PESTE AMERICANA E NOSEMA

Eliminare I Vecchi Favi

Prevenzione Al Primo Posto

di Anna Granato, Fulvio Bordin, Nicoletta Dainese, Laura Zulian, Albertin Elena, Mauro Caldon, Rosa Colamonico, Franco Mutinelli*

Introduzione

La corretta gestione degli apiari è uno dei cardini nella lotta e prevenzione delle malattie delle api, poiché, ad oggi, per la maggior parte dei patogeni non sono disponibili trattamenti efficaci o risolutivi. Tra le buone pratiche apistiche la rimozione sistematica dei favi vecchi dall’alveare (2-3/anno) e la loro sostituzione con fogli cerei nuovi rappresenta una delle azioni efficaci nella prevenzione delle principali malattie dell’alveare ed in particolare di quelle causate da microrganismi sporigeni quali Nosema spp. e Paenibacillus larvae (foto a lato), responsabili, rispettivamente, della nosemiasi e della peste americana. Per questi patogeni, infatti, le spore rappresentano la forma di resistenza e di propagazione, in quanto sono in grado di sopravvivere per molto tempo, anche anni, e in condizioni ambientali non ottimali, preservando la loro capacità infettante. Valutare la presenza di spore di Nosema spp. e di P. larvae nei favi vecchi, eliminati nell’ambito del- le buone pratiche apistiche, può essere utile per ottenere informazioni sulla presenza di questi patogeni e, più in generale, sullo stato di salute dell’alveare e sull’eventuale rischio di poter sviluppare la malattia. Mentre è ormai noto che da ben più di un decennio Nosema apis è stato soppiantato da Nosema ceranae, per P. larvae, ad oggi, sono stati identificati 5 diversi genotipi (denominati ERIC = Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus): ERIC I, ERIC II, ERIC III, ERIC IV e ERIC V) che si differenziano, oltre che per la forma delle spore e le caratteristiche morfologiche delle colonie in coltura, anche per il diverso grado di virulenza. ERIC I è il ceppo meno virulento, è responsabile della peste americana classica ed è presente sia in Europa sia in America; ERIC II è più virulento del primo ed è presente solo in Europa; ERIC III ed ERIC IV sono, come ERIC II, genotipi molto virulenti, ma raramente sono stati riscontrati in campo e pertanto sono di scarsa rilevanza epidemiologica; ERIC V, isolato nel 2020 in Spagna da un campione di miele, ha dimostrato, in prove sperimentali, una virulenza paragonabile, se non maggiore, a quella di ERIC II (Beims et al., 2020). Ad oggi le informazioni disponibili sui ceppi di P. larvae che circolano sul territorio della regione Veneto sono molto scarse.

NPC: controllo negativo di estrazione; Marker: marcatore di peso molecolare (da 100 bp a 1500 bp con banda addizionale a 2642 bp); ERIC I: controllo positivo genotipo ERIC I; ERIC II: controllo positivo genotipo ERIC II; ERIC IV: controllo positivo genotipo ERIC IV; C+: controllo positivo di amplificazione per P. larvae (B) Elettroforesi su gel di agarosio 1.7% di 4 isolati di P. larvae per meglio evidenziarne il genotipo. Il periodico Apitalia è depositato con il n. 123854 del 17.12.2019 presso il Registro Pubblico Generale delle Opere Protette ai sensi della L. n. 633/1941, come certificato dalla Direzione Generale Biblioteche e Istituti culturali (Servizio II - Patrimonio bibliografico e Diritto d’Autore) del Ministero per i Beni e le Attività Culturali e per il Turismo.

Lo studio ha previsto l’analisi di favi vecchi per la ricerca di spore di:

• P. larvae con caratterizzazione genetica delle eventuali colonie positive isolate dall’esame colturale dei favi e di alcuni campioni di DNA di isolati di P. larvae di archivio;

• Nosema spp. ed eventuale identificazione di specie N. apis/N. ceranae

Materiali E Metodi

Il progetto è stato realizzato con la collaborazione di 10 associazioni di apicoltori della regione del Veneto (Tabella 1). d ogni associazione è stato richiesto l’invio di 20 favi vecchi, eliminati secondo le buone pratiche apistiche, da almeno 10 dei loro apicoltori (2 favi per ogni apicoltore).

