Obtención y evaluación del semen bovino. Una puesta al día

Carolina Tamargo de Miguel1, Carlos O. Hidalgo Ordóñez2, Ángel Fernández García3 y María José Merino Hernantes4

1Investigadora del Área de Selección y Reproducción Animal del Servicio Regional de Investigación y Desarrollo Agroalimentario (Serida) 2Jefe del Área de Selección y Reproducción Animal del Serida 3Ayudante técnico del Área de Selección y Reproducción Animal del Serida 4Ayudante técnico de Asturgen SL

Contacto con los autores: Carolina Tamargo: ctamargo@serida.org; Carlos O. Hidalgo: cohidalgo@serida.org.

Resumen

La utilización del semen bovino congelado es la principal biotecnología reproductiva para la mejora genética (Freitas y cols., 2009). De este modo, la valoración de la calidad seminal representa un componente fundamental en los programas de reproducción animal, dada la importancia que tiene en las tasas de fertilización (Phillips y cols., 2004). El principal objetivo del proceso de crioconservación del semen es preservar eficientemente las células espermáticas con su capacidad completa para fertilizar, aunque durante dicho proceso se producen daños en el espermatozoide, que van desde lesiones letales, hasta aquellas que solo alteran su función posterior. En los centros de colecta, envasado y congelación de dosis seminales, se albergan los mejores ejemplares de cada raza bovina y en este trabajo se describen las técnicas de recolección de semen y de evaluación de los eyaculados más comúnmente usadas en el laboratorio de producción de dosis bovinas congeladas.

Palabras clave: semen bovino, calidad seminal, análisis laboratorial.

Abstract

Collection and evaluation of bovine semen. An update

The use of frozen bovine semen is the main reproductive biotechnology for genetic improvement (Freitas et al., 2009). Thereby, the assessment of semen quality represents a main component in animal breeding programs, given its importance in fertilisation rates (Phillips et al., 2004). The primary objective of the semen cryopreservation process is to efficiently preserve the sperm cells with their full capacity to fertilise, although damage to the sperm occurs during this process, ranging from lethal lesions to those that only alter their subsequent function. In the semen collection, packaging and freezing centers, the best specimens of each bovine breed are housed, and this paper describes the semen collection and ejaculate evaluation techniques most commonly used in the laboratory for the production of frozen bovine doses.

Keywords: bovine semen, seminal quality, laboratory analysis.

MÉTODOS DE OBTENCIÓN DE SEMEN BOVINO

La obtención del semen es el primer paso dentro de un programa de congelación, preservación e inseminación artificial (IA). Esta fase es fundamental para conseguir eyaculados de calidades óptimas, así como para el adecuado aprovechamiento de los sementales.

Vagina artificial

El método más comúnmente empleado en la mayoría de las especies domésticas, incluida la bovina, es la obtención del semen mediante el uso de la vagina artificial (VA), lo cual permite la colecta de eyaculados limpios y de buena calidad, si bien está condicionada por una fase previa de entrenamiento. Antes de la recogida de semen se deben tener en cuenta dos aspectos importantes: la higiene y el estímulo del semental (Galina y Valencia, 2009). Previamente a la monta, se deberá lavar con agua y secar perfectamente el vientre y la zona del prepucio; el mechón de pelos del orificio prepucial estará limpio y los pelos se cortarán a una longitud aproximada de 2 cm.

