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Sumario SUGERENCIAS TÉCNICAS . . . . . . . . . . . . . 3 Uso de FPA en el Diagnóstico de la Brucelosis Bovina

EQUIPO DE TRABAJO DEL LABORATORIO DE DIAGNÓSTICO DIRECTORA TÉCNICA

GERENTE DE LABORATORIO VET. FERNANDO LUNA VETERINARIOS

VET. FERNANDO ACUÑA VET. LUISA CASTIGLIONE VET. MELISA FENIG VET. MARÍA CRUZ MAJÓ

TÉCNICOS

EMILIANO MUZZIO SANTIAGO ONETO YAMILA SOMOZA FEDERICO SOZZI

REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA . . . . . . . . . . . . 7 Leucosis Enzoótica Bovina NOTICIAS DE INTERÉS . . . . . . . . . . . . . . 15 - CDV logra obtener el registro de la vacuna Anti Viral Aftosa - Auditoria de Mantenimiento Norma ISO 9001-2000 2

DRA. SUSANA CONIGLIARO

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Uso de FPA en el Diagnóstico de Brucelosis Bovina VET. FERNANDO ACUÑA VET. FERNANDO LUNA DRA. SUSANA CONIGLIARO

La brucelosis es una enfermedad contagiosa que afecta tanto a animales como a humanos, y es causada por bacterias del género Brucella. En bovinos, cerdos y caninos se caracteriza por abortos e infertilidad.

En Argentina, la brucelosis bovina es comúnmente diagnosticada mediante estudios serológicos, utilizando pruebas de aglutinación en placa (BPA), en tubo (SAT) y fijación del complemento (FC). Además existen un ELISA de competencia y otro indirecto, mucho menos utilizado hasta el momento. Recientemente se comenzó a usar la técnica de Luz Fluorescente Polarizada (FPA), ya aprobada por SENASA como prueba oficial.

La técnica de FPA permite medir sencillamente anticuerpos infecciosos contra Brucella abortus en bovinos.

También ha sido desarrollada y validada para porcinos, ovinos, caprinos, bisontes y ciervos. Esta prueba posee varias ventajas sobre otras técnicas serológicas, incluyendo la relación costo-efectividad, velocidad, simplicidad y adaptación de su uso a campo. Su especificidad, sensibilidad y repetibilidad es igual o mayor a las demás pruebas serológicas (APHIS / USDA, 2004). Esto significa que el FPA raramente clasifica animales no infectados como positivos (alto grado de especificidad) y que raramente clasifica animales infectados como negativos (alto grado de sensibilidad). Ésta técnica posee ciertas particularidades que la diferencian de las usadas habitualmente. El resultado de la prueba es objetivo porque no requiere interpretación por parte del técnico que ejecuta la prueba, ya que solamente lee un número en el visor del instrumento. En las pruebas usadas de rutina el lector debe interpretar la presencia o ausencia de aglutinación.

La bibliografía nacional e internacional estima que la técnica de FPA es capaz de diferenciar anticuerpos vacunales de los producidos por la infección. Como en nuestro país la vacunación es obligatoria, la aparición de títulos vacunales trae serios problemas al Programa de Control y Erradicación de Brucelosis Bovina. Según Nielsen et al.

(1998) y Samartino et al. (1999) no se detectan anticuerpos en un animal después de aproximadamente 3 meses de

haber sido vacunados con Brucella abortus cepa 19 si se utiliza la técnica de FPA. Esto representaría una ventaja considerable.

Cabe aclarar que el FPA es adecuado para la detección de anticuerpos contra Brucella abortus, B. melitensis y B. suis, que son las especies “lisas” de Brucella (Nielsen et al., 2001). Recordemos, entonces, que existen especies “rugosas” de Brucella, las cuales difieren antigénicamente de manera considerable. Estas últimas serían Brucella canis y Brucella ovis.

Ha sido descripta la utilización de FPA como método para la detección de anticuerpos para Brucella abortus en muestras de leche provenientes de tanque, con una sensibilidad y una especificidad de 100 y 95,9% respectivamente (Gall et al., 2002). En este trabajo encontraron que puede detectar anticuerpos a niveles menores que el ELISA indirecto para leche, diferenciando también la presencia de anticuerpos debidos a vacunación.

El principio de esta prueba se basa en que si una molécula unida a una sustancia fluorescente es excitada por luz polarizada, rotará libremente modificando su alineación con respecto al plano de polarización, y lo hará a una tasa inversamente proporcional a su tamaño.

En el FPA la molécula fluorescente es excitada con luz polarizada. Sólo aquellas moléculas cuyo vector de absorción esté paralelo al plano de excitación absorberán y resultarán excitadas, es decir que se excitan selectivamente.

Las moléculas que tengan orientado su vector de absorción perpendicularmente no absorberán luz y, por lo tanto, no podrán emitir luz tampoco. Las moléculas que estén en otras orientaciones podrán absorber luz en diferente grado, dependiendo esto de cuan parecida sea su alineación a la del plano de excitación. En realidad, lo que tenemos es un conjunto enorme de moléculas que se mueven y giran libremente en solución, y el resultado que obtengamos va a depender de cuanto ha podido rotar la molécula durante el tiempo de fluorescencia en el estado excitado. Cuanto más pequeña la molécula, más rápidamente rotará, y su polarización de la fluorescencia será menor o, lo que es lo mismo, 3

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mayor despolarización de la fluorescencia habrá ocurrido.

