M
etody oznaczania glutenu w produktach spożywczych w aspekcie bezpieczeństwa osób chorych na celiakię
wprowadzenie
Z punktu widzenia osób chorych na celiakię istotne jest, aby spożywana żywność była bezpieczna i nie zawierała glutenu. Dlatego ważne jest dysponowanie wiarygodną metodą oznaczania glutenu w produktach spożywczych w celu wykrycia, czy żywność nie jest zanieczyszczona glutenem. Celiakia jest chorobą immunologiczną przewodu pokarmowego spowodowaną spożyciem glutenu przez osoby szczególnie wrażliwe na gluten. Za szkodliwe działanie glutenu odpowiedzialne są głównie białka prolaminowe glutenu. Prolaminy zawierają duże ilości takich aminokwasów, jak glutamina (ok. 35%) oraz prolina (ok. 15%). Skład aminokwasowy białek prolaminowych oraz ich struktura powoduje, że u części osób ich trawienie jest utrudnione i wywołuje zaburzenia w pracy przewodu pokarmowego. Białka prolaminowe pszenicy (gliadynę), żyta (sekalinę), jęczmienia (hordeinę) oraz owsa (aweninę) przyjęto ogólnie nazywać glutenem. Ich szkodliwość dla osób chorych na celiakię jest zróżnicowana, a w przypadku prolamin owsa – dyskusyjna. Białka prolaminowe kukurydzy, gryki, ryżu, prosa i sorgo uznawane są za bezpieczne dla osób chorych na celiakię (Sollid L.M. i wsp., 2005). Osoby cierpiące na celiakię dla zachowania zdrowia muszą pozostawać przez całe życie na diecie bezglutenowej. Wykazano, że osoby chore na celiakię tolerują do 20 mg glutenu/kg spożywanej żywności dziennie. Istnieje wiele metod oznaczania glutenu uwzględniających jego szkodliwość dla osób chorych na celiakię (Bremer M., 2009). Główną rolę odgrywają wśród nich metody immunologiczne tj. metoda ELISA R5 Mendeza oraz metoda ELISA G12. W artykule przedstawiono przegląd metod wykorzystywanych do oznaczania glutenu w produktach spożywczych w aspekcie choroby celiakii.
Metoda PCR
Metoda PCR polega na wykrywaniu genów odpowiedzialnych za produkcję składników glutenu techniką reakcji łańcuchowej polimerazy (ang. polymerase chain reaction – PCR). W metodzie przeprowadza się powielanie łańcuchów DNA i analizuje się
19
określone sekwencje DNA. W porównaniu z innymi metodami badania białek metoda ta jest czulsza o kilka rzędów wielkości. Do badań glutenu, metoda PCR została po raz pierwszy zastosowana przez Allmanna M. i wsp., 1993, którzy zbadali 35 różnych próbek żywności, które potencjalnie mogły zawierać gluten. Badaniom poddano również dodatki piekarnicze oraz analizowano wpływ procesów technologicznych – podgrzewania i przetwarzania żywności na wyniki oznaczeń. Badanie PCR jest metodą na tyle czułą, że pozwala ona na wykrycie niewielkich ilości glutenu w próbkach skrobi pszennej, która z założenia nie powinna zawierać glutenu. W badaniu przeprowadzonym przez Köppela E. i wsp., 1998 analizie poddano próbki owsa, które zostały wzbogacone glutenem pszennym. Porównanie metody PCR i metody immunoenzymatyczną R5 ELISA wykazało, że metoda PCR jest dziesięciokrotnie czulsza niż metoda R5 ELISA. Dahinden I. i wsp., 2001 udoskonalili metodę PCR i opracowali tzw. test QC-PCR, co pozwoliło na oznaczanie zanieczyszczeń próbek żywności pszenicą, żytem i jęczmieniem. Metodę zastosowano do 15 produktów bezglutenowych. Uzyskane wyniki były porównywalne z testem ELISA wykonanym przy użyciu przeciwciała monoklonalnego R5 (mAb). Wyróżniającą się techniką wśród metod PCR jest metoda Real Time PCR. Metoda opiera się na zastosowaniu ilościowej reakcji łańcuchowej polimeryzacji w czasie rzeczywistym. Metoda wykorzystując techniki fluorescencyjne, pozwala na monitorowanie ilości produktu reakcji w czasie jej trwania, co odróżnia ją od klasycznej reakcji PCR. Dzięki temu cała procedura analizy jest stosunkowo szybka.
„
Badanie PCR jest metodą na tyle czułą, że pozwala ona na wykrycie niewielkich ilości glutenu w próbkach skrobi pszennej, która z założenia nie powinna zawierać glutenu.
„
