Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais – Moacyr Alcoforado Rebello by Editora Rubio

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais descreve as principais experiências que alicerçaram as técnicas que possibilitaram o advento de novas áreas de conhecimento da Biologia.

Moacyr Alcoforado Rebello Professor Titular do Departamento de Virologia, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Professor Visitante do Departamento de Bioquímica da Universidade de Cambridge, Inglaterra. Professor Adjunto de Biofísica e Fisiologia do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da UFRJ. Professor-Assistente de Bioquímica da Escola Médica de Volta Redonda, RJ. Professor Auxiliar de ensino de Química Orgânica e Biológica da Universidade Federal Fluminense (UFF). Pós-Doutorado em Ciências Biológicas (Biofísica Molecular) pela Universidade de Yale, EUA. Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica) pela UFRJ. Graduado em Farmácia Bioquímica pela UFF.

A obra aborda aspectos históricos, dando evidência aos trabalhos realizados pelos principais estudiosos da área; os conceitos atuais sobre a cultura celular (células desagregadas dos tecidos) e os conhecimentos básicos sobre a biologia das células em cultura; os principais meios de cultura utilizados nos laboratórios, bem como a análise das condições físico-químicas essenciais para a estabilidade celular. Também expõe as principais linhagens obtidas, desde o clássico embrião de galinha até as células-tronco, além dos conceitos básicos que podem facilitar, para o leitor, o acompanhamento do enorme progresso observado nesses assuntos nos últimos anos. O livro destina-se a estudantes de pós-graduação de toda a área biológica, que terão neste texto os conhecimentos essenciais para a sua formação.

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

cultura celular vem contribuindo de maneira relevante para o esclarecimento de diversas questões das ciências biológicas. A virologia tem sido uma especialidade bastante beneficiada por essa técnica, haja vista os conhecimentos obtidos sobre a replicação e a identificação de moléculas utilizadas como alvos para substâncias inibidoras da multiplicação dos vírus.

Outros Títulos de Interesse Protozoologia Médica Wanderley de Souza (Org.)

Psicobiologia do Comportamento Alimentar Sebastião de Sousa Almeida / Telma Maria Braga Costa / Maria Fernanda Laus / Gisele Straatmann

Fundamentos da

Cultura de Tecido e Células Animais

Esquistossomoses Humanas Rodrigo Siqueira-Batista / Andréia Patrícia Gomes / Luzidalva Barbosa de Medeiros / Alberto Novaes R. Júnior / Fernando Schemelcer de Moraes Bezerra

Redação de Trabalhos Acadêmicos nas Áreas das Ciências Biológicas e da Saúde Haroldo Ferreira

Bizu de Biologia – 2.700 Questões Selecionadas para Concursos Leonardo da Silva Vidal / Marco Pinheiro Gonçalves / Mildred Ferreira Medeiros / Tatiana Amorim M. de Alencar

Manual de Comportamento Animal Marcos Rochedo Ferraz

MOACYR ALCOFORADO REBELLO

Ciências Biológicas Microbiologia

MOACYR A. REBELLO

Áreas de interesse

Saiba mais sobre estes e outros títulos em nosso site: www.rubio.com.br

9 788564 956636

CAPA – Fundamentos da Cultura de Tecido.indd 1

26/09/2013 17:45:28

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 6

05-09-2013 16:58:41

C o p y r i g h t ©2 0 1 4E d i t o r aR u b i oL t d a . R e b e l l o . F u n d a me n t o sd aC u l t u r ad eT e c i d oeC é l u l a sAn i ma i s . Al g u ma sp á g i n a s , n ã os e q u e n c i a i s , ee mb a i x ar e s o l u ç ã o .

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 1

26/09/2013 15:12:50

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 2

05-09-2013 16:58:40

Professor Titular do Departamento de Virologia, Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes, da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Professor Visitante do Departamento de Bioquímica da Universidade de Cambridge, Inglaterra. Professor Adjunto de Biofísica e Fisiologia do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, da UFRJ. Professor-Assistente de Bioquímica da Escola Médica de Volta Redonda, RJ. Professor Auxiliar de ensino de Química Orgânica e Biológica da Universidade Federal Fluminense (UFF). Pós-Doutorado em Ciências Biológicas (Biofísica Molecular) pela Universidade de Yale, EUA. Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica) pela UFRJ. Graduado Farmacêutico Bioquímico pela UFF.

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 3

Moacyr Alcoforado Rebello

26/09/2013 15:12:51

Copyright © 2014 Editora Rubio Ltda. ISBN 978-85-64956-63-6 Todos os direitos reservados. É expressamente proibida a reprodução desta obra, no todo ou em parte, sem autorização por escrito da Editora. Produção e Capa Equipe Rubio Editoração Eletrônica Elza Maria da Silveira Ramos Ilustrações Lin Lima

CIP-BRASIL. CATALOGAÇÃO-NA-FONTE SINDICATO NACIONAL DOS EDITORES DE LIVROS, RJ Rebello, Moacyr Alcoforado R234f Fundamentos da cultura de tecido e células animais / Moacyr Alcoforado Rebello; ilustrações Lin Lima. – 1. ed. - Rio de Janeiro: Rubio, 2014. 208 p.: il.; 23cm. Inclui bibliografia e índice ISBN 978-85-64956-63-6 1. Tecidos (Anatomia e fisiologia) – Cultura e meios de cultura. 2. Citologia. 3. Biologia molecular. I. Título. 13-03786 08/08/2013 09/08/2013

Editora Rubio Ltda. Av. Franklin Roosevelt, 194 s/l 204 – Castelo 20021-120 – Rio de Janeiro – RJ Telefax: 55(21) 2262-3779 • 2262-1783 E-mail: rubio@rubio.com.br www.rubio.com.br Impresso no Brasil Printed in Brazil

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 4

CDD: 571.6 CDU: 576

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

05-09-2013 16:58:41

Cecília Meireles A Christina. A sua presença, tão querida entre nós, tem para mim o significado da mensagem de Cecília Meireles.

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 5

A primavera chegará, mesmo que ninguém mais saiba seu nome, nem acredite no calendário, nem possua jardim para recebê-la. A inclinação do sol vai marcando outras sombras; e os habitantes da mata, essas criaturas naturais que ainda circulam pelo ar e pelo chão, começam a preparar sua vida para a primavera que chega.

05-09-2013 16:58:41

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 6

05-09-2013 16:58:41

Seria impossível escrever este livro sem a colaboração, a amizade e o incentivo da minha esposa, Maria Christina Soares Rebello. Seus conhecimentos e sua habilidade em analisar textos científicos foram de importância fundamental. Sou imensamente grato aos colegas Maria da Glória da Costa Carvalho, Izabel Christina Nunes de Palmer Paixão, Davis Fernandes Ferreira, Marcelo Damião Ferreira de Meneses e Luciana Jesus da Costa, pelas valiosas sugestões recebidas. Na implantação da técnica de cultura celular em nosso laboratório do Instituto de Biofísica, somos devedores do auxílio e da amizade dos professores Carlos Chagas Filho, Firmino Torres de Castro, Alberto Barbosa Hargreaves, Aida Hasson Volloch e Eduardo Penna Franca. Após o nosso ingresso no Instituto de Microbiologia, tivemos também a colaboração dos Professores Raimundo Diogo Machado, Sergio Eduardo Fracalanza, Maulori Curié Cabral e Maria Genoveva von Hubinger, a quem estendemos os nossos agradecimentos. A documentação de dados históricos sobre cultura de tecido foi obtida, em parte, no acervo da biblioteca do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, com o auxílio e a gentileza da Sra. Dilma Santana Cayres. Nossos sinceros agradecimentos à equipe de produção da Editora Rubio, pelo excelente trabalho profissional e pela maneira agradável como conduziram este trabalho. Durante todo o período de nossa atividade na Universidade Federal do Rio de Janeiro, contamos com a participação de inúmeros colegas, alunos, técnicos e funcionários. A eles o nosso reconhecimento pelas demonstrações de solidariedade que nos proporcionaram e que representam uma das mais ricas experiências que temos vivido. Moacyr Alcoforado Rebello

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 7

Agradecimentos

05-09-2013 16:58:41

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 8

05-09-2013 16:58:41

Neste livro procuramos descrever as principais experiências que deram fundamento às técnicas de cultura de tecido e de células animais. Registramos também dados históricos, prestando, dessa maneira, uma homenagem aos pesquisadores cujos trabalhos contribuíram de modo relevante para estes estudos. Sem dúvida, o desenvolvimento dessas técnicas possibilitou o advento de novas áreas de conhecimento da Biologia, que se mantêm em progresso até os dias atuais. Alguns autores utilizam a expressão “cultura de tecido” de maneira genérica, denotando a cultura celular e a cultura de órgão, o que pode ser atribuído ao fato de a cultura de tecido ter sido a técnica original, utilizada durante mais de 50 anos, e que deu origem à cultura de células dispersas. A esse respeito, foi nosso objetivo especificar essas técnicas, descrevendo não só as suas características metodológicas como também os dados obtidos e as suas aplicações. A cultura de tecido possibilitou o esclarecimento de diversas questões, entre as quais citamos a teoria axonal e o fator de crescimento do nervo. A cultura de células tem contribuído de modo notável para a biologia molecular de maneira geral, além de proporcionar os estudos sobre metabolismo, a interação com microrganismos e a fisiologia das células tumorais. Os conceitos descritos neste livro seguem as normas da Comissão de Terminologia, formada em 1990 pela Sociedade Americana de Cultura de Tecido, que foram adotadas internacionalmente. Nos Capítulos 1, Primeiros Estudos, e 2, Cultura de Tecido, descrevemos aspectos históricos da cultura de tecido, evidenciando os trabalhos realizados por Roux, Arnold e Loeb. Posteriormente, Harrison desenvolveu um método (da gota pendente) que possibilitou o cultivo de tecidos por longos períodos. Carrel, Bur-

