Metody oznaczania glutenu w produktach spożywczych w aspekcie bezpieczeństwa osób chorych na celiakię (mgr inż. Wojciech Kłys, PZH – Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego, prof. Katarzyna Stoś Instytut Żywności i Żywienia

Metody oznaczania glutenu w produktach spożywczych w aspekcie bezpieczeństwa osób chorych na celiakię

wprowadzenie

Z punktu widzenia osób chorych na celiakię istotne jest, aby spożywana żywność była bezpieczna i nie zawierała glutenu. Dlatego ważne jest dysponowanie wiarygodną metodą oznaczania glutenu w produktach spożywczych w celu wykrycia, czy żywność nie jest zanieczyszczona glutenem. Celiakia jest chorobą immunologiczną przewodu pokarmowego spowodowaną spożyciem glutenu przez osoby szczególnie wrażliwe na gluten. Za szkodliwe działanie metoda PCR jest dziesięciokrotnie czulsza niż glutenu odpowiedzialne są głównie białka prolaminowe glutenu. Prolaminy zawierają duże ilości takich aminokwasów, jak glutamina (ok. 35%) oraz prolina (ok. 15%). Skład aminokwasowy białek prolaminowych oraz ich struktura powoduje, że u części osób ich trawienie jest utrudnione i wywołuje zaburzenia w pracy przewodu pokarmowego. Białka prolaminowe pszenicy (gliadynę), żyta (sekalinę), jęczmienia (hordeinę) oraz owsa (aweninę) przyjęto ogólnie nazywać glutenem. Ich szkodliwość dla osób chorych na celiakię jest zróżnicowana, a w przypadku prolamin owsa – dyskusyjna. Białka prolaminowe kukurydzy, gryki, ryżu, prosa i sorgo uznawane są za bezpieczne dla osób chorych na celiakię (Sollid L.M. i wsp., 2005).

Osoby cierpiące na celiakię dla zachowania zdrowia muszą pozostawać przez całe życie na diecie bezglutenowej. Wykazano, że osoby chore na celiakię tolerują do 20 mg glutenu/kg spożywanej żywności dziennie. Istnieje wiele metod oznaczania glutenu uwzględniających jego szkodliwość dla osób chorych na celiakię (Bremer M., 2009). Główną rolę odgrywają wśród nich metody immunologiczne tj. metoda ELISA R5 Mendeza oraz metoda ELISA G12. W artykule przedstawiono przegląd glutenu w produktach spożywczych w aspekcie choroby celiakii.

Metoda PCR

Metoda PCR polega na wykrywaniu genów odpowiedzialnych za produkcję składników glutenu techniką reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. polymerase chain reaction – PCR). W metodzie przeprowadza się powielanie łańcuchów DNA i analizuje się określone sekwencje DNA. W porównaniu z innymi metodami badania białek metoda ta jest czulsza o kilka rzędów wielkości.

Do badań glutenu, metoda PCR została po raz pierwszy zastosowana przez Allmanna M. i wsp., 1993, którzy zbadali 35 różnych próbek żywności, które potencjalnie mogły zawierać gluten. Badaniom poddano również dodatki piekarnicze oraz analizowano wpływ procesów technologicznych – podgrzewania i przetwarzania żywności na wyniki oznaczeń. Badanie PCR jest metodą na tyle czułą, że pozwala ona na wykrycie niewielkich ilości glutenu w próbkach skrobi pszennej, która z założenia nie powinna zawierać glutenu. W badaniu przeprowadzonym przez Köppela E. i wsp., 1998 analizie poddano próbki owsa, które zostały wzbogacone glutenem pszennym. Porównanie metody PCR i metody immunoenzymatyczną R5 ELISA wykazało, że metod wykorzystywanych do oznaczania

metoda R5 ELISA.

Dahinden I. i wsp., 2001 udoskonalili metodę PCR i opracowali tzw. test QC-PCR, co pozwoliło na oznaczanie zanieczyszczeń próbek żywności pszenicą, żytem i jęczmieniem. Metodę zastosowano do 15 produktów bezglutenowych. Uzyskane wyniki były porównywalne z testem ELISA wykonanym przy użyciu przeciwciała monoklonalnego R5 (mAb).

Wyróżniającą się techniką wśród metod PCR jest metoda Real Time PCR. Metoda opiera się na zastosowaniu ilościowej reakcji łańcuchowej polimeryzacji w czasie rzeczywistym. Metoda wykorzystując techniki fluorescencyjne, pozwala na monitorowanie ilości produktu reakcji w czasie jej trwania, co odróżnia ją od klasycznej reakcji PCR. Dzięki temu cała procedura analizy jest stosunkowo szybka. „ Badanie PCR jest metodą na tyle czułą, że pozwala ona na wykrycie niewielkich ilości glutenu w próbkach skrobi pszennej, która z założenia nie powinna zawierać glutenu. „

Sandberg M. i wsp., 2003, którzy zastosowali metodę Real-Time PCR uzyskali również porównywalne wyniki z wynikami uzyskanymi metodą immunologiczną ELISA R5.

Henterich i wsp., 2003 opracowali test immuno-PCR RT, w którym przeciwciało monoklonalne R5 (mAb) było sprzężone z oligonukleotydem. W porównaniu z testem

ELISA R 5 uzyskano 30-krotnie większą czułość.