El estado excitado tiene un tiempo de vida determinado antes de que ocurra la emisión de luz. Durante este tiempo la molécula rota aleatoriamente, por lo tanto emitirán luz despolarizada, es decir que el plano de luz emitida difiere de la del plano de excitación. Aquellas moléculas o complejos moleculares que giren lentamente habrán adoptado, al momento de la emisión, una posición aleatoria pero similar a cuando fueron excitadas. Esto resulta en una alta polarización de la fluorescencia. Aquellas moléculas o complejos moleculares que giren rápidamente tomarán, antes de que ocurra la emisión de luz, una posición aleatoria, distinta de cuando fueron excitadas. Esto resulta en una baja polarización de la fluorescencia. La velocidad de rotación de una molécula depende de la temperatura y viscosidad de la solución, y del volumen molecular. Si las dos primeras variables permanecen constantes, entonces la polarización está directamente relacionada al volumen molecular.

Cambios en este pueden estar dados por uniones o disociaciones, síntesis o degradación, o cambios conformacionales de la molécula fluorescente. En este último principio se basa la detección de anticuerpos, ya que al producirse la unión antígeno-anticuerpo el complejo molecular resultante posee mayor volumen que el antígeno libre.

La molécula fluorescente es un antígeno (OPS) de Brucella abortus conjugado con fluoresceína, que al permanecer libre gira rápidamente. Cuando este antígeno se une a los anticuerpos séricos aumenta su tamaño disminuyendo notoriamente su velocidad de giro y, por lo tanto, crece el valor de polarización (mP). El grado de polarización de la fluorescencia es determinado a través de dos medidas: la intensidad de la fluorescencia paralela y perpendicular al plano de excitación, y se expresa en términos de polarización de la fluorescencia (P) o anisotropía (r). Las fórmulas utilizadas son:

P= (Fpa-Fpe) / (Fpa+Fpe) r= (Fpa-Fpe) / (Fpa+2Fpe) donde Fpa es la intensidad de la fluorescencia paralela al plano de excitación, y Fpe es la intensidad de la fluorescencia perpendicular al plano de excitación. Para medir esto se necesita un filtro de emisión polarizado paralelamente al filtro de excitación (mide la intensidad de la fluorescencia paralela al plano de excitación) y un filtro de emisión polarizado perpendicularmente al filtro de excitación (mide la intensidad de la fluorescencia perpendicular al plano de excitación). El resultado se expresa en unidades llamadas mili polarización (mP).

El Área de Brucelosis del Laboratorio de Diagnóstico de CDV comenzó a realizar la prueba de FPA para Brucella 4

abortus desde marzo de 2006. Para el presente trabajo se recopilaron datos de 1600 muestras ingresadas a dicho Área, a las cuales se les realizó BPA, SAT y FPA conjuntamente.

Recordemos brevemente en que consiste cada prueba utilizada. La Aglutinación de Antígeno Bufferado en Placa (BPA) es la prueba tamiz más difundida, por su alta sensibilidad, rapidez y bajo costo. Su desventaja es la baja especificidad. Se fundamenta en la detección de anticuerpos aglutinantes (Ig G y variable cantidad de Ig M). El reactivo consiste en una suspensión de Brucellas inactivadas y de bajo pH. Al ponerse en contacto con el suero, si este posee anticuerpos, se unirán a las bacterias produciendo aglutinación y, por lo tanto, dando resultado positivo. Estas muestras reaccionantes son sometidas luego a una técnica confirmatoria o complementaria.

La prueba complementaria más comúnmente usada es la Seroaglutinación en Tubo(SAT) utilizando el antígeno de Wright, con y sin 2 Mercaptoetanol. La función de esta sustancia es destruir las Ig M, por lo tanto podemos obtener valores semicuantitativos de Ig M e Ig G. En el primer título se expresa el resultado de la prueba sin 2ME, y el segundo con esta sustancia. El fundamento de esta técnica también es la aglutinación de los complejos antígeno-anticuerpo.

Veamos tres ejemplos: Primero, supongamos que obtenemos un título 1/200 – negativo. Esto nos está diciendo que este animal posee gran cantidad de Ig M circulante y nada de Ig G, por lo tanto podemos inferir que hubo una infección (o vacunación) reciente.

Imaginemos ahora 1/200 – 1/100. Estaríamos ante la presencia de una infección menos reciente, ya que ha subido la curva de Ig G a pesar de que las Ig M se encuentran todavía altas.

Por último: ¿que nos estaría diciendo un titulo 1/50 – 1/50? Probablemente nos encontremos con una infección de larga data, ya que hay Ig G y las Ig M han desaparecido.

Si bien en el esquema clásico no se incluye al FPA dentro de las pruebas consideradas tamiz, bien podría utilizarse directamente para obtener los resultados serológicos de Brucelosis en cualquier rodeo. Por el momento, la mayoría opta por utilizarla como prueba complementaria, o en casos “problema”, sobre todo cuando se presume que la vacunación no fue realizada correctamente.

Con respecto al análisis de los resultados, podrían extraerse las siguientes conclusiones.

De las 674 muestras positivas a SAT, se obtuvieron 236 positivos a FPA, lo que representa un 35 %. Es probable que gran cantidad de estos animales resulten positivos a SAT, siendo negativos a FPA, por la presencia de anticuerpos vacunales. Sin embargo, se debe tener en cuenta la categoría a la que pertenecen los animales y otros datos epidemiológicos para sacar conclusiones de este tipo. En futuros

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trabajos sería importante clasificar estos resultados según la categoría (vaquillona, vaca, toro) para poder extraer conclusiones con mayor precisión.

Cabe aclarar que se observa una clara tendencia a obtener mayores porcentajes de positividad a FPA a medida que consideramos títulos mayores a SAT, por ejemplo, el 94% de las muestras con título 1/200 1/200 para el SAT resultó positiva a FPA. Esto último se deba, tal vez, a los títulos séricos bajos (pero positivos) remanentes de una vacunación tardía.

