a cura di Gianna Ferretti

3. Pesticidi e sensibilità di genere

a cura di Gianna Ferretti, professore associato in Biochimica, Dipartimento di Scienze Cliniche, direttore Centro di Ricerca e Servizio di Educazione Sanitaria e Promozione della Salute, Facoltà di Medicina, Università Politenica delle Marche

La Food and Agriculture Organization (FAO) definisce un pesticida come “qualsiasi sostanza o miscela di sostanze destinate a prevenire, distruggere o controllare qualsiasi parassita, inclusi vettori di malattie umane o animali, specie indesiderate di piante o animali che causano danni o interferiscono in altro modo con la produzione, la trasformazione, lo stoccaggio, il trasporto o la commercializzazione di alimenti, materie prime agricole, legno, prodotti in legno o alimenti per animali, o che possono essere somministrati agli animali per il controllo di insetti, acari o altri parassiti in o sui loro corpi”. Pertanto i pesticidi sono usati, oltre che in agricoltura, anche in altri settori produttivi per controllare insetti, erbe infestanti, parassiti, animali e vettori di malattie. Accanto agli effetti previsti, una vasta letteratura dimostra che i pesticidi possono anche avere effetti negativi sulla salute degli esseri umani1-6. Oltre al rischio cancerogeno che è stato oggetto di numerosi studi e indagini1, particolare attenzione viene posta alla capacità di molti pesticidi di favorire l’insorgenza di malattie croniche come disturbi neurodegenerativi (mor-

bo di Parkinson, morbo di Alzheimer) e patologie cardiovascolari e dismetaboliche tra cui il diabete1-6 .

Tra le categorie maggiormente interessate agli effetti sui pesticidi,vi sono i lavoratori delle aziende produttrici di prodotti fitosanitari e gli agricoltori per l’esposizione a pesticidi e fertilizzanti. Oltre che all’esposizione professionale, per la popolazione generale l’ambiente e l’assunzione con gli alimenti sono i veicoli principali di esposizione6. Il contatto a breve e/o a lungo termine con i pesticidi può danneggiare la funzione di diversi organi del corpo. La manifestazione degli effetti dipende dal tipo di pesticida e dalle sue caratteristiche strutturali, dal livello e dalla durata dell’esposizione1-6. Inoltre fattori genetici e differenze di genere appaiono svolgere un ruolo nella insorgenza degli effetti esercitati dai pesticidi7 .

Da un esame della letteratura emerge che la maggior parte degli studi sull’esposizione a diversi pesticidi negli adulti si concentra sull’esposizione professionale.

Sebbene soggetti di sesso femminile rappresentino oltre il 40% della forza lavoro agricola globale, la maggior parte degli studi sugli effetti avversi dell’esposizione professionale esamina gli effetti esclusivamente in partecipanti maschi o si reclutano donne solo per includerle nel gruppo non esposto.

Ciò crea una non facile comparabilità tra i gruppi esposti e quelli non esposti7. L’interesse per lo studio di differenze di genere negli effetti dei pesticidi si basa sulla conoscenza di alcune differenze in

aspetti collegati al metabolismo dei pesticidi nell’organismo umano tra sesso femminile e maschile7-9 .

Con il termine “genere” (gender) si intende definire le categorie “uomo” e “donna”, non solo fondate su differenze biologiche, ma anche condizionate da fattori ambientali, sociali e culturali10,11. La Medicina di Genere è una nuova dimensione della medicina che studia l’influenza del sesso e del genere su fisiologia, fisiopatologia e patologie umane con l’obiettivo di comprendere i meccanismi responsabili delle differenze osservate nell’incidenza, nella patogenesi, nella progressione delle malattie, nella risposta alle terapie farmacologiche, nella risposta alla esposizione di sostanze chimiche tra cui i pesticidi7,10-12 .

I principali meccanismi molecolari che sono coinvolti nell’effetto dei pesticidi sulla salute umana sono riassunti nella tabella 1 e figura 1. Tra questi, sono descritti lo stress ossidativo e stress del reticolo endoplasmatico (ER), alterazioni mitocondriali, squilibri nella funzione recettoriale con azione di “interferenza endocrina”. Alcuni degli effetti sulla salute sono in parte mediati dai metaboliti che si formano durante il metabolismo dei pesticidi come xenobiotici a livello epatico e in altri tessuti (Fig. 1).