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 9

Apresentação

05-09-2013 16:58:41

Moacyr Alcoforado Rebello

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 10

rows e Fischer foram os principais responsáveis pela caracterização da morfologia, da nutrição e do crescimento das culturas. Os conceitos atuais sobre a cultura celular (células desagregadas dos tecidos) e os conhecimentos básicos da biologia das células em cultura estão citados nos Capítulos 3, Cultura de Células, e 4, Biologia das Células em Cultura. Os principais meios de cultura utilizados nos laboratórios foram descritos no Capítulo 5, Meios de Cultura, onde assinalamos a importância dos seus componentes no metabolismo celular. Nesse mesmo capítulo analisamos as condições físico-químicas essenciais para a estabilidade celular. No Capítulo 6, Linhagens Celulares, mostramos as principais linhagens obtidas, desde o clássico embrião de galinha até as células-tronco. Procuramos assinalar a origem do tecido animal utilizado e as suas propriedades proliferativas. Nos Capítulos 7, Transformação; 8, Senescência; e 9, Imortalização, descrevemos conceitos básicos que podem facilitar para o leitor o acompanhamento do imenso progresso observado nesses assuntos nos últimos anos. Esperamos que este livro possa contribuir para os estudos sobre a cultura de tecido e de células.

05-09-2013 16:58:41

Os projetos de pesquisa do nosso laboratório sobre os mecanismos moleculares de ação de substâncias antivirais levaram-nos a desenvolver as técnicas de cultura de células animais. A elaboração deste livro foi, portanto, consequência da experiência que adquirimos durante a realização desses trabalhos e da nossa atividade como docente nos cursos de pós-graduação em Biofísica e Microbiologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro. A cultura celular tem contribuído de maneira relevante para o esclarecimento de diversas questões das ciências biológicas. A virologia tem sido uma especialidade bastante beneficiada por esta técnica, haja vista os conhecimentos obtidos sobre a replicação e a identificação de moléculas utilizadas como alvos para substâncias inibidoras da multiplicação dos vírus. Atualmente, a cultura de células enfrenta dois grandes desafios. O primeiro é a obtenção de células-tronco embrionárias humanas em larga escala. Os métodos convencionais encontram dificuldades não só pelo aspecto técnico, mas também por questões éticas e religiosas. As técnicas de indução de célulastronco pluripotentes por alteração da expressão gênica têm sido consideradas um caminho promissor. O segundo desafio consiste na obtenção de tecidos específicos por uma metodologia, de grande importância médica, denominada engenharia de tecidos. Esperamos que, no futuro, esses desafios possam ser contornados. Moacyr Alcoforado Rebello

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 11

Prefácio

05-09-2013 16:58:41

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 12

05-09-2013 16:58:41

ATCC

American Type Culture Collection

BME

meio basal de Eagle (Eagle basal medium)

Conicet

Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas

DMEM

meio de Eagle modificado por Dulbecco (Dulbecco’s modified Eagle’s medium)

DMSO

dimetilsulfóxido

densidade de saturação

corpo embrioide (embryoid body)

EBV

vírus Epstein-Barr (Epstein-Barr virus)

ECM

matriz extracelular (extracellular matrix)

EDTA

ácido etilenodiaminotetracético (ethylenediamine tetraacetic acid)

EGF

fator de crescimento da epiderme (epidermal growth factor)

EGTA

ácido etilenoglicol tetracético (ethylene glycol tetraacetic acid)

EMS

etil-metano-sulfonato

FDA

Food and Drug Administration

FSH

hormônio foliculoestimulante (follicle-stimulating hormone)

G6PD

glicose-6-fosfato desidrogenase

GMEM

meio mínimo essencial de Glasgow (Glasgow minimum essential medium)

HGPRT

hipoxantina-guanina fosforribosiltransferase

hTERT

enzima transcriptase reversa da telomerase humana (human telomerase reverse transcriptase)

hTR

telomerase humana componente RNA (human telomerase RNA)

IGF

fator de crescimento semelhante à insulina (insulin-like growth factor)

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 13

Lista de abreviaturas

05-09-2013 16:58:41

meio de Dulbecco modificado por Iscove (Iscove’s modified Dulbecco’s medium)

iPSC

células-tronco pluripotentes induzidas (induced pluripotent stem cells)

LIF

fator inibidor da leucemia (leukemia inhibitory factor)

MAPK

proteinocinase ativada por mitógenos (mitogen activated protein kinase)

MCDB

biologia molecular, celular e de desenvolvimento (Molecular, cellular and developmental biology)

MEM

meio essencial mínimo

MIC

massa interna celular

NDV

vírus da doença de Newcastle (Newcastle disease virus)

NGF

fator de crescimento do nervo (nerve growth factor)

NIH

National Institute of Health

PBS

tampão fosfato salino (phosphate buffered saline)

PCR

reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction)

PDGF

fator de crescimento derivado das plaquetas (platelet derived growth factor)

PGM

fosfoglicomutase (phosphoglucomutase)

ROS

espécies reativas de oxigênio (reactive oxygen species)

RPMI

Roswell Park Memorial Institute

RSV

vírus do sarcoma de Rous (Rous sarcoma virus)

STR

sequências curtas repetidas em tandem (short tandem repeat)

SV40

vírus vacuolante símio 40 (simian vacuolating virus 40)

tempo de duplicação

TSH

hormônio estimulante da tireoide (thyroid-stimulating hormone)

unidades internacionais

VSV

virus da estomatite vesicular (vesicular stomatitis virus)

WNV

vírus do Nilo Ocidental (West Nile virus)

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 14

IMDM

05-09-2013 16:58:41

Primeiros Estudos.................................................................................. 1 Impacto da Teoria Celular..................................................................................................1 Os Pioneiros..........................................................................................................................2

Cultura de Tecido.................................................................................. 7 Histórico.................................................................................................................................7 Difusão da Técnica no Mundo...................................................................................... 26

Cultura de Células...............................................................................41 Terminologia....................................................................................................................... 41 Obtenção das Células...................................................................................................... 41

Biologia das Células em Cultura......................................................55 Morfologia........................................................................................................................... 55 Cultura em Três Dimensões (3D)................................................................................. 59 Cultura de Órgão............................................................................................................... 61 Expansão da Técnica de Cultura Celular.................................................................... 63

Meios de Cultura.................................................................................67 Meios Naturais................................................................................................................... 67 Meios Sintéticos................................................................................................................ 68 Componentes dos Meios de Cultura........................................................................... 73 Composição do Soro....................................................................................................... 78

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 15

Sumário

05-09-2013 16:58:41

Propriedades Físico-Químicas....................................................................................... 83

Linhagens Celulares............................................................................91 Introdução........................................................................................................................... 91 Células de Embrião de Galinha..................................................................................... 92 Células L.............................................................................................................................. 93 As Células HeLa............................................................................................................... 101 Células de Macaco.......................................................................................................... 111 Células de Roedores...................................................................................................... 112 Células de Porco............................................................................................................. 114 Células Humanas Normais........................................................................................... 114 Células de Tumores........................................................................................................ 116 Células-Tronco.................................................................................................................. 118

7 Transformação................................................................................... 133 Conceito............................................................................................................................ 133 Alterações Celulares....................................................................................................... 134 Transformação por Substâncias Químicas e Radiação......................................... 139

8 Senescência....................................................................................... 147 Envelhecimento Celular................................................................................................ 147 Encurtamento dos Telômeros......................................................................................148 Estresse e Senescência.................................................................................................. 151 Controle da Senescência.............................................................................................. 152 Modelos de Estudo......................................................................................................... 154

9 Imortalização..................................................................................... 161 Introdução......................................................................................................................... 161 Expressão da Telomerase............................................................................................. 161 Expressão de Genes Virais............................................................................................162 Métodos para Imortalização........................................................................................163

Índice Remissivo............................................................................... 169

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 16

Meios Isentos de Soro..................................................................................................... 79 Meios para Células de Insetos...................................................................................... 81

05-09-2013 16:58:41

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00 - caderno cor.indd 17

Caderno em Cores

05-09-2013 16:58:18

Fonte: adaptada de White,1963.8

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00 - caderno cor.indd 18

Figura 1.1 Células obtidas da cavidade peritonial de sapo. Desenho realizado em 1887 por Julius Arnold. Acima, leucócitos mantidos in vitro após migração para a solução salina. Abaixo, à esquerda, fibroblastos e, à direita, macrófagos. Note a presença de células multinucleadas

05-09-2013 16:58:18

1 4

Figura 2.1 (A a E) Experiência de Harrison. Técnica da gota pendente (hanging drop). Em uma lamínula 1 E (2,2 × 2,2cm) estéril é colocada uma gota de linfa de sapo (A). Adição do fragmento do tecido (B). A lamínula é invertida sobre uma lâmina escavada estéril (C). Vedação com parafina (D). Montagem final (E). Vista frontal. Lâmina escavada (1); lamínula (2); tecido e linfa de sapo (3); parafina (4)

0,05

0,10

13 dias

15 dias

18 dias

Figura 2.4 (A e B) Crescimento de fibra nervosa de embrião de sapo. Desenho feito a partir de uma preparação usando a câmera lúcida. Preparado de 4 dias registrados em uma mesma amostra com intervalos de 30min mostrando o comprimento total (A). Registro de preparações após 13, 15 e 18 dias (B)

