4. Biotecnología

de contactar con otros componentes del virus e infectarse; por el contrario, quede protegido fabricando anticuerpos que bloqueen la entrada del virus a la célula. De manera reciente, en noviembre de 2006, salió al mercado la vacuna contra el virus del papiloma humano (VPH). Este virus produce el cáncer cérvico uterino. Las jóvenes a partir de los trece años y bajo prescripción y vigilancia médicas se pueden aplicar esta vacuna, para que al llegar a la edad reproductiva se encuentren ya protegidas. Como se ha analizado a lo largo de esta unidad, el conocimiento de la estructura del ADN, de los procesos de replicación y síntesis proteica, y de los padecimientos que surgen por daño al material genético, así como el entendimiento de los temas tratados en las otras unidades, son aprendizajes que nos abren las puertas para adentrarnos al fascinante mundo de la biología molecular y celular, para acercarnos más a los avances tecnológicos y científicos que están aconteciendo en la época que vivimos, para comprender más el mundo que nos rodea y así servir mejor a nuestro país.

La biotecnología es la ciencia que estudia la transformación de materias primas en productos de utilidad para el ser humano, que se lleva a cabo por medio del empleo de microorganismos y sus metabolitos, así como en algunos casos utilizando células animales. Para ello recurre al análisis y modificación de las características fenotípicas y genotípicas de las células, el estudio de los procesos metabólicos y las condiciones en las cuales se llevan a cabo, y colabora en el diseño de los procesos de ingeniería.

Procesos microbiológicos Para llevar a cabo la biotransformación de la materia prima se requiere por principio, conocer ciertas características del microorganismo con el que se va a trabajar, por ejemplo: 1. Características fenotípicas del microorganismo. Es indispensable saber si se va a cultivar un microorganismo con flagelos, en forma esférica o si se agrupa en cúmulos, etcétera. Estas características tendrán repercusión en el proceso de agitación que se lleva a cabo en los biofermentadores (ver más adelante). 2. Características genotípicas que pueden dividirse en dos: a) Las secuencia nucleotídica y composición del genoma del microorganismo, es decir, con qué genes cuenta y si éstos poseen marcos de lectura de sobreexpresión, si se encuentran apagados, etcétera. b) Su comportamiento genético para transmitir ciertos caracteres, es decir, ¿cómo se propagarán ciertos genes deseables? y ¿cómo lo harán otros con efecto negativo?, se requiere conocer su dominancia y su recesividad. 3. ¿Cuáles son las condiciones óptimas de cultivo del microorganismo en cuestión? Para ello debemos considerar pH, temperatura, atmósfera (porcentaje y presión de diversos gases, oxígeno y

CO2, por ejemplo), qué tipo y cantidad de nutriente requiere, etcétera. 4. Se debe tener en cuenta también que los microorganismos producen durante su etapa de crecimiento metabolitos de desecho, metabolitos primarios y metabolitos secundarios (estos dos últimos se revisarán adelante), los cuales podrían llegar a contaminar el producto final.

Cultivo de bacterias

El proceso de biotransformación de la materia prima se lleva a cabo en equipos llamados biorreactores o biofermentadores.

Un biorreactor es el lugar físico donde se realizará el proceso de biotransformación, es decir, donde se cultivarán los microorganismos o en algunos casos, donde solamente reaccionen las enzimas de éstos con la materia prima. Los biorreactores pueden ser tan pequeños como una caja de Petri o tan grandes como toda una zona territorial de varios metros. Pero los que se utilizan de forma rutinaria en la industria de alimentos, farmacéutica y otras, no son mayores a un salón de clases. Para centrarnos en algún tipo de biorreactor, estudiaremos los de la industria de alimentos, que deben ser de acero inoxidable y variarán en forma y tamaño dependiendo de cada alimento, como se verá adelante.

Para la selección del biorreactor debemos considerar, además de las características del microorganismo ya mencionadas, otras como: • Medio de cultivo. Composición, características fisicoquímicas (acidez, turbidez, precipitación, formación de burbujas, reacción con otros elementos, etcétera), facilidad para esterilizarlo (para evitar la contaminación del producto).

Por ejemplo, la leche de vaca con la que se elabora queso, yogur y otros productos, debe cumplir con ciertas características antes de comenzar el proceso, en este caso la leche es el medio de cultivo o el sustrato para las enzimas microbianas. La leche debe cumplir con ciertas normas de calidad que incluyen su pH, porcentaje de grasa, ausencia de otros microorganismos (para ello se pasteuriza antes de mandarla a la elaboración de otros productos), y ausencia de cuerpos extraños, etcétera. • Características bioquímicas del proceso. Algunos productos requieren para su producción ausencia de oxígeno (por ejemplo ciertos quesos madurados), otros por el contrario cuando la cantidad de oxígeno disponible disminuye se interrumpe el proceso o se desvía hacia otro producto indeseable.

Otras características bioquímicas del proceso son la temperatura, pH, masa molecular de la enzima, estabilidad molecular, etcétera.