Studi condotti su modelli animali hanno dimostrato variazioni individuali nell’espressione dei principali enzimi coinvolti nel metabolismo di farmaci e pesticidi inclusi i citocromi P450 (CYP P450s), le solfotransferasi, la glutatione transferasi7-9 .

Tabella 1 - Pesticidi ed effetti sulla salute. Meccanismi molecolari

Danno ossidativo Interferenti endocrini Alterazioni ormonali Disfunzione mitocondriale Stress del reticolo endoplasmatico Modificazioni genetiche ed epigenetiche

Fig. 1 - Metabolismo dei pesticidi a livello epatico ed extraepatico. Uridina difosfato glucuronitransferasi (UGT); Sulfotransferasi (SULT), glutatione transferasi (GST).

Tali differenze individuali, alcune delle quali dipendono dal sesso, possono spiegare diversità nella biodisponibilità degli xenobiotici tra donne e uomini. In generale, le reazioni mediate dal CYP P450 facilitano l’escrezione di xenobiotici.

Tuttavia, alcuni metaboliti reattivi e radicali liberi possono anche essere formati tramite CYP P450. Studi condotti su microsomi epatici isolati da soggetti di sesso femminile mostrano una maggiore attività di metabolizzare l’insetticida clorpirifos, rispetto a microsomi epatici isolati da soggetti di sesso maschile8. Altri fattori che contribuiscono alle differenze interindividuali nell’espressione degli enzimi responsabili del metabolismo dei pesticidi vi sono polimorfismi genetici9, la gravidanza13 e fattori ormonali endogeni, che cambiano con l’età e differiscono tra soggetti maschili e femminili14 .

Nei paragrafi successivi si descrivono alcuni meccanismi molecolari alla base degli effetti dei pesticidi sulla salute umana (Fig. 2) con particolare attenzione alle differenze di genere.

Stress ossidativo

Lo stress ossidativo è una condizione che si verifica quando la formazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) supera la capacità di neutralizzazione esercitata dal sistema di difesa antiossidante che coinvolge meccanismi enzimatici e non enzimatici15-16. Tra i sistemi di difesa antiossidante di natura enzimatica sono inclusi la superossido dismutasi, la glutatione perossidasi, la glutatione reduttasi

e la catalasi16. Le specie reattive dell’ossigeno sono generate come metaboliti del metabolismo dell’ossigeno e hanno ruoli importanti nella trasduzione del segnale cellulare e omeostasi in condizioni normali17. Tuttavia, a volte durante alcune condizioni patologiche (come processi infiammatori o infezioni) i livelli di ROS possono aumentare notevolmente e

Fig. 2 – Effetti dei pesticidi sulle funzioni cellulari, principali meccanismi molecolari. L’esposizione ai pesticidi provoca alterazioni strettamente correlate tra loro. Oltre ad alterazioni a livello mitocondriale, si osserva un aumento della formazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS). La diminuzione di alcuni meccanismi di difesa antiossidante può favorire il danno ossidativo. Alcuni pesticidi si comportano come interferenti endocrini e possono contribuire ulteriormente al alterazioni dell’omeostasi cellulare e allo stress del reticolo endoplasmatico. Inoltre i ROS possono favorire alterazioni epigenetiche.

provocare danni significativi alle strutture cellulari e alle principali biomolecole (fosfolipidi, proteine, acidi nucleici)17-19. L’esposizione a stress ambientali come esposizione ai raggi UV o pesticidi può ugualmente favorire la formazione di ROS6,18,19. Infatti come detto in precedenza, durante il metabolismo dei composti xenobiotici inalati o ingeriti o venuti a contatto con la pelle umana, dall’attività di enzimi come il citocromo P450, si formano diversi radicali liberi implicati nella fisiopatologia di molte malattie umane tra cui patologie tumorali, patologie cardiovascolari, patologie neurodegenerative legate all’invecchiamento15,19,2). Lo stress ossidativo può indurre anche una disfunzione mitocondriale con compromissione di enzimi della matrice mitocondriale e conseguente alterazione del metabolismo energetico21 .

Nella donna durante la gravidanza, questo cambiamento metabolico indotto dallo stress ossidativo può avere un effetto avverso sulla placenta. Infatti lo squilibrio tra pro-ossidanti e antiossidanti può portare a infertilità e a una serie di malattie riproduttive come endometriosi e sindrome dell’ovaio policistico22. In soggetti di sesso maschile lo stress ossidativo ha effetti avversi sulla qualità e sulle funzioni dello sperma23 .