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00 - caderno cor.indd 19

05-09-2013 16:58:21

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 6

05-09-2013 16:58:41

Cultura de Tecido

HISTÓRICO

O trabalho de Harrison Ross Granville Harrison (1870-1959) nasceu na Pensilvânia, EUA, e estudou inicialmente na Universidade Johns Hopkins, onde se graduou em Zoologia e obteve o título de Ph.D. Posteriormente, formou-se em Medicina na Universidade de Bonn, na Alemanha. Adquiriu ampla formação em Ciências Naturais, demonstrando inclinação para morfologia e embriologia. No início de sua carreira foi orientado pelos renomados professores W. Brooks e F. Mall e pelo anatomista alemão G. Born em seus trabalhos em embriologia usando sapo como modelo. Na Universidade Johns Hopkins, ocupou o cargo de instrutor de anatomia e, posteriormente, o de professor de histologia e embriologia.1 Em seus trabalhos sobre biologia marinha destacamos a participação em diversas comissões de estudos nos EUA e no Caribe, além de ter prestado intensa colaboração como professor dos famosos cursos de verão do Marine Biological Laboratory, em Massachusetts.2 Harrison descreveu uma técnica que se mostrou eficiente para o cultivo e a manutenção prolongada de tecidos in vitro enquanto desenvolvia estudos sobre a embriologia de anfíbios. Retirou, em condições assépticas, um fragmento de 3mm do tubo medular de um embrião de sapo e, com o auxílio de uma pipeta fina, colocou em uma lamínula sobre uma gota de linfa de sapo adulto. A linfa coagulava rapidamente, mantendo o fragmento de tecido em posição fixada ao vidro. A lamínula era

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-02.indd 7

capítulo

05-09-2013 16:59:06

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

então invertida sobre uma lâmina de vidro contendo uma cavidade no centro (lâmina escavada) e, em seguida, vedada nas bordas com parafina (Figura 2.1). Com esta técnica, chamada gota pendente (hanging drop), o tecido se mantinha vivo por um período de 1 a 4 semanas, desde que fosse preparado sob rigorosa assepsia.3 Como, naquela época, os recursos da fotografia científica estavam ainda em fase inicial, a morfologia da cultura era registrada por meio de desenho das imagens obtidas pelo microscópio. Um recurso bastante utilizado foi a câmera lúcida, que possibilitou a realização do desenho sem que o observador necessitasse retirar os olhos da lente ocular do microscópio. Esse dispositivo óptico, patenteado em 1806 por William Hyde Wollaston, foi muito utilizado por pintores e desenhistas na época, sendo ainda hoje usado por artistas. Com o avanço das técnicas de microscopia, os cientistas conectarem esse aparelho ao microscópio, o que permitiu então maior facilidade no registro das imagens (Figura 2.2). Na ocasião, a Universidade de Yale, nos EUA, interessada nesse trabalho, convidou Harrison para chefiar o Departamento de Zoologia. Em poucos anos o

3 4

2 4 1

Figura 2.1 (A a E) Experiência de Harrison. Técnica da gota pendente (hanging drop). Em uma lamínula (2,2 × 2,2cm) estéril é colocada uma gota de linfa de sapo (A). Adição do fragmento do tecido (B). A lamínula é invertida sobre uma lâmina escavada estéril (C). Vedação com parafina (D). Montagem final (E). Vista frontal. Lâmina escavada (1); lamínula (2); tecido e linfa de sapo (3); parafina (4) (ver caderno em cores)

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-02.indd 8

05-09-2013 16:59:06

Figura 2.2 Câmera lúcida. Visor (V); lentes de aproximação (L); parafuso para fixação (P)

departamento se tornou um dos mais importantes do país e, com o grupo da Universidade de Freiburg na Alemanha, formou uma das melhores escolas de embriologia experimental.1 Nos estudos relacionados com o desenvolvimento embrionário do sistema nervoso, uma das questões mais importantes residia na origem das fibras nervosas.4 Duas teorias estavam em discussão na época: Hensen, respeitado anatomista alemão, defendia a ideia de que as fibras seriam formadas a partir da ligação de pequenos segmentos originários das células locais. Santiago Ramon y Cajal, na Espanha, e Wilhelm His, na Alemanha, acreditavam na teoria neuronal, admitindo que as fibras se desenvolviam mediante um processo de crescimento de dentro para fora das células (Outgrowth Theory). É importante mencionar que as técnicas de histologia clássica existentes naquela época eram insuficientes para apontar qual das duas hipóteses estava correta.5 Em continuidade aos seus estudos, Harrison demonstrou, utilizando a técnica da gota pendente, que, de fato, as fibras nervosas emergiam em um processo de crescimento para fora das células, confirmando a teoria neuronal.4,6 A Figura 2.3

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-02.indd 9

Cultura de Tecido

05-09-2013 16:59:06

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

Figura 2.3 Desenvolvimento do axônio. Desenho feito com câmera lúcida do tecido do sistema nervoso de embrião de sapo. Registro de uma preparação de 4 dias, mostrando uma mesma célula com intervalos de 50min

apresenta uma experiência clássica feita em 1908 por Harrison, mostrando uma célula do tubo medular de embrião de sapo no qual se observa o desenvolvimento do axônio.7 Em outro trabalho feito em seguida, Harrison (1910)8 analisou em mais detalhe a mudança da forma e o desenvolvimento axonal (Figura 2.4). O trabalho de Harrison foi reconhecido como uma grande contribuição científica, além de ser considerado por muitos autores o início do desenvolvimento da técnica de cultura de tecido. Entretanto, para surpresa da comunidade acadêmica, Harrison jamais conseguiu receber o prêmio Nobel em reconhecimento. Em 1917, o Comitê Científico que analisou o seu trabalho deu um parecer favorável, porém o Instituto Nobel decidiu suspender a concessão de todos os prêmios daquele ano em virtude dos acontecimentos da Primeira Guerra Mundial. Em 1933, o trabalho de Harrison foi novamente submetido ao prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina, mas o parecer do Comitê não foi favorável à concessão: “O prêmio não pode ser recomendado tendo em conta opiniões divergentes e o valor bastante limitado

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-02.indd 10

05-09-2013 16:59:06

0,05

0,10

13 dias

15 dias

18 dias

do método e o tempo da descoberta”.5 Naquela época, os trabalhos científicos de Mendel estavam em pleno renascimento e o prêmio Nobel daquele ano foi concedido Thomas Hunt Morgan pela sua contribuição à genética nos seus trabalhos com Drosophila melanogaster.6 É interessante mencionar que, em 1954, o prêmio Nobel foi concedido a Enders, Weller e Robins pelo trabalho sobre a multiplicação do vírus da poliomielite em células cultivadas pelo método descrito por Harrison em 1907.9 A produção em larga escala do vírus da poliomielite possibilitou, posteriormente, a preparação da vacina.6 Durante toda a sua vida acadêmica, Harrison foi considerado um brilhante cientista, ocupando cargos de significativa importância. Foi o primeiro editor de Journal of Experimental Zoology, trabalhando ativamente nesta revista até aposentar-se, em 1946. Foi membro da Academia Nacional de Ciências e da Sociedade Filosófica Americana. Recebeu os prêmios John Scott, John Carty e a comenda da cidade de Filadélfia. Foi presidente do National Research Council, onde coordenou a pesquisa científica realizada durante o período da Segunda

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-02.indd 11

Cultura de Tecido

05-09-2013 16:59:09

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

Guerra Mundial, participando ativamente no programa de produção e distribuição de penicilina.5,6

Desenvolvimento da técnica Em 1910, Simon Flexner, diretor do então recém-criado Rockefeller Institute for Medical Research, decidiu implantar a técnica de cultura de tecido em sua instituição e convidou Montrose T. Burrows, que havia se graduado, à época, pela Universidade Johns Hopkins, para realizar um estágio no laboratório de Harrison na Universidade de Yale.2,10 No laboratório de Harrison, após aprender a técnica original (embrião de sapo), Burrows obteve permissão para desenvolver experiências com tecidos provenientes de embrião de galinha. Este material se mostrou extremamente satisfatório não somente quanto à intensa proliferação das células como também pela facilidade de obtenção do tecido (ovo embrionado) em uma forma normalmente isenta de contaminação com bactérias e fungos (Figura 2.5). A partir desse trabalho ficou evidente que os tecidos embrionários se mostravam mais apropriados para o cultivo quando comparados com os tecidos provenientes de animais adultos. Segundo White (1963), a expressão “cultura de tecido” foi criada por Burrows no decorrer da realização desses estudos.11 Inicialmente, o próprio Burrows introduziu uma modificação na técnica original, passando a utilizar, com grande vantagem, o plasma obtido do sangue de galinha em vez da linfa de sapo,12 o que possibilitou cultivo, com relativa facilidade, de tecidos do sistema nervoso e do coração de embrião de galinha.13 Mediante este procedimento, Burrows mostrou que células do coração do embrião cultivadas in vitro mantinham, por alguns dias, o ritmo de batimento cardíaco (contração das células), visível ao microscópio óptico, provando assim a origem mioblástica da pulsação cardíaca.14 De volta ao Instituto Rockefeller, que o contratara, Burrows foi imediatamente convidado por Alexis Carrel para trabalhar em seu laboratório. Alexis Carrel (1873-1944), nascido na França, graduou-se em Medicina na Universidade de Lyon em 1900, e se especializou em cirurgia, ocupando o cargo de professor de Anatomia e Cirurgia. Seu primeiro trabalho, publicado em 1902 na revista Le Lyon Medical, abordava a anastomose de vasos sanguíneos.15 Em 1904, foi para os EUA, onde continuou seu trabalho no Departamento de Fisiologia da Universidade de Chicago e obteve grande notoriedade com o seu projeto, nada modesto, sobre transplante de órgãos e tecidos humanos. Em 1906 re-

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-02.indd 12

05-09-2013 16:59:09

C Figura 2.5 (A a C) Embrião de galinha. Ovo embrionado (9 a 11 dias) é examinado e as impurezas presentes na casca são removidas com algodão embebido em álcool. Em condições assépticas, o embrião é removido (A). Em seguida é colocado em placa de Petri e lavado com solução salina (B). O fragmento do tecido desejado é retirado do embrião e montado na lâmina escavada, tal como descrito por Harrison (C) (ver Figura 2.1) (ver caderno em cores)

cebeu convite para trabalhar no Instituto Rockefeller, onde desenvolveu brilhante carreira.16 Em 1912 recebeu o prêmio Nobel em Fisiologia ou Medicina pela sua contribuição ao desenvolvimento de métodos de sutura vascular e de transplante de vasos sanguíneos e de órgãos.17 Como cita Rapaport (1987), este foi o primeiro prêmio Nobel conquistado por um pesquisador residente nos EUA.18 Os trabalhos publicados por Harrison causaram forte impacto no projeto de pesquisa de Carrel, que passou a considerar a possibilidade de estudar os diferentes fatores que envolviam a manutenção dos tecidos in vitro por longos períodos. Com a vinda de Burrows para o seu laboratório, Carrel teve a oportunidade de desenvolver um projeto sobre a cultura de tecido de mamíferos.