Observemos también que existe un “salto” en la positividad a FPA a partir del título 1/50 de SAT con 2ME. Con respecto a la técnica de FPA los puntos de corte actuales están establecidos de la siguiente manera: un resultado inferior o igual a 94 mP es negativo, un resultado superior o igual a 104 mP es positivo, y un resultado comprendido entre estos valores es sospechoso. Sin embargo, un

trabajo de Rivera et al., en el cual se tomaron muestras de grupos infectado y no infectados, y vacunados y no vacunados (con cepa 19) concluyó que el origen y la condición epidemiológica de las poblaciones de donde provenían las muestras influía en la determinación del punto de corte óptimo. Por lo tanto, sugieren que para mantener el alto rendimiento diagnóstico de la prueba se debería considerar la condición de vacunación con cepa 19 en la interpretación de los resultados.

Creemos que incluir esta prueba dentro del Programa Nacional de Control y Erradicación de la Brucelosis Bovina es un gran aporte y una herramienta muy útil para el Veterinario y el Productor. Pero, si bien lo expuesto hasta aquí permite sacar algunas conclusiones interesantes, consideramos que es necesario ampliar el estudio de esta prueba, su relación con otras técnicas, correlacionar diversas variables y llegar a un criterio uniforme sobre su interpretación.

BIBLIOGRAFÍA Animal and Plant Health Inspection Service, US Department of Agriculture Fluorescence Polarization Assay (FP) Test Field Trial and Testing Results Validation of the FP Test in Cattle, Bison, and Swine APHIS / USDA, 2004 Gall D, Nielsen K, Bermudez M R, Moreno F, Smith P: . 2002.Fluorescence Polarization Assay for detection of Brucella abortus Antibodies in Bulk Tank Bovine Milk Samples. Clin Diagn Lab Immunol. November; 9(6): 1356–1360.

Gall D, Nielsen K, Forbes L, Davis D, Elzer P, Olsen S, Balsevicius S, Kelly L, Smith P, Tan S, Joly D: 2000.Validation of the fluorescence polarization assay and comparison to other serological assays for the detection of serum antibodies to Brucella abortus in bison.

J Wildl Dis. Jul,36(3):469-76.

Nielsen K.: 2002.Diagnosis of brucellosis by serology.Vet Microbiol. Dec 20;90(1-4):447-59.

Nielsen K, Gall D: 2001.Fluorescence polarization assay for the diagnosis of brucellosis: a review.J Immunoassay Immunochem.

22(3):183-201.

Nielsen K, Gall D, Lin M, Massangill C, Samartino L, Perez B, Coats M, Hennager S, Dajer A, Nicoletti P, Thomas F: 1998.Diagnosis of bovine brucellosis using a homogeneous fluorescence polarization assay.Vet Immunol Immunopathol. 11;66(3-4):321-9.

Nielsen K, Gall D, Jolley M, Leishman G, Balsevicius S, Smith P, Nicoletti P, Thomas F: 1996.

A homogeneous fluorescence polarization assay for detection of antibody to Brucella abortus.

J Immunol Methods. 195(1-2):161-8.

Rivera A., Pérez B, Rojas X, Wojciechowski E, Pino C, Nielsen K.: Validation Assay of Fluorescence Polarization Test for Bovine Brucellosis Serological Diagnosis.

Samartino L, Gregoret R, Gall D, Nielsen K: 1999.Fluorescence polarization assay: application to the diagnosis of bovine brucellosis in Argentina.J Immunoassay 20(3):115-26 (ISSN: 0197-1522).

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Leucosis Enzoótica Bovina VET. FERNANDO ACUÑA VET. FERNANDO LUNA DRA. SUSANA CONIGLIARO

INTRODUCCIÓN La Leucosis Enzoótica Bovina (EBL) es una enfermedad viral, de curso crónico, que se transmite fundamentalmente a través de sangre o leche. El hombre juega un rol importante en la transmisión, ya que algunas prácticas de manejo mal desempeñadas facilitan el contagio. Esta enfermedad afecta considerablemente la productividad y la eficiencia reproductiva del rodeo, lo que lleva inevitablemente a pérdidas económicas.

ETIOLOGÍA El virus de la leucosis bovina es un Oncovirus tipo C perteneciente a la familia Retroviridae. En 1981, Kettmann y col. estudiaron el genoma del virus pudiendo clasificarlo en tres sub-grupos: europeo, australiano y norteamericanojaponés. Su genoma está compuesto por dos moléculas de ARN monocatenario idénticas. Comprende los genes estructurales clásicos de los retrovirus (gag, prot, pol y env), y además una región llamada “X”. Aquí se encuentran varios genes que codifican para diferentes proteínas de regulación.

Algunas de ellas están implicadas en la transformación tumoral de la célula huésped. (Ver gráfico 1) El gen gag produce tres proteínas que forman la cápside viral. El gen pol produce tres enzimas: la transcriptasa reversa (permite la transcripción de ARN viral a ADN proviral), la ARNasa H (que degrada el ARN de la molécula híbrida ARN/ADN obtenida después de la transcripción reversa) y la integrasa (implicada en la integración del ADN proviral dentro del ADN celular). El gen env codifica para dos proteínas de la envoltura: gp51 (implicada en el reconocimiento del receptor celular y el desencadenamiento de la respuesta inmunitaria) y gp30 (sirve como ancla de la gp51 a la membrana viral). (Ver gráfico 2) El virus entra al organismo por inoculación directa o a través de mucosas hasta llegar al torrente sanguíneo. Una vez allí ingresa a los leucocitos, principalmente linfocitos B y monocitos. Luego ocurre la transcripción reversa de su genoma, es decir de ARN a ADN, y es insertado en el de la célula huésped. Por lo tanto, una vez que el virus ingresa al organismo, el animal se transforma en diseminador por el resto de su vida. La infección se caracteriza por la formación de anticuerpos permanentemente, pero también por una respuesta inmune celular. (Ver gráfico 3)

El virus es muy sensible a las agresiones del medio ambiente, por lo que no sobrevive fuera del hospedador por más de cuatro horas. Esto es importante ya que nos dice que el bovino infectado es la única fuente de infección. El virus es inactivado por muchos desinfectantes, los rayos ultravioleta, la congelación y la descongelación repetidas y la pasteurización.