La relazione tra stress ossidativo e pesticidi è dimostrata dal significativo aumento dei livelli di markers di stress ossidativo di lipidi, proteine e acidi nucleici in soggetti esposti a pesticidi6,18,24,25. tuttavia differenze di genere non sono state studiate

fino a oggi. Questi aspetti meriterebbero una maggiore attenzione poiché differenze nello stress ossidativo legate al genere femminile e maschile sono state descritte in modelli animali e in soggetti umani (Tabella 2).

Tabella 2 - Stress ossidativo: differenze di genere M = soggetti di sesso maschile F = soggetti di sesso femminile

Produzione di ROS nelle cellule vascolari (29) M > F Potenziale antiossidante (30) M < F Espressione della NADPH-ossidasi (26) M > F Produzione di anione superossido (26) M > F Markers di stress ossidativo (28) M > F Livelli di perossido di idrogeno nei mitocondri (46) M > F Livelli di enzimi e antiossidanti nei mitocondri (46) M < F

In condizioni fisiologiche, le femmine sembrano essere meno sensibili allo stress ossidativo26,27. Ciò può essere dovuto alle differenze di genere nell’attività di enzimi coinvolti nella produzione di ROS come la NADPH-ossidasi, alle proprietà antiossidanti degli estrogeni o ad altri meccanismi ancora da definire. Altri studi hanno dimostrato che alcuni biomarkers in vivo dello stress ossidativo erano più elevati nei giovani uomini rispetto alle donne

della stessa età28. Allo stesso modo, è stato osservato che la produzione di ROS era più alta nelle cellule vascolari dei maschi rispetto alle cellule isolate dalle femmine29. Inoltre, dati clinici e sperimentali suggeriscono un maggiore potenziale antiossidante nelle femmine rispetto ai maschi30. Questi studi indicano che esiste una associazione tra genere e stress ossidativo e le donne sembrano essere meno suscettibili26. Il coinvolgimento dello stress ossidativo nel favorire le patologie cardiovascolari in soggetti esposti a pesticidi è supportato dall’aumento dei livelli di markers biochimici plasmatici di stress ossidativo tra cui un aumento dei livelli di lipoproteine a bassa densità ossidate (ox-LDL) nei soggetti esposti a pesticidi31. Le ox-LDL contribuiscono a instaurare un processo infiammatorio e danni endoteliali32. L’aumento dei livelli di pesticidi liposolubili nel plasma si riflette inoltre in un aumento dei livelli di queste molecole assemblate nelle lipoproteine plasmatiche (LDL,VLDL e HDL). Tali modificazioni provocano alterazioni funzionali delle HDL con ripercussioni negative sulla loro capacità di proteggere dal danno ossidativo33 .

Oltre a differenze nei livelli di attività di enzimi coinvolti nella produzione e/o difesa dai ROS tra maschi e femmine, come discusso in precedenza, un ruolo modulatore dello stress ossidativo è esercitato dagli ormoni estrogeni34 .

Studi in vitro hanno dimostrato infatti che gli estrogeni, in relazione alle loro caratteristiche strutturali agiscono come antiossidanti e contrastano l’a-

zione dei radicali liberi. Si è ipotizzato che l’azione antiossidante degli estrogeni, i cui livelli sono più elevati nel plasma delle donne rispetto agli uomini, potrebbe spiegare le differenze di genere nelle attività degli enzimi antiossidanti come la glutatione perossidasi (GPx). Alcuni estrogeni inoltre tra cui l’estradiolo si comportano come agenti modulatori della espressione di geni che codificano per altri enzimi antiossidanti come la superossido dismutasi (Mn-SOD)35 .

Si auspicano studi volti a delucidare se questi meccanismi possono proteggere in maniera diversa dalla esposizione acuta o cronica ad alcuni pesticidi tra donne e uomini.