La vagina artificial consta de (figura 1): ■ Un cuerpo cilíndrico semirrígido con dos aberturas laterales, que está atravesado por un tapón con rosca para meter agua. ■ Una camisa o revestimiento interno de goma elástica y cilíndrica, con una longitud un poco mayor que el cuerpo, ya que va por la luz del mismo y se ha de revertir en los bordes, limitando una cavidad para alojar el agua (debe ser impermeable para evitar el daño a la biología espermática). ■ Un colector de esperma, de vidrio reutilizable o de plástico desechable, graduado y transparente para la evaluación directa del eyaculado, que está unido a la VA por medio de un intermediario (suele ser un cono de látex). ■ Una funda externa que recubre la VA y el colector, para proteger del frío y de la luz directa. En la cámara interna de la VA se introduce agua a aproximadamente 50 °C, siendo fundamental que, tanto la temperatura, como la presión que ejerce el agua, sean las adecuadas e idóneas, asemejando con ello las condiciones que se dan en la monta natural lo máximo posible (se tiende a temperaturas entre 39 y 43 °C), para que el semental eyacule y la calidad del semen sea la mejor. En animales de mayor edad suele ser necesario que las temperaturas sean más altas que en los más jóvenes. De la misma manera, el personal encargado de la recogida suele conocer las preferencias individuales de algunos de los toros, con el fin de conseguir unos parámetros de calidad seminal (sobre todo, volumen y concentración) óptimos. La lubrificación de la VA con un lubricante no espermicida siempre es recomendable. El lubricante se aplica con una varilla de cristal que rota sobre la camisa en dos tercios de su longitud, para impedir que entre en el colector, si bien existen modelos que, además, llevan en la camisa unas rugosidades destinadas a un mayor estímulo peneano.

Electroeyaculador

Otro método empleado comúnmente cuando no es posible el adiestramiento previo para la recogida del semen de toros es la electroeyaculación. Se utilizan distintos equipos, pero todos los modelos constan de una sonda que colocada vía rectal emite una serie de estímulos eléctricos de bajo voltaje y de intensidad creciente a los nervios pélvicos, mediante el empleo de uno o más electrodos. El voltaje necesario para la colecta varía con el toro, así como los síntomas colaterales que pueden manifestarse, como es la contracción muscular generalizada. Esta técnica presenta algunos inconvenientes, como la contaminación del semen con orina y la variabilidad seminal de los eyaculados obtenidos. En ocasiones, para disminuir el grado de los síntomas que manifiestan algunos toros ante el estímulo recibido por la electroeyaculación, se han probado dos estrategias de acompañamiento: la anestesia epidural y la sedación (GarcíaPaloma y cols., 2021).

Masaje rectal

Por último, cabe mencionar la colecta de semen por masaje rectal. Esta técnica consiste en aplicar vía rectal un masaje con movimientos cráneo-caudales de los dedos índice, medio y anular sobre las ampollas del conducto deferente. El semen se libera desde las ampollas y se exterioriza goteando a través del prepucio, al no acompañarse generalmente de erección (Palmer y col., 2005), hay autores que consideran el semen colectado por masaje rectal como una emisión más que como una verdadera eyaculación (Kastelic, 2014). En los centros de IA se emplea de manera rutinaria la VA; excepcionalmente, en casos muy concretos, como pueden ser toros con problemas físicos que les impiden realizar la monta, animales jóvenes o mal entrenados que se niegan a saltar, se puede utilizar el electroeyaculador.

1 Figura 1. Elementos de la vagina artificial.

4 5

1. Intermediario

2. Tubo colector

3. Válvula

4. Cuerpo

5. Funda protectora

6. Camisa

6 2

3

RÉGIMEN DE SALTOS

La recogida de semen en los toros adultos suele realizarse dos veces a la semana, con un intervalo de 3-4 días entre los dos días de la monta. El método más efectivo para estimular al toro es la falsa monta, que consiste en permitir al semental montar sobre un señuelo (hembra, macho o maniquí) y desviar el pene tomando con la palma de la mano la piel del prepucio sin ofrecerle la vagina. Después de varios segundos de intento de búsqueda de la vagina, el animal desciende; nunca se deberá tocar con la mano la mucosa del pene. En el siguiente intento de monta, la persona a cargo de la recolección desvía el pene del toro a la VA, la cual se mantiene paralela al flanco de la hembra y, al tener contacto con la superficie tibia y lubrificada, el toro eyacula. En ese momento, la VA debe inclinarse hacia abajo, en dirección al tubo colector (figura 2). La monta falsa en el bovino aumenta la calidad del semen en cuanto a volumen, concentración espermática y motilidad (Galina y Valencia, 2009). En cada día de recogida, en toros adultos, se pueden colectar dos eyaculados con un intervalo de 20 minutos entre cada monta y en animales jóvenes dos recogidas semanales de un eyaculado o tres colectas cada dos semanas (Corteel, 1977; Salisbury y cols., 1978). Se ha observado también que el rendimiento eyaculatorio de los sementales se eleva cuando se encuentran ya en el establo sometidos a ciertas excitaciones sexuales, siendo de gran interés en este sentido la visión a través del box de la zona de colecta y la apreciación de olores, mugidos, etc., de animales próximos.