TRANSMISIÓN Existen varias vías de transmisión. Muchas de las infecciones ocurren al principio de la vida del bovino, cuando es ternero y mama leche de una madre enferma. Algunos terneros nacen ya infectados, pero el mecanismo de contagio no es bien conocido. Sin embargo, debemos recalcar que la transmisión horizontal es la más importante de las vías, y la que produce mayor cantidad de nuevos infectados. En casi todas las secreciones y fluidos biológicos (sangre, leche, calostro, secreción nasal, saliva, semen y orina) se pueden encontrar linfocitos infectados, pero la mayor proporción de ellos se encuentra en la sangre. Por lo tanto, todas las prácticas tales como: extracción de sangre, vacunación, castración, descorne, inyección de medicamentos, cirugía, palpación rectal, tatuaje, colocación de caravanas, etc, que se realicen sin respetar las medidas higiénicas, son las vías más importantes de transmisión.

Los artrópodos hematófagos parásitos de los vacunos (tábanos, mosca brava, mosquitos, garrapatas, etc.) también transmiten la enfermedad.

Cabe aclarar, además, que a pesar de la falta de evidencias concluyentes sobre la transmisión de virus por semen, muchos criadores y centros de inseminación de países extranjeros requieren material obtenido de planteles libres de leucosis.

Algunos autores sostienen que cuando hay hacinamiento de bovinos infectados la transmisión horizontal se ve facilitada, porque el contacto físico estrecho y prolongado favorecería el contagio.

Experimentalmente se ha demostrado que pequeñas cantidades de sangre pueden transmitir la infección. En un estudio realizado por González y col. (2001) se logró infectar bovinos experimentalmente al inocularles sangre de bovinos seropositivos y sin linfocitosis. Se utilizaron volúmenes de 5, 10 y 50 microlitros, y diversas vías de inoculación: endovenosa, intramuscular, subcutánea e intradérmica. En todos 7

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Gráfico 1 - Estructura del EBLV gp51 gp30

Bicapa lipídica

p15 p24 ARN Transciptasa inversa

p12

(Uckert et al., 1984)

Gráfico 2 - Provirus EBLV

LTR 3’

LTR 5’ U3

R

U5

U3

R

U5

R3 Gag

Pol G4 Prot

Env Rex Tax Región X

Genes estructurales

Genes reguladores

Gráfico 3 - Representación esquemática del ciclo de replicación de un retrovirus Citoplasma Membrana plasmática ADN

Virion

Provirus Traducción

ARN ARN Transcripción

Nucleocápside incompleta Nucleoide incompleto

Traducción

Glicoproteínas de membrana

Núcleo Receptor viral

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(Coffin et al., 1997)

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los casos se logró transmitir el virus.

Existe cierta controversia sobre la posibilidad de que el virus infecte al humano. Estudios estructurales y genéticos han señalado una similitud notable con el virus de la leucemia del humano (HTLV). Un estudio sostiene que el consumo de productos lácteos no pasteurizados o carne mal cocida puede ser vía de transmisión del virus del bovino hacia el humano. Ha sido demostrado experimentalmente que el virus de la EBL puede infectar ovinos y primates, y produce cáncer en las ovejas. En condiciones de laboratorio puede infectar células de muchas especies incluyendo humanos y primates. Recientemente se descubrió que el virus puede infectar células de la glándula mamaria bovina, lo que indica que la afinidad del virus no es exclusiva por los leucocitos. En otro estudio, se analizó sangre humana buscando anticuerpos contra el virus de la EBL. Se detectó la presencia de ADN viral en células sanguíneas y en mamas extraídas quirúrgicamente. También se encontraron proteínas relacionadas al virus en tejido mamario, y se detectaron anticuerpos contra EBL en más de la mitad de los voluntarios testeados. Estos resultados sugieren que el virus puede infectar al hombre.

DISTRIBUCIÓN E IMPORTANCIA DE LA ENFERMEDAD La leucosis enzoótica bovina es una enfermedad de distribución mundial, siendo su incidencia mayor en los sistemas de producción láctea. Por esta razón los países desarrollados o con interés en la exportación de lácteos, como Australia y Nueva Zelanda, tienen programas para su control y erradicación. En Europa es una enfermedad de declaración obligatoria y lucha sanitaria. Su prevalencia se estima en 0,1% en la mayoría del territorio, salvo en Francia, España e Italia donde es de 1 a 5%. En nuestro país la prevalencia es muy heterogénea según la zona estudiada, pero se considera para la mayoría de los tambos entre un 10 a 45% de prevalencia.

Se calcula que en el estado de California, EEUU, alrededor del 1% de las reses son decomisadas debido a la presencia de linfosarcomas. Esto significó un aumento del 300% con respecto a los decomisos en los setentas por esta causa. Alrededor del 30 a 40% de las vacas adultas de los EEUU son seropositivas a EBL. En los rodeos con alta prevalencia de la presentación tumoral, los porcentajes suelen ser más elevados.

La presencia del virus en el país se confirmó en 1978, por medio de técnicas serológicas. Si bien en nuestro país la prevalencia difiere sensiblemente según las regiones y tipo de explotación ganadera, se ha comprobado que en estos 29 años la enfermedad se ha extendido marcadamente.