Procesos de fermentación en la industria alimentaria

En la industria de alimentos una de las formas en que la biotecnología participa es en la preparación y mejoramiento de cepas puras de microorganismos para los procesos de biotransformación, como sucede en la elaboración de levaduras liofilizadas (en polvo), que usa la industria de la panadería y repostería. También participa en la transformación genética y mejoramiento del trigo, para obtener un mayor rendimiento en la elaboración del pan y en el proceso de fermentación, como ocurre en la industria del vino o la cerveza.

A continuación se revisan los procesos de biotransformación en la industria del queso, yogur, vino y pan. • Queso. Originalmente la elaboración del queso se realizaba colocando la leche no pasteurizada en un recipiente y añadiéndole posteriormente el cuajo o estómago del ternero lactante.

El cuajo es el estómago glandular del ternero lactante, este órgano produce una enzima llamada renina o quiosina, que coagula la leche y el consecuente precipitado de la fracción sólida de la misma.

Actualmente ya se emplea la ingeniería genética para la producción a gran escala de la enzima, como veremos adelante, además se utiliza preferentemente la leche pasteurizada para darle al queso mayor calidad higiénica y características estándares ya que los microorganismos pueden hacer variar su sabor y composición. • Yogur. El yogur es un producto lácteo obtenido por la fermentación acidoláctica de la leche, tradicionalmente se elaboraba con los llamados búlgaros, grumos de leche que contienen cúmulos de una variedad heterogénea de microorganismos, predominantemente lactobacilos.

Actualmente, en la producción de yogur se emplea leche pasteurizada para evitar que se contamine con microorganismos y sus metabolitos, lo que asegura su buena calidad y características.

Los microorganismos empleados son de cepas puras con fermentación homogénea, los cuales convertirán la lactosa en ácido láctico.

Los beneficios del yogur han sido estudiados de forma científica desde la época de Elie Metchnikoff, actualmente se le considera un excelente probiótico que ayuda, entre otras cosas, a inhibir el crecimiento de microorganismos patógenos.

ELABORACIÓN DE QUESOS

Introducción

La industria alimenticia data de tiempos ancestrales, probablemente desde que el ser humano dejó de ser nómada y comenzó a ser sedentario y edificar las primeras civilizaciones. En sus comienzos, la elaboración de los alimentos se fue dando de forma empírica y sin un registro real y científico del proceso. Algunos seguramente originados como producto de la casualidad. El queso por ejemplo, se cree que fue producto de un evento fortuito en el que pastores de Medio Oriente tenían que transportar leche fresca (obviamente sin pasteurizar) en estómagos de cabras o borregos, lo que aunado al calor del desierto generó la colonización y proliferación bacteriana y condujo a la coagulación de las proteínas de la leche y la separación de la fase sólida (queso) de la líquida (suero de leche). Se comenzó entonces a adicionar de forma rutinaria el estómago de terneros lactantes a la leche, lo que dio paso a la elaboración artesanal del queso. Posteriormente se obtuvo la enzima principal llamada quimosina o renina, por medio del sumergimiento del estómago en salmuera que la contenía. Después se logró purificar la enzima químicamente, lo cual aportó ventajas de estandarización en el proceso. Actualmente se han creado bacterias genéticamente modificadas que contienen el gen de la enzima y, por tanto, su producción a gran escala, altamente purificada, de mejor calidad y a menor costo.

Objetivo

• Elaboración casera de queso fresco tipo panela.

Material

• 5 litros de leche bronca de vaca (no industrializada) • 1 cucharada de bicarbonato de calcio • 3 ml de cuajo • 2 tazas cada una con un cuarto de agua tibia • Sal (al gusto) • 1 lata de chiles jalapeños en rajas (opcional) • 2 ollas de acero inoxidable • Pala de madera • Paños limpios (tela de manta de cielo) • Termómetro • Molde • Cuchillo

Método

1. Hervir a fuego lento la leche (sin que se tire) por 5 a 10 minutos (80 a 90 °C) 2. Dejar enfriar la leche hasta que alcance 32 °C 3. Disolver el bicarbonato en un cuarto de taza de agua tibia 4. Disolver el cuajo en un cuarto de agua tibia 5. Agregar a la leche la solución del bicarbonato y después la del cuajo, simultáneamente remover con la pala de madera 6. Dejar reposar por 20 minutos 7. Verificar que se haya formado la cuajada (fase sólida de la leche) y que se observe el suero 8. Cortar la cuajada en trozos de 3 cm aproximadamente 9. Calentar por 10 minutos sin hervir (fuego muy bajo) 10. Vertir la cuajada a otro recipiente, pero cuele con la tela 11. Amasar la cuajada añadiendo sal 12. Añadir ahora los chiles si se desea y continuar amasando 13. Colocar en un recipiente a forma de molde y comprimir para eliminar el remanente de suero 14. Colocarlo en un lugar seco y limpio libre de contaminantes, roedores o insectos 15. Al segundo día estará listo para disfrutarlo

• Vino. Una de las ventajas que aportó el vino en sus inicios fue la posibilidad de disponer de una fuente de agua potable y de carbohidratos a la vez. Recordemos que los sistemas de suministro de agua potable aparecieron varias décadas después que el vino, asimismo, los primeros vinos no estaban altamente fermentados, por lo que su contenido alcohólico era bajo. Hoy en día contamos con fuentes de agua potable y el vino posee un mayor grado de alcohol; además, el consumo excesivo de bebidas alcohólicas está asociado con diversos padecimientos de salud y accidentes.

