
CHIP Clonal Hematopoiesis of Indeterminate Potential (CHIP)
Steensma DP et al. Blood. 2015 Jul 2;126(1):9-16
CHIP
Steensma DP et al. Blood. 2015 Jul 2;126(1):9-16
Perfil molecular de los ‘CHIP’
Jaiswal S et al. N Engl J Med. 2014 Dec 25;371(26):2488-98
Perfil molecular de los ‘pre-SMD’
Cargo CA et al. Blood. 2015 Sep 21
Perfil molecular de los ‘CCUS’
Kwok et al. Blood. 2015
Perfil molecular de los ‘CCUS’
Kwok et al. Blood. 2015
Limitaciones del NGS para el diagnรณstico โ ฏ No incluido en la clasificaciรณn OMS 2016 Presencia de clones en las aplasias medulares adquiridas : BCOR/BCORL1, ASXL1 y DNMT3A Otras enfermedades del sistema mieloide : ausensia de modelo discriminante
Malcovati L et al. Blood. 2014 Aug 28;124(9):1513-21
Valor pronostico â&#x20AC;¯ 5 mutaciones en 4 genes : JAK2, TET2, SMC3, ZRSR2
Papaemmanuil E et al. Blood. 2013 Nov 21;122(22):3616-27; quiz 3699
Clinical Impact of gene mutations in lower-risk MDS Informative mutation in 21% lower-risk MDS
Bejar R et al, NEJM 2011 ; Bejar J Clin Oncol 2012
Mutations in lower-risk MDS treated with ESA
32
Variable
OR
P=
Male (vs Female)
0.35
0.04
IPSS-R INT (vs Low/Very-Low)
0.32
0.04
sEPO > 100 UI/L
0.19
0.04
RBC-TD
0.38
0.03
Muta8ons > 2
0.29
0.29
Kosmider Haematologica 2016
Valor theranostico de la biologia molecular en los SMD de bajo riesgo â&#x20AC;Ż ESA : no â&#x20AC;Ż LEN : CRBN polymorphism? Luspatercept: SF3B1 mutations?
33
Sardnal et al. Leukemia 2013 ; Platzbecker Blood 2015: 126(23):2862
Evolucion
Respuesta completa con EPO durante 12 meces
Caso 2 Mujer, 72 anos, Sindrome 5q- tipico Tratamiento con EPO durante 12 meces Pérdida de respuesta Mielograma : blastos 5%, disgranulopoyesis Cariotipo : 46,XX,del(5)(q13q33)[18]/46,XX[2] NGS Gene
CDS
Protein
VAF (%)
CUX1
c.1829dupT
p.L610fs
21
RUNX1
35
c.353_354insCTGAG p.R118_N119delinsSX
19
SF3B1
c.C2098G
p.Q700E
24
TP53
c.G713T
p.C238F
24
U2AF1
c.C101G
p.S34C
21
Caso 2 : pregunta El perfil molecular no es compatible con un sindrome 5q- : hay que buscar una equivoquadad en el laboratorio La mutacion de TP53 es de pronostico desfavorable La mutacion de TP53 no es significativa porque la ‘VAF’ es demasiado baja La mutacion de TP53 contraindica el tratamiento con LEN
36
Caso 2 : pregunta El perfil molecular no es compatible con un sindrome 5q- : hay que buscar una equivoquadad en el laboratorio La mutacion de TP53 es de pronostico desfavorable La mutacion de TP53 no es significativa porque la ‘VAF’ es demasiado baja La mutacion de TP53 contraindica el tratamiento con LEN
37
Subclonal TP53 mutations in del5q syndrome
• Incidence of TP53 mutations in 5q- MDS: ~20% • No difference in baseline caracteristics • No impact on response rate or quality to LEN • Poor outcome in OS and EFS
Jadersten J Clin Oncol 2011, Mossner Leukemia 2016
Caso 3 Hombre de 62 anos Ausencia de comorbilidad Hb 7,2 g/dL, Neutrofilos 1,8 G/L Pqt 78 G/L AREB-2 (blastos 13%) Cariotipo : 46,XY [30] NGS Gene
CDS
Protein
VAF (%)
ASXL1
c.1888_1910del
p.H630fs
14
SRSF2
c.C284G
p.P95R
34
TET2 TET2 39
c.4130_4131delinsGCATG p.F1377delinsCM c.G4108T
p.G1370W
28 31
Caso 3 : pregunta El perfil molecular podría reclasificar el IPSS de int-2 a ‘highrisk’ El perfil molecular se debe integrar con el IPSS-R La mutación de TET2 sugiere que un tratamiento con agentes hipometilantes seria superior a une alo-TPH La mutación de ASXL1 sugiere que un con alo-TPH seria superior a un tratamiento con agentes hipometilantes 40
Caso 3 : pregunta El perfil molecular podría reclasificar el IPSS de int-2 a ‘high-risk’ El perfil molecular se debe integrar con el IPSS-R La mutación de TET2 sugiere que un tratamiento con agentes hipometilantes seria superior a une alo-TPH La mutación de ASXL1 sugiere que un con alo-TPH seria superior a un tratamiento con agentes hipometilantes 41