Un estudio realizado en 1979 en la zona de la cuenca de Mar y Sierras (Bs. As.), indicó que el 95 % de los establecimientos lecheros estaban libres; mientras que quince años después se comprobó que sólo el 32 % estaban en esa situación.

Estudios serológicos realizados en establecimientos lecheros del área central de la provincia de Santa Fe indicaron que la prevalencia de EBL alcanzaba el 29%. De los 50 tambos analizados, el 78 % tenía animales seropositivos, con una

prevalencia que oscilaba entre el 10% y el 67%. En vaquillonas pre-servicio la prevalencia fue de 13 % (con un rango entre 1 y 22%). Este dato da cuenta de la importancia que puede tener la infección temprana en nuestros rodeos.

En el Noreste Argentino se calculaba una prevalencia del 10% en el año 1980. Ya para el año 1995 Chaco y Formosa superaban el 40%. Corrientes en 1995 mostraba una prevalencia del 24,39%, y en 1999 llegaba a 31%. Un estudio de Resoagli y col., en 2001, encontró que 6 de los 7 tambos estudiados poseían animales infectados y que la prevalencia ascendía a 32,53%.

Otro estudio, publicado en 2004, realizado en el litoral, concluyó que en Curuzú Cuatiá el 17,9% de los animales muestreados eran seropositivos, y que el 100% de los tambos poseía algún animal seropositivo. Para Monte Caseros los resultados fueron 4,9% de los animales y 33% de los establecimientos eran positivos.

Morris y col. realizaron estudios en el sur del país, zona que se ha mantenido libre el virus por mucho tiempo.

Encontraron que, si bien los rodeos de cría permanecieron libres, un tambo en Viedma posee el 52,8% de sus animales infectados. El establecimiento había introducido animales ubicados al norte del Río Colorado.

Si bien es cierto que sólo un bajo porcentaje de los animales desarrolla tumores, las pérdidas económicas generadas por una alta prevalencia de la enfermedad ocurren antes de que aparezca la enfermedad tumoral, e incluso si nunca aparece. Por un lado, las cabañas se preocupan ya que es una limitante para la exportación de vacunos y la comercialización de semen y embriones. También está el costo del tratamiento del animal enfermo previo al diagnóstico de la enfermedad. Hay disminución de la producción de leche, venta prematura y aumento de la mortalidad. Además, los animales con tumores son decomisados en el frigorífico.

Existen evidencias de que las vacas infectadas y sin síntomas clínicos, además de una menor producción de leche, presentan una disminución de la respuesta inmunológica a otras enfermedades.

En un intento de aportar algunos datos con respecto a la distribución de la enfermedad en el país, nos propusimos estudiar las muestras que ingresaron al Área de Serología del Laboratorio de Diagnóstico de CDV. Para esto trabajamos con 8819 sueros provenientes de casi todo el país, en el período mayo 2005 a febrero 2007. A partir de estas muestras obtuvimos los siguientes resultados.

Los tambos resultaron tener una prevalencia del 36,67%, los rodeos de carne un 21,75%, y las cabañas un 12,28%.

(Ver gráfico 4) En los tambos localizados en la Provincia de Buenos Aires obtuvimos una prevalencia de 29,6%, en Córdoba 67,5%, Entre Ríos 57,4%, Santa Fe 55,5% y Tucumán 33,2%. Las prevalencias de los diferentes establecimientos poseen una variación amplia. Hemos encontrado valores de seropositividad muy altos en algunos tambos, por ejemplo, en un esta9

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Gráfico 4 - Prevalencia (%) según producción

Gráfico 5 - Prevalencia (%) de EBL en tambos

blecimiento localizado en Entre Ríos, la prevalencia fue del 79,1%. También encontramos tambos libres de la enfermedad, pero solamente en 4 casos, lo que representa un porcentaje muy bajo.

Con respecto a los rodeos de carne se obtuvieron seropositividades bajas en todos los casos, excepto en el de La Pampa, en donde obtuvimos 75 muestras positivas de 114 recibidas (65,8%).

Trabajamos con 1.937 muestras provenientes de cabañas y centros de inseminación localizados en la Provincia de Buenos Aires, obteniendo un 10,79% de seropositividad.

(Ver gráfico 5) 10

PATOGENIA Existen dos formas de Leucosis Bovina. La más común, objeto de este trabajo, es la producida por el virus, y se denomina leucosis “enzoótica”, “endémica”, o “forma adulta”. La otra es referida como forma “esporádica”, y comprende tres presentaciones diferentes: “juvenil”, “tímica” y “cutánea”.

En la forma enzoótica, al exponerse el animal al virus, se infectará y permanecerá infectados por el resto de su vida. El virus parece “esconderse” del sistema immune dentro de los linfocitos. A pesar de que los animales producen anticuerpos, estos son ineficaces para controlar la infección. Los títulos de anticuerpos se utilizan para detectar a los enfermos,

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pero no predicen si ese animal desarrollará un tumor o no.

La enfermedad consta de tres fases: • Fase inaparente: formación de anticuerpos solamente.

• Fase de Leucositosis Persistente: Ocurre en un 30% de los infectados, generalmente entre los 3 y 6 años de vida. Está incrementado el número de glóbulos blancos en sangre circulante. Aparece una respuesta celular que consiste en una expansión policlonal de linfocitos B infectados. En ambas fases los animales aparentan estar sanos.

• Fase tumoral: En un porcentaje, que se estima menor al 5 %, se presenta la enfermedad tumoral característica (linfosarcoma). En esta fase aparecen los signos clínicos y las mayores pérdidas económicas.