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Ogni favo pervenuto è stato sottoposto ad esame ispettivo per verificare la presenza di eventuali segni riferibili alla presenza di P. larvae e, successivamente, dalla zona centrale di ognuno di essi è stata ritagliata una porzione di circa 10 x 10 cm per le successive analisi. La rilevazione di spore di P. larvae è stata effettuata mediante esame colturale su opportuno terreno di coltura e le colonie isolate sono state successivamente identificate mediante test biochimico e colorazione di Gram. La determinazione del genotipo di P. larvae è stata effettuata a partire sia da DNA estratto da colonie isolate dai favi vecchi risultate positive all’esame colturale sia da 7 campioni di DNA di archivio mediante l’amplificazione tramite PCR (Polymerase Chain Reaction) di sequenze ripetitive (ERIC) presenti nel genoma di questo batterio. Il numero così esiguo di campioni di DNA di archivio deriva dal fatto che negli ultimi anni sono stati pochi i campioni risultati positivi a questo batterio e che l’esame colturale è di per sé conclusivo e non necessita, pertanto, di ulteriori approfondimenti. Studi recenti hanno dimostrato che ciascun genotipo di P. larvae presenta, dopo elettroforesi su gel, dei prodotti di amplificazione con dimensioni, espresse in paia di basi (bp), caratteristiche: ERIC I banda a circa 970 bp; ERIC II banda a 2500 bp e 970

ERIC III sui 205 favi conferiti (rilevazione presenza di N. ceranae, N. apis e P. larvae e determinazione del genotipo ERIC di P. larvae). da a 1200 bp.

Per la rilevazione di Nosema spp. e l’identificazione di specie N. apis o N. ceranae, il DNA estratto da ciascun campione di favo è stato analizzato mediante PCR e i prodotti di amplificazione sono stati visualizzati mediante elettroforesi capillare microfluidica.

Risultati E Discussione

Tutte e 10 le associazioni di apicoltori coinvolte hanno contribuito alla realizzazione di questo progetto con il conferimento di un numero, talvolta anche maggiore rispetto al richiesto, di favi vecchi eliminati nell’ambito delle buone pratiche apistiche. I risultati ottenuti sono riassunti nella Tabella 1 Sono stati conferiti in totale 205 favi vecchi ritenuti non più idonei al loro utilizzo. L’esame ispettivo ha rilevato segni riferibili alla presenza di peste americana solo in 4 di loro (1.95%). L’esame colturale per P. larvae dei 205 favi non solo ha confermato la presenza di questo batterio in 3 dei 4 favi risultati sospetti all’esame ispettivo, ma anche altri 5 favi (3.9% in totale). Per i restanti 197 (96.1%) non è stata rilevata alcuna crescita o la stessa non era attribuibile a P. larvae. La successiva analisi del genotipo di questi 8 isolati di P. larvae ha evidenziato che ERIC I è il genotipo prevalente nei campioni esaminati (5 su 8) a cui segue ERIC II (2 su 8). Un campione presentava un quadro elettroforetico dubbio per la presenza di una banda a 1200 bp descritta in letteratura come caratteristica del genotipo ERIC V. Tuttavia, la mancanza di materiale di riferimento per questo recente genotipo non ha permesso di caratterizzare con certezza questo campione che necessita pertanto di ulteriori indagini di verifica e di conferma. I risultati della genotipizzazione sono presentati nella Figura 1 e riassunti nella Tabella 1. Anche in 6 dei 7 campioni di DNA di archivio di P. larvae sono stati rilevati i due genotipi più comuni: ERIC I è il genotipo più frequente (4 campioni su 7) a cui segue ERIC II (2 campioni su 7). Non è stato possibile attribuire il genotipo ad un campione per la presenza di una banda a circa 1300 bp. I risultati della genotipizzazione sono mostrati nella Figura 2. Per quanto riguarda la ricerca di Nosema spp. e l’identificazione di specie N. apis/N. ceranae, solo in 4 favi su 205 (1.95%) è stata rilevato la presenza di N. ceranae, mentre in nessun favo è stato riscontrato N. apis (Tabella 1).