Mujico i wsp., 2011 udoskonalili metodę RT-

PCR, która pozwoliła na wykrywanie glutenu w przetworzonych i nieprzetworzonych próbkach żywności. Technika ta również wykazywała większą czułość niż metoda ELISA R5. Metoda ,, ta umożliwia wykrycie obecności DNA już w stężeniu 20 pg DNA/mg materiału badanego.

Badania porównawcze metod PCR i ELISA przeprowadzone w okresie sześciu lat w różnych laboratoriach (Scharf A. i wsp., 2013) wykazały, że zaletą metody PCR jest fakt, że nie daje ona fałszywie pozytywnych wyników. Natomiast w przypadku metody immunoenzymatycznej ELISA przypadki takie występowały dla 2% oznaczeń. Dotyczyło to szczególnie żywności przetworzonej.

Pomimo wysokiej czułości metody PCR, nie można jej stosować do określenia zawartości glutenu w produktach hydrolizowanych, takich jak piwo, syrop i ekstrakty słodowe (Osorio

C.E, i wsp., 2019).

Metody spektrometrii masowej

Precyzyjną metodą wykrywania i oznaczania glutenu jest spektrometria mas techniką MALDI-TOF MS. W metodzie tej połączono źródło jonów MALDI i analizator TOF. Metoda pozwala na oznaczanie białka i hydrolizatów białkowych o wielkości od 1000 do 100 000 daltonów bez konieczności oczyszczania chromatograficznego (Osorio C.E, i wsp., 2019). Technika pozwala na wiarygodne oznaczenie poziomu białka już od 0,01 mg/ ml w próbkach żywności (Mejías J.H. i wsp., 2014).

Po raz pierwszy metodę zastosowano do zbadania 30 próbek żywności bezglutenowej. Uzyskane wyniki były porównywalne z wynikami testu ELISA (Camafeita E. i wsp., 1997). Dodatkową zaletą tej metody był fakt, że pozwoliła ona na określenie rodzaju źródła zanieczyszczenia (Camafeita E., 1998). Ograniczeniem metody jest konieczność zastosowanie bardzo drogiego specjalistycznego sprzętu, a metoda ma zastosowanie tylko do oznaczeń półilościowych (Ferranti P. i wsp., 2007). Inną odmianą techniki spektrometrii mas stosowaną do oznaczania glutenu jest tandemowa spektrometria mas (LC-MS / MS) (Sealey-Voyksner J.A. i wsp., 2010, Scherf K.A. i wsp., 2016). Metoda pozwala na ilościowe oznaczenie glutenu w zakresie od 0,01 do 100 mg/kg w próbkach żywności nieprzetworzonej i przetworzonej. Metoda LC-MS / MS umożliwiła wykrycie peptydów glutenu pszennego w próbkach mąki owsianej i sojowej poddanej działaniu chymotrypsyny i trypsyny w stężeniach odpowiednio 10 i 15 mg/kg (Fiedler K.L. i wsp., 2014, Colgrave M.L.i wsp., 2015). Zastosowanie metody do badań zawartości glutenu m.in. w piwie (Weber D. i wsp. 2009, Tanner G.J. 2013, Colgrave M.L, 2014) wykazało, że metoda LC-MS / MS daje często wyniki pozytywne, podczas gdy dla tych samych próbek metoda ELISA wykazywała nieobecność glutenu.

Metoda chromatografii kolumnowej

Do charakteryzowania, rozdzielania i oznaczania ilościowego białek nasion zbóż stosowana jest również chromatografia kolumnowa. Najczęściej stosowaną odmianą tej metody jest chromatografia wykluczania (GPC/SEC). Jest to technika analityczna pozwalająca na charakteryzowanie cząsteczek na podstawie ich wielkości. Kolumna chromatograficzna jest wypełniona porowatym żelem i połączona z zestawem detektorów. Podczas przepływu próbki przez kolumnę, zawarte w niej małe cząsteczki łatwo wnikają w głąb porów i dłużej się w nich znajdują, wydłużają czas retencji w stosunku do cząsteczek większych, którym do porów wniknąć jest trudno. Inną odmianą chromatografii kolumnowej jest chromatografia z odwróconą fazą (RP), która rozdziela białka zgodnie z ich hydrofobowością (Scherf K.A. i wsp., 2016). Metoda chromatografii kolumnowej ma szereg zalet m.in. szybkość oznaczania (często są to 30 minutowe cykle), jak i zdolność wykrywania glutenu na niskim poziomie 1–2 mg. Seilmeier W. i wsp., 2003 zastosowali metodę chromatografii kolumnowej do określenia stopnia zanieczyszczenia glutenem 23 próbek skrobi o zawartości gliadyny (składnik glutenu „

Zastosowanie metody do badań zawartości glutenu m.in. w piwie wykazało, że metoda LC-MS /

MS daje często wyniki pozytywne, podczas gdy dla tych samych próbek metoda ELISA wykazywała nieobecność glutenu. „

stanowiący ok. 50% zawartości glutenu) od 15 do 574 mg/kg. Metoda chromatografii kolumnowej może być stosowana do oznaczania glutenu, ma ona jednak wadę, że nie jest w stanie rozróżnić białek glutenowych i nieglutenowych w złożonych próbkach żywności.