Clinical Impact of gene mutations in MDS
Informative mutation in 51% NK MDS (splicing mutations not assessed)
Bejar R et al, NEJM 2011 ; Bejar J Clin Oncol 2012
Incorporating molecular data in IPSS-R IPSS-R
43
New Model
EZH2 SF3B1 TP53
Nazha Leukemia 2016
Prediction de la respuesta a los hipometilantes Respuesta NingĂşn inďŹ&#x201A;uencia en Supervivencia
HMA
44
Itzykson Leukemia 2011; Voso Leukemia 2011; Metzler Leukemia 2012; Traina Leukemia 20 Bejar Blood 2014
Pronostico molecular despues de aloTPH
45
Della Porta J Clin Oncol 2016
Caso n°4 Hombre de 42 años Antecedente de vitíligo Erupción cutánea, artralgias ANA - ; biopsia de piel : Lupus
Leu : 2,2 G/L Neu : 0,98 G/L Mon : 0,33 G/L, Hb : 12,1 g/dL, Plaquetas : 138 G/L Frotis de PB : pseudo-Pelger Myelograma AREB-1 6% blastos, displasia multilineal
Cariotipo Normal
Pronóstico clínico Catégorie
OS
25%AMLFS
Int-1
3.5y
3.3y
WPSS
Int
4y
N/A
IPSS-R
Low
5.3y
10.8y
IPSS
Caso 4 : qué tipo de tratamiento ? SAL porque es joven Tratamiento del lupus con glucocorticoides, antipalúdicos… Tratamiento con quimioterapia antes de alo-TPH Tratamiento con azacitidine antes de alo-TPH Alo-TPH de repente 48
NGS Gene
Status
Prognosis
Gene
Status
Prognosis
CBL
WT
-
TET2
WT
-
PTPN11
WT
-
IDH1
WT
-
KIT
SNP
-
IDH2
WT
-
KRAS
WT
-
DNMT3A
WT
-
NRAS
WT
POOR (L)
ASXL1
SNP
POOR
MPL
WT
-
PHF6
WT
-
JAK2
WT
-
EZH2
WT
POOR
RIT1
WT
-
SETBP1
WT
-
Status
Prognosis
Gene
Status
Prognosis Gene
ETV6
WT
POOR
SF3B1
WT
GOOD
RUNX1
WT
POOR
SRSF2
WT
POOR (L)
TP53
p.Q317K (46%)
POOR
ZRSR2
SNP
-
WT1
WT
-
U2AF1
WT
POOR (L)
Alo-TPH de repente ?
Probability of Overall Survival
1.0
Intermediate(N=61) Intermediate(N=40) P High risk (N=
0.8 0.6 0.4 0.2 0.0
0
2
4
6
Years
Figure 4. Overall Survival, According Status. Panel A shows the overall survival o tients with mutations in one or mor Koreth J et al. J Clin Oncol. 20;31(21):2662-70 pared2013 with Jul patients without such mu presence and absence of prognostic survival curve for patients in the ne the comparison curve is for patients comparison of overall survival betw group. The IPSS risk classification, w the number of cytopenias (Table 2 i the time of bone marrow sample co
2504
Th Downloaded from nejm.org at INSERM DISC Copyright Š 2011
Bejar R et al. N Engl J Med. 2011 Jun 30;364(26):2496-506
Alo-TPH de repente ?
All tumors: n=24,210
176
248
273
317?
MDS: n=65
Germline ? Family history ? Functional test ?
Alo-TPH de repente ?
Papaemmanuil E et al. Blood. 2013 Nov 21;122(22):3616-27; quiz 3699
Alo-TPH de repente ? â&#x20AC;¯ 87 SMD patients Mostly RIC, PBSC, MUD
Bejar R et al. J Clin Oncol. 2014 Sep 1;32(25):2691-8
Evolución SMD : vigilancia Lupus : glucocorticoides, antipalúdicos, rituximab Respuesta completa
8 meses después : evolución en “LMMC-2” Leu 11,5 G/L ; Monos 1,5 G/L ; precursores inmaduros14% Mielograma : 15% blastos, Cariotipo normal NGS : TP53 c.949C>A : p.Q317K (VAF 48%)
9 meses después : LMA 25% blastos Quimioterapia intensiva Alo-TPH
Formas familiales de SMD
â&#x20AC;Ż 11 genes identificados Cribado clinico molecular
Family history Previous cytopenia / platelet dysfunc:on Previous BMF
Kiran Tawana and Jude Fitzgibbon, Blood 2016
Valor del NGS en los SMD Diagnostico : ayuda aunque todavía no reconocida por la clasificación WHO 2016 CCUS ? Formas familiales ++
Pronostico : Funciona al nivel de una población de SMD, mas difícil al nivel de un paciente IPSS-R-mol todavía no existe
Téranostico : El futuro ? SF3B1 y Luspatercept ?
Ensayos clínicos +++ 56