Estudios moleculares en SMD y su valor pronóstico - Dr. Raphael Itzykson

Estudios moléculares en los SMD : valor diagnostico y pronostico Raphaël Itzykson Hôpital Saint-Louis, Paris, Francia

Mutaciones somaticas en los SMD Splicing

Señalización Gen

Frequencia

SF3B1

15-30%

TET2

15-25%

ASXL1

10-20%

RUNX1

5-15%

TP53

5-10%

DNMT3A

5-10%

N-/K-RAS

5-10%

SRSF2

5-10%

U2AF1

5-10%

BCOR/L1

5-6%

ZRSR2

5%

EZH2

3-7%

JAK2

3-4%

SRSF2

RAS

EZH2

Exon 2

U2AF1

JAK2 ZRSR2

Epigenetica

ASXL1

A

NH2

TET2

N N

O

IDH

DNMT3A

SF3B1 Factores de transcripción

RUNX1 TP53 BCOR/L1

logR

Eventos oncogenéticos AA, BB AB

111 genes séqusecuenciados en 838 pacientes BAF

BCOR DNMT3A CBL CUX1 ZRSR2 SFRS2 RUNX1 STAG2 NRAS IDH2 TP53 ASXL1 U2AF1

TET2 IDH1 EZH2 JAK2

SF3B1

Co−occurring

RA

25

RARS RARS−T Odds ratio

c

Complex del(20q) del(17) del(12) +8 del(7q) del(5q) Rearr chr3

Nombre de pa:ents avec muta:on(s)

Mutaciones somáticas en un 80% de los casos

RCMD RCMD−RS

OR=1

RAEB 5q− CMML MDS−MPN MDS−U

0.1 Mutually exclusive

MDS−AML

q<0.1

* Splicing

* Chromatin

* Transcription

q<0.05

* DNA methylation

* Signalling

* Other

q<0.01

Figure 1

Papaemmanuil E et al. Blood. 2013 Nov 21;122(22):3616-27

Clonal Architecture of MDS

Walter NEJM 2012

Recurent inter-pathway coopera8vity

Haferlach Leukemia 2014

Spliceosome muta8ons in MDS

U2 U1

SF1

U4

SF3B1

U2AF65

U2AF35

U6

U5

Hotspot subs:tu:ons: gain of func:on?

SRSF2

U1

Func8onal consequences of spliceosome muta8ons

Gain of func8on

Alterna8ve splice sites in 5’ or 3’

AAUAAA

AAUAAA AAUAAA

Dominant nega8ve

Alterna8ve polyadenyla8on sites

AAUAAA

AAUAAA

AAUAAA AAUAAA

Loss of func8on

Intron Reten8on

AAUAAA

AAUAAA

AAUAAA

TAG / TAA / TGA

“Nonsense mediated mRNA decay”

Junc:on complexes exon – exon

Eg. Przychodzen Blood 2013

A case of intron reten8on

Park Mol Cell 2016

Therapeu8c targe8ng of splice muta8ons

Lee Nature Med 2016

Func8onal consequences of SF3B1 muta8ons

Obeng Cancer Cell 2016

Muta8ons aï¬&#x20AC;ec8ng DNA methyla8on Cytosine NH2

NH2

CH3

DNMT3A

N N

5-methylcytosine

N O

N

O

Isocitrate

IDH1 /2 2-OG

COH3

TET2

NH2 N N

O

5-hydroxymethylcytosine

Itzykson Leukemia 2013

Muta8ons aï¬&#x20AC;ec8ng the histone machinery

Ac5ve

Repressive

EED

JARID2 SUZ12

PR-DUB BAP1

ASXL1

PRC1

BMI1

H2AK119 Ub

H3K4

HATs

H3K27 me3

EZH2

PRC2

MLL

UTX/ KDM6A

H3K4 me3

H2AK119

HDACs

H3K27

Ac

Corelaciones genotipo - fenotipo • SF3B1 : Ringed Sideroblasts (RARS, RARS-T…) • SRSF2, TET2, ASXL1 : more frequent in CMML • JAK2 : Thrombocytosis • RUNX1 : thrombocytopenia • TP53 : complex karyotypes • 5q- syndromes (20-25%; sub-clonal)

Next-generation sequencing (NGS) en comparación con el método de Sanger

Mas rapido Mas barato (si secuencia varios genes) Mas sensible (subclón ~5% vs. 20%) Mas exhaustivo Les consumidor de ADN cobertura

Whole Genome Sequencing

Targeted Resquencing

profundida

Whole Exome Sequencing

Limitaciones del NGS Tecnicas Technicas de enriquecimiento Elección del secuenciador Pruebas automatizadas Almacenamiento de datos

Analiticas Insercion/suprecion (incluso FLT3, MLL) GC-rich, homopolymers (eg. CEBPA)

Interprétacion SNV non recurrentes Concordancia de los 4 softwares de predicción: 19% ADN germinal ?