MÉTODOS DE EVALUACIÓN DEL SEMEN BOVINO: PARÁMETROS DE PRODUCCIÓN SEMINAL

El análisis seminal o espermiograma incluye una serie de pruebas que evalúan diversos factores cinéticos, morfológicos o bioquímicos de la célula espermática, pudiendo calificar la muestra como apta o no apta para su uso en IA y que pueda ser correlacionado con la fertilidad. Sin embargo, las técnicas de contrastación del semen, especialmente en la rutina de producción de dosis seminales, deben ser precisas, sencillas, rápidas y económicas, de ahí el interés de la industria y los especialistas en desarrollar métodos con esas características de evaluación in vitro del semen bovino. Parece ser, por lo visto por diferentes autores, que hay evidencias de que los análisis de laboratorio de rutina están correlacionados con la fertilidad de manera modesta, ya que las pruebas de laboratorio corrientes no son capaces de dar más que una estimación, no tanto una predicción, de la fertilidad de una muestra de semen de un semental. A pesar de que la correlación entre estos parámetros y la fertilidad no es definitiva, sí ofrecen información válida acerca de la calidad seminal, ya que, si una muestra de buena calidad seminal puede no siempre ser fértil, una de baja calidad rara vez lo será (Hidalgo y cols., 2005).

Figura 3. Espetrofotómetro Acucell® (IMV Technologies, Francia).

El método más ampliamente usado de calidad seminal desde los inicios de la IA hasta el presente ha sido la determinación de la proporción de espermatozoides normales, con movimiento progresivo (Anderson, 1945), siendo fundamental el uso de un buen microscopio. Actualmente, el análisis seminal clásico ha mejorado mediante la introducción de nuevas técnicas analíticas procedentes de otros campos de la investigación científica. Así, el estudio de la motilidad espermática, la concentración espermática y las anomalías morfológicas que anteriormente se hacían de una manera subjetiva, pueden realizarse hoy en día mediante el uso de métodos computerizados de análisis (Davis y Katz, 1993; Holt, 1996). La implementación de estos métodos informáticos atenúa en gran parte el factor subjetivo del análisis seminal y garantiza una mejor correlación con la capacidad fecundante del espermatozoide (Jasko y cols., 1992). Tras la obtención del semen, se realiza una primera valoración de la calidad seminal atendiendo a las características de color, volumen, concentración espermática y motilidad. Los dos componentes críticos de la evaluación del eyaculado son su volumen y concentración, ya que de ellos depende el número total de espermatozoides obtenido por eyaculado, debiendo calcularse de forma precisa, ya que de estos dos parámetros va a depender el número de dosis seminales que pueden elaborarse a partir de un eyaculado.

Color

El color del semen es el primer factor que se valora y se debe hacer en el mismo tubo colector, inmediatamente tras su obtención. Un semen de buena calidad presenta un color blanco lechoso o bien cremoso y uniforme, indicativo de la alta concentración de células espermáticas (Bhattacharyya y cols., 2009), mientras que las muestras translúcidas contienen pocos espermatozoides. Debe desecharse el semen con aspecto lechoso o con fragmentos de material, pues ello indica infección en el aparato reproductor, así como las coloraciones rojas o marrones, indicativas de la presencia de sangre roja o hemolizada. Además, debe estar libre de pelos, suciedad y otros contaminantes. Según Ax y cols. (2000), los toros pueden producir semen de color amarillo, debido a la presencia inocua de riboflavina, que no debe confundirse con un color amarillento por presencia de orina, la cual tiene un olor característico.