El proceso de fermentación es del tipo alcohólica e intervienen levaduras como la Sacharomyces cerevisae que metabolizan la fructosa de las uvas para producir etanol y bióxido de carbono. En algunos tipos de vino se califica bien la presencia de gas (como en el Champagne), pero en otros no (como el Cabernet Sauvignon). Por tanto, las características del proceso de fermentación variarán en cada caso. El proceso de elaboración comienza con la recolección de uvas, las que son aplastadas y estrujadas. Si se conservan los orujos (tallitos y cáscara) se obtiene un vino tinto, si son eliminados se producirá un vino blanco.

El jugo obtenido se denomina mosto, el cual pasará a fermentarse en barricas de madera (roble blanco por ejemplo) y después del proceso de maduración se obtienen vinos de diferentes tipos. • Pan. El trigo empleado para la elaboración del pan contiene una gran cantidad de almidón, que es un polímero de glucosa. Éste es tomado por la levadura

Sacharomyces cerevisae que lo desdoblará por medio de enzimas amilasas con la consecuente liberación de glucosa y bióxido de carbono.

La característica de esponjado en el pan está dada por pequeñas burbujas de bióxido de carbono que se produjeron en la masa húmeda y que quedaron atrapadas cuando el pan al hornearse formó una costra que no permitió su salida, dándole una textura agradable.

Producción de antibióticos

Los antibióticos son moléculas producidas por microorganismos (principalmente hongos) que causan la muerte de bacterias. El primer antibiótico conocido por la humanidad es la penicilina, producida por el hongo Penicillium notatum descubierto por Alexander Fleming; sin embargo, no poseía las herramientas tecnológicas para el aislamiento, identificación y producción industrial de la molécula. No fue sino hasta 1943 cuando por métodos de cultivo celular se pudo industrializar dicho medicamento. Actualmente se están desarrollando antibióticos a partir de microorganismos modificados genéticamente, para así reducir su toxicidad y efectos secundarios y aumentar su potencia y especificidad.

Técnicas de ingeniería genética Para llevar a cabo las modificaciones genéticas en los organismos se requieren diversas técnicas de biología molecular. Para explicar algunas pondremos el ejemplo de la insulina recombinante.

Un tipo de diabetes es causada por la ausencia (o baja producción) de la hormona llamada insulina, que permite la entrada de la glucosa a la célula, provocando así que el nivel de glucosa en sangre se eleve (al no poder entrar la glucosa a la célula y seguirla consumiendo en los alimentos), y por otro lado halla un déficit energético celular (al no poder introducirla); es como morir de sed cerca del manantial.

En 1921, sir Frederick Grant Banting y su ayudante Charles H. Best determinaron que la insulina participaba de forma importante en la diabetes. Sus descubrimientos los llevaron a compartir con John James MacLeod el premio Nobel de medicina en 1923. De esta forma se comenzó a purificar la insulina de cerdos para aplicación humana. Este procedimiento implicaba la extracción de varios gramos de páncreas (órgano productor de insulina) a partir de cerdos sacrificados en el rastro, para obtener apenas algunos microgramos de insulina purificada, lo cual repercutía en el alto costo. En 1954, Frederick Sanger y sus colaboradores de la Universidad de Cambridge aislaron e identificaron la estructura molecular de la insulina. El conocimiento sobre la secuencia de aminoácidos de la insulina favoreció en gran medida el arduo trabajo de deducir la secuencia de nucleótidos y, por tanto, determinar así, qué genes codificaban la proteína. Recordemos que en la síntesis proteica, cada aminoácido va unido a su ARNt y que el anticodón de éste corresponde a un codón del ARNm,

Evaluación formativa

Parte I. Investiga algunas enfermedades que hayan sido tratadas con algún tipo de antibiótico. Parte II. Escribe en cada paréntesis la letra de la respuesta correcta. 1. Son algunas características genotípicas de los microorganismos que se tienen en cuenta en los procesos microbiológicos. ( ) a) La manera de propagación de genes deseables b) Sus condiciones óptimas de cultivo c) Sus metabolitos de desecho durante su crecimiento d) La forma y caracteres externos que presentan 2. Es el sitio donde se biotransforman la materia prima en los procesos microbiológicos. ( ) a) Laboratorio b) Campo c) Biorreactor d) Centrífuga

por ello, basándose en el código genético y conociendo la secuencia aminoacídica (de la proteína) se podía deducir la secuencia nucleotídica (del gen o genes). En 1978, Lydia Villa y Komaroff aislaban los genes que codificaban para la proinsulina que es la forma inactivada de la insulina. Años después se procedía a clonar en microorganismos el gen de la insulina por medio de la tecnología del ADN recombinante y así producir cantidades industriales que abarataron el costo del medicamento.