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-02.indd 13

Cultura de Tecido

05-09-2013 16:59:09

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

Eles conseguiram cultivar, a partir da técnica modificada por Burrows (plasma de galinha coagulado), com relativa facilidade, não só tecidos embrionários como também de animais adultos, tais como cão, gato, rato e porquinho-daíndia (cobaia). Estes tecidos davam origem a células de formato epitelial e fibroblastoide que migravam para a superfície da lamínula. Tiveram também sucesso no cultivo de tecido proveniente da tireoide (cão), do baço (galinha) e também de tecido tumoral, tal como o sarcoma de Rous (galinha), tumor de Erlich (camundongo) e sarcoma de Jensen (rato).19 De grande importância também foi a verificação de que a cultura in vitro do sarcoma de Rous, quando transplantada para galinha, induzia o desenvolvimento do sarcoma. O sarcoma de Rous é um tumor formado pela infecção pelo vírus do sarcoma de Rous (RSV – Rous sarcoma virus) caracterizado por Peyton Rous no seu laboratório do Instituto Rockefeller.20 Este vírus (tipo RNA), que pertence à família Retroviridae, é considerado o primeiro vírus identificado como indutor de tumor.21

Morfologia Nos trabalhos iniciais foi descrito que o fragmento de tecido retirado do animal apresentava grande complexidade, pois, além das células especializadas, continha também células de tecido conjuntivo, dos vasos sanguíneos e do retículo endotelial. Verificava-se também a migração das células do tecido para a periferia da lamínula.22 Primeiro eram os macrófagos que migravam de uma maneira radial e, posteriormente, as células epiteliais. Grande parte das células especializadas se mantinha imóvel no estroma do tecido conjuntivo (Figura 2.6). Observavam-se, também, células que formavam círculos concêntricos em torno do fragmento do tecido. Quando a cultura era fixada e corada por hematoxilina, o contorno das células era mais evidente, podendo-se distinguir grânulos citoplasmáticos, o núcleo e o nucléolo.22-26 Trabalhos realizados por Lambert & Hanes (1911)27 e por Lewis & Gey (1923),28 com culturas de sarcoma de rato e de camundongo, revelaram dois tipos de células morfologicamente distintas. O primeiro era representado pelas células tumorais propriamente ditas. Estas células, inicialmente redondas, tomavam a forma alongada durante a migração. A maioria delas era mononuclear com nucléolo com larga conformação. O segundo tipo foi identificado como sendo macrófagos, que constituíam a população majoritária e iniciavam a migração 1 a 2h após a preparação da cultura.

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-02.indd 14

05-09-2013 16:59:09

Figura 2.6 (A e B) Morfologia da cultura de tecido. Observação ao microscópio de tecido de embrião de galinha. Reprodução de desenho feito com câmera lúcida. O tecido foi preparado tal como se descreve na Figura 2.5 e montado em lâmina escavada (gota pendente), como descrito por Harrison (ver Figura 2.1). Cultura de tecido conjuntivo após 30 dias da preparação. Do fragmento do tecido original observam-se a migração e a proliferação das células formando anéis em torno do tecido. Verifica-se, também, no centro da preparação, uma região escura formada provavelmente por células mortas e de plasma envelhecido (A). Aspecto da cultura após 50 dias da preparação, mostrando uma redução do fragmento inicial do tecido e o espalhamento das células na lamínula (B)

O brilhante estudo realizado por Warren Lewis e Margareth Lewis na Universidade Johns Hopkins contribuiu de maneira relevante para os conhecimentos de citologia. Entre outros, citamos os trabalhos sobre métodos de coloração para identificação do núcleo, do nucléolo, do citoplasma, da mitocôndria e dos vacúolos, bem como sobre o processo de locomoção dos leucócitos e de contração das células do músculo liso.29-31 Com o avanço das técnicas fotográficas estes cientistas conseguiram registrar por microcinematografia o processo de divisão celular além de uma atividade celular, ainda desconhecida, que foi denominada pinocitose.29 Produziram também diversos filmes científicos que foram exibidos durante vários anos em congressos e reuniões científicas.6

Manutenção da cultura Em 1912, Carrel publicou um trabalho de grande repercussão no qual afirmava ser possível manter, de maneira permanente, um tecido em cultura. Até então

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-02.indd 15

Cultura de Tecido

05-09-2013 16:59:10

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

sabia-se que os tecidos cultivados in vitro eram viáveis por apenas curtos períodos, de 3 a 15 dias. Em períodos maiores, a migração celular era reduzida gradativamente e o tecido morria. Carrel admitia que a senilidade e a morte dos tecidos eram decorrentes do acúmulo de substâncias catabólicas e da exaustão do meio e que, com a supressão desses fatores, o tecido poderia manter-se vivo indefinidamente.22 O método de Carrel consistia no seguinte procedimento: em uma cultura já desenvolvida (método de gota pendente) a lamínula era retirada e o fragmento original do tecido e as células eram removidos do plasma coagulado com o auxílio de um bisturi. Em seguida, a preparação era lavada diversas vezes com solução de Ringer (composta de solução de cloreto de sódio a 0,86% + cloreto de potássio a 0,03% + cloreto de cálcio a 0,033%) e colocada em uma nova lâmina escavada. O meio de cultura utilizado era constituído de plasma de galinha diluído em solução de Ringer e acrescido de extrato de embrião de galinha. Este procedimento era repetido periodicamente antes que o tecido e as células circunvizinhas apresentassem sinais de senilidade (Figura 2.7). Durante a evolução dos estudos sobre cultura de tecido e, posteriormente, de células, o conceito emitido por Carrel sobre a proliferação permanente das culturas foi invalidado. Nas décadas de 1950 e 1960 foi bastante divulgado que o crescimento de uma cultura de modo infinito ou imortal só era obtido por células transformadas. Ao contrário da suposição de Carrel, as células de embrião de galinha (seu modelo de estudo) ou de aves de modo geral não dão origem a linhagens com crescimento infinito.21,32,33 Vale salientar que, apesar deste comentário, a técnica de manutenção da cultura, tal como descrita por Carrel, foi bastante utilizada em trabalhos subsequentes. Nos anos seguintes, a técnica de manutenção da cultura foi aprimorada por um procedimento denominado passagem ou transferência, um método delicado, com grande possibilidade de contaminação bacteriana mas que, sem dúvida, representou um passo à frente no estudo da cultura de tecido. A técnica (Figura 2.7) consistia em remover a parafina retirando em seguida a lamínula sobreposta na lâmina escavada e colocando-a sobre uma placa de vidro estéril. Com o auxílio de um bisturi, o material que se localizava nas bordas da lamínula (restos celulares e plasma envelhecido) era retirado e descartado. Em todo o procedimento eram tomados cuidados especiais para que o corte não danificasse a preparação. A cultura contendo o fragmento do tecido e as células circunvizinhas era então cortada em duas ou quatro partes. As peças resultantes eram retiradas e transferidas para uma nova lamínula, recebendo a adição do

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-02.indd 16

05-09-2013 16:59:10

6 5

2 1

Figura 2.7 (A a D) Manutenção e passagem da cultura. A preparação é retirada da estufa e com o auxílio de um bisturi a parafina é removida (A). A lamínula contendo o tecido e as células é retirada e, após remoção do excesso de plasma, lavada com solução de Ringer e montada em uma nova lâmina escavada (B). A lamínula é depositada em uma placa de vidro estéril e o material é cuidadosamente retirado. O excesso de plasma é eliminado (C). A peça é cortada em 4 partes e montada em nova lamínula segundo o procedimento descrito na Figura 2.1 (D)

meio de cultura e montadas novamente na lâmina escavada, como já foi descrito na Figura 2.1. Esta técnica foi utilizada durante vários anos nos laboratórios de Fischer, Carrel e Ebeling do Instituto Rockefeller.10

Nutrição A linfa de sapo foi o primeiro nutriente utilizado em cultura de tecido, porém o seu uso foi superado após Burrows (1911) descobrir as vantagens do plasma de galinha que, com boa transparência e textura uniforme, facilitava a visualização da cultura ao microscópio. Além disso, Burrows considerava fator importante o fato de o plasma de galinha possuir alta concentração de fibrina e baixo nível de enzimas proteolíticas.13