Volumen

El volumen es una apreciación que debe realizarse inmediatamente después de la colecta y ha de referirse a una sola eyaculación, evitando la mezcla en el colector de más de un eyaculado o residuos de la eyaculación anterior. Puede calcularse mediante pesada y transformación posterior de este valor mediante el factor de densidad correspondiente, que es de 1,0 (Foote, 2002; Brito y cols., 2002; Contri y cols., 2010) o por lectura directamente en un tubo graduado. Se trata de un parámetro que presenta una baja repetitividad y en el toro existen amplias variaciones de volumen relacionadas con varias circunstancias, entre las que figura la edad del semental, raza (en general los sementales de razas lecheras suelen tener mayores volúmenes en los eyaculados que las cárnicas), momento y frecuencia de la colecta, época del año, alimentación y grado de excitación sexual en que se encontraba el semental antes de la recogida, además de factores ambientales como la experiencia y destreza del operario responsable (Hafez, 2002). El volumen de los eyaculados de los toros, según los datos publicados por distintos autores es muy variable; Hunter (1987) señala entre 4 y 8 ml, Stalhammar y cols. (1989), entre 5 y 5,5 ml; Marín (1994) entre 2 y 12 ml; Christensen y cols. (1999) reporta volúmenes de 5,1 y 4,1 para las razas Holstein y Jersey respectivamente; Brito y cols. (2002) de 8,2 ml; Asad y cols. (2004) de 14,26 ml; Fuerst-Walt y cols. (2006): 4,8-7,0; Muiño y cols. (2009) de 5,1 ml y Galina y Valencia (2009) de 2 a 10 ml Como norma, volúmenes de 4 a 8 ml en toros sometidos a 3-4 eyaculados por semana pueden considerarse como normales.

Concentración espermática

El conocimiento preciso de la concentración espermática es fundamental en cualquier centro de IA, ya que las dosis seminales deben contener un número mínimo de espermatozoides que aseguren una fertilidad óptima, lo que requiere sistemas de recuento de gran exactitud y precisión, existiendo una variabilidad muy grande en la concentración de un eyaculado a otro, y de un toro a otro. La concentración puede calcularse por varios métodos a partir de la muestra de semen: la espectrofotometría, la colorimetría, la citometría de flujo y el uso de cámara de recuento celular, como las de Bürker, Neubauer o Thoma (Woelders, 1997; Hafez, 2002; Noakes y cols., 2001). La espectrofotometría es un método indirecto que trata de medir la luz monocromática absorbida por las partículas en suspensión o los espermatozoides. Dicha medición de la densidad óptica de la muestra es comparada frente a la curva estándar patrón previamente validada y permite, así, conocer el número de espermatozoides, siendo el método más usado en los centros de producción de dosis seminales (figura 3). Existe una alta correlación significativa entre el número de espermatozoides inseminados y la fertilidad del toro (Shannon y Vishwanath, 1995). La presencia de un mayor número de espermatozoides, siempre y cuando sus características sean normales, incrementa la posibilidad de fertilización (Amman y Hammerstedt, 2002). Este aspecto es crucial en el caso de los toros con baja concentración espermática, o en los casos en que se utiliza semen descongelado, que ha sido diluido y sometido a estrés durante el proceso de congelación-descongelación, provocando un daño irreversible en un porcentaje elevado de espermatozoides (Januskauskas y cols., 2003). La fertilidad de un toro usado en IA, entre otras razones, dependerá básicamente del número de espermatozoides normales que se utilicen al inseminar. Sin embargo, cada animal tiene un mínimo de espermatozoides requeridos para alcanzar una máxima fertilidad, por lo que no se lograría incrementar la fertilidad, aunque se incluyeran más espermatozoides en la dosis inseminada (den Dass, 1992; Shannon y Vishwanath, 1995; Januskauskas y cols., 2003), dato que tiene un valor comercial evidente.