La tecnología del ADN recombinante requiere (como ya se vio) de pasos previos, como son el conocimiento de la secuencia de aminoácidos de la proteína que se pretende producir a gran escala. El conocimiento de la secuencia aminoacídica de la proteína permite la deducción de la secuencia nucleotídica del gen que se desea expresar. Al saber lo anterior, se procede a su amplificación por medio de la tecnología de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés), es decir, que por medio del PCR se generarán varias copias de la misma secuencia de ADN. La tecnología del PCR se describe más adelante.

Después de obtener una gran cantidad de copias de secuencias de ADN de la región del gen (no todo), que codifica para la proteína, se procede a su inserción en un plásmido bacteriano. Un plásmido es una unidad circular de doble cadena de ADN extracromosómico (no pertenece el ADN cromosómico) y autorreplicable (no necesita que se replique el ADN cromosómico para expresarse), que se encuentra en el citoplasma de muchas bacterias. Finalmente se requiere que esta región de ADN recién insertada al plásmido sea expresada y comience a sintetizar proteína (insulina) en gran cantidad. Al proceso de anexar una secuencia de ADN de una especie (humano en este caso) junto con el ADN de otra (la bacteria Escherichia coli, en este caso) se le llama recombinación, de donde obtiene el nombre de tecnología del ADN recombinante. Para trabajar con el plásmido e insertarle el ADN humano se necesita que éste se encuentre fuera de la bacteria, de hecho de forma comercial los laboratorios ya venden, tanto plásmidos separados como las bacterias sin plásmidos. Al proceso (posterior a la recombinación) en el que se introduce el plásmido ya modificado a la bacteria se le conoce como transformación. Una vez transformada la bacteria se procede a su cultivo para separar las bacterias que se modificaron; sin embargo, no se obtiene un índice de 100% de transformación. Las bacterias que expresen el gen reportero indicarán que fueron transformadas, en caso contrario esas bacterias fallaron en permitir la entrada del plásmido. Por último, la bacteria exitosamente transformada será propagada para producir generaciones enteras de células idénticas, proceso que recibe el nombre de clonación. De esta forma se producirá la proteína deseada en gran cantidad. Tanto el proceso de recombinación, como la transformación y la expresión del gen reportero se describen a continuación.

Tecnología del PCR Entre 1971 y 1974 el doctor Molineux describió la técnica de amplificación del ADN que después se conocería como PCR. Sin embargo, no fue considerada de utilidad y quedó recluida en el rincón del olvido científico. Para 1985 y 1988 Kary B. Mullis redescribió el proceso y ganó el premio Nobel de Química, en 1993. Este proceso trata de copiar de forma artificial lo que en la naturaleza ocurre como replicación del ADN, pero sólo que en el caso del PCR no se replica una gran cantidad de ADN, sino solamente una pequeña fracción de secuencia.

Actividad con TIC

Investiga por Internet los avances de la ingeniería genética, los beneficios y consecuencias de su uso. Después realiza una presentación grupal de la investigación.

a)

b)

Previamente al PCR se requiere de la obtención de células y la purificación del ADN de éstas. Por ejemplo, si se quiere amplificar la secuencia que codifica para una proteína determinada en el humano, se puede obtener una muestra de sangre y purificar los glóbulos blancos (leucocitos), posteriormente someterlos a todo un proceso de destrucción celular con fenol y cloroformo para obtener el ADN. Una vez obtenido el ADN se procede al PCR: 1. Desnaturalización térmica del ADN. Cuando el ADN se desnaturaliza por calor (alrededor de los 90 °C), sus bandas se separan, volviéndose a unir cuando la temperatura baja (fig. 2.69).

Este fenómeno no es observado en las proteínas, ya que éstas se coagulan con el calor. Por ejemplo, la albúmina de huevo no se puede desnaturalizar y luego renaturalizar, es por ello que si enfriamos un huevo frito no vuelve a su estado líquido.

Por otro lado, en el ADN sí se puede ver el fenómeno de desnaturalización y renaturalización a cierta temperatura, esta característica brinda la posibilidad de crear artificialmente y por un momento, una especie de horquilla de replicación para preparar el ADN para el siguiente paso (el acoplamiento de cebadores). 2. Apareamiento o hibridación de primers o cebadores. En la tecnología del PCR se emplean cebadores o primers, secuencias de ADN elaboradas en laboratorios comerciales especializados y previamente diseñadas por el investigador que realizará el PCR, que determina la secuencia de nucleótidos que tendrá (fig. 2.70).

Los cebadores son secuencias de ADN con veinte nucleótidos en promedio, complementarias a uno de los extremos de cada una de las dos hebras del ADN. Es decir, si la hebra que va de 3’ a 5’ del ADN lleva la secuencia TCGA el cebador o primer irá de 5’ a 3’ con secuencia complementaria a esta hebra (AGCT), igual a la secuencia complementaria original del ADN.