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-02.indd 17

Cultura de Tecido

05-09-2013 16:59:10

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

As toxinas bacterianas foram também estudadas por esta técnica. Destacamos os trabalhos pioneiros de Levaditi & Mutermilch (1913) e Burrows & Suzuki (1918), mostrando que a toxina diftérica inibia a proliferação de fibroblastos de coração de embrião de galinha.56-57 Posteriormente, Okabe & Teruuchi (1930)58 repetiram esta experiência em culturas de coração de embrião de pombo, mostrando que o efeito inibidor sobre a proliferação celular podia ser revertido pelo tratamento com o soro antitoxina diftérica. Experiências semelhantes foram realizadas por Aronson (1931), Rich & Lewis (1932) com tuberculina e Lasfargue & Delaunay (1946) com as toxinas estafilocócicas, tetânicas e tifoides, mostrando a capacidade do antissoro correspondente de neutralizar a atividade biológica destas toxinas.59-61 Um grande progresso na protozoologia foi também obtido com o emprego desta técnica. Os primeiros estudos foram realizados por Bass & Johns (1912)62 sobre a sobrevivência de Plasmodium vivax e de Plasmodium falciparum em hemácias humanas mantidas em solução salina de Locke acrescida de líquido ascítico. Em seguida tivemos os trabalhos sobre Trichomonas (gallinarium, muris, buccalis e vaginalis) cultivadas em embrião de galinha;63 Toxoplasma (gondii) cultivado em embrião de galinha e de pombo;64,65 e Leishmania (donovani) cultivada em embrião de galinha e de hamster.66 O primeiro trabalho sobre Trypanosoma cruzi foi publicado por Kofoid et al. (1937),67 mostrando o seu cultivo em coração de embrião de rato e de camundongo. Posteriormente, Gavrilov (1940)68 estudou a manutenção de T. cruzi, T. brucei e T. rhodesiense em culturas de baço e de coração de embrião de cobaia. O ciclo evolutivo do T. cruzi foi estudado por Herta Meyer (1942) em culturas de coração, fígado, baço e epitélio de embrião de galinha e em células ganglionares de cérebro de embrião de galinha.69-71 A Virologia foi, sem dúvida, o ramo da Biologia que mais se beneficiou desta técnica, permitindo o isolamento e a caracterização de inúmeros vírus animais. A seguir citamos, em ordem cronológica, os principais vírus estudados pela técnica de cultura de tecido (Tabela 2.1).

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-02.indd 24

05-09-2013 16:59:11

Tabela 2.1 Os principais vírus estudados pela técnica de cultura de tecido

Ano

Vírus

Tecido

Referência

1906

Vacínia

Córnea e conjuntiva de coelho

Aldershoff & Boers, 190672

1913

Vacínia

Córnea de coelho

Steinhardt et al., 191373

1925

Da estomatite vesicular (VSV – vesicular stomatitis virus)

Embrião de galinha

Carrel, 192574

1925

Do herpes simples

Testículo de coelho

Parker & Nye, 192575

1926

Do sarcoma de Rous

Embrião de galinha

Carrel & Ebeling, 192676

1930

Da febre aftosa

Epitélio de cobaio

Hecke, 193077

1932

Da febre amarela

Embrião de galinha

Theiler & Haagen, 193278

1934

Da doença de Newcastle (NDV – Newcastle disease virus)

Embrião de galinha

Topacio, 193479

1934

Do herpes (varicela-zóster)

Embrião de galinha

Glaubersohn & Barg, 193480

1935

Influenza

Embrião de galinha

Francis & Magill, 193581

1935

Da encefalite de Saint-Louis

Cérebro de embrião de camundongo

Syverton & Berry, 193582

1936

Da raiva

Cérebro de embrião de coelho

Kanazawa, 193683

1936

Da poliomielite

Sistema nervoso de embrião humano

Sabin & Olitsky, 193684

1938

Da encefalite japonesa

Fígado e coração de embrião de galinha

Haagen & Crodel, 193885

1948

Do Nilo Ocidental (WNV – West Nile virus)

Embrião de galinha

Koprowski & Lennette, 194686

1948

Da caxumba

Embrião de galinha

Weller & Enders, 194887

1949

Da poliomielite

Diversos tecidos de embrião

Enders et al., 194988

Fonte: adaptada de Penso & Balducci, 1963.89

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-02.indd 25

Cultura de Tecido

05-09-2013 16:59:11

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-00.indd 6

05-09-2013 16:58:41

Biologia das Células em Cultura

MORFOLOGIA A observação por meio de microscópio óptico invertido com contraste de fase é a maneira mais simples e direta de se caracterizar a morfologia das células. Entretanto, convém notar que as células cultivadas in vitro adquirem formas que nem sempre se assemelham àquelas do tecido de origem. De modo geral, as células dos tecidos classicamente caracterizados como epitelial, conjuntivo, muscular e linfático, quando colocadas em cultura, adquirem apenas três formas distintas, denominadas epitelial, fibroblasto e linfoide.1 As células epiteliais apresentam uma forma poligonal, com dimensões regulares e discreta separação entre si, formando geralmente uma única camada celular (Figura 4.1D). Os fibroblastos têm forma bipolar ou multipolar, com grande mobilidade no substrato. Apresentam aspecto fusiforme, formando várias camadas de células (Figura 4.1A a C e E). As células linfoides, ao contrário das células epiteliais e dos fibroblastos, não proliferam aderidas a substrato artificial (Figura 4.1F), embora possuam um crescimento satisfatório em suspensão em forma isolada ou em aglomerados.2 As formas que as células adquirem em cultura decorrem, em parte, da plasticidade morfológica em resposta às condições de cultivo, tais como: composição do meio, tipo de substrato e da fase de crescimento da cultura.3,4 Como exemplos citamos: A linhagem celular humana HeLa, tipicamente epitelial, quando mantida em alta concentração de soro assume uma forma alongada, característica dos fibroblastos.

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-04.indd 55

capítulo

05-09-2013 16:59:38

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

Figura 4.1 (A a F) Morfologia das células em cultura. Aspecto típico de fibroblastos em fase exponencial (A), fibroblastos em fase estacionária (B), células epiteliais (C e D), fibroblastos semiconfluentes, em forma de feixes paralelos (E, ver caderno em cores), células linfoides (F)

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-04.indd 56

05-09-2013 16:59:39

A linhagem celular 3T3 (camundongo) possui a forma de fibroblasto quando mantida em baixa densidade populacional, adquirindo, porém, a forma epitelial quando a cultura se encontra em fase estacionária. Células de rim de hamster (BHK) ou humanas (pulmão e pele) quando subconfluentes, possuem forma de fibroblasto multipolar. Ao alcançarem a confluência, tornam-se bipolares e se distribuem em uma forma alongada de feixes paralelos. Pelos motivos descritos anteriormente, alguns pesquisadores preferem a designação epitelioide e fibroblastoide para distinguir estas formas celulares. Entretanto, apesar do valor limitado, a identificação morfológica das células cultivadas in vitro é ainda de uso corrente nos laboratórios. Atualmente, além da morfologia, outros métodos são utilizados para a identificação e autenticação de determinada linhagem celular, entre os quais incluímos o cariótipo;5 análise de isoenzimas; imunocitoquímica e análise de DNA por enzimas de restrição.4

Migração e inibição por contato A técnica de microcinematografia mostra que as células cultivadas in vitro, particularmente os fibroblastos, se movimentam alcançando distâncias significativas na extensão do substrato. A migração é mais acentuada em culturas com baixo número de células e estimulada pela presença de fatores de crescimento presentes no soro, podendo, entretanto, ser interrompida quando as células fazem contato umas com as outras.6,7 No processo de migração, as células passam da forma achatada para a cúbica, assumindo polaridade morfológica (Figura 4.1A). Apesar de este mecanismo não estar ainda totalmente esclarecido, sabe-se que o movimento celular se faz à custa da formação de lâminas (lamelopódio), que consistem em uma projeção do citoesqueleto e do filamento de actina direcionados para a membrana celular.8 O lamelopódio gerado pela polimerização da actina se estende e adere ao substrato.9 A porção da membrana plasmática situada no lado oposto da célula se retrai, causando o movimento. Quando duas células se encontram, a polaridade é revertida e a migração é modificada para a direção oposta.10,11 Observa-se também que, quando as células atingem a confluência, ocorre parada do movimento e da proliferação celular. Este processo, originalmente descrito

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-04.indd 57

Biologia das Células em Cultura

05-09-2013 16:59:39

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

por Abercrombie & Heaysman (1954), foi denominado inibição do crescimento por contato.12 Posteriormente, observou-se que outros fatores, além do contato entre as células, provocavam a parada da proliferação celular, tais como a diminuição da concentração de nutrientes e de fatores de crescimento do meio de cultura decorrentes do metabolismo celular.11,13-16 De modo geral, as culturas provenientes de tecidos normais (epitelial e fibroblasto) param de crescer ao alcançar a confluência, formando apenas uma camada de células. Em algumas linhagens, entretanto, se o meio de cultura for renovado, a cultura continua a crescer, embora a um ritmo reduzido, formando várias múltiplas camadas de células. As culturas de células transformadas são exemplos de células que geralmente proliferam após a confluência.17