Metoda NIR

Coraz częściej stosowaną metodą w badaniach żywności jest metoda spektroskopii w bliskiej podczerwieni (NIR). Radman M. i wsp., 2018 podjęli próby zastosowania techniki NIR do wykrywania zanieczyszczenia produktów bezglutenowych glutenem. Jak wynika z przeprowadzonych badań, w technice NIR kluczową rolę odgrywała odpowiednia kalibracja. Wymaga ona dostępności dużej liczby próbek o znanej zawartości glutenu, oznaczonego innymi technikami analitycznymi. Dostępność tzw. „zestawu uczącego” jest warunkiem wstępnym kalibracji sprzętu NIR w celu możliwości badania nieznanych próbek pod kątem zanieczyszczenia glutenem.

Metoda biosensorów

Nietypową metodą badania zawartości glutenu jest zastosowanie biosensorów, które umożliwiają otrzymanie mierzalnego sygnału, proporcjonalnego do stężenia badanego analitu. Najczęściej wykorzystywane są biosensory oparte na absorbcji, fluorescencji lub na zjawisku plazmonowego rezonansu jądrowego (ang. surface plasmon resonance; SPR). Technika SPR jest techniką o wysokiej efektywności, dostarcza wyników w czasie rzeczywistym, może być zautomatyzowana i cechuje się wysoką czułością. Zastosowanie techniki SPR umożliwia skrócenie czasu badania i jego automatyzację (Wójcik T, 2020, Bremer M., 2009).

Metody immunologiczne

Najbardziej preferowanymi metodami wykrywania i oznaczania glutenu są aktualnie metody immunologiczne. Opierają się one na reakcji przeciwciał z wybranymi peptydami.

Odpowiednia metoda oznaczania glutenu powinna rozpoznawać specyficzne fragmenty peptydów odpowiedzialne za szkodliwe działanie glutenu. W łańcuchu polipeptydowym prolamin występuje wiele obszarów o większej lub mniejszej szkodliwości i wiele z nich dotychczas nie zostało zidentyfikowanych (Mena, 2015). ,,

Wśród metod immunologicznych główną rolę odgrywa metoda immunoenzymatyczna

ELISA. Wynika to z jej czułości, precyzji i szerokich możliwości standaryzacji.

Metoda immunoenzymatyczna ELISA jest również najczęściej używaną techniką w komercyjnie dostępnych zestawach do Metoda ELISA występuje najczęściej w postaci testu kanapkowego (ang. sandwich ELISA) i testu kompetycyjnego (ang. competitive ELISA). Metoda kanapkowa wykorzystuje dwa przeciwciała, a w metodzie kompetycyjnej oznaczane białko konkuruje z cząsteczkami wzorca o dostęp do wiązania z przeciwciałem. Im większe jest stężenie antygenu w próbce, tym mniej wzorca zwiąże się z przeciwciałem. Barwny produkt powstaje wtedy, gdy przeciwciało zwiąże się z wzorcem. Z tego powodu w metodzie kompetycyjnej intensywność reakcji kolorymetrycznej jest odwrotnie proporcjonalna do ilości antygenu w próbce. Zalecaną metodą badania zawartości glutenu jest kanapkowy test ELISA R5 Mendeza, w którym stosuje się dwa przeciwciała R5 wiążące się z gliadyną. Jest to test o wysokiej czułości i specyficzności, odpowiedni do stosowania zwłaszcza, gdy stężenie badanego białka jest niskie oraz gdy towarzyszą mu wysokie stężenia innych białek. W celu opracowania odpowiedniej metody oznaczania glutenu pod względem jego toksyczności dla osób chorych na celiakię wykorzystuje się fakt powstawania podczas trawienia glutenu – peptydów, które nie są w pełni trawione przez organizm człowieka. Metody takie są aktualnie preferowane w porównaniu z metodami oznaczania ogólnej zawartości glutenu. Do peptydów takich należy głównie peptyd tzw. 33-mer, o wysokiej toksyczności (Shan i wsp., 2002). Przeciwciała stosowane w metodach oznaczania glutenu wytwarzane są u zwierząt doświadczalnych, takich jak myszy i króliki przez ich immunizację poprzez podawanie im peptydowych fragmentów prolamin. Fragmenty te uzyskiwane są przez hydrolizę prolamin lub są wytwarzane syntetycznie. Po wywołaniu odpowiedzi immunologicznej otrzymuje się poliklonalne lub monoklonalne przeciwciała. „

Metoda chromatografii kolumnowej może być stosowana do oznaczania glutenu, ma ona jednak wadę, że nie jest w stanie rozróżnić białek glutenowych i nieglutenowych w złożonych próbkach żywności. „