Otra forma de linfoma ocurre en los bovinos. Ésta no es causada por el virus de la EBL y, por lo tanto, no es transmisible. Es llamada “forma esporádica” de linfoma bovino, y su etiología es desconocida. Incluye las formas “juvenil”, “tímica” y “cutánea”. El linfoma juvenil usualmente desarrolla en los primeros 6 meses de vida, y se caracteriza por agrandamiento de los nódulos linfáticos, leucemia linfocítica y pancitopenia, y tumores linfomatosos de distribución multicéntrica. La forma tímica desarrolla usualmente en terneros de menos de 1 año y se caracteriza por agrandamiento masivo del timo, con signos clínicos derivados de la compresión que genera en la zona (disnea, disfagia, etc.). La forma cutánea de linfoma bovino aparece en animales de entre 2 y 3 años, y es la más “benigna” de todas las formas.

DIAGNÓSTICO La EBL posee un período de incubación de 1 a 5 años, y desarrolla lentamente. Incluso algunos animales infectados permanecen clínicamente sanos toda su vida. Los signos más frecuentemente observados son: pérdida de condición corporal, menor apetito, disminución en la producción láctea y agrandamiento de linfonódulos. De manera inconstante aparecen otros signos como: paresia posterior, fiebre, afección respiratoria, exoftalmos, diarrea, estreñimiento, insuficiencia cardíaca, renal o hepática. Estos y otros signos están relacionados a la compresión o infiltración que produce el tumor sobre los órganos internos. Los órganos afectados pueden ser: linfonódulos, corazón, tracto gastrointestinal, hígado, bazo, útero o riñones.

El agrandamiento de los linfonódulos periféricos puede ser detectado por inspección o palpación. Los linfonódulos internos también pueden ser palpados por vía rectal cuando están agrandados. (foto 1) La afección cardíaca se debe generalmente a la compresión del atrio derecho. En este caso observaremos los signos relacionados a la insuficiencia cardíaca derecha como, por ejemplo, edema en zonas ventrales. Más tarde, el cuadro evolucionará a una insuficiencia cardíaca global, y empezare-

Foto 1

Foto 2 mos a ver signos como diseña y palidez de mucosas. (foto 2) El linfosarcoma también puede producir engrosamiento de la pared uterina o afección de los linfonódulos intrapélvicos, lo que lleva a una mala performance reproductiva.

La infiltración o compresión del hígado o riñones llevará a insuficiencia hepática o renal, respectivamente.

Siempre se debe sospechar de EBL en vacas adultas con linfonódulos agrandados. La serología confirmará el diagnóstico presuntivo. La prueba es muy precisa, por lo que un resultado positivo significa casi siempre que la vaca está infectada, y una animal seronegativo significa, casi siempre, que no existió contacto con el virus. (foto 3)

Foto 3 11

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La linfocitosis persistente ocurre en el 30% de los casos.

Los linfocitos circulantes pueden ser normales morfológicamente o exhibir características de linfocitos B reactivos.

Cuando la médula ósea se vuelve linfomatosa puede haber leucemia, con conteos de linfocitos tan altos como 100.000/ul. En estos casos, pueden aparecer células linfoides blásticas. Sin embargo, algunos animales serán linfopénicos, debido probablemente al secuestro que sufren los linfocitos en los tejidos linfomatosos.

Es importante recordar que en otras enfermedades crónicas como tuberculosis, trypanosomiasis o brucelosis, también puede haber linfocitosis, aunque en un rango de 8.000 a 20.000/ul. La infección con el virus de la EBL suele producir valores más altos. Además, la linfocitosis persistente que suelen sufrir los afectados de EBL, se describe como linfocitosis absoluta en dos hemogramas consecutivos separados por tres meses.

La infección por EBL puede sospecharse cuando al examen post-mortem de un bovino adulto se encuentran tumores linfomatosos en sitios múltiples. Su aspecto macroscópico es variable, pero generalmente son blandos, color blanco o grisáceo, y presentan zonas friables de necrosis.

El análisis histopatológico de los órganos revela abundantes células linfoides reemplazando el tejido normal. En el bazo se observa un infiltrado difuso de células linfoides neoplásicas que ocupan los cordones y sinusoides esplénicos, y se extienden a las trabéculas y a la cápsula. También invaden el tejido linfoide periarteriolar y centros germinales. En los ganglios linfáticos se observa pérdida de la arquitectura folicular, que es reemplazada por una población de células linfoblásticas neoplásicas que se extienden a los sinusoides medulares y, a través de la cápsula, al tejido conectivo perinodal.

El diagnóstico ante-mortem puede ser establecido por citología por aspiración de un linfonódulo afectado. La técnica consiste en realizar una punción con aguja fina de algún linfonódulo periférico agrandado. El material extraído se deposita sobre un portaobjetos, el cual se remite al laboratorio. Se observará el campo cubierto casi en su totalidad por células linfoides neoplásicas. (foto 4)

Foto 4 12

Una de las características de esta enfermedad es una respuesta humoral que dura toda la vida del animal. La infección por EBL estimula una fuerte reacción inmune humoral en contra de las principales proteínas virales gp51 y p24 que constituyen la base para la detección mediante pruebas serológicas. En la mayoría de los casos, anticuerpos contra gp51, una glucoproteína de la envoltura viral, tiene el título más alto y aparece antes que los anticuerpos contra p24, un polipéptido del core viral.

