La evolución del diagnóstico microbiológico en la industria

Por: Victor A. Orozco DMV Director General Tecnologías Orozco gerentetot@etb.net.co

Mucho se ha avanzado desde cuando el gran Louis Pasteur, padre de la microbiología, descubrió que la presencia de microrganismos en alimentos causaban deterioro y alteración de los mismos.

El análisis de las contaminaciones y alteraciones de los alimentos ocasionados por microrganismos, procedentes de diferentes fuentes exógenas o endógenas han sido hechos preferencialmente utilizando medios de cultivo ya sea estáticos (en placas) o fluídos (caldos). Este es considerado un método estándar y aún se utiliza ampliamente en la mayoría de empresas productoras de alimentos, pero son laboriosos, utilizan grandes volúmenes de medios de cultivo, materiales de laboratorio y requieren de considerables espacios de tiempo para obtener resultados confiables.

Mientras tanto las enfermedades transmitidas por alimentos han seguido ocasionando cuantiosas pérdidas económicas en el sector público y privado, además de los problemas en la salud pública a los que conllevan, siendo los más vulnerables los niños, los ancianos y las personas inmuno suprimidas. Se calcula que al menos el 25 por ciento de los alimentos producidos en el mundo, se pierde debido a la acción de los microrganismos, patógenos a alterantes.

Métodos rápidos

Los dilatados tiempos de liberación de productos ocasionados por análisis largos y dispendiosos, la implementación de sistemas HACCP que requieren el análisis de un gran número de muestras y la obtención rápida de resultados, originó la necesidad de tener métodos que garanticen la sanidad el producto en menor tiempo, sin descuidar la precisión y confiabilidad de los resultados. Es así como aparecen los métodos rápidos que además de cumplir con los anteriores requisitos son fáciles de usar y no requieren de un alto conocimiento técnico para su utilización. Estos métodos no excluyen ni el preenriquecimiento, ni la confirmación de resultados cuando son positivos, ni mucho menos una buena preparación y toma de muestra.

Recuento de células viables: requieren automatización de procesos, la utilización de medios gelificados, o liofilizados, cromogénicos o el uso de equipos de filtración y filtros que mejoran el NMP convencional.

Medición de la biomasa: al ser los métodos convencionales de recuento en placa tan laboriosos, se han desarrollado métodos para estimar de manera indirecta el número de microrganismos presentes en los alimentos, basados en la medición de señales de crecimiento bacteriano, utilizando equipos que permitan medir el nivel de ATP (adenosina trifosfato), enzimas específicas, impedancia, pH, conductancia y capacitancia eléctricas.

La medida del ATP, sustancia que poseen todas las células vivas que es degradada rápidamente al morir estas, se realiza en presencia de oxígeno con la utilización de la enzima luciferasa en presencia del sustrato luciferina que al combinarse con el ATP producen un destello de luz que es medido directamente y en tiempo real con un luminómetro en unidades RLU.

En cultivos puros puede hallarse una buena correlación entre la presencia del ATP y el UFC, sin embargo con ATP residual se incluye tanto el residual como el ATP microbiano y la correlación no es tan exacta.

La medida de los cambios de pH es también una herramienta valiosa, que acorta el tiempo de prueba y posibilita la inferencia del crecimiento bacteriano con un alto nivel de confianza.

Inmunoensayo: Se basa en una reacción específica de antígeno y anticuerpo siendo la técnica mas utilizada es la ELISA que dependiendo del numero de pruebas puede hacerse de manera manual a automatizada. El sustrato puede ser cromogenico o fluorescente e igualmente se puede utilizar la separación inmunomagnética. También es usual el uso de la cromatografía de flujo lateral que requiere menos instrumentación, condiciones de almacenamiento a medio ambiente e interpretación muy rápida seguida a una previa incubación de la muestra y entrega resultados tanto cualitativos como cuantitativos. Otros métodos también usuales son inmunodifusion en agar o la inmunodifusion pasiva en látex.

Métodos genéticos: Hibridación de DNA. A diferencia de los anteriores métodos rápidos, estos se basan en la hibridación de Ácidos Nucleicos utilizando sondas genéticas u oligonucleótidos sintéticos marcados con enzimas que hibridan RNA ribosomal catalizando una reacción coloreada la cual indica la presencia del microrganismo.

Sistemas miniaturizados y kits de diagnóstico: permiten disminuir la cantidad de medio y reactivos necesarios para el ensayo en un formato manejable medir el efecto de un compuesto sobre un número de aislados o el aislado sobre un numero de compuestos. De estos hay una gran variedad de productos. Se requiere un alto conocimiento técnico y microbiológico para la interpretación de resultados.

PCR (reacción en cadena de la polimerasa): esta es una tecnología actualmente en uso creciente dentro de la industria de alimentos. Se trata de amplificar el ADN de microrganismos diana (que han sido reproducidos en medios de cultivo anticipadamente) para disponer de suficiente material y facilitar su detección. La técnica del PCR consiste en la repetición cíclica de tres etapas; desnaturalización del ADN bicatenario, unión de cebadores específicos (oligonucleótidos sintéticos) a las cadenas simples, mediante complementariedad de las bases y la extensión de la cadena de ADN a copiar, mediante la enzima polimerasa de ADN. Normalmente se utilizan dos temperaturas diferentes durante los ciclos de amplificación.

ANSR (Amplified nucleic single temperature reaction) amplificación isotérmica del ADN y detección fluorescente. Es un sistema simple de tres pasos -todo en uno- que incluye la lisis del microrganismo diana, amplificación del ADN a temperatura constante (56ºC) y lectura en 10 minutos. Utiliza entre 20 y 30 minutos para obtener resultados en tiempo real y compara la muestra con positivos y negativos.

Por: Multivac