Metoda Mendeza R5

Metoda ELISA R5 Mendeza jest metodą typu I zalecaną przez Codex Alimentarius Commision jako metoda określania zawartości glutenu w żywności (Codex Alimentarius Commision, 2006), a AOAC International zaakceptowało metodę Mendeza R5 jako Metodę Oficjalną nr 991.19 (Abbott M. i wsp.,2010). W metodzie ELISA R5 Mendeza zastosowano przeciwciała reagujące głównie w odniesieniu do peptydu QQPFP obecnego w gliadynie pszenicy, sekalinie żyta, hordeinie jęczmienia. Przeciwciała stosowane w metodzie R5 są również w stanie rozpoznawać inne podobne peptydy, takie jak: LQPFP, QLPYP, QLPTF, QQSFP, QQTFP, PQPFP i QQPYP, aczkolwiek ze znacznie niższą czułością (Osman i wsp., 2001). Metoda R5 pozwala na zidentyfikowanie i oznaczenie ilościowe toksycznego białka pszenicy, jęczmienia i żyta. Jest ona odpowiednia do oceny obecności zanieczyszczeń glutenem żywności bezglutenowej. Metoda ta daje zawyżone wyniki dla jęczmienia, a dla glutenu zhydrolizowanego uzyskiwano wyniki nieprawidłowe (Thompson T. i Méndez Z., 2008). Opracowano szereg modyfikacji metody, co pozwoliło również na oznaczanie zhydrolizowanego glutenu. Granica wykrywalności metody wynosi od 0,30 ng/ ml do 1,22 ng/ml, w zależności od rodzaju zboża. Kompetycyjny test R5 ELISA, oparty o jedno monoklonalne przeciwciało, umożliwia precyzyjne określenie poziomu zarówno glutenu w całości, jak i jego fragmentów. Według Codex Alimentarius Commision modyfikacja testu R5 jest wskazana do badania poziomu hydrolizowanego glutenu (Codex Alimentarius Commision, 2006).

Metoda pozwala na uzyskanie prawidłowych wyników dla próbek nie zawierających owsa, co stanowi duże jej ograniczenie. Hernando A. i wsp., 2008 badając metodą R5 25 próbek owsa wykazali, że w niektórych próbkach nie wykrywano prolamin owsa. Problem toksyczności owsa dla osób chorych na celiakię jest istotny ze względu na fakt, że niektórzy autorzy wskazują, iż awenina owsa u niektórych pacjentów może wywoływać stan zapalny i atrofię w jelitach (Pulido O. i wsp., 2009). Arentz-Hansen H. i wsp., 2004 opisali uszkodzenia kosmków jelitowych u osób chorych na celiakię, które wynikały ze spożywania owsa. Badania wskazują, że awenina owsa może mieć podobne oddziaływanie jak gluten pszenicy, żyta lub jęczmienia. Badania 19 dorosłych pacjentów chorych na celiakię, którzy spożywali 50 g owsa/dzień przez okres 12 tygodni, wykazały, że może wystąpić u nich wrażliwość na owies. Istotne jest zatem wykrywanie i oznaczanie ilościowe potencjalnie toksycznego owsa w diecie osób chorych na celiakię. Stosowanie drugiej popularnej metody ELISA – metody G12 może pozwolić na pogłębienie badań w zakresie toksyczności białka owsa.

Metoda G12

Badania poszczególnych immunotoksycznych peptydów powstających w trakcie trawienia glutenu sprawia, że prowadzone są poszukiwania nowych, odpowiednich przeciwciał. Jednym z wyników poszukiwań jest otrzymanie, a następnie opatentowanie przeciwciał G12 i A1 (Patent No.: WO2013098441 A1). Przeciwciała te reagują z peptydem 33-mer, uważanym za najbardziej szkodliwy peptyd występujący w białku glutenu. Przeciwciała zostały zastosowane w metodzie tzw. ELISA G12. Metoda immunoenzymatyczna ELISA G12 została po raz pierwszy opisana przez Moron B., Bethune M.T. i wsp. w 2008 roku. W kolejnych badaniach potwierdzono wysoką przydatność metody (Moron B., Cebolla A. i wsp. 2008, Mena M.C, 2009). Przeciwciało G12 rozpoznaje fragment peptydu α-2 gliadyny, który jest w znacznej mierze odpowiedzialny za immunotoksyczność glutenu. Kanapkowy test ELISA oparty na przeciwciale G12 dał bardzo obiecujące rezultaty na próbkach różnego typu, jego granica wykrywalności wyniosła 0,6 ng/ml. Opracowano również wariant kompetycyjny testu ELISA z przeciwciałem G12. Metoda ta jest wysoce czuła, granica oznaczalności wynosi 0,44 ppm gliadyn i charakteryzuje się wysoką powtarzalnością. Reaktywność użytych przeciwciał skorelowano z potencjalną immunotoksycznością zbóż, z których ekstrahowano białka (Moron B., Bethune M.T. i wsp., 2008, Ehren J. i wsp., 2009). Metodę poddano walidacji, w wyniku której stwierdzono, że jest to metoda o wysokiej czułości i specyficzności. Jej czułość jest znacznie wyższa niż innych równoważnych metod rozpoznających szkodliwe peptydy glutenu. Granica wykrywalności metody dla oznaczeń w pszenicy, jęczmieniu i życie wyniosła poniżej 1 ppm prolaminy. W celu wykrycia prolamin małotoksycznego owsa wymagana była większa ilość próbki. Metoda prawidłowo wskazywała na niską szkodliwość białka kukurydzy i ryżu. Metoda okazała się szczególnie przydatna w badaniach toksyczności owsa. W badaniach Comino I. i wsp., 2011 stwierdzono, że różne odmiany owsa wykazują bardzo różny stopień toksyczności u osób chorych na celiakię. Wykazano również wysoką korelację pomiędzy wynikami oznaczeń prolamin owsa, uzyskanych metodą G12, a wynikami badań klinicznych. „