Cromossomos A citogenética humana nasceu com o trabalho fundamental de Tjio & Levan (1956), sobre o número de cromossomos de uma cultura de fibroblastos humanos obtida de tecido embrionário de pulmão.18-20 Descrevemos, a seguir, alguns dados sobre as principais características dos cromossomos das células em cultura. As linhagens celulares provenientes de tecidos normais, quando colocadas em cultura, mantêm a característica euploide. Como exemplo, citamos as células humanas normais que permanecem diploides durante cerca de 50 gerações até atingir a senescência e morte celular.21 Entretanto, as células suscetíveis de serem transformadas (p. ex., de roedores) permanecem euploides somente até a crise. As células que sobrevivem a esta fase formam uma linhagem emergente com característica heteroploide, ou seja, o número de cromossomos e o cariótipo diferem de uma célula para outra. As linhagens heteroploides proliferam formando as culturas com crescimento infinito.2 A maioria das células heteroploides possui um número médio de cromossomos bem maior do que o número haploide da sua espécie. Como exemplo podemos citar as células de camundongo que possuem 40 cromossomos, enquanto a linhagem celular 3T3 (camundongo) tem um número médio de 70. As células humanas normais têm 46 cromossomos, mas as células HeLa, de tumor humano, têm um número médio de cromossomos igual a 66.4 A heteroploidia que acompanha o estabelecimento das células em cultura tem bastante semelhança com a heteroploidia verificada em células tumorais.22

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-04.indd 58

05-09-2013 16:59:39

Na Figura 4.2 mostramos histogramas sobre o número de cromossomos de algumas linhagens celulares, tal com descrito por Kraemer et al. (1971).23 Na linhagem celular WI-38 (célula humana normal, de pulmão), vemos que o número de cromossomos apresenta uma distribuição em uma faixa limitada, que é uma característica das células diploides (Figura 4.2A). Com as células HeLa (de tumor humano), ao contrário, verificamos dispersão, com o número de cromossomos altamente variável de uma célula para outra, tal como poderíamos esperar de uma linhagem heteroploide (Figura 4.2B). Outro exemplo de heteroploidia é a linhagem celular PK-15 (rim de porco) que apresenta uma distribuição cromossômica bimodal, preservada em cultura por vários anos (Figura 4.2C).

CULTURA EM TRÊS DIMENSÕES (3D) A manutenção de uma cultura em monocamadas de células ligadas a um substrato sólido e impermeável (plástico ou vidro) é convencionalmente chamada de cultura em duas dimensões (2D). Sem dúvida, esta técnica tem contribuído enormemente para o conhecimento de diversos aspectos da fisiologia celular, da ação de fármacos e de hormônios e da interação com microrganismos. Nos últimos anos, entretanto, tem havido um interesse crescente pelo estudo desses processos em células cultivadas em ambiente tridimensional. Este modelo de estudo possibilita examinar a célula sob um aspecto morfológico e funcional que, de certo modo, se assemelha às condições existentes no tecido in vivo.24 Nos tecidos de mamíferos, as células se ligam através de uma estrutura complexa, denominada matriz extracelular (ECM – extracellular matrix). Esta estrutura é constituída de macromoléculas (colágeno, elastina, laminina etc.) que formam uma malha supramolecular de nanofibras que preenchem o espaço entre as células. A ECM funciona como um suporte para a manutenção física das células, oferecendo a superfície para a adesão e a migração das mesmas. Além disso, ela forma um reservatório de moléculas e fatores de crescimento responsáveis pela regulação da diferenciação e da função metabólica.4 Quando as células são desagregadas dos tecidos e colocadas em cultura, diversas características inerentes à arquitetura dos tecidos e da interação entre as células se perdem.25 A tecnologia empregada na cultura de células em 3D tem como objetivo restaurar as condições ambientais que as células perdem quando são desagregadas dos tecidos e durante o subcultivo seriado. Para isso as células são embebidas em um meio de cultura cujos componentes fazem parte da ECM.26

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-04.indd 59

Biologia das Células em Cultura

05-09-2013 16:59:39

20 15 10 5 0 30

100

Número de células

Número de cromossomos

8 6 4 2 0 30

100

4N Número de cromossomos

Número de células

8 6 4 2 0 30

40 2N

100

4N Número de cromossomos

Figura 4.2 (A a C) Cromossomos. Histograma mostrando o número de cromossomos de algumas linhagens celulares. Células WI-38 (A). Células HeLa (B). Células PK-15 (C)

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-04.indd 60

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

Número de células

05-09-2013 16:59:39

A Abelson, sarcoma de, 137 Adenovírus, 139 Aflatoxina, 141 - B1, 141 - B1-2,3-epóxido, 141 Alfa-MEM, meio de cultura, 72 Alteração(ões) - celulares, 134 - - em oncogenes - - - celulares, 135 - - - virais, 136 - do DNA, 151 Aminoácidos, 74 - deficiência de, 71

Antibióticos, 75 - usados em cultura de células animais, 76 Antígeno T, 139 - do vírus SV40, 165 Aparelho de George Gey, 102 Arnold, Julius, 3, 5 Aspergillus flavus-oryzae, 141 Avental, uso de, 28 Aves, 137 - eritroblastose de, 137 - mieloblastose de, 137 - mielocitomatose de, 137 Axônio, desenvolvimento do, 10

Amostra celular, 47

Benda, Carl, 2

Ampicilina, 76

Benzopireno, 141

Anfotericina B, 76

Biologia das células em cultura, 55-66

Animais de laboratório, transplante de tumores em, 4

- de órgão, 61 - em três dimensões, 59

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-10-Indice Remissivo.indd 169

Índice Remissivo

05-09-2013 17:00:57

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

- expansão da técnica, 63

Carrel, 28

- morfologia, 55

- frasco de, 23, 95

- - cromossomos, 58 - - migração e inibição por contato, 57

- laboratório de, câmera asséptica utilizada para manutenção das culturas de, 28

Bisturi, 17, 23

Cavalo, 95

Blastocisto, 123

- relação entre longevidade e duplicação celular, 148

Brown, Robert, 1 Burrows-Suzuki, trabalhos de, 24

- soro de, 95 Cavidade peritonial de sapo, células obtidas da, 5 Células, 114

Câmera, 9

- alimentadoras, preparação das, 104

- asséptica utilizada para manutenção das culturas de laboratório de Carrel, 28

- clonagem de, 104

- lúcida, 9 Camundongo, 84 - células de, 112 - - estresse em, 157

- - HeLa, 103 - - L, 97 - contaminadas, 110 - cultura de, 41-54

- efeito do sarcoma 37 de, sobre tecido nervoso de embrião de galinha, 33

- - antibióticos usados em, 76

- fragmentos de tecido subcutâneo de, da cepa C3H, 95

- - - cromossomos, 58

- ovário de, estrogênio em, 22 - relação entre longevidade e duplicação celular, 148 Canamicina, 76 Câncer, estudos sobre o, 4 Canguru, relação entre longevidade e duplicação celular, 148

- - biologia das células, 55-66 - - - de órgão, 61 - - - em três dimensões, 59 - - - expansão da técnica, 63 - - - migração e inibição por contato, 57 - - - morfologia, 55 - - curva de crescimento da, 47 - - meios de, de insetos, 81

Cão, tecido de linfossarcoma de, 4

- - obtenção das células, 41

Capilar, 100

- - - ciclo cultural, 46

Capuz, uso de, 28

- - - cultura primária, 44

Carboidratos, 75

- - - interação com o substrato, 45

Carcinoma embrionário, células-tronco e, 119

- - - linhagens celulares com crescimento finito, 50

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-10-Indice Remissivo.indd 170

170

05-09-2013 17:00:57

171

- - - linhagens celulares com crescimento infinito, 52

- multinucleadas, 5

- - - subcultivo, 48

- PK-15, 60

- - técnica de, 63

- proliferação de, ligadas ao substrato, 45

- - terminologia, 41

- sobreviventes, 52

- de camundongo, 112

- somáticas, 121

- - estresse em, 157 - de embrião de galinha, 92 - de hamster, 112 - de macaco, 111 - de porco, 114 - de rato, 113 - de roedores, 112 - de tumores, 116 - epiteliais, 56, 156 - HeLa, 60, 101 - - clonagem das, 103

- obtidas da cavidade peritonial de sapo, 5

- WI-38, 60 Células-tronco, 118 - e carcinoma embrionário, 119 - embrionárias, 119 - - cultivo de, 123 - isolamento, 120 - - e manutenção, 119 - - método de, 120 - origem das, 121 - pluripotentes, 121

- - indução de, 123 - - linhagens celulares consideradas Centrifugação, 43 provenientes de tumores humanos, mas que apresentam características de, 110 Cepa(s), 95 - - pesquisas com as, 106

- C3H, fragmentos de tecido subcutâneo de camundongo da, 95

- - problemas de contaminação, 107

- isolamento das, 108

- humanas, 156

- S1, 108

- - estresse em, 156

- S2, 108

- - normais, 114

- S3, 108

- isolamento das, 99, 104

Ciclinas, ação das, 153

- L, 93

Ciclo, 46

- - clonagem das, 97

- celular, 153

- L-A9, 84

- cultural, 46

- linfoides, 56

Cinase, enzima, 153

- montagem para análise das, 99

Ciprofloxacino, 76

- mortas, 15

Citocromo P-450, 141

- - monocamadas de, 105

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-10-Indice Remissivo.indd 171

Índice Remissivo

05-09-2013 17:00:57

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

Citologia, período heroico da, 2

- - em três dimensões, 59

Clonagem de células, 104

- - expansão da técnica, 63

- HeLa, 103

- - morfologia, 55

- L, 97

- - - cromossomos, 58

Coagulação do plasma, 23

- - - migração e inibição por contato, 57

Coelho, relação entre longevidade e duplicação celular, 148

- crescimento das células, curva de, 47

Compostos, 77

- - ciclo cultural, 46

- atividade cancerígena de alguns, 141

- - interação com o substrato, 45

Contaminação de células HeLa, problemas de, 107

- - linhagens celulares com crescimento, 52

Cortisol, 22 Crescimento, 137 - da(s) cultura(s), 102 - - de células, curva de, 47 - - de tecido, 19 - - - determinação do, pelo método micrométrico, 20 - - - determinação do, pelo método projetoscópio, 21 - - em tubo de ensaio, 102 - de fibra nervosa de embrião de sapo, 11