Figura 2.69 A) ADN no desnaturalizado y b) ADN desnaturalizado.

Figura 2.70 Apareamiento de cebadores en los dos extremos de la secuencia que se va a amplificar. Obsérvese que para este ejemplo se pusieron cebadores con sólo cuatro nucleótidos, pero en la vida real se emplean cebadores de veinte nucleótidos cada uno en promedio.

De igual forma, a la secuencia del ADN que va de 5’ a 3’ se le unirá el cebador en dirección contraria de manera complementaria, es decir (según el ejemplo de la figura) a GGCA (de 5’ a 3’) se le unirá el cebador CCGT (de 3’ a 5’). Colocar los cebadores en uno de los extremos de cada una de dos hebras delimita la región de ADN que se va a amplificar; sin embargo, se deben considerar dos aspectos: a) Resulta obvio que para el diseño de los primers que el científico solicita al laboratorio comercial, se requiere previamente conocer la secuencia de la región que se desea amplificar.

Algunas veces (y como y se vio) cuando se desconoce la secuencia nucleotídica se puede deducir a partir de la secuencia aminoacídica de la proteína. b) Uno se pregunta, ¿cómo le hacen los cebadores para unirse a la secuencia específica y no perderse entre tanto ADN? Recordemos el cálculo que se hizo en la unidad 2 respecto de la variabilidad genética entre las diferentes especies y la probabilidad de que un nucleótido siga a otro, esto es, si existe la posibilidad de que un lugar en la secuencia sea ocupado por cualquiera de las cuatro bases (A, T, C y G) la probabilidad de que un nucleótido siga a otro en una secuencia determinada es de 4 3 4 = 16.

De igual forma, la probabilidad de que una secuencia de ADN (con veinte nucleótidos) empleada como cebador, se acople a una secuencia específica de ADN (de origen celular), es igual a la probabilidad de que después de un nucleótido determinado (G por ejemplo) le siga el otro (T por ejemplo) y así a lo largo de toda la secuencia del cebador (20 nucleótidos), lo cual equivaldría a 4 3 1020 por cada cebador, por tanto es casi imposible que el cebador se fije a una secuencia inespecífica de ADN, de tal modo que sí se puede encontrar dentro de todo el ADN de una célula la secuencia del ADN a la que se tiene que unir el cebador para delimitar la región que se requiere amplificar.

El acoplamiento de los cebadores se da alrededor de los 60 °C. Sin embargo, la temperatura exacta es un punto crucial en esta tecnología, ya que aquí pueden ocurrir fracasos en la amplificación por no darse un acoplamiento correcto. Para corregir este problema el investigador calcula la temperatura ideal por medio de diversos cálculos matemáticos considerando el porcentaje de C y G que hay en el cebador (y por ende en la secuencia).

Bajar la temperatura de los 90 °C a cerca de los 60 °C no renaturaliza el ADN, pero sí permite que las dos hebras se acerquen más. 3. Elongación o polimerización. Una vez acoplados los cebadores la temperatura de la reacción se eleva alrededor de los 70 °C para que la enzima polimerasa pueda actuar. Esta temperatura no logra separar los cebadores previamente acoplados (fig. 2.71).

Figura 2.71 Elongación en el PCR.

En la replicación del ADN, la enzima encargada de construirlo (a partir de una secuencia molde) es la ADN polimerasa.

La ADN polimerasa no puede trabajar sobre una banda de ADN sola, requiere la presencia de un punto de inicio que dé la señal de acción de la polimerasa, este punto está conformado por dos bandas unidas, una hecha del ADN (celular) y otra un cebador de ARN (naturalmente producido por la célula). De estas dos bandas, una (la del ADN) se prolonga sola para formar la banda que funcionará como molde.