Interferenti endocrini

Vengono definiti interferenti endocrini quelle molecole in grado di alterare la funzionalità del sistema endocrino36. Agiscono con questi meccanismi numerose sostanze chimiche utilizzate come pesticidi o antiparassitari. Fino ad ora, un totale di 101 pesticidi è stato elencato come interferente endocrino testato o possibile dalla Pesticide Action Network UK (37,PAN, 2009). Queste sostanze non solo esplicano effetti negativi sull’individuo esposto, ma anche sulle cellule germinali con effetti trans-generazionali. Tra le malattie correlate all’azione dei pesticidi come interferenti endocrini vi sono patologie dismetaboliche (obesità, diabete, sindrome metabolica) e patologie legate al genere in relazione a effetti sugli ormoni estrogeni e androgeni36. La fun-

zione ormonale può essere alterata in seguito alla esposizione ai pesticidi in molti modi tra cui alterazioni nella sintesi e rilascio dell’ormone, alterazioni nel trasporto e suo metabolismo; modificazioni delle interazioni e legami con i recettori ormonali. Nel sesso femminile, tale effetto è considerato la causa di effetti avversi sulla salute della donna durante la gravidanza e del feto38. La maggior parte degli studi fino a oggi ha studiato l’impatto metabolico degli Interferenti endocrini sui maschi e meno numerosi sono i dati sull’impatto metabolico degli interferenti endocrini nelle femmine.

Sebbene siano state condotte numerose ricerche per associare l’esposizione professionale ai pesticidi a problemi di fertilità negli uomini, gli studi sulle donne sono meno numerosi.

Vi sono indicazioni che l’esposizione a particolari pesticidi può indurre disfunzione ovarica. Farr et al.39 hanno esaminato l’associazione tra esposizione ai pesticidi e caratteristiche del ciclo mestruale. Lo studio ha evidenziato che le donne che lavoravano con pesticidi sospettati di essere ormonalmente attivi avevano una probabilità maggiore del 60–100% di sperimentare alterazioni dei cicli rispetto alle donne che non avevano mai lavorato con pesticidi. Nella donna in alcune condizioni particolari come la gravidanza, l’esposizione costante e prolungata nel tempo, anche al di sotto della dose tossica riconosciuta, durante le fasi critiche dello sviluppo dell’organismo può provocare interferenze sul sistema endocrino e riproduttivo che si riflettono in un

aumentato rischio di infertilità come osservato tra le donne esposte a pesticidi o che lavorano in industrie associate alla produzione di fitofarmaci per l’agricoltura. Nei soggetti di sesso maschile, si sono osservati tumori testicolari e ridotta qualità del seme40 . La ridotta qualità del seme è facilmente evidenziabile dai dati sulla numerosità degli spermatozoi nello sperma. È indispensabile, quindi, rispettare e far rispettare le condizioni di lavoro che garantiscono la sicurezza di lavoratori e lavoratrici e monitorare l’effetto di tali sostanze chimiche sullo stato di salute riproduttiva. Le differenze di genere sono correlate anche ad altri aspetti del metabolismo tra cui le differenze nel metabolismo lipidico nel tessuto adiposo tra maschi e femmine che possono parzialmente dipendere dagli ormoni sessuali femminili e maschili41. Anche se i meccanismi che regolano il diverso comportamento metabolico non sono completamente compresi, è noto che gli uomini e le donne, con un indice di massa corporea normale hanno una forma diversa, con gli uomini che mostrano una distribuzione di grasso nella parte superiore del corpo (grasso viscerale), e le donne che hanno principalmente una distribuzione nella parte inferiore del corpo (grasso sottocutaneo). Questa differenza nel deposito di grasso e la sua distribuzione sono di particolare interesse da un punto di vista clinico poiché malattie metaboliche legate all’obesità come diabete di tipo2, la sindrome metabolica, e patologie cardiovascolari sono associate ad alterazioni del tessuto adiposo e alla distribuzione “androide” del grasso corporeo41 .

Disfunzione mitocondriale

I mitocondri sono la principali fonte di ATP e specie reattive dell’ossigeno (ROS) nella cellula e hanno ruoli importanti nell’omeostasi del calcio, nella modulazione dell’apoptosi e nella sintesi di ormoni steroidei42. Un corretto svolgimento della catena respiratoria mitocondriale è indispensabile per l’omeostasi dell’energia cellulare42. La perturbazione di questo organello è considerata come uno dei meccanismi di neurodegenerazione, come documenta un’ampia letteratura a supporto del coinvolgimento mitocondriale di proteine che hanno alcuni noti ruoli nei principali disturbi neurodegenerativi, incluso il morbo di Parkinson e morbo di Alzheimer43. Disfunzioni mitocondriali costituiscono un parametro importante anche nella insorgenza di malattie dismetaboliche44 .