- obtenção das células, 41

- - - finito, 50 - - - infinito, 52 - - primária, 44 - - subcultivo, 48 - técnica de, 63 - - número de publicações relacionadas com a, 64 - terminologia, 41 Cultura de tecido, 7-40 - aplicação, 22 - conjuntivo, 15

- fator(es) de, 79, 137

- crescimento, 19

- linhagens celulares com, 52

- - determinação do, 21

- - finito, 50

- - - pelo método micrométrico, 20

- - infinito, 52

- - - pelo método projetoscópio, 21

Cromossomos, 58

- histórico, 7

- histograma mostrando o número de, de algumas linhagens celulares, 60

- manutenção da cultura, 15

Cultura de células, 41-66

- morfologia, 14

- antibióticos usados em, 76

- nutrição, 17

- biologia das células, 55-66

- técnica de

- - de órgão, 61

- - desenvolvimento da, 12

- - e passagem, 17

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-10-Indice Remissivo.indd 172

172

05-09-2013 17:00:58

- - difusão da, no mundo, 26

- cancerígeno, 141

- - - América do Sul, 30

- citopático, 71

- - - EUA, 27

Elementos inorgânicos, íons e, 74

- - - Europa, 26

Embrião(ões), 15

- - principais vírus estudados pela, 25

- de galinha, 13

- trabalho de Harrison, 7

- - células de, 92

Cultura, meios de (v. Meio[s] de cultura)

- - efeito do sarcoma 37 de camundongo sobre tecido nervoso de, 33

- - extrato de, 95

Deficiência de aminoácidos, 71

- - - preparação do, 18

Desagregação, 42

- - observação ao microscópio de tecido de, 15

- enzimática, 43

- - tecido ganglionar de, 33

- mecânica, 42

- de sapo, 10

Desenvolvimento do axônio, 10

- - crescimento de fibra nervosa de, 11

Diol-epóxido, 141

- - sistema nervoso de, 10

DNA, 141

Enders, 11

- alteração do, 151 - molécula do, 141

Ensaio, tubo de, crescimento das culturas em, 102

- vírus de, interação de proteínas de, com

Envelhecimento celular, 147

os fatores de supressão tumoral, 139

Enzima, 141

Drosophila melanogaster, 11

- cinase, 153

Dulbecco, meio de cultura de, modificado

- citocromo P-450, 141

por Iscove, 72 Duplicação celular, relação entre longevidade e, 148

Epóxi 7,8 óxido, 141 Eritroblastose de aves, 137 Eritromicina, 76 Erlenmeyer (recipiente), 43 Estreptomicina, 76

Eagle, 71

Estresse, 157

- meio de cultura de, 69

- e senescência, 151

- - modificações do, 71

- - alteração do DNA, 151

Earle, sais de, solução com, 73

- - oncogenes, 152

Efeito, 71

- - oxidativo, 152

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-10-Indice Remissivo.indd 173

173

Índice Remissivo

05-09-2013 17:00:58

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

- em células de camundongo, 157 Estrogênio, 22 Estudo(s), 15 - de Margareth Lewis, 15 - de Warren Lewis, 15 - primeiros estudos, 1-6 - - impacto da teoria celular, 1 - - os pioneiros, 2 Estufa, 17 Extrato de embrião de galinha, 95 - preparação do, 18

G Galinha, 15 - colocação de plasma na, 23 - embrião de, 13 - - células de, 92 - - efeito do sarcoma 37 de camundongo sobre tecido nervoso de, 33 - - extrato de, 95 - - - preparação do, 18 - - observação ao microscópio de tecido de, 15 - - tecido ganglionar de, 33 - plasma de, 23, 61, 95

Fator(es), 139

Gânglio linfático de rato, 22

- de crescimento, 79, 137

Gene(s), 141

- de supressão tumoral, interação de proteínas de vírus de DNA com os, 139

- da telomerase humana, 156

Fibra nervosa de embrião de sapo, crescimento de, 11 Fibroblastos, 5, 156 - em fase estacionária, 56 - em fase exponencial, 56 - semiconfluentes, em forma de feixes paralelos, 56 Fixação, parafuso para, 9 Flexner, Simon, 12

- p53, 141 - T do vírus SV40, 165 - virais, expressão de, 162 Gentamicina, 76 George Gey, aparelho de, 102 Golgi, Camilo, 2 Golgi, aparelho de, 2 Gota pendente, técnica da, 33

Fontana, Felice, 1

Ham, meio de cultura da, 72

Fragmentos de tecido subcutâneo de camundongo da cepa C3H, 95

Hamburger, V., 3

Frasco de Carrel, 23, 95

Hanks, sais de, solução com, 73

Fungo Aspergillus flavus oryzae, 141

Harrison, trabalho de, e cultura de tecido, 7

Fujiname, sarcoma, 137

Hamster, células de, 112

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-10-Indice Remissivo.indd 174

174

05-09-2013 17:00:58

Harvey, sarcoma felino, 137 Hidrocarboneto aromático policíclico, 141 - com ação cancerígena, 94 Hidrolisados de proteínas, 77 Homem, relação entre longevidade e duplicação celular, 148

L L-15, meio de cultura, 72 Laboratório, 4 - de Carrel, 28 - transplante de tumores em animais de, 4

Hooke, Robert, 1

Lambert-Hanes, trabalhos de, 14

Hormônios, 79

Lâmina escavada, 13

HPV, 139

175

- estéril, 8 Lamínula, 17, 33, 106 Lasnitzki, trabalhos de, 23

Imortalização, 161-167

Leeuwenhoek, Anton van, 1

- expressão da telomerase, 161

Lentes de aproximação, 9

- expressão de genes virais, 162 - métodos para, 163

Leucócitos mantidos in vitro após migração para a solução salina, 5

Infecção viral, 71

Lewis, Margareth, 15

Insetos, meios de cultura de células de, 81

Lewis, Warren, 15

Insulina, 22 Íons e elementos inorgânicos, 74 Iscove’s modified Dulbecco’s medium, 72 Isolamento, 119 - de células, 99, 104 - de células-tronco, 120 - - e manutenção, 119 - - método de, 120 - de cepas, 108

J Jolly, trabalho de, 4

Linfa, tecido e, de sapo, 8 Linfossarcoma de cão, tecido de, 4 Linhagem(ns) celular(es), 44, 91-132 - células, 111 - - de embrião de galinha, 92 - - de macaco, 111 - - de porco, 114 - - de roedores, 112 - - - de camundongo, 112 - - - de hamster, 112 - - - de rato, 113 - - de tumores, 116 - - HeLa, 101 - - - clonagem das, 103

Kirsten, sarcoma murino, 137

- - - pesquisas com as, 106

Kolliker, Albert, 1

- - - problemas de contaminação, 107

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-10-Indice Remissivo.indd 175

Índice Remissivo

05-09-2013 17:00:58

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

- - humanas normais, 114

Massa celular, 123

- - L, 93

McCoy 5A,72

- - - clonagem das, 97

MCDB, meio de cultura da série, 73

- células-tronco, 118

Medula óssea, L-tirosina em, 22

- - do carcinoma embrionário, 119

Meio(s) de cultura, 67-90

- - embrionárias, 119

- componentes dos, 73

- - isolamento, 120

- - aminoácidos, 74

- - - e manutenção, 119

- - antibióticos, 75

- - - método de, 120

- - carboidratos, 75

- - pluripotentes, 121

- - compostos, 77

- - - indução de, 123

- - hidrolisados de proteínas, 77

- com crescimento, 52

- - íons e elementos inorgânicos, 74

- - finito, 50

- - soluções salinas, tipos de, 73

- - infinito, 52

- - vitaminas, 75

- histograma mostrando o número de cromossomos de algumas, 60

- composição do soro, 78

- obtidas de tecidos, 91 - - neoplásicos com crescimento infinito, 92

- - fatores de crescimento, 79 - - hormônios, 79 - - proteínas, 78

- - normais com crescimento, 92

- hipertônico, 84

- - - finito, 91

- isentos de soro, 79

- - - infinito, 92

- isotônico, 84

Ljunggren, trabalhos de, 4

- naturais, 67

Loeb, Leo, 4

- para células de insetos, 81

Longevidade, relação entre, e duplicação celular, 148

- propriedades físico-químicas, 83

L-tirosina em medula óssea, 22

- - pressão osmótica, 83

- - pH, 85 - - tamponamento, 86 - - temperatura, 85

Macaco, células de, 111

- - tensão de oxigênio, 83

Macrófagos, 5

- sintéticos, 68

Maloney, sarcoma murino, 137

- - alfa-MEM, 72

Malpighi, Marcello, 1

- - da série MCDB, 73

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-10-Indice Remissivo.indd 176

176

05-09-2013 17:00:58

- - de Dulbecco modificado por Iscove, 72 - - de Eagle, 69 - - - modificações do, 71 - - de Ham, 72

177

N Nistatina, 76 Nitrato de prata, 33 Nutrição, 17

- - de McCoy 5A, 72 - - L-15, 72 - - RPMI-1640, 73 Mendel, trabalhos de, 11 Metilcolantreno, 94 - ação do, 95

O Okabe-Teruuchi, trabalhos de, 24 Oncogenes, 152 - celulares, 135 - dos retrovírus, 137

- - transformação celular por, 96

- virais, 136

- estrutura química do, 94

Organelas, 2

Método(s) (v.t. Técnicas) - de isolamento de células-tronco, 120

Órgãos, técnicas usadas para cultura de fatias de, 63

- determinação do crescimento da

Osteossarcoma murino FBJ, 137

cultura de tecido pelo método, 21 - - micrométrico, 20

Ovo embrionado, 13 Oxigênio, tensão de, 83

- - projetoscópio, 21 - para imortalização, 163

Micrômetro, 20

Papilomavírus humano (v. HPV)

