ROW update van het lab: stamcellen en een nieuwe kenmerk in bloed van patienten
Dr. Valeria Orlova Dr. Franck Lebrin Prof. Christine Mummery HHT Patientdag 2017 28-10-2017
BLOEDVATEN: VAN KLEIN TOT GROOT MICROVASCULAR NETWORK
FUNCTIE: BRENGEN VOEDINGSTOFFEN EN ZUURSTOF NAAR ALLE WEEFSELS EN ORGANEN 1
BLOEDVATEN: VAN KLEIN TOT GROOT MICROVASCULAR MICROVASCULAR NETWORK NETWORK
FUNCTIE: BRENGEN VOEDINGSTOFFEN EN ZUURSTOF NAAR ALLE WEEFSELS EN ORGANEN
Endotheelcellen betrokken in ROW 2
BLOEDVATEN: VAN KLEIN TOT GROOT MICROVASCULAR MICROVASCULAR NETWORK NETWORK
1) ROW : AFWIJKINGEN IN KLEINEBLOEDVATEN 2) MUIZEN MET ROW: MATURATIE VAN BLOEDVATEN GEREMD, VERLIES VAN vSMC EN PERICYTEN OP DE BUITENKANT VAN DE VATEN LEIDT TOT ZWAKKE BLOEDVATEN EN BLOEDINGEN
3) BLOEDVATEN VERWIJDEN, ADERS EN SLAGADERS WORDEN ZONDER TUSSENLIGGEND CAPILLAIREN VERBONDEN 3
WAAROM?
GEINDUCEERD PLURIPOTENTE STAMCELLEN VAN PATIENTEN (hIPSC)
ONBEPERKTE BRON VAN PATIENT CELLEN ONDERZOEKEN WAAROM BLOEDVATEN AFWIJKEND ZIJN ZOEKEN VOOR NIEUWE MEDICIJNEN 4
Adapted from: Bellin and Mummery Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2012
WEEFSEL VAN PATIENTEN VOOR STAMCEL PRODUCTIE
Huid biopt
Bloed
Urine
Hoeveelheid nodig
4mm
10ml
300ml
celtyp
huid fibroblasten
Erythroblasten
niercellen
Efficientie van herprogrammering
++++
++++
+++
Patient belasting
+++
+
-
Voor kinderen?
nee
nee
ja
Biopt opslag?
ja
nee
nee
LUMC IPS CORE FACILITY 5
HHT Mutaties
Data from HHT mutations database: http://www.arup.utah.edu/database/HHT/ 2015 6
GENERATION OF INDUCED PLURIPOTENT STEM CELL LINES FROM HHT1 PATIENTS (HHT1-IPSCS) c.782G>A c.1083delAA c.1234+2T>C
ATG 1
2
3
4
5
6
7
8
EXTRACELLULAR
Splice-site mutations Frameshift mutations ENG mutations
Premature stop codon
Missense mutations HHT Patient day 2015 7
9A
c.1678C>T
B
10
RGD
11
12
13
14
TM
LUMC0008iENG 8: c.1083delAA ♀ LUMC0009iENG 5: c.1234+2T>C ♀ Haploinsufficiency LUMC0082iENG 11: c.1678C>T ♂ LUMC0083iENG WT ♂ LUMC0105iENG 6: c.782G>A ♂ LUMC0106iENG 6: c.782G>A ♀ LUMC0107iENG 6: c.782G>A ♂
GENERATION OF INDUCED PLURIPOTENT STEM CELL LINES FROM HHT2 PATIENTS (HHT2-IPSCS) c.1042delG ATG 1
2
3
4
5
6
EXTRACELLULAR TM
7
c.1120C>T c.1139T>G c.1120del18bp 8
9
10
KINASE DOMAIN
Kinase domain LUMC0001iALK1 8: c.1139T>G ♀ LUMC0002iALK1 8: c.1042delG ♂
Premature stop codon ALK1 mutations