Kompetycyjny test

R5 ELISA, oparty o jedno monoklonalne przeciwciało, umożliwia precyzyjne określenie poziomu zarówno glutenu w całości, jak i jego fragmentów. Według

Codex Alimentarius

Commision modyfikacja testu R5 jest wskazana do badania poziomu hydrolizowanego glutenu. „

Zaletą metody G12 jest to, że pozwala ona prawidłowo określać zawartość toksycznego glutenu w żywności poddanej ogrzewaniu lub enzymatycznym procesom, które mogą powodować częściową deamidację glutenu. Czynników, które mogą wpływać na dokładność oznaczeń glutenu w żywności jest wiele. Należą do nich m.in. modyfikacja białek w wyniku procesów technologicznych, interferencja innych składników żywności, zastosowanie odpowiednich wzorców i inne. Modyfikacja białek w wyniku procesów technologicznych obejmuje głównie enzymatyczną deamidację lub transamidację oraz degradację w wyniku hydrolizy białka. W celu porównania obu metod immunologicznych tj. metody R5 Mendeza i metody G12 przeprowadzono szereg badań (Gell G. 2015, Hochegger R., 2015). Wykazały one, że obie metody są odpowiednie do stosowania w badaniach produktów spożywczych w zakresie obecności białek szkodliwych dla osób chorych na celiakię.

Aspekty prawne

Produkty spożywcze bezglutenowe do niedawna były traktowane jako środki spożywcze specjalnego przeznaczenia żywieniowego. Aktualnie taka kwalifikacja nie ma zastosowania.

Zgodnie z rozporządzeniem Parlamentu Europejskiego i Rady 1169/2011, wśród substancji lub produktów powodujących alergie lub reakcje nietolerancji, wymieniono m.in.: zboża zawierające gluten, tj. pszenica (w tym orkisz i pszenica khorasan), żyto, jęczmień, owies lub ich odmiany hybrydowe, a także produkty pochodne, z wyjątkiem: a) syropów glukozowych na bazie pszenicy zawierających dekstrozę*; b) maltodekstryn na bazie pszenicy*; c) syropów glukozowych na bazie jęczmienia; d) zbóż wykorzystywanych do produkcji destylatów alkoholowych, w tym alkoholu etylowego pochodzenia rolniczego;

*oraz produkty pochodne, o ile obróbka, jakiej je poddano, najprawdopodobniej nie wpływa na zwiększenie alergenności, ocenionej przez właściwy organ w odniesieniu do produktu, z którego powstały.

Szczegółowe wymagania dotyczące sposobu etykietowania substancji lub produktów wymienionych w grupie substancji lub produktów powodujących alergie lub reakcje nietolerancji zamieszczone są w artykule 21 rozporządzenia 1169/2011. Ponadto w zakresie znakowania żywności bezglutenowej obowiązuje rozporządzenie wykonawcze Komisji (UE) nr 828/2014 z dnia 30 lipca 2014 r. w sprawie przekazywania konsumentom informacji na temat nieobecności lub zmniejszonej zawartości glutenu „ w żywności. Zgodnie z tym rozporządzeniem, ,, Zaletą metody G12 jest to, że pozwala ona sformułowanie „bezglutenowy” można prawidłowo określać stosować wyłącznie, jeśli dana żywność zawartość toksycznego w postaci sprzedawanej konsumentowi końcowemu zawiera nie więcej niż 20 mg/kg glutenu. Z kolei sformułowanie glutenu w żywności poddanej ogrzewaniu lub „o bardzo niskiej zawartości glutenu” można enzymatycznym procesom, stosować wyłącznie, jeżeli zawartość glutenu które mogą powodować w żywności składającej się z jednego lub większej liczby składników lub zawierającej jeden lub większą liczbę składników częściową deamidację glutenu „ wytworzonych z pszenicy, żyta, jęczmienia, owsa lub ich odmian krzyżowych, które zostały specjalnie przetworzone w celu zmniejszenia zawartości glutenu, nie przekracza 100 mg/kg glutenu w żywności sprzedawanej konsumentowi końcowemu.

Mając na względzie zapewnienie bezpieczeństwa konsumentów ważne są metody i jakość badań zawartości glutenu w produktach kierowanych do szczególnej grupy osób wrażliwych na ten składnik. ,,Kodeks Żywnościowy (Codex Alimentarius Commission 2007, 2008) określił ogólne wytyczne dla metod wykrywania lub oznaczania glutenu w produktach spożywczych. Wytyczne wskazują, że może to być metoda immunologiczna lub inna zapewniająca równie wysoką czułość i specyficzność jak metody immunologiczne. Stosowane w metodzie immunologicznej przeciwciała powinny reagować z toksycznymi fragmentami białek zbóż, a nie powinny reagować z innymi białkami zbóż lub z innymi składnikami zbóż. Metoda stosowana do oznaczeń glutenu powinna być poddana walidacji. Granica oznaczalności metody powinna wynosić 10 mg glutenu na kg lub poniżej.