Motilidad

La motilidad espermática ha sido el parámetro más utilizado habitualmente para definir la calidad de un eyaculado y su idoneidad para ser usado en la IA, si bien su relación con la fertilidad no está muy clara, como se deriva del amplio rango de correlaciones (r=0,15-0,83) descritas en los diferentes trabajos publicados (Rodríguez-Martínez, 2003); estos valores se encuentran en muchos casos condicionados por la realización de estimaciones visuales del porcentaje de movilidad espermática, como queda de manifiesto cuando, al utilizar sistemas CASA (del inglés, Computer Assisted System Analyser), que aportan una mayor objetividad y repetitividad en los resultados, se reduce esta variabilidad y se incrementan los coeficientes de correlación al combinar los resultados obtenidos con otros parámetros de calidad seminal (Tamargo y cols., 2019) (figura 4). La motilidad masal únicamente se presenta en eyaculados con una concentración espermática alta, como los de los rumiantes y aparece como consecuencia del efecto combinado de esa alta concentración de células espermáticas con el movimiento de las mismas. Se clasifica según una escala de 0 a 5, con una puntuación de 5 cuando se observan oleadas o remolinos con movimiento rápido y vigoroso y de 0 cuando no se observa movimiento de ondas. La valoración de la motilidad individual es un análisis cuantitativo y cualitativo que establece tanto el porcentaje de espermatozoides que se mueven, como la calidad de ese movimiento espermático en función de la rapidez y la progresividad de los mismos (Muiño y cols., 2008). Aunque no se aborda en este trabajo, la evaluación de la motilidad progresiva posdescongelación es el parámetro más ampliamente utilizado para la calificación de las dosis seminales en los centros de producción.