Subclones Sangre vs. MO Concordancia … en Sanger1 1. Mohamedali AM et al. Blood. 2013 Jul 25;122(4):567-70 Marceau-Renaut A et al. Hématologie 2013;19 (2):112-22

Valor del NGS en clinica Valor diagnรณstico?

Valor pronostico ?

Valor teranรณstico ?

caso clínico n°1 86 anos Anémia macrocitica antigua Hemograma Leucocitos : 7,58 x109/L (neutrofilos : 5,51 ; linfocitos 1,24 ; monocitos 0,61) Hemoglobina : 9,4 g/dL, VCM : 105,7 fL , reticulocitos : 117,5 x109/L Plaquetas : 283 x109/L Anisocitosis, poiquilocitosis - algunas con punteado basofilo

Aspirado de MO Blastos : 1%, hiperplasia de las lineas granulocitica y megacariocitica

Citogenetica : 46,XY Folates, B12 Normales EPO : 213 U/L Haptoglobina < 0,2 g/L Ausensia de celulas HPN ; Prueba de antiglobulina directa negativa ; electroforesis de la Hb normal

Estomatocitosis adquirida ?

Estomatocitosis confirmada en ektacytometria

Adquirida ? Ausensia de la mutacion PIEZO11

1. Konstantopoulos K et al. Med Oncol Tumor Pharmacother. 1992;9(4):213-4

NGS

NGS

Caso 1 : pregunta La mutacion de JAK2 orienta asia un SMPC El perfil molecular es compatible con un ‘CHIP’ El perfil molecular permite el diagnostico de SMD El perfil molecular indica un tratamiento con EPO El perfil molecular es de alto riesgo, una alo-TPH debe ser organisada 21

AB

JAK2 y SMD BAF

BCOR DNMT3A CBL CUX1 ZRSR2 SFRS2 RUNX1 STAG2 NRAS IDH2 TP53 ASXL1 U2AF1

TET2 IDH1 EZH2 JAK2

Co−occurring

SF3B1

SMD

Complex del(20q) del(17) del(12) +8 del(7q) del(5q) Rearr chr3

c

RA

25

RARS

Odds ratio

RARS−T RCMD RCMD−RS

JAK2

OR=1

RAEB 5q− CMML MDS−MPN MDS−U

0.1 Mutually exclusive

MDS−AML

q<0.1

* Splicing

* Chromatin

* Transcription

q<0.05

* DNA methylation

* Signalling

* Other

Figure 1

q<0.01

SMD/SMP : ARSI-T 1% 43% 4% 86% 22

Papaemmanuil Blood 2013, Broseus Leukemia 2014

CHIP Clonal Hematopoiesis of Indeterminate Potential (CHIP)

Steensma DP et al. Blood. 2015 Jul 2;126(1):9-16

CHIP

Steensma DP et al. Blood. 2015 Jul 2;126(1):9-16

Perfil molecular de los ‘CHIP’

Jaiswal S et al. N Engl J Med. 2014 Dec 25;371(26):2488-98

Perfil molecular de los ‘pre-SMD’

Cargo CA et al. Blood. 2015 Sep 21

Perfil molecular de los ‘CCUS’

Kwok et al. Blood. 2015

Perfil molecular de los ‘CCUS’

Kwok et al. Blood. 2015

Limitaciones del NGS para el diagnรณstico โ ฏ No incluido en la clasificaciรณn OMS 2016 Presencia de clones en las aplasias medulares adquiridas : BCOR/BCORL1, ASXL1 y DNMT3A Otras enfermedades del sistema mieloide : ausensia de modelo discriminante

Malcovati L et al. Blood. 2014 Aug 28;124(9):1513-21

Valor pronostico â&#x20AC;¯ 5 mutaciones en 4 genes : JAK2, TET2, SMC3, ZRSR2

Papaemmanuil E et al. Blood. 2013 Nov 21;122(22):3616-27; quiz 3699

Clinical Impact of gene mutations in lower-risk MDS Informative mutation in 21% lower-risk MDS