Jakościowe wykrywanie glutenu powinno opierać się na odpowiednich metodach, takich jak: metoda immunoenzymatyczna ELISA lub metody opierające się na wykrywaniu DNA. Powyższy dokument wskazał, że metoda immunoenzymatyczna ELISA R5 Mendeza jest metodą spełniającą wymagania dla ilościowego oznaczania glutenu w produktach spożywczych. Podczas 36. Sesji Kodeksu Żywnościowego (Codex Alimentarius Commission, 2014) Austria wnioskowała, aby metoda G12 została włączona do wykazu metod Kodeksu Żywnościowego (Codex Standard 118-

mgr inż. Wojciech Kłys

Narodowy Instytut Zdrowia Publicznego PZH, Zakład Żywienia i Wartości Odżywczej Żywności, były kierownik Pracowni Białka i Pełnomocnik Dyrektora ds. Akredytacji Instytutu Żywności i Żywienia w Warszawie. Uczestniczył w pracach nad metodami oznaczania glutenu w ramach Grupy Roboczej Analityki i Toksyczności Prolamin (Prolamin Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity). Ekspert Komisji Europejskiej Platformy Działań w Zakresie Diety, Aktywności Fizycznej i Zdrowia oraz Grupy Wysokiego Szczebla ds. Żywienia i Aktywności Fizycznej DG SANTE. Współpracuje z Polskim Komitetem Normalizacyjnym.

1979, 2008) jako metoda odpowiednia do oznaczania glutenu. W uzasadnieniu przedstawiono spełnienie przez metodę wszystkich wymagań określonych przez Kodeks Żywnościowy.

Przedstawiono uzasadnienie, że metoda ELISA, wykorzystująca przeciwciała G12 (AgraQuant® Gluten G12), została zaaprobowana przez AACC (AACC 2014) jako metoda międzynarodowa nr 38-52.01. Podstawą do uznania metody G12 przez AACC były m.in. badania biegłości (Abbott M. i wsp., 2010, Don C. i wsp., 2014). Badania biegłości przeprowadzono przy zastosowaniu 12 próbek ryżu, czekolady, chleba kruchego. Próbki fortyfikowano glutenem na 5 poziomach. Metoda została również przyjęta przez AOAC (AOAC, 2014) jako oficjalna metoda badań o nr. 2014.03.

Jako uzasadnienie dla wpisania metody G12 do Kodeksu Żywnościowego Austria przedstawiła również własne wyniki badań porównawczych metody R5 i G12. Badano 50 różnych próbek produktów spożywczych znakowanych jako produkty bezglutenowe obiema metodami. Uzyskano podobne wyniki badań. W roku 2015 w badaniach 43 próbek potwierdzono, że obie metody dają porównywalne wyniki (Hochegger R., 2015).