BIBLIOGRAFÍA

Amann R.P., Hammerstedt R.H. 2002. Detection of differences in fertility. Journal of Andrology 23 (3), 317-325. Anderson J. 1945. Seasonal variation in the reproductive capacity of the bull. The Journal of Agricultural Science, 35 (3), 184-196. Asad L., Husain S.S., Rahman M.G.M, Khandoker M.A.M.Y., Hossain M.E., Rahman M.Z. 2004. Genetic and non-genetic factors affecting the semen quality of bulls. Biology Science, 7: 1903-1907. Ax R. L., Dally M., Didion B. A., Lenz R. W., Love C. C., Varner D. D., Hafez B., Bellin M. E. 2000. Semen evaluation. En: “Reproducción e inseminación artificial en animales. Séptima edición.”. Eds: Hafez, E.S.E. y Hafez, B. Mc Graw-Hill, México. Pp: 363-375. Bhattacharyya H.K., Goswami B. K., Bujarbaruah K.M., Deka B.C., Biswas R.K. 2009. Collection and characterization of semen in Mithun (Bos frontalis) bulls. Theriogenology, 72 (5):699-703. doi: 10.1016/j. theriogenology.2009.05.010. Brito L.F.C., Silva A.E.D.F, Rodríguez L.H., Vieira F.V., Deragon L.A.G., Kastelic J.P. 2002. Effects of environmental factors, age and genotype on sperm production and semen quality in Bos indicus and Bos taurus AI bulls in Brazil. Animal Reproduction Science, 70: 181-190. Christensen P., Brockhoff P. B., Lehn-Jensen H. 1999. The relationship between semen quality and the nonreturn rate of bulls. Reproduction in Domestic Animals, 23: 503-507. Contri A., Valorz C., Faustini M., Wegher L., Carluccio A. 2010. Effect of semen preparation on CASA motility results in cryopreserved bull spermatozoa. Theriogenology, 74: 424-435. Corteel J.M., 1977. Production, storage and insemination of goat semen. Proceedings of Symposium of Management of Reproduction in sheep and goats. American Society of Animal Science, 41-57. Davis R.O., Katz D.F., 1993. Operational standards for CASA instruments. Journal of Andrology 14, 385-394. Den Daas N., 1992. Laboratory assessment of semen characteristics. Animal Reproduction Sciences, 28: 87-94. Foote R.H. 2002. The history of artificial insemination: Selected notes and notables. Journal of Animal Science. Biography and History Series, 1-10. Freitas-Dell’Aqua C.P., Crespilho A.M., Papa F.O., Dell’Aqua J.A. 2009. Metodologia de avaliação laboratorial do semen congelado bovino. Revista Brasileira de Reprodução Animal, Belo Horizonte 33 (4): 213-222. Fuerst-Waltl B., Schwarzenbacher H., Perner C., Solkner J. 2006. Effects of age and environmental factors on semen production and semen quality of Austrian Simmental bulls. Animal Reproduction Science, 95: 27–37. Galina C., Valencia J. 2009. Reproducción de los Animales Domésticos. Editorial Limusa. Pp 381. García- Paloma J.A., Pérez S., Oliet A., Montoya G., Noval G., Carleos C., Astiz S.2021. La guía VART: propuesta para estandarizar la valoración de la aptitud reproductiva de toros en España. Parte 3. Valoración física, seminal y de comportamiento. Producción Animal, 36: 36-68. Hafez E.S.E. 2002. Anatomía del aparato reproductor del macho. Parte I. Anatomía funcional de la reproducción. En: “Reproducción e inseminación artificial en animales. Séptima edición.”. Eds: Hafez, E.S.E. y Hafez, B. Mc Graw-Hill, México. Pp: 3-12. Hidalgo C.O., Tamargo C., Díez C. 2005. Análisis del semen bovino. Tecnología Agroalimentaria n.º2, 3943. Holt W.V., 1996. Can we predict fertility rates? Making sense of sperm motility. Reproduction in Domestic Animals, 31: 17-24. Hunter R.H.F. 1987. Reproducción de los animales de granja. Editorial Acribia. Pp 200. Januskauskas A., Johannisson A., Rodríguez-Martínez H. 2003. Subtle membrane changes in cryopreserved bull semen in relation to sperm viability, chromatin structure and field fertility. Theriogenology, 60: 743-758. Jasko D.J., Little T.V., Lein D.H., Foote R.H. 1992. Comparision of spermatozoal movement and semen characteristics with fertility in stallions: 64 cases (1987-1988). Journal of American Medicine Association, 200 (7): 979-985. Kastelic J.P. 2014. Understanding and evaluating bovine testes. Theriogenology, 81: 18-23. Marín M. 1994. Endocrinología veterinaria y fisiología de la reproducción. Calibac, Distribuidor. Pp 598. Muiño R., Peña A.I., Rodríguez A., Tamargo C., Hidalgo C.O. 2009. Effects of cryopreservation on the motile sperm subpopulations in semen from Asturiana de los Valles bulls. Theriogenology, 72: 860-868. Muiño R., Tamargo C., Hidalgo C.O., Peña A.I. 2008. Identification of sperm subpopulations with defined motility characteristics in ejaculates from Holstein bulls: effects of cryopreservation and between-bull variation. Animal Reproduction Science, 109: 27–39. https://doi.org/10.1016/j.anireprosci.2007.10.007. Noakes D.E., Parkinson T.J., England C.W. 2001. Artificial Insemination En: “Arthur’s Veterinary Reproduction and Obstetrics, 8.ª edición”. WB Saunders Company London. Pp 767-768. Phillips N.J., Evans G., McGowan M.R. 2004. Measures used to assess frozen-thawed semen in Autralian livestock semen processing centers. Australian Veterinary Journal, 82: 309-310. Rodríguez-Martínez H. 2003. Laboratory semen assessment and prediction of fertility: still utopia? Reproduction in Domestic Animals, 38: 312-318. Salisbury G.W., VanDemark N.L., Lodge J.R., 1978. Physiology of reproduction and artificial insemination of cattle. Principles and techniques of freezing spermatozoa (2.ª edición). Freeman and Company. San Francisco. pp. 494-554. Stalhammar E.M., Lennart J., Philipsson J. 1989. Genetic studies on fertility in A.I. bulls. I. Age, season and genetic effects on semen characteristics in young bulls. Animal Reproduction Science, 19: 1-17. Shannon P., Vishwanath R. 1995. The effect of optimal and suboptimal concentrations of sperm on the fertility of fresh and frozen bovine semen and a theoretical model to explain the fertility differences. Animal Reproduction Sciences, 39(1): 1-10. Tamargo C., Hidalgo C.O., Caamaño J.N., Salman A., Fueyo C., Arija C., Fernández A., Merino M.J., MartínezPastor, F. 2019. Assessment of a germplasm bank for the autochthonous cattle breed Asturiana de la Montaña: extender (Biociphos vs. BIOXCell) affected sperm quality but not field fertility. Reprod. Domest. Anim. 54 (Suppl. 4), 90–93. https://doi.org/10.1111/rda.13502. Woelders H. 1997. Fundamentals and recent development in cryopreservation of bull and boar semen. Veterinary Quarterly, 19: 135-138.