Bejar R et al, NEJM 2011 ; Bejar J Clin Oncol 2012

Mutations in lower-risk MDS treated with ESA

32

Variable

OR

P=

Male (vs Female)

0.35

0.04

IPSS-R INT (vs Low/Very-Low)

0.32

0.04

sEPO > 100 UI/L

0.19

0.04

RBC-TD

0.38

0.03

Muta8ons > 2

0.29

0.29

Kosmider Haematologica 2016

Valor theranostico de la biologia molecular en los SMD de bajo riesgo â&#x20AC;Ż ESA : no â&#x20AC;Ż LEN : CRBN polymorphism?

Luspatercept: SF3B1 mutations?

33

Sardnal et al. Leukemia 2013 ; Platzbecker Blood 2015: 126(23):2862

Evolucion

Respuesta completa con EPO durante 12 meces

Caso 2 Mujer, 72 anos, Sindrome 5q- tipico Tratamiento con EPO durante 12 meces Pérdida de respuesta Mielograma : blastos 5%, disgranulopoyesis Cariotipo : 46,XX,del(5)(q13q33)[18]/46,XX[2] NGS Gene

CDS

Protein

VAF (%)

CUX1

c.1829dupT

p.L610fs

21

RUNX1

35

c.353_354insCTGAG p.R118_N119delinsSX

19

SF3B1

c.C2098G

p.Q700E

24

TP53

c.G713T

p.C238F

24

U2AF1

c.C101G

p.S34C

21

Caso 2 : pregunta El perfil molecular no es compatible con un sindrome 5q- : hay que buscar una equivoquadad en el laboratorio La mutacion de TP53 es de pronostico desfavorable La mutacion de TP53 no es significativa porque la ‘VAF’ es demasiado baja La mutacion de TP53 contraindica el tratamiento con LEN

36

Caso 2 : pregunta El perfil molecular no es compatible con un sindrome 5q- : hay que buscar una equivoquadad en el laboratorio La mutacion de TP53 es de pronostico desfavorable La mutacion de TP53 no es significativa porque la ‘VAF’ es demasiado baja La mutacion de TP53 contraindica el tratamiento con LEN

37

Subclonal TP53 mutations in del5q syndrome

• Incidence of TP53 mutations in 5q- MDS: ~20% • No difference in baseline caracteristics • No impact on response rate or quality to LEN • Poor outcome in OS and EFS

Jadersten J Clin Oncol 2011, Mossner Leukemia 2016

Caso 3 Hombre de 62 anos Ausencia de comorbilidad Hb 7,2 g/dL, Neutrofilos 1,8 G/L Pqt 78 G/L AREB-2 (blastos 13%) Cariotipo : 46,XY [30] NGS Gene

CDS

Protein

VAF (%)

ASXL1

c.1888_1910del

p.H630fs

14

SRSF2

c.C284G

p.P95R

34

TET2 TET2 39

c.4130_4131delinsGCATG p.F1377delinsCM c.G4108T

p.G1370W

28 31

Caso 3 : pregunta El perfil molecular podría reclasificar el IPSS de int-2 a ‘highrisk’ El perfil molecular se debe integrar con el IPSS-R La mutación de TET2 sugiere que un tratamiento con agentes hipometilantes seria superior a une alo-TPH La mutación de ASXL1 sugiere que un con alo-TPH seria superior a un tratamiento con agentes hipometilantes 40

Caso 3 : pregunta El perfil molecular podría reclasificar el IPSS de int-2 a ‘high-risk’ El perfil molecular se debe integrar con el IPSS-R La mutación de TET2 sugiere que un tratamiento con agentes hipometilantes seria superior a une alo-TPH La mutación de ASXL1 sugiere que un con alo-TPH seria superior a un tratamiento con agentes hipometilantes 41

Clinical Impact of gene mutations in MDS

Informative mutation in 51% NK MDS (splicing mutations not assessed)

Bejar R et al, NEJM 2011 ; Bejar J Clin Oncol 2012

Incorporating molecular data in IPSS-R IPSS-R

43

New Model

EZH2 SF3B1 TP53

Nazha Leukemia 2016

Prediction de la respuesta a los hipometilantes Respuesta NingĂşn inďŹ&#x201A;uencia en Supervivencia