Mientras que el diagnóstico de los bovinos con linfosarcoma es relativamente sencillo para el veterinario clínico, la detección de los bovinos infectados sin signos clínicos requiere de la ayuda del laboratorio. Las pruebas utilizadas son: -Inmunodifusión en gel de agar (AGID): la primer prueba serológica para diagnosticar EBL fue el AGID, utilizando el polipéptido interno p24. Cuando se descubrió que la glicoproteína gp51 incrementaba la sensibilidad de la prueba, se lo utilizó en reemplazo de la p24 o pasó a usarse una mezcla de ambos antígenos. La mayoría de los antígenos que se usan hoy contienen ambos antígenos, pero la prueba debe ser estandarizada para la demostración de anticuerpos anti gp51. Esta ha sido la prueba oficial en muchos países para la detección de anticuerpos contra EBL. Actualmente es la prueba oficial de SENASA para la certificación de establecimientos libres de leucosis (resolución 337/94) y para la exportación de ganado en pie. Además, es sencilla y se puede obtener el resultado en 48 horas. Sin embargo, la prueba tiene algunas limitaciones, por ejemplo, es incapaz de detectar la presencia de anticuerpos durante las etapas iniciales de la infección. Este período puede durar de 3 a 14 semanas.

Tampoco es capaz de discriminar anticuerpos calostrales de anticuerpos infectantes, por lo tanto, puede dar falsos positivos antes de los 6 meses de edad. No debe ser utilizada para detección de anticuerpos un mes antes del parto.

• Enzimoinmunoensayo (ELISA): se ha desarrollado y evaluado una serie de ELISAs, algunos de los cuales son actualmente reconocidos como métodos oficiales en EE.UU., Canadá y otros países. Si bien el ELISA posee las misma limitaciones que la AGID, puede detectar niveles de anticuerpos menores. Esto permite que se la pueda utilizar en estudios epidemiológicos de gran escala, ya que es posible evaluar pooles de sueros de un determinado número de individuos, reduciendo tiempo y costos. Al evaluar animales individualmente, tiene la ventaja de detectar la presencia de anticuerpos antes que AGID. También existen algunos ELISAs diseñados para evaluar leche de tanque.

• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR): las pruebas de detección directa, como la PCR, permiten un diagnóstico confiable en las etapas iniciales de la enfermedad y se pueden aplicar a la detección del virus en animales menores de 6 meses, evitando así reacciones falso positivas, causadas por la transferencia pasiva de inmunoglobulinas a través del calostro. Otra ventaja radica en la capacidad para detectar el virus en animales inmunotolerantes, los que no desarrollan

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una respuesta inmune normal (Fechner y col 1996). PCR es una prueba conveniente para detectar DNA proviral en muestras de sangre, suspensión de órganos y material tumoral, siendo un método sensible que permite un diagnóstico rápido y temprano. Esta técnica permite detectar la presencia del ADN del virus en la sangre; con anterioridad a la detección de anticuerpos. Su alto costo y complejidad la restringe a ser utilizada en trabajos de investigación.

Diversos autores han demostrado una menor sensibilidad de AGID respecto de las pruebas diagnósticas ELISA y PCR (Eaves y col. 1994, Fechner y col. 1996, Trono y col. 2001, Morris y col.). Por ejemplo, en un estudio de Felmer y col. en 2006, la prueba AGID identificó un menor número de animales positivos que las pruebas de PCR en sangre, ELISA en suero y ELISA en leche. El PCR detectó un 25% más de positivos que AGID. Tres animales positivos a AGID fueron negativos, según la prueba PCR en sangre. El método ELISA, aplicado tanto en suero como en leche, permitió detectar un 25% más de animales positivos que la prueba AGID. Todos los animales positivos a AGID fueron también positivos a ELISA aplicado tanto en suero como en leche.

PREVENCIÓN En la actualidad no existen vacunas para prevenir la Leucosis Enzoótica Bovina, pero el control de la enfermedad es técnicamente posible. Es más, la EBL ha sido erradicada de algunos países. Como hemos visto, es una enfermedad de fácil diagnóstico, por lo tanto, realizando alguna prueba de laboratorio sumado al envío inmediato a faena de los positivos puede completarse el saneamiento del rodeo.

Pero debemos encarar con realismo la estrategia de saneamiento, ya que el costo económico de eliminar a los positivos puede ser altísimo, sobre todo si la prevalencia en el rodeo es alta. Una estrategia de erradicación moderada podría ser crear y manejar dos rodeos completamente separados, uno con los positivos y otro con los negativos, e ir eliminando a los positivos de a poco, según las posibilidades del tambo. Este es un método más lento, pero quizás más aplicable y realista. A la larga, este sistema irá reduciendo el número de vacas infectadas hasta que se pueda plantear una estrategia más drástica. Hay que tener en cuenta que, además de la identificación de los infectados y su eliminación, se deben implementar cambios en el manejo.

Teniendo en cuenta lo que se dijo sobre las características del agente etiológico y su transmisión, algunas consideraciones sobre el manejo serían las siguientes: Sólo se deben usar agujas y jeringas descartables (una por animal), y todos los elementos como instrumentos quirúrgicos, de descorne, de caravaneado, de tatuaje, pipetas, etc. deben ser desinfectados después de cada uso. Este sea quizás el punto de mayor impacto de todas las prácticas que enumeraremos.

Se debe usar guantes descartables para el tacto rectal. Si bien no es particularmente de alto riesgo, los guantes de tacto deben ser cambiados entre animales.

Si es posible conviene usar un método de descorne que evite el contacto con la sangre del animal.

Al ordeñar (o revisar glándula mamaria y tomar muestras), se debe hacer primero en vacas seronegativas y luego en las seropositivas. El ordeño de ambos grupos debe realizarse en forma separada.

También debemos implementar el uso de inseminación artificial con semen de toros seronegativos, ya que el semen puede contener linfocitos infectados. Tampoco se debe usar vacas seropositivas como receptoras de transferencia embrionaria, ya que es posible que la infección pase al feto.

Se debe controlar la población de insectos hematófagos en el tambo, los cuales pueden llegar a ser vías de diseminación importantes, sobre todo cuando la carga de insectos es alta.