LUMC0011iALK 8: c.1120C>T ♀ Frameshift mutations Missense mutations
8
LUMC0110iALK 8: c.1120del18bp ♂ LUMC0111iALK 7: c.1042delG ♂ LUMC0112iALK 7: c.1042delG ♂
INDUCED PLURIPOTENT STEM CELL LINES FROM HHT PATIENTS (HHT-IPSCS) (LUMC) hiPSCs
Reprogramming method
Number of clones
Somatic cells
CDS
Protein
Sex
LUMC iPSC line
HHT2c.1139T>G
RV
2
Fibroblast
c.1139T>G
p.Val380Gly
Female
LUMC0001iALK1
HHT2c.1042delG
RV
1
Fibroblast
c.1042delG
p.Asp348Thrfs *
Male
LUMC0002iALK1
HHT1c.1083delAA
LV
9
Fibroblast
c.1083delAA
p.T361fs
Female
LUMC0008iENG
HHT1c.1234+2T>C
LV
9
BOECs
c.1234+2T>C
N/A
Female
LUMC0009iENG
HHT2c.1120C>T
LV
4
Fibroblast
c.1120C>T
p.Arg372Trp
Female
LUMC0011iALK
HHT1c.1678C>T
Episomal
3
Erythroblast (PB)
c.1678C>T
p.Q560X
Male
LUMC0082iENG
HHT1WT
Episomal
3
Fibroblast
WT
WT
Male
LUMC0083iENG
HHT1c.782G>A #1
Episomal
3
Fibroblast
c.782G>A
p.Trp261Arg
Male
LUMC0105iENG
HHT1c.782G>A #2
Episomal
3
Fibroblast
c.782G>A
p.Trp261Arg
Female
LUMC0106iENG
HHT1c.782G>A #3
Episomal
3
Fibroblast
c.782G>A
p.Trp261Arg
Male
LUMC0107iENG
HHT1c.1120del18bp
Episomal
3
Fibroblast
c.1120del18
p.Arg374_Glu 379del
Male
LUMC0110iALK
HHT1c.1042delG
Episomal
3
Fibroblast
c.1042delG
p.Asp348Thrfs *
Male
LUMC0111iALK
HHT19c.1042delG
Episomal
3
Fibroblast
c.1042delG
p.Asp348Thrfs *
Male
LUMC0112iALK
Erythroblasts
PBMCs
EEN MOZAIEK HHT1 PATIENT IN NEDERLAND
Blood (+) Buccal swab (-) Skin Fibroblasts (-) Fib-iPSCs (-) PBMCs (-)
HHT1 Patient: ENG;11 c.1678C>T 10
Erythroblast (+)
EEN MOZAIEK HHT1 PATIENT IN NEDERLAND
URE 2.
Mo
ddPCR
Stro Fib
PBMCs
Mo ECFCs
Ery
ENG Mut-probe
Gr
ENG Mut-probe
Ly
HHT1 Patient: ENG;11 c.1678C>T
C. 50 40 30
11
ENG Wt-probe
ENG Wt-probe
n as S t Mo t ro s G no ma ra c y Ly nulo t e mp cy s ho t e s cy Ery PB t es t MC + hro Mo bla s n st EC ocyt s F e EC Cs s F # EC Cs 1 F # EC Cs 2 F # EC Cs 3 F # EC Cs 4 FC #5 s #6
PBMCs
HHT1 Patient: ENG;11 c.1678C>T
12
ECFCs
Stro
ddPCR
Fib
ddPCR B.
Mo
ECFCs
50 40 30 20 10 0
Ery 4000
%ENG MUT Probe (ddPCR) Fi ENG Mut-probe Mut-probe b
D.
C.0
no cyt es
Gr
Ery
Mo
Mo
Mo
14 +
Ly PBMCs
Sk ro b i n la S st Mo t ro s G no ma ra c y Ly nulo t es mp cy ho t es c C Er PB yt e D yt M s 14 h C + ro Mo bla s n st EC ocyt s F e EC Cs s F # EC Cs 1 F # EC Cs 2 F # EC Cs 3 F # EC Cs 4 FC #5 s #6
Fib
D
50 40 30
Stro
C
no cyt es
URE 2.
Mo
Mo
CD105, MFI
Ly ECFCs
EEN MOZAIEK HHT1 PATIENT IN NEDERLAND Gr C
C.