En el caso del PCR la doble banda está hecha por el ADN (de origen celular) de la secuencia que se requiere amplificar y por el cebador (hecho en laboratorio). Al inicio, cuando la tecnología del PCR se empezaba a desarrollar, los cambios de temperatura se lograban al sumergir los tubos que contenían la reacción en varios recipientes con agua a distintas temperaturas deseadas, las cuales se iban pasando de uno al otro; como la primera temperatura (94 °C) desnaturaliza el ADN y también las enzimas (proteínas), entonces la polimerasa (que es una enzima) se requería aplicar hasta el final. Estos detalles convertían esta tecnología en un verdadero lío al tener que verificar temperaturas, sumergir tubos y abrirlos para añadir la enzima. Con el paso del tiempo estos problemas se fueron resolviendo, principalmente con dos avances: • El empleo de la Taq Polimerasa. Los científicos descubrieron que existen microorganismos que pueden vivir y reproducirse cerca de fuentes de aguas termales, las cuales superan los 100°C, lo que hacía suponer que estos microorganismos poseían enzimas termorresistentes (resistentes al calor). Efectivamente, uno de estos microorganismos, la arqueobacteria Thermus aquaticus (fig. 2.72), poseía tal enzima, la cual fue aislada y se le dio el nombre de Taq. Posteriormente se identificaron otros microorganismos como el Pyrococcus furiosus, del que se aisló la enzima Pfu; el Thermococcus litoralis, con la polimerasa Vent y el Thermus termophilus, que posee la Tth. Sin embargo, la más usada es la Taq polimerasa que es termo resistente y se podía aplicar al tubo de reacción al inicio del experimento. • El problema de la temperatura fue resuelto con el diseño de una platina térmica digitalmente controlada para elevar y bajar la temperatura según sea programada por el investigador, a este aparato se le llama termociclador (fig. 2.73). Los cambios de temperatura aun en esta platina llevaban algo de tiempo, pero actualmente los termocicladores son más precisos y hacen los cambios en segundos. Actualmente todo el proceso se lleva a cabo dentro de unos pequeños tubos plásticos de fondo cónico llamados Eppendorf. En estos tubos se pone la muestra de ADN, la enzima, los cebadores y los dNTPs, que son los desoxinucleótidos, nucleótidos de ADN que funcionarán como los ladrillos para ir construyendo el ADN. Una de las dudas que surgen cuando se comienza el estudio de esta tecnología es: ¿cómo sabe la polimerasa dónde detenerse y por qué no se sigue de largo? La respuesta se entiende cuando se sabe que un ciclo de PCR está hecho de los tres pasos que ya se describieron, pero que para la amplificación de una zona de ADN se requieren cerca de treinta ciclos. En los primeros ciclos, la polimerasa efectivamente se sigue de largo, pero conforme pasan los ciclos se van creando fragmentos del tamaño deseado y el número de copias es de varios millones (fig. 2.74).

Figura 2.72 Fig i ura 2 72 Aguas termales de Yellowstone donde habita el Thermus aquaticus. Figura 2.73 Figura 2 2.73 Termociclador moderno.

Figura 2.74 Final del primer ciclo y comienzo el segundo ciclo de PCR.

Figura 2.75 Gel de agarosa, revelado de la amplificación del PCR.

Figura 2.76 Plásmido abierto con segmentos adhesivos (T y A).

Figura 2.77 Regiones del plásmido. Una vez que se ha logrado amplificar (copiar) millones de veces una región determinada de ADN, se procede a su observación. Para ello se toma una pequeña muestra del ADN amplificado y se coloca en un gel de agarosa, el cual se somete a una corriente eléctrica específica, a este proceso se le llama electroforesis (fig. 2.75).

Tecnología de la recombinación Las secuencias de ADN amplificadas pueden ser usadas como insertos o secuencias que se unan a plásmidos abiertos para la tecnología de recombinación (fig. 2.76). Los plásmidos pueden ser abiertos por enzimas llamadas de restricción, de origen bacteriano que cortan en puntos específicos; es decir, reconocen secuencias determinadas de

ADN.

Por otra parte, ya se venden comercialmente los plásmidos abiertos con puntos adhesivos, es decir, con nucleótidos libres que permiten que el inserto se pegue. Los insertos son pegados al plásmido por medio de enzimas llamadas ligasas. Los plásmidos poseen una secuencia que funciona como gen reportero y otra como inicio de la transcripción. Si el plásmido se logra cerrar, entonces la recombinación tuvo éxito; por tanto, la secuencia de iniciación de la transcripción funcionará sobre el inserto para la síntesis proteica y el gen reportero se podrá expresar para evidenciar que la recombinación fue exitosa.

El gen reportero puede ser un gen destinado a la resistencia a algún antibiótico (ampicilina por ejemplo) o el mismo operón de lactosa (fig. 2.77).

Tecnología de transformación y clonación Una vez que el inserto se recombina con el plásmido, se procede a introducirlo en una bacteria receptora (carente de plásmido). Este proceso se llama transformación. Hay dos mecanismos muy usados para la transformación: la electroporación y el choque térmico. La electroporación consiste en una pequeña descarga eléctrica que recibe la bacteria para permitir que se abran poros y facilitar así la entrada del plásmido. De igual forma el choque térmico es una variación de 4 °C (temperatura en la que se encuentran conservadas las bacterias) a 37 °C (temperatura fisiológica) por unos segundos. Una vez transformada la bacteria se procede al cultivo y su posterior selección y clonación. La bacteria recién transfor-

mada se cultiva en medio líquido con nutrientes, después se pasa a cajas de Petri con medio de cultivo sólido que contiene nutrientes y el factor represor sobre el que actuará el gen reportero (antibiótico o lactosa). Si la bacteria transformada posee un plásmido cerrado, entonces podrá sobrevivir en un medio, ya sea con antibiótico o en presencia de lactosa (y no glucosa como en la mayoría de bacterias), de tal suerte que el gen reportero nos permi- te de alguna forma seleccionar las bacterias con recombinación y transformación exitosas. Éstas posteriormente serán clonadas; es decir, propagadas en gran cantidad para obtener bacterias exactamente iguales con información genética y perfil bioquímico idéntico, que serán capaces de producir en cantidades industriales la proteína codificada por la secuencia de ADN que se insertó.