I pesticidi sono stati segnalati come capaci di interferire con la funzione mitocondriale, sia inibendo la catena respiratoria sia disaccoppiando la fosforilazione ossidativa45. Studi condotti in modelli animali, hanno dimostrato come i mitocondri siano luogo di marcato dimorfismo sessuale che coinvolge principalmente capacità ossidative, manipolazione dei livelli di calcio e resistenza allo stress ossidativo46. Studi recenti riportano che i mitocondri isolati da soggetti di sesso femminile generano metà della quantità di perossido di idrogeno rispetto ai mitocondri isolati da soggetti di sesso maschile e contengono livelli più elevati di enzimi e composti antiossidanti46. Inoltre, altri parametri mitocondria-

li mostrano differenze tra ratti maschi e femmine in vari tessuti, supportando così l’esistenza di meccanismi specifici del sesso nel controllo della biogenesi mitocondriale47 .

Questi e altri meccanismi molecolari potrebbero spiegare la minore prevalenza di alcune malattie croniche e neurodegenerative associate alla disfunzione mitocondriale e al danno ossidativo nei soggetti di sesso femminile48 .

Alterazioni del reticolo endoplasmatico (ER)

Alterazioni a livello mitocondriale e lo stress ossidativo sono associati ad alterazioni del reticolo endoplasmatico (ER), un organulo presente sia nelle cellule animali che vegetali.

L’ER svolge un ruolo importante in numerosi processi di fondamentale importanza per la sopravvivenza e per il normale funzionamento cellulare. L’ER è la sede della sintesi, del ripiegamento (“folding”) e delle modificazioni post-traduzionali delle proteine di membrana e di proteine destinate a essere secrete49. L’azione dell’ER sul folding delle proteine è altamente sensibile a stimoli che inducono modificazioni dei livelli intracellulari di energia, dello stato redox o della concentrazione del calcio. Tali stimoli sono in grado di modificare la capacità del folding del reticolo, la quale risulta nell’accumulo e nell’aggregazione di proteine non ripiegate o mal ripiegate nel lume del reticolo stesso, una condizione che viene definita come stress del reticolo endoplasmatico.

Studi recenti evidenziano che alcuni pesticidi oltre a contribuire allo stress ossidativo e ad alterazioni dell’omeostasi cellulare, provocano disfunzioni dell’ER50 .

La formazione di aggregati proteici è tossica per le cellule e si è ipotizzato che rappresenti la base molecolare delle alterazioni e dello stress del reticolo endoplasmatico coinvolti nella insorgenza delle malattie neurodegenerative provocate dalla esposizione ad alcuni pesticidi51 .

Conclusioni

Fino ad alcuni anni fa il “dimorfismo sessuale” espressione delle differenze a tutti i livelli dell’organizzazione biologica oltre gli organi sessuali tra femmine e maschi della stessa specie è stato in gran parte ignorato nella progettazione della maggior parte delle indagini sui processi fisiologici o patologici nella specie umana, nelle colture cellulari e negli organismi modello in tutte le discipline della biologia e della medicina. Questo perché si pensava che gli effetti di importanza biologica sarebbero stati osservati indipendentemente dal sesso. Anche nella ricerca sui pesticidi emerge che la maggior parte degli studi finora ha studiato l’impatto in prevalenza su soggetti di sesso maschile.

Vi è anche una scarsità di dati per entrambi i sessi relativi all’impatto metabolico derivante dall’esposizione a miscele di pesticidi che rappresentano uno scenario più realistico dell’esposizione a singole sostanze chimiche.

Tuttavia, oggi è impossibile ignorare le differenze tra femmine e maschi per quanto riguarda la vulnerabilità alle malattie, l’esposizione ad agenti esogeni e i loro effetti.

Diversi meccanismi molecolari, strettamente collegati tra loro, spiegano l’effetto dei pesticidi nella insorgenza delle patologie dismetaboliche. In particolare un aumento dei livelli di ROS e una diminuzione dei meccanismi di difesa antiossidante può contribuire ad alterazioni a livello mitocondriale e del reticolo endoplasmatico. Inoltre i ROS possono favorire alterazioni epigenetiche tra cui la metilazione del DNA. Ognuno dei meccanismi descritti, appare modulato da fattori genetici e dal sesso. Infatti dall’esame della letteratura più recente, differenze di genere sono descritte nel metabolismo dei pesticidi, nello stress ossidativo, nella interferenza endocrina e a livello mitocondriale. Si auspica quindi che gli studi futuri vengano condotti con una maggiore attenzione alle differenze di genere.

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