ENG Wt-probe
HHT1WT
% Cells harbouring mutation
3000
2000
1000
HHT1c.1678C>T
CD105 MFI ECFCs
Fibroblasts Skin Stroma Monocytes Granulocytes ENG Wt-probe Lymphocytes PBMCs Erythroblasts CD14+ Monocytes ECFCs 3 23 53 56 20 37 73 92 >80
ISOGEEN HHT1-iPSCs VAN MOZAIEK HHT1 PATIENT
hiPSCs
Reprogramming method
Number of clones
Somatic cells
ENG CDS
ENG Protein
Sex
HHT1WT
Episomal
3
Fibroblast
WT
WT
Male
Identical DNA profile:
HHT1c.1678C>T
Episomal
3
p.Q560X
Male
HHT1WT LU0082iENG HHT1c.1678C>T
Erythroblast c.1678C> (PB) T
DNA LUMC iPSC Fingerprinting line
LU0083iENG
LUMC0082iENG20 SSEA4 & Nanog & Oct3/4 SSEA4/NANOG/OCT3/4
HHT1WT
HHT1c.1678C>T
100x
13
400x
ISOGEEN HHT1-iPSCs VAN MOZAIEK HHT1 PATIENT
FIGURE 4. A.
HHT1WT
HHT1WT
HHT1WT
HHT1WT
Fib
Endothelial Cells
hiPSCs
Monocytes
M1/M2 M⏀
Ery
15000
0
CD31, MFI
0.5 0.0 R C G K1 K5 1 3 D N E AL AL CD K VE
F.
N=3
20000 10000 0
ns
1500
ns
1000
50
0
500
* * *
2000 0
N=5
0
G.
4000
M0
30000
6000
M2
5000
100
**** **
M1
10000
KDR, MFI
*
**
CD105, MFI
5000
ns
M2
10000
0
1.0
14
20000
M1
1.5
****
Mo and M1/M2 M⏀
D.
M0
2.0
15000
HHT1c.1678C>T
% CD45+ CD14+
HHT1c.1678C>T
Endothelial Cells CD105, MFI
HHT1WT
C.
HHT1c.1678C>T
n
E.
Endothelial Cells
n
Relative cDNA expression
B.
HHT1c.1678C>T
VEC, MFI
HHT1c.1678C>T
H.
BLOEDVATEN “OP EEN CHIP”
Endothelial Cells
Pericytes
van der Meer and Orlova et al., 2013.
Collagen Gel
BLOEDVATEN “OP EEN CHIP”
Endothelial Cells
Collagen Gel
48 uren time lapse video
200 μm
van der Meer and Orlova et al., 2013.
BLOEDVATEN “OP EEN CHIP”
Endothelial Cells
Pericytes
Collagen Gel
24 uren time lapse video
200 μm
van der Meer and Orlova et al., 2013.
HHT ROW
Gezond weefsle
TE VEEL AFTAKINGEN VAN BLOEDVATEN IN HHT2
Bloedvaten “fragiel”
WAAROM? 18
ABNORMALE ANGIOGENESE IN HHT2 “STAMCEL-BLOEDVATEN” Acvrl1 control+/-; sFlt-1 Acvrl1+/-
Hoechst/Nanog
control
Acvrl1+/-
200mm
Acvrl1+/+
• VEGF belangrijk voor bloedvaten vorming • Verlaagd VEGF-receptoren in HHT2 endotheelcellen PECAM
sVEGFR1
PECAM
mVEGFR1
200mm
Acvrl1+/-
*
* * * * * *
TOEVOEGEN VAN sVEGFR1 HERSTELD STAMCELBLOEDVAT AFWIJKING IN HHT2 Acvrl1+/-; sVEGFR1
Acvrl1+/-
control
Acvrl1+/-; mVEGFR1
*
*
200mm
200mm
200mm
1.5
mVEGFR1
0.5 0.0
sVEGFR1
1.0
Acvrl1+/+
**** **** ****
40 30 20 10 0
mVEGFR1
2.0
50
sVEGFR1
2.5
**** **** ****
Percent filopodia within angle > 50°
Acvrl1+/Tip cell number per sprout
control
200mm
Acvrl1+/-
VEGFR1 EXPRESSIE IS LAGER IN HHT2 PATIENTS
sVEGFR1 is verlaagd in bloed van HHT2 patienten Een nieuwe idee voor therapie?!
THANK YOU! Department of Anatomy and Embryology Professor Christine Mummery Dr Valeria Orlova Lisa van den Hil Department of Kidney Disease Dr Franck Lebrin
LUMC iPS Core Facility Dr. Christian Freund
St. Antonius Hospital Nieuwegein Dr. Kees Westermann Dr. Hans Jurgen Mager Dr. Frans Disch Dr. Repke Snijder Dr Anna Hosman