Literatura

1. Abbott M., Hayward S., Ross W. i in.: Validation procedures for quantitative food allergen ELISA methods: community guidance and best practices. J. AOAC Int., 2010, 93, 442–450. 2. Allmann M., Candrian U., Höfelein C., Lüthy J.: Polymerase chain reaction (PCR): A possible alternative to immunochemical methods assuring safety and quality of food Detection of wheat contamination in non-wheat food products. Z Lebensm Unters Forch. 1993;196:248–251. 3. AOAC Official Method 2014.03: Gluten in Rice Flour and Rice-Based Food Products G12 sandwich ELISA, First Action 2014. 4. Arentz-Hansen, H., Fleckenstein, B., Molberg, Ø. i in.: The molecular basis for oat intolerance in patients with celiac disease. PLoS Medicine, 2004, 1, 84–92. 5. Bremer MGEG: Selecting a suitable food alergen detection method. Food Saf. Mag. 2009, 15, 3. 6. Camafeita E., Alfonso P., Mothes T., Méndez E.: Matrix-assisted laser desorption/ionization timeof-flight mass spectrometric micro-analysis: The first non-immunological alternative attempt to quantify gluten gliadins in food samples. J. Mass Spectrom. 1997, 32, 940–947. 7. Camafeita E., Solís J., Alfonso P. i in.: Selective identification by matrix-assisted laser desorption/ ionization time-of-flight mass spectrometry of different types of gluten in foods made with cereal mixtures. J. Chromatogr. A. 1998, 823, 299–306. 8. Codex Alimentarius Commission. Joint Food and Agriculture Organization of the United Nations/World Health Organization Food Standards Program. Report of the Twenty – Seventh Session of the Codex Committee on Methods of Analysis and Sampling. 2006; ALINORM 06/29/23. 9. Codex Alimentarius Commission: Draft Revised Standard for Foods for Special Dietary Use for Persons intolerant to Gluten (at Step 8). Committee on Nutrition and Foods for Special Dietary Uses. Joint FAO/WHO Food Standards Programme Codex Alimentarius CommissioN. Thirty-first Session Geneva, Switzerland, 30 June – 4 July 2008, Report of the 29th session of the Codex Committee on Nutrition and Foods for Special Dietary Uses 2007, ALINORM 08/31/26, 50–51. 10. Codex Alimentarius Commission. Codex Standard 118–1979 rev. 2008, Foods for special dietary use for persons intolerant to gluten Codex Alimentarius FAO/WHO Rome, 2008. 11. Codex Alimentarius Commission. INT FAO/ WHO Food Standards Programme Codex Committee on Nutrition and Foods for Special Dietary Uses Thirty-sixth Session, Kuta, Bali, Indonesia, 24–28 November 2014. Proposals for New Work Comment from Austria: Proposal for an extension of the method recommendation in CODEX STAN 118–1979 (Codex Standard for Foods for Special Dietary Use or Persons Intolerant to Gluten) with a method that accurately detects the toxic fraction in gluten harmful for individuals intolerant to gluten: the ELISA G12 method. 12. Colgrave M.L., Goswami H., Blundell M. i in.: Using mass spectrometry to detect hydrolysed gluten in beer that is responsible for false negatives by ELISA. J. Chromatogr. A. 2014, 1370, 105–114. 13. Colgrave M.L., Goswami H., Byrne K. i in.: Proteomic profiling of 16 cereal grains and the application of targeted proteomics to detect wheat contamination. J. Proteome Res. 2015, 14, 2659–2668. 14. Comino I., Real A., de Lorenzo L. i in.: Diversity in oat potential immunogenicity: basis for the selection of oat varieties with no toxicity in coeliac disease, Gut, 2011, 60, 915–22. 15. Dahinden I., von Büren M., Lüthy J.: A quantitative competitive PCR system to detect contamination of wheat, barley or rye in gluten-free food for coeliac patients. Eur. Food Res. Technol. 2001, 212, 228–233. 16. Don C, Halbmayr-Jech E, Rogers A, Koehler P., AACCI approved methods technical committee report: Collaborative Study on the Immunochemical Quantitation of Intact Gluten in Rice Flour and Rice-Based products by G12 Sandwich ELISA Cereal Foods World 59, 2014, 187–193. 17. Don C., Halbmayr-Jech E., Rogers A., Koehler P.: 4.1 Collaborative Study on the immunochemical determination of intact gluten in rice flour and rice based products by G12 sandwich ELISA – progress report w: Proceedings of the 27th MeetingWorking Group on Prolamin Analysisand Toxicity (PWG), 2014. 18. Ehren J, Moron B, Martin E. i in.: A food-grade enzyme preparation with modest gluten detoxification properties. PloS One, 2009, 4, 7, e6313. 19. Ferranti P., Mamone G., Picariello G., Addeo F.: Mass spectrometry analysis of gliadins in celiac disease. J. Mass Spectrom. 2007, 42, 1531–1548. 20. Fiedler K.L., McGrath S.C., Callahan J.H., Ross M.M.: Characterization of grain-specific peptide markers for the detection of gluten by mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 2014, 62, 5835–5844. 21. Gell G., Kovács K., Molnár I. i in.: Celiac disease-specific prolamin peptide content of wheat relatives and wild species determined by ELISA assays and bioinformatics analyses, Cereal Research, 2015, akademiai.com, www.editorialmanager.com/crc/ download.aspx?id=9175&guid. 22. Henterich N., Osman A.A., Méndez E., Mothes T.: Assay of gliadin by real-time immunopolymerase chain reaction. Food Nahr. 2003, 47, 345–348. 23. Hernando A., Mujico J.R., Mena M.C. i in.: Measurement of wheat gluten and barley hordeins in contaminated oats from Europe, the United States and Canada by Sandwich R5 ELISA. Eur J Gastroenterol Hepatol, 2008, 20, 6, 545–554.

dr inż. Katarzyna Stoś, prof. nadzw. NIZP-PZH

Profesor Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego. Ekspert w gremiach krajowych i międzynarodowych m.in. w Radzie SanitarnoEpidemiologicznej, w grupach roboczych Komisji Europejskiej i Rady Europejskiej z zakresu prawa żywnościowego, środków spożywczych specjalnego przeznaczenia żywieniowego, nowej żywności, suplementów diety, witamin i składników mineralnych oraz innych substancji dodawanych do żywności, a także znakowania wartością odżywczą. Obszar badań naukowych i prac rozwojowych: badania spożycia, skład i jakość zdrowotna żywności, zmniejszanie ryzyka chorób na tle wadliwego żywienia (szczególnie na tle niedoboru jodu), spożycie i bezpieczeństwo stosowania suplementów diety.