Productos obtenidos: transgénicos, vacunas, enzimas Al emplear esta tecnología del ADN recombinante se ha podido modificar genéticamente diversos organismos, por ejemplo, para lograr alimentos transgénicos, vacunas y enzimas.

Evaluación formativa

Parte I. Ordena del 1 al 5 los pasos fundamentales de la tecnología de PCR. ( ) Desnaturalización térmica del ADN. ( ) Elongación. ( ) Observación por electroforesis en gel del ADN amplificado. ( ) Purificación del ADN de las células que primero deben obtenerse. ( ) Apareamiento de primers o cebadores. Parte II. Relaciona ambas columnas. Escribe dentro del paréntesis de la izquierda el número de la columna de la derecha que corresponda a la respuesta correcta. ( ) Es la enzima de mayor uso para acoplar los nucleótidos en la tecnología de PCR. ( ) Aparato utilizado actualmente para los cambios rápidos de temperatura en PCR. ( ) Técnica que emplea como materia prima la muestra de ADN, los cebadores, los desoxinucleótidos y la enzima Taq polimerasa. ( ) Enzima de origen bacteriano que corta en sitios específicos la molécula de ADN. ( ) Enzimas que pegan los insertos al plásmido. ( ) Es el proceso de introducción del plásmido modificado a la bacteria. ( ) Facilita la entrada del plásmido a la bacteria. ( ) Proceso que consiste en obtener bacterias con igual información genética y perfil bioquímico idéntico. 1. Ligasas 2. PCR 3. De restricción 4. Topoisomerasa 5. Taq polimerasa 6. Termociclador 7. Helicasa 8. Electroporación y choque térmico 9. Clonación 10. Transformación

Transgénicos El diseño de organismos transgénicos, por ejemplo en ciertas plantas, requiere además de la tecnología del ADN recombinante, el empleo de técnicas de cultivo celular vegetal. Se comienza por conocer la secuencia de ADN que se necesite insertar para dar a la nueva planta características de resistencia a plaguicidas, a insectos y aumento del aporte nutricional, mayor vida de anaquel, entre otras. Posteriormente se realizará la amplificación de la secuencia en cuestión, por ejemplo por medio de PCR. Siguiendo la recombinación de la secuencia amplificada con un plásmido. Existe una bacteria llamada Agrobacterium tumefaciens, que tiene la facilidad de infectar cierto tipo de plantas, de tal modo que logra acoplar su ADN bacteriano con el del vegetal. De esta forma se podrán transformar células vegetales como las encontradas en las raíces de algunas plantas. Otro mecanismo de transformación es por medio de la inyección de ADN directamente al núcleo celular (proceso llamado microinyección de ADN), o por medio de biobalística, es decir, el disparo de partículas de ADN cubiertas con oro o tungsteno a velocidades supersónicas a través de un acelerador de partículas. Una vez transformada la célula vegetal se procede a su cultivo. Las células transformadas pueden provenir de semillas, raíces, tallos u hojas. Por medio del cultivo celular podemos obtener de una hoja un cúmulo de células que se transformarán en plántulas y luego en pequeñas plantas listas para sembrar y desarrollarse a la etapa madura y productiva.

Ejemplo de plantas transgénicas son el maíz, jitomate, remolacha, algodón, melón, tabaco, papa, calabaza, calabacín, soja, trigo, alfalfa, girasol, naranjo, ciruelo, eucalipto.

Vacunas

Otro campo donde se emplean las herramientas de la biotecnología es en el diseño de nuevas vacunas. Por ejemplo, en la prevención de la hepatitis B. La hepatitis B se adquiere por transmisión sexual, contacto con otros fluidos corporales, por lesiones percutáneas contaminadas con el virus (tatuajes y percings), etcétera. Dentro de las secuelas importantes encontramos la hepatomegalia (aumento de tamaño del hígado), cirrosis hepática, carcinoma hepatocelular y muerte. El carcinoma hepatocelular que produce la hepatitis B es la segunda causa de muerte por cáncer en el mundo, después del cigarro. El virus de la hepatitis B está clasificado como un virus envuelto; es decir, posee una capa externa elaborada con membrana citoplasmática celular (de células previamente infectadas). Esta envoltura tiene en todo su entorno una proteína llamada antígeno de superficie HBs Ag, la cual es la primera en contactar con los receptores celulares para infectar la célula. En el desarrollo de vacunas para la prevención de esta enfermedad se intentaron varios productos, como el empleo de virus inactivado (muerto) y de virus atenuado (vivo); sin embargo, no se obtuvieron los resultados esperados y, por el contrario, se corría el riesgo de infección. Actualmente se ha desarrollado una vacuna recombinante la cual emplea el gen que codifica para la HBsAg, insertado en una levadura inofensiva para el ser humano (Sacharomyces spp), de modo que el paciente queda protegido al elaborar anticuerpos contra el antígeno de superficie, así evita que el virus interactúe con la célula y la infecte.