Micropipeta, componentes da, 98

Parafina, 17

Microscópio de dissecção, 99

- vedação com, 8

Mieloblastose de aves, 137

Parafuso para fixação, 9

Mielocitomatose de aves, 137

Pasteur, pipeta, 108

Migração celular, 20

Penicilina G, 76

Mitocôndria, 2

Pesquisas com células HeLa, 106

Molécula do DNA, 141

pH, 85, 99

Molecular, cellular and developmental

Pinça, 23

biology (v. MCDB) Morcego, relação entre longevidade e duplicação celular, 148 Morgan, Thomas Hunt, 11

Pirimidinas, 77 Placa de Petri, 13, 42, 61, 99, 106 - estéril, 23 Planimetria, 21

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-10-Indice Remissivo.indd 177

Índice Remissivo

05-09-2013 17:00:58

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

Plasma, 15

- células de, 113

- coagulação do, 23

- gânglio linfático de, cortisol em, 22

- de galinha, 61, 95

- relação entre longevidade e duplicação celular, 148

- - colocação de, 23 - envelhecido, 15 Plasmídio, 164 Plasmodium, 24 Porco, células de, 114 Prata, nitrato de, 33 Pressão osmótica, 83 Projetoscópio, 21 Proliferação celular, 154 Proteína(s), 78 - celulares, 84 - de vírus de DNA, interação de, com os fatores de supressão tumoral, 139 - E1A, 139 - E1B, 139 - E6, 139 - E7, 139 - hidrolisados de, 77

- sarcoma de tireoide de, 4 Relógio, vidro de, uso do, 61 Remak, Robert, 1 Retículo endoplasmático, 2 Reticuloendoteliose T, 137 Retrovírus, principais oncogenes dos, 137 Ribbert, Hugo, 4 Ringer, solução de, 17 Robins, 11 Roedores, células de, 112 - de camundongo, 112 - de hamster, 112 - de rato, 113 Roswell Park Memorial Institute (v. RPMI1640) Rous, sarcoma de, 137 Roux, Wilhelm, 2 RPMI-1640, meio de cultura, 73

- p19, 157 - p21, 153 - p53, 139, 153, 157 - Rb, 139, 154 Protozoologia, 24 Purinas, 77

S Sais, solução com, 73 - de Earle, 73 - de Hanks, 73 Sapo, 11 - células obtidas da cavidade peritonial de, 5

Radiação, transformação por substâncias químicas e, 139

- embrião de, 10

Rato, 148

- - sistema nervoso de, 10

- - crescimento de fibra nervosa de, 11

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-10-Indice Remissivo.indd 178

178

05-09-2013 17:00:58

- tecido e linfa de, 8

Solução(ões), 13

Sarcoma, 33

- de Ringer, 17

- aviário, 137

- de tripsina, 43

- de Abelson, 137

- salina, 13

- de camundongo, 14 - de rato, 14

- - leucócitos mantidos in vitro após migração para a, 5

- - de tireoide, 4

- - salina-glicose, 95

- de Rous, 137

- - tipos de, 68, 73

- efeito do sarcoma, 37 de camundongo sobre tecido nervoso de embrião de galinha, 33

Soro, 78

- felino, 137 - - Harvey, 137 - - McDonough, 137 - Fujiname, 137 - murino, 137 - - Kirsten, 137 - - Maloney, 137 - símio, 137 Schleiden, M. J.,1 Schwann, T., 1 Senescência, 147-160 - controle da, 152 - curva de, 51

- composição do, 78 - - fatores de crescimento, 79 - - hormônios, 79 - - proteínas, 78 - de cavalo, 95 - leucócitos mantidos em, 4 - meios de cultura isentos de, 79 Spallanzani, Lazzaro, 1 Subcultivo, 50 Substrato, proliferação de células ligadas ao, 45 Supressão tumoral, fatores de, interação de proteínas de vírus de DNA com o, 139

- encurtamento dos telômeros, 148

- - telomerase, 149

Tamponamento, 86

- envelhecimento celular, 147

Tecido(s), 8

- estresse e, 151

- cultura de, 7-40

- - alteração do DNA, 151

- - aplicação, 22

- - oncogenes, 152

- - conjuntivo, 15

- - oxidativo, 152

- - crescimento da, 19

- modelo de estudo, 154

- - - determinação do, pelo método micrométrico, 20

Sistema nervoso de embrião de sapo, 10

179

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-10-Indice Remissivo.indd 179

Índice Remissivo

05-09-2013 17:00:58

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

- - - determinação do, pelo método projetoscópio, 21

- de cultura de tecido, 30

- - histórico, 7

- - difusão da, no mundo, 26

- - manutenção da cultura, 15

- - - América do Sul, 30

- - - e passagem, 17

- - - EUA, 27

- - morfologia, 14

- - - Europa, 26

- - nutrição, 17

- - principais vírus estudados pela, 25

- - técnica de, 26

Telomerase, 149

- - - desenvolvimento da, 12

- expressão da, 161

- - - difusão da, no mundo, 26

- humana, gene da, 156

- - - principais vírus estudados pela, 25

Telômeros, 150

- - trabalho de Harrison, 7

- encurtamento dos, 148

- de embrião de galinha, 33

Temperatura, 85

- - ganglionar, 33

Teoria, 1

- - observação ao microscópio de, 15

- celular, impacto da, 1

- de linfossarcoma de cão, 4

- neuronal, 9

- e linfa de sapo, 8

Tetraciclina, 76

- in vitro, 2

Tireoide, sarcoma de, de rato, 4

- neoplásicos, 92

Touca, uso de, 28

- nervoso, efeito do sarcoma 37 de camundongo sobre, 33

Toxinas bacterianas, 24

- normais, linhagens celulares obtidas de, 92

Trabalho(s), 4

- - com crescimento, 92 - - - finito, 91 - - - infinito, 92 - subcutâneo, fragmentos de, de camundongo da cepa C3H, 95

- - desenvolvimento da, 12

Toxoplasma gondii, 24 - de Aronson, 24 - de Burrows-Suzuki, 24 - de Enders, 11 - de Harrison e cultura de tecido, 7 - de Jolly, 4

Técnica(s) (v.t. Método[s])

- de Lambert-Hanes, 14

- da gota pendente, 33

- de Lasnitzki, 23

- de cultura de células, 63

- de Levaditi-Muttermilch, 24

- - número de publicações relacionadas com a, 64

- de Ljunggren, 4 - de Mendel, 11

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-10-Indice Remissivo.indd 180

180

05-09-2013 17:00:58

apresentam características de células HeLa, 110

- de Okabe-Teruuchi, 24 - de Robins, 11 - de Thomas Hunt Morgan, 11 - de Weller, 11 Transformação, 133-145 - alterações celulares, 134

181

- transplante de, em animais de laboratório, 4

- - oncogenes, 136

Vedação com parafina, 8

- - - celulares, 135

Vidro de relógio, uso do, 61

- - - virais, 136

Virchow, Rudolf, 1

- conceito, 133

Virologia, 24

- por substâncias químicas e radiação, 139

Vírus, 165

Transplante de tumores em animais de laboratório, 4

- de DNA, proteínas de, interação de, com os fatores de supressão tumoral, 139

Trichomonas, 24

- estudados pela técnica de cultura de tecido, principais, 25

Tripsina, 106 - solução de, 43 Trofectoderme, 123 Trofoblasto, 123 Trypanosoma, 24 Tubo de ensaio, crescimento das culturas em, 102 Tumores, 116 - células de, 116 - humanos, linhagens celulares consideradas provenientes de, mas que

- gene T do, 165 - HPV, 139 - SV40, 139 Vitaminas, 75 Vidro, placa de, estéril, 17 Vochtig, botânico alemão, 2

W Weller, 11 Wollaston, William Hyde, 8

Fundamentos da Cultura de Tecido e de Celulas Animais - cap-10-Indice Remissivo.indd 181

Índice Remissivo

05-09-2013 17:00:58

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais descreve as principais experiências que alicerçaram as técnicas que possibilitaram o advento de novas áreas de conhecimento da Biologia.

Fundamentos da Cultura de Tecido e Células Animais

Outros Títulos de Interesse Protozoologia Médica Wanderley de Souza (Org.)

Psicobiologia do Comportamento Alimentar Sebastião de Sousa Almeida / Telma Maria Braga Costa / Maria Fernanda Laus / Gisele Straatmann

Fundamentos da

Cultura de Tecido e Células Animais

Esquistossomoses Humanas Rodrigo Siqueira-Batista / Andréia Patrícia Gomes / Luzidalva Barbosa de Medeiros / Alberto Novaes R. Júnior / Fernando Schemelcer de Moraes Bezerra

Redação de Trabalhos Acadêmicos nas Áreas das Ciências Biológicas e da Saúde Haroldo Ferreira

Bizu de Biologia – 2.700 Questões Selecionadas para Concursos Leonardo da Silva Vidal / Marco Pinheiro Gonçalves / Mildred Ferreira Medeiros / Tatiana Amorim M. de Alencar

Manual de Comportamento Animal Marcos Rochedo Ferraz

MOACYR ALCOFORADO REBELLO

Ciências Biológicas Microbiologia

MOACYR A. REBELLO

Áreas de interesse

Saiba mais sobre estes e outros títulos em nosso site: www.rubio.com.br

9 788564 956636

CAPA – Fundamentos da Cultura de Tecido.indd 1

26/09/2013 17:45:28