La realización de análisis periódicos es importante para detectar animales infectados lo antes posible. Se debe hacer a partir de los seis meses de edad, ya que los terneros menores de esa edad pueden dar falso positivos debido a la presencia de anticuerpos calostrales. En las vacas preñadas el análisis debe hacerse, por lo menos, seis semanas antes de la fecha de parto para evitar también falsos positivos.

Los terneros deben ser apartados de su madre infectada antes de mamar el calostro, ya que es una vía de contagio. A estos terneros se les debe suministrar calostro proveniente de vacas no infectadas. Si esto no es posible, el calostro debe ser pasteurizado o congelado para inactivar el virus. Algunos sostienen que de esta manera se aprovechan los anticuerpos sin administrarle el virus al ternero. Estudios muestran que a los 90 días de vida los terneros sin anticuerpos calostrales tienen de 2 a 2,75 veces más probabilidad de infectarse comparado con terneros que recibieron anticuerpos en el calostro.

También es útil hacerle el análisis serológico a los terneros antes de mamar calostro. De esta manera identificaremos a los terneros infectados in utero, y podremos tomar las medidas correspondientes con la mayor prontitud posible.

Si tomamos la muestra de sangre después de haber mamado calostro, podremos obtener un falso positivo por aparición de anticuerpos calostrales.

Con respecto a los ejemplares de reposición que ingresan a un establecimiento deben resultar negativos a pruebas de diagnostico serológico. Hasta no contar con el resultado, los animales ingresantes deben permanecer separados del resto del rodeo.

CERTIFICACIÓN DE ESTABLECIMIENTO LIBRE DE EBL En nuestro país se ha implementado un sistema voluntario de erradicación de la EBL. A través de la resolución Nº 337/94, el SENASA dio a conocer el Programa de Control por el cual se reglamenta el Sistema de certificación de Establecimientos Libres de Leucosis Enzoótica Bovina. Esta resolución establece las normas y procedimientos para la certificación de establecimientos libres de EBL. La idea es disponer de rodeos de producción, certificados oficialmente como libres de LEB, para facilitar la comercialización del 13

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ganado en pie y el material genético, tanto en el país como en el exterior. Para ello deben mantenerse identificados todos los animales del rodeo, disponer de registros que permitan identificar su ascendencia y descendencia, contar con infraestructura que permita evitar la entrada o salida a predios vecinos y sólo se permitirá el ingreso de animales que provengan de establecimientos libres.

Como primera medida se debe hacer el testeo, por medio de AGID, a todos los animales del rodeo mayores de 6 meses.

De esta forma se clasifica al rodeo como “libre” o “infectado”.

En el primer caso se realizarán recertificaciones anuales del

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Cuando todos los animales hayan dado resultado negativo en dos controles consecutivos, separados por 60 a 90 días, el establecimiento podrá declararse libre de leucosis. A partir de ese momento se hará un seguimiento serológico anual para recertificar su condición. Todos los bovinos que se incorporen deben ser serológicamente negativos y se mantendrán aislados del resto. Si a los tres meses resultasen negativos a una nueva prueba podrán incorporarse al rodeo.

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Agradecimientos : A la Dra. Elisa D’Ambrosio por las imágenes de microscopía y la información aportada.

A Santiago Oneto por la recopilación de datos y a todo el personal de CDVsa. 14

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CDV logra obtener el registro de la vacuna Anti Viral Aftosa Nos es grato comunicar al mercado Veterinario la aprobación del registro de la Vacuna Anti Viral Aftosa.

Este logro reafirma la confianza en el trabajo de CDV y en un conjunto de personas con la capacidad de afrontar cualquier desafío.

CDV está habilitado por el Senasa para la elaboración y venta de vacuna antiaftosa oleosa, de acuerdo con la resolución 219/95 y 351/06, que regulan los requerimientos de elaboración y control. El Organismo Oficial le ha otorgado el certificado número 08-029, según la Disposición 133/08 del 30 de enero de 2008. Dicha vacuna se produce en la planta de bioseguridad NBS 3A que la empresa posee en el Parque Industrial de Pilar.

De este modo hemos logrado concretar una etapa más dentro del proceso de expansión del Laboratorio. Ahora somos uno de los 4 únicos laboratorios de Argentina que elabora la vacuna antiaftosa y el segundo laboratorio que obtiene el registro de la vacuna utilizando el sistema de multiplicación del virus sobre cultivos celulares BHK. Esta metodología es la mas apropiada para cumplimentar las normas GMP ya que permite una mayor estandarización de los procesos de elaboración.

CDV ha comercializado hasta el presente, 5 series de vacuna en el mercado local y ha realizado su primera exportación de vacuna antiaftosa a la República de Bolivia.

Continuar creciendo es el desafío.

Auditoria de Mantenimiento Norma ISO 9001-2000 CDV logró superar con éxito, la segunda auditoria de mantenimiento al sistema de gestión de la calidad según norma ISO 9001-2000 realizada los días 4 y 5 de junio próximo pasado.

La auditoria se llevo acabo por BVQI en los siguientes áreas: Ventas, Dirección Técnica, Depósitos, Gestión de Calidad y Dirección, Producción, Medios de cultivo, Bacterianas, Virales, Cultivos celulares, Laboratorio de Control de Calidad y Bioterio, Desarrollo, RRHH, Mantenimiento y Servicios del Depto. Técnico.

Se destacó fundamentalmente el exhaustivo sistema de Auditorias internas y el tratamiento y seguimiento de los hallazgos, la implementación de indicadores de desempeño de procesos y el alto compromiso de la Dirección y del Personal del Laboratorio.

Felicitaciones a todo el gran equipo de CDV! 15

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