Enzimas

La biotecnología participa también en el diseño de nuevos productos como las enzimas, para su posterior empleo en la industria de alimentos, un ejemplo de éstos es la quimosina recombinante. En la elaboración artesanal del queso, como ya se vio, se emplea el cuajo de ternero para la coagulación de la leche; esto se debe a que el estómago (cuajo) del becerro lactante (ternero) produce una enzima llamada quimosina que ayuda a degradar las proteínas lácteas, esta enzima deja de producirse conforme crece el animal.

Actualmente, en la industria moderna del queso se utiliza la enzima quimosina (renina) recombinante, que es obtenida a partir de hongos Kluyveromyces lactis o de Aspergillus niger los cuales han sido modificados genéticamente para que expresen los genes de origen animal (bovino) que codifican para la enzima. Esto implica el hecho de que se haya logrado la extracción de células de ganado vacuno y su posterior aislamiento y secuenciación de genes, que codifican para la quimosina para finalmente recombinarlo y expresarlo en microorganismos.

Terapia génica: tratamiento de enfermedades Los avances de la biotecnología han llegado a resolver enfermedades de origen hereditario, convirtiéndose en una prometedora herramienta del futuro que ya ha empezado a dar sus primeros pasos. Al uso de recursos biotecnológicos y de ingeniería del ADN en el tratamiento de enfermedades se le conoce como terapia génica.

Actividad con TIC

Presenta un video sobre las implicaciones del uso de la ingeniería genética y terapia génica y elabora un reporte puntualizando sus aportes, beneficios e implicaciones bioéticas.

Por ejemplo, existe una enfermedad llamada inmunodeficiencia combinada severa (SCID, por sus siglas en inglés), que se debe a la falla en un gen en el cromosoma 20 asociado con la enzima deaminasa de adenosina o ADA (enzyme adenosine deaminase), la cual es necesaria para el correcto funcionamiento del sistema inmune. Esta enfermedad se caracteriza por ausencia de linfocitos T y presencia de linfocitos B defectuosos, de tal modo que el paciente padece de numerosas y severas infecciones por microorganismos oportunistas que en condiciones normales no harían ningún daño.

La cura antigua de esta enfermedad era la inyección de esta enzima, pero de origen bovino. Después se intentaron los trasplantes de médula ósea; sin embargo, el paciente receptor tenía que recibir la médula proveniente de personas sanas e inmunológicamente compatible. La terapia génica permitió transformar las células enfermas de la médula ósea del paciente para después ser introducidas en el bazo, así se reducía la complicación del rechazo y se permitía la presencia de células productoras de ADA en un organismo que no había nacido con la posibilidad de elaborar esta enzima. El 14 de septiembre de 1990 los médicos W. French Anderson, Michael Rosenberg y Kenneth Culver trataron exitosamente a la primera paciente, la niña Ashanti de Silva, en Estados Unidos.

De igual forma están en vías de experimentación las tecnologías necesarias para la sustitución de genes supresores de los oncogenes, sustitución de protooncogenes defectuosos y modificaciones moleculares de activación del sistema inmune. Las perspectivas hacia el futuro de la terapia génica son muy prometedoras, y en nuestro país se empiezan a dar los primeros pasos en esta fascinante ciencia.

Bioética

Criterios que limitan las aplicaciones de la ingeniería genética Existe una gran controversia con respecto a la modificación genética de los organismos y el uso de los mismos. Muchos de los argumentos en contra de la biotecnología no están sustentados científicamente y caen en el terreno de la especulación y suposiciones amarillistas. Por otra parte, la postura de quienes defienden los avances de la ingeniería genética, están fuertemente influenciados por intereses económicos de compañías transnacionales que se dedican a la investigación y venta de productos transgénicos como plantas resistentes a plaguicidas, y que curiosamente han sido vinculadas con la venta de estos químicos. Por todo ello, la postura que se debe tomar ante tal revolución científico tecnológica debe ser crítica y de profundo análisis. Es cierto que existen además posturas religiosas, éticas y morales, ante esto resulta complicado abordar tales temas. Sin embargo, consideramos que resultaría pertinente que además se considerara también el beneficio hacia el individuo, sin el detrimento de su integridad física, moral,

Evaluación formativa

Escoge la opción correcta y escríbela en el paréntesis. 1. Son organismos en cuyo material genético se ha integrado genes procedentes de otra especie. ( ) a) Transgénicos b) Clonados c) Emparentados d) Relacionados 2. Son otras aportaciones biotecnológicas que inmunizan el organismo contra ciertas enfermedades por medio de moléculas biológicas que generan anticuerpos específicos. ( ) a) Enzimas b) Antibióticos c) Vacunas d) Levaduras 3. Procedimiento por el cual es reemplazado un gen defectuoso por otro sano para curar una enfermedad genética hereditaria. ( ) a) Transformación b) Terapia génica c) Transgénico d) Biomedicina preventiva 4. Disciplina que pretende analizar los avances biotecnológicos a la luz de los principios y valores morales. ( ) a) Bioética b) Biopsicosocial c) Análisis biológico d) Biopsicomoral