Análisis
VD Edición Especial 2020
Análisis de multilocus de secuencias de ADN
en la detección de genogrupos de Piscirickettsia salmonis
Adolfo Isla1,2,3, Mónica Saldarriaga-Córdoba4, Derie E. Fuentes5, Jorge Mancilla-Schulz6, Alexis Martínez7, Jaime Figueroa1,2, Rubén Avendaño-Herrera2,8,9, Alejandro Yáñez1,2 1 Facultad de Ciencias, Instituto de Bioquímica y Microbiología, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile 2 Interdisciplinary Center for Aquaculture Research (INCAR) 3 Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ciencias, Universidad Santo Tomás, Valdivia, Chile 4 Centro de Investigación en Recursos Naturales y Sustentabilidad, Universidad Bernardo O’Higgins, Santiago, Chile 5 Fraunhofer Chile Research Foundation, Center for Systems Biotechnology, Santiago, Chile 6 Mowi Chile S.A., Puerto Montt, Chile 7 Laboratorio Antares S.A., Puerto Montt, Chile 8 Laboratorio de Patología de Organismos Acuáticos y Biotecnología Acuícola, Facultad de Ciencias de la Vida, Universidad Andrés Bello, Viña del Mar, Chile 9 Centro de Investigación Marina Quintay (CIMARQ), Universidad Andrés Bello, Quintay, Chile
ANTECEDENTES
El patógeno Piscirickettsia salmonis fue inicialmente identificado en Chile en centros de cultivo de salmón Coho (Oncorhynchus kisutch) a comienzo de la década del 90 (Bravo y Campos, 1989). Desde entonces, la Piscirickettsiosis afecta a todas las especies de salmónidos siendo una infección sistémica caracterizada por la colonización de los órganos internos. Inicialmente, P. salmonis fue clasificado erróneamente dentro de la familia Rickettsiaceae y la clase Alphaproteobacteria, pero la secuenciación y el análisis de la estructura secundaria del gen 16S del ARN ribosomal (ARNr) permitieron la reclasificación en la clase de las Gammaproteobacterias. Posteriormente fue utilizada la secuenciación del ARNr 23S, el ARNr 16S y las regiones del espaciador transcrito interno (ITS) para la tipificación molecular de diversas muestras aisladas de diferentes regiones geográficas, estas técnicas permitieron evidenciar dos grupos genéticos denominados como LF-89 y EM-90. Sin embargo, estas técnicas de genotipificación requieren de información genómica detallada y análisis bioinformático los cuales tiene un importante costo económico. Trabajos previos de nuestro grupo permitieron definir la existencia de dos genogrupos principales dentro de las variantes de P. salmonis (Nourdin-Galindo y col., 2017). Aunque los distintos niveles de variación genética entre los aislados son evidentes, los análisis previos se sustentan en la caracterización de un gen individual, impidiendo reflejar la historia evolutiva de un microorganismo. En este sentido, una metodología que permite realizar este tipo de descripciones en poblaciones bacterianas es el Multilocus Sequence Typing (MLST). El MLST, se basa en la secuenciación y análisis de genes constitutivos o housekeeping, de copia única y distribuidos uniformemente en el genoma del micro28
organismo. Inicialmente, durante desarrollo de esta metodología en Neisseria meningitidis, fueron seleccionados 6 genes de los 11 analizados. Sin embargo, observaciones posteriores mostraron que el uso de 7 genes entrega mejor información epidemiológica. El MLST permite diferenciar cepas en especies bacterianas con frecuentes transferencias laterales de genes y recombinaciones homólogas o con poca o ninguna divergencia en la secuencia del gen 16S del ARNr. Además, permite integrar información epidemiológica de los aislados analizados (Urwin y Maiden, 2003). El objetivo de nuestro estudio fue contribuir a la vigilancia epidemiológica mediante la elaboración de un esquema de MLST que permita la tipificación de la diversidad genética y/o las relaciones filogenéticas de 43 aislados de P. salmonis chilenos, incluyendo la cepa tipo LF-89T. Los aislados fueron obtenidos de S. salar (27 aislamientos), O. kisutch (nueve aislamientos) y O. mykiss (siete aislamientos). Geográficamente los aislados se recuperaron en la Región de Los Lagos (35 aislamientos) y de Aysén del General Carlos Ibáñez del Campo (6 aislamientos), de dos aislados se desconoce su información. Seis aislados se recuperaron el 2008, siete en 2009, diez en 2010, uno en 2012, doce en 2013 y seis en 2015 (Isla y col., 2019). La metodología utilizada involucro el análisis de siete genes con función celular conservada (Tabla 1), mediante PCR, siendo los productos de amplificación secuenciados y analizados, respectivamente. Posteriormente, cada secuencia fue depositada en una base de datos de acceso público diseñada para el patógeno (http://pubmlst. org/psalmonis), la cual incluye información como ubicación geográfica, hospedero y año de aislamiento. Lo que contribuye para el desarrollo de diversos estudios en epidemiologia molecular.