24. Hochegger R., Mayer W., Prochaska M.: Comparison of R5 and G12 Antibody-Based ELISA Used for the Determination of the Gluten Content in Official Food Samples Foods, 2015, 4, 654–664. 25. Köppel E., Stadler M., Lüthy J., HuÈbner P.: Detection of wheat contamination in oats by polymerase chain reaction (PCR) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) Zeitschrift für Lebensmitteluntersuchung und-Forschung A. 1998;206:399–403. 26. Mejías J.H., Lu X., Osorio C., Ullman J.L., von Wettstein D., Rustgi S. Analysis of wheat prolamins, the causative agents of celiac sprue, using reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) Nutrients. 2014, 6, 1578–1597. 27. Mena MC, Hernando A, Lombardía M, Albar J.: The application of proteomics in gluten analysis: Identification and characterization of prolamins and glutelins through mass spectrometry. Proceeding of the 23rd Meeting Working Group on Prolamin Analysis and Toxicity. 2009, 23–28. 28. Mena MC, Sousa C.: Analytical Tools for Gluten Detection. Policies and Regulation. W: Arranz E, Fernández-Bañares F, Rosell CM, Rodrigo L, Peña AS (editors), Advances in the Understanding of Gluten Related Pathology and the Evolution of Gluten-Free Foods. Barcelona, Spain, OmniaScience, 2015, 527–564. 29. Moron B, Bethune MT, Comino I. i in.: Toward the assessment of food toxicity for celiac patients: characterization of monoclonal antibodies to a main immunogenic gluten peptide. PloS One, 2008, 3, 5, e2294. 30. Moron, B., Cebolla, A., Manyani, H. i in.: Sensitive detection of cereal fractions that are toxic to celiac disease patients by using monoclonal antibodies to a main immunogenic wheat peptide, Am. J. Clin. Nutr., 2008, 87, 405–414. 31. Mujico J.R., Lombardía M., Mena M.C., i in.: A highly sensitive real-time PCR system for quantification of wheat contamination in gluten-free food for celiac patients. Food Chem. 2011, 128, 795–801. 32. Osman, A.A., Uhlig, H.H., Valdes, I. i in.: A monoclonal antibody that recognizes a potential coeliactoxic repetitive pentapeptide epitope in gliadins. Eur. J. Gastroent. Hepatol, 2001, 13, 1189–1193. 33. Osorio C.E., Mejías J.H., Rustgi S.: Nutrients. 2019, 11 (12), 2920. 34. Pulido, O., Gillespie, Z., Zarkadas, M. i in.: Introduction of oats in the diet of individuals with celiac disease: A systematic review, In: Advances in Food and Nutrition Research, Steve L. Taylor, 2009, 235–285. 35. Radman M., Jurina T., Benković M. i in.: Application of NIR spectroscopy in gluten detection as a cross-contaminant in food. Croat. J. Food Technol. Biotechnol. Nutr. 2018, 13, 120–127. 36. Rozporządzenie Wykonawcze Komisji (UE) nr 828/2014 z dnia 30 lipca 2014 r. w sprawie przekazywania konsumentom informacji na temat nieobecności lub zmniejszonej zawartości glutenu w żywności. (Dz. U. L 228 z 31.7.2014, s. 5) 37. Rozporządzenie ROZPORZĄDZENIE PARLAMENTU EUROPEJSKIEGO I RADY (UE) NR 1169/2011 z dnia 25 października 2011 r. w sprawie przekazywania konsumentom informacji na temat żywności, zmiany rozporządzeń Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1924/2006 i (WE) nr 1925/2006 oraz uchylenia dyrektywy Komisji 87/250/EWG, dyrektywy Rady 90/496/EWG, dyrektywy Komisji 1999/10/WE, dyrektywy 2000/13/ WE Parlamentu Europejskiego i Rady, dyrektyw Komisji 2002/67/WE i 2008/5/WE oraz rozporządzenia Komisji (WE) nr 608/2004 (Dz.U. L 304 z 22.11.2011, s. 18) 38. Sandberg M., Lundberg L., Ferm M., Yman I.M.: Real time PCR for the detection and discrimination of cereal contamination in gluten free foods. Eur. Food Res. Technol. 2003, 217, 344–349. 39. Sealey-Voyksner J.A., Khosla C., Voyksner R.D., Jorgenson J.W.: Novel aspects of quantitation of immunogenic wheat gluten peptides by liquid chromatography–mass spectrometry/mass spectrometry. J. Chromatogr. A. 2010, 1217, 4167–4183. 40. Shan L., Molberg O., Parrot I. i in.: Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue. Science, 2002, t. 297, 2275–2279. 41. Scharf A., Kasel U., Wichmann G., Besler M.: Performance of ELISA and PCR methods for the determination of allergens in food: An evaluation of six years of proficiency testing for soy (Glycine max L.) and wheat gluten (Triticum aestivum L.) J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 10261–10272. 42. Scherf K.A., Poms R.E.: Recent developments in analytical methods for tracing gluten. J. Cereal Sci. 2016, 67, 112–122. 43. Scherf K.A., Wieser H., Koehler P.: Improved quantitation of gluten in wheat starch for celiac disease patients by gel-permeation high-performance liquid chromatography with fluorescence detection (GP-HPLCFLD) J. Agric. Food Chem. 2016, 64, 7622–7631. 44. Seilmeier W., Wieser H.: Comparative investigations of gluten proteins from different wheat species. Eur. Food Res. Technol. 2003, 217, 360–364. 45. Sollid L.M., Khosla C.: Future therapeutic options for celiac disease. Nature Clinical Practice. Gastroenterology and Hepatology, 2005, 2, 140–147. 46. Tanner G.J., Colgrave M.L., Blundell M.J. i in.: Measuring hordein (gluten) in beer—A comparison of ELISA and mass spectrometry. PLoS ONE. 2013, 8, e56452. 47. Thompson, T., Mendez Z.: Commercial assays to assess gluten content of gluten-free foods: why they are not created equal. Journal of the American Dietetic Association, 2008, 108, 1682–1687. 48. Weber D., Cléroux C., Godefroy S.B.: Emerging analytical methods to determine gluten markers in processed foods—method development in support of standard setting. Anal. Bioanal. Chem. 2009, 395, 111–117. 49. Wójcik T.: Detekcja glutenu – wybrane techniki, Jagiellońskie Centrum Innowacji, 2020 r. (dostęp w sieci).