Il periodico Apitalia è depositato con il n. 123854 del 17.12.2019 presso il Registro Pubblico Generale delle Opere Protette ai sensi della L. n. 633/1941, come certificato dalla Direzione Generale Biblioteche e Istituti culturali (Servizio II - Patrimonio bibliografico e Diritto d’Autore) del Ministero per i Beni e le Attività Culturali e per il Turismo.

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Conclusioni

Questo studio, realizzato con il sostegno finanziario del Regolamento (UE) N. 1308/2013, azione F2 della regione del Veneto, ha permesso di mettere a punto un protocollo per l’analisi di una matrice non convenzionale come il favo, a partire dalla fase cruciale della preparazione del campione, al fine di rilevare la presenza di spore di P. larvae e N. apis/N. nelle spore il loro meccanismo di difesa e di resistenza, nonché di diffusione dell’infezione. L’esiguo numero di favi risultati positivi a questi patogeni (< 5%) ha confermato un’appropriata e corretta gestione degli apiari da parte degli apicoltori delle associazioni aderenti al progetto, focalizzata sulla prevenzione delle malattie dell’alveare mediante la regolare e periodica sostituzione dei favi (almeno 2-3 favi per alveare/anno) che aiuta a ridurre o eliminare la diffusione di queste malattie. Va inoltre sottolineato che il numero molto basso di favi in cui è stata rilevata la presenza di spore di N. ceranae (1,95%) indurrebbe a ritenere che i favi vecchi non costituiscano un particolare pericolo per l’alveare rispetto a questo microrganismo. È stato inoltre sviluppato e testato un protocollo molecolare per discriminare i differenti ceppi di P. larvae a partire da colonie ot- tenute dall’esame colturale. La sua applicazione sugli isolati ottenuti dai favi vecchi e sui campioni di DNA di archivio ha confermato quanto già descritto in letteratura riguardo alla maggior diffusione dei genotipi ERIC I e II di questo batterio. L’applicazione del protocollo sviluppato ha dato risultati soddisfacenti, offrendo così la possibilità di poter effettuare in futuro studi epidemiologici su questo patogeno. L’analisi dei favi eliminati nell’ambito delle buone pratiche apistiche può costituire perciò un utile strumento per ottenere informazioni sulla presenza dei sopracitati patogeni dell’alveare e sul rischio di sviluppare la malattia, nonché per caratterizzare i genotipi di P. larvae circolanti nel nostro territorio.

Il periodico Apitalia è depositato con il n. 123854 del 17.12.2019 presso il Registro Pubblico Generale delle Opere Protette ai sensi della L. n. 633/1941, come certificato dalla Direzione Generale Biblioteche e Istituti culturali (Servizio II - Patrimonio bibliografico e Diritto d’Autore) del Ministero per i Beni e le Attività Culturali e per il Turismo.

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Anna Granato, Fulvio Bordin, Nicoletta Dainese, Laura Zulian, Albertin Elena, Mauro Caldon, Rosa Colamonico, Franco Mutinelli

Titolo originale del lavoro: Paenibacillus larvae e Nosema spp. in favi vecchi eliminati secondo le buone pratiche apistiche

Gli Autori di questo articolo sono tutti appartenenti alla struttura

Figura 2 - Pattern elettroforetico su gel di agarosio 1.7% dei 7 campioni di DNA di archivio di P. larvae (identificati con i numeri da 1 a 7). Marker: marcatore di peso molecolare (da 100 bp a 1500 bp con banda addizionale a 2642 bp); ERIC I: controllo positivo genotipo ERIC I; ERIC II: controllo positivo genotipo ERIC II; ERICIV: controllo positivo genotipo ERIC IV; NTC: controllo negativo reagenti; NPC: controllo negativo di processo; C+: controllo positivo di amplificazione.

Istituto Zooprofilattico

Sperimentale delle Venezie, CRN per l’Apicoltura, Legnaro (PD)