HMA

44

Itzykson Leukemia 2011; Voso Leukemia 2011; Metzler Leukemia 2012; Traina Leukemia 20 Bejar Blood 2014

Pronostico molecular despues de aloTPH

45

Della Porta J Clin Oncol 2016

Caso n°4 Hombre de 42 años Antecedente de vitíligo Erupción cutánea, artralgias ANA - ; biopsia de piel : Lupus

Leu : 2,2 G/L Neu : 0,98 G/L Mon : 0,33 G/L, Hb : 12,1 g/dL, Plaquetas : 138 G/L Frotis de PB : pseudo-Pelger Myelograma AREB-1 6% blastos, displasia multilineal

Cariotipo Normal

Pronóstico clínico Catégorie

OS

25%AMLFS

Int-1

3.5y

3.3y

WPSS

Int

4y

N/A

IPSS-R

Low

5.3y

10.8y

IPSS

Caso 4 : qué tipo de tratamiento ?

SAL porque es joven Tratamiento del lupus con glucocorticoides, antipalúdicos…

Tratamiento con quimioterapia antes de alo-TPH Tratamiento con azacitidine antes de alo-TPH Alo-TPH de repente 48

NGS Gene

Status

Prognosis

Gene

Status

Prognosis

CBL

WT

-

TET2

WT

-

PTPN11

WT

-

IDH1

WT

-

KIT

SNP

-

IDH2

WT

-

KRAS

WT

-

DNMT3A

WT

-

NRAS

WT

POOR (L)

ASXL1

SNP

POOR

MPL

WT

-

PHF6

WT

-

JAK2

WT

-

EZH2

WT

POOR

RIT1

WT

-

SETBP1

WT

-

Status

Prognosis

Gene

Status

Prognosis Gene

ETV6

WT

POOR

SF3B1

WT

GOOD

RUNX1

WT

POOR

SRSF2

WT

POOR (L)

TP53

p.Q317K (46%)

POOR

ZRSR2

SNP

-

WT1

WT

-

U2AF1

WT

POOR (L)

Alo-TPH de repente ?

Probability of Overall Survival

1.0

Intermediate(N=61) Intermediate(N=40) P High risk (N=

0.8 0.6 0.4 0.2 0.0

0

2

4

6

Years

Figure 4. Overall Survival, According Status.

Panel A shows the overall survival o tients with mutations in one or mor Koreth J et al. J Clin Oncol.

20;31(21):2662-70 pared2013 with Jul patients without such mu presence and absence of prognostic survival curve for patients in the ne the comparison curve is for patients comparison of overall survival betw group. The IPSS risk classification, w the number of cytopenias (Table 2 i the time of bone marrow sample co

2504

Th Downloaded from nejm.org at INSERM DISC Copyright Š 2011

Bejar R et al. N Engl J Med. 2011 Jun 30;364(26):2496-506

Alo-TPH de repente ?

All tumors: n=24,210

176

248

273

317?

MDS: n=65

Germline ? Family history ? Functional test ?

Alo-TPH de repente ?

Papaemmanuil E et al. Blood. 2013 Nov 21;122(22):3616-27; quiz 3699

Alo-TPH de repente ? â&#x20AC;¯ 87 SMD patients Mostly RIC, PBSC, MUD

Bejar R et al. J Clin Oncol. 2014 Sep 1;32(25):2691-8

Evolución SMD : vigilancia Lupus : glucocorticoides, antipalúdicos, rituximab Respuesta completa

8 meses después : evolución en “LMMC-2” Leu 11,5 G/L ; Monos 1,5 G/L ; precursores inmaduros14% Mielograma : 15% blastos, Cariotipo normal NGS : TP53 c.949C>A : p.Q317K (VAF 48%)

9 meses después : LMA 25% blastos Quimioterapia intensiva Alo-TPH

Formas familiales de SMD

â&#x20AC;Ż 11 genes identificados Cribado clinico molecular

Family history Previous cytopenia / platelet dysfunc:on Previous BMF

Kiran Tawana and Jude Fitzgibbon, Blood 2016

Valor del NGS en los SMD Diagnostico : ayuda aunque todavía no reconocida por la clasificación WHO 2016 CCUS ?

Formas familiales ++

Pronostico : Funciona al nivel de una población de SMD, mas difícil al nivel de un paciente IPSS-R-mol todavía no existe

Téranostico : El futuro ? SF3B1 y Luspatercept ?

Ensayos clínicos +++ 56