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Efecto del Diclofenaco sódico sobre la fisiología reproductiva de Daphnia pulex Research · June 2015 DOI: 10.13140/RG.2.1.3038.7367
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1 author: Carlos Eduardo Restrepo Giraldo Institute of Ecology INECOL 3 PUBLICATIONS 1 CITATION SEE PROFILE
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Efecto del Diclofenaco sódico sobre la fisiología reproductiva de Daphnia pulex Estefania Chamorro1, Juana Carolina Osorio, Carlos E. Restrepo Giraldo1. 1: Estudiantes
de Biología, Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Caldas, Manizales-Colombia.
Introducción Diariamente, las actividades humanas generan impactos de diverso orden y magnitud sobre su entorno, de este modo, hasta las actividades más simples como son la higiene y el cuidado de la salud, implican el uso de productos que pueden convertirse a largo plazo en factores adversos y de desequilibrio en el ecosistema. Los fármacos de amplio uso como el Diclofenaco, son catalogados por muchos científicos como Contaminantes Emergentes, los cuales por definición, sabemos que son compuestos de distinta naturaleza química y origen, de los cuales, aún no se conoce muy bien las implicaciones que tienen sobre los organismos y el ecosistema, y que en muchos casos carecen de algún tipo de regulación (Henriquez, 2012). Cabe resaltar que este tipo de contaminantes (en el caso de los fármacos como el Diclofenaco) no tienen que ser persistentes en el medio para generar un impacto adverso, si bien son tratados, su continuo consumo y excreción, asegura su introducción y permanencia en el medio ambiente (Barceló, 2003). Por ejemplo, en Alemania, para los efluentes de aguas servidas, se ha llegado a registrar una carga hasta de 100g/dia de Diclofenaco de Sodio (Ternes, 1998). Si bien dichos compuestos químicos están diseñados para el bienestar de nuestra salud, aún no conocemos la magnitud real del efecto de estos sobre la salud del ecosistema. Por esto, se desarrollan pruebas de Ecotoxicidad. Ensayos de Toxicidad Aguda aplicados a organismos acuáticos proponen que existe un bajo riesgo ecotoxicológico (Han et al.,2006), no obstante en ensayos de Toxicidad Crónica, el panorama es diferente, ya que los individuos son expuestos a bajas concentraciones a lo largo de todo su ciclo vital (Fent et al., 2006), así, estos ensayos representan un estudio más completo en comparación a los ensayos de toxicidad aguda, pues debido al tiempo de exposición que manejan, se pueden estudiar efectos
sobre la longevidad, el desarrollo y la fecundidad (Schindler, 1987). En el caso del Diclofenaco sodico, por ejemplo, se han hecho ensayos de toxicidad aguda para Fitoplancton y Zooplancton, los cuales mostraron una mayor sensibilidad del Fitoplancton (CE50(96h)=14,5mgL-1 y CE50(96h)=22,43mgL-1respectivamente) medida en términos de la concentración efectiva necesaria para afectar al 50% de la población expuesta al cabo de 96 horas (Ferrari et al., 2003). Gran parte de estos estudios de ecotoxicología realizados en organismos acuáticos, se enfocan en la toxicidad aguda o mortalidad (Silva, 2003; Núñez, 2005; Foster, 1998; Díaz et al., 2004), aunque es de mayor importancia conocer el efecto que las concentraciones subletales de contaminantes tienen sobre el crecimiento, la reproducción y la supervivencia de los organismos expuestos (Jak & Meador, 1997). No es necesario alcanzar concentraciones letales cuando hablamos de algún agente contaminante, solamente con concentraciones subletales, se pueden originar efectos crónicos sobre las poblaciones de organismos acuáticos propiciando un impacto nocivo difícilmente medible a largo plazo. Se piensa que dichos efectos crónicos podrían perjudicar la supervivencia, reproducción, crecimiento, comportamiento filtrador y fisiología de los invertebrados acuáticos que forman el zooplancton (Bodar et al., 1988). En los ambientes acuáticos, cuando se presentan concentraciones subletales de ciertos contaminantes, puede generarse eutrofización debido a la inhibición de la tasa de filtración del zooplancton (Jark et al.,1996). Así, esta inhibición, puede usarse como un indicador rápido y sensible de estrés tóxico, y puede ayudar a explicar otros cambios observados en la supervivencia, crecimiento y reproducción; pues al verse alterada la tasa de filtración e ingestión de alimento, no hay disponible suficiente energía para que los organismos incrementen su tamaño corporal e inicien su reproducción,
dado que la madurez sexual en Daphnia magna por ejemplo, es función de su tamaño corporal, no de su edad (Polohiemo et al., 1982; Hanazato, 1998). En el zooplancton, Daphnia magna Strauss (Crustacea:Cladocera) representa una herramienta excepcional como bioindicador en los estudios de ecotoxicología acuática, por ser un organismo muy sensible a los diversos tipos de contaminación acuática (Hanazato, 1998; Abe et al., 2001). Las poblaciones normales de Daphnia solo están compuestas por hembras partenogénicas, que producen huevos diploides de los cuales eclosionan hembras partenogénicas que poseen desarrollo directo. Bajo ciertas condiciones de estrés, como aumento de la temperatura o reducción de la disponibilidad del alimento, se induce la aparición de machos, los cuales van a reproducirse sexualmente con las hembras, generando huevos fecundados de resistencia, llamados Efipias, los cuales, una vez haya pasado la condición adversa o estrés eclosionan dando lugar a hembras partenogénicas, iniciando de nuevo el ciclo de reproducción partenogénica (Ruppert & Barnes, 1996). Este estudio pretende realizar ensayos de toxicidad crónica del Diclofenaco sódico en distintas concentraciones sobre Daphnia pulex, con el fin de encontrar el rango donde se genere estrés toxicológico que pueda inducir a D. pulex a cambiar su tipo de reproducción partenogénica por la reproducción sexual. Materiales y Métodos Animales Experimentales Para la ejecución del experimento se utilizaron individuos de Daphnia pulex provenientes de un cultivo preexistente en el Laboratorio de Zoología de la Universidad de Caldas (Fig.1), el cual cuenta con condiciones estandarizadas (fotoperiodo de 12:12, temperatura promedio 22ºC) para el óptimo desarrollo de D. pulex.
Figura 1. Cultivo de Daphnia pulex, caja de luz y pipeta adecuada para extracción de D. pulex.
Alimentación Los individuos se alimentaron con soluciones establecidas en el protocolo que maneja el Laboratorio de Zoología de la Universidad de Caldas (0.4g Selenio, 0.4mL vitamina B12, 0.2g Biotina, 0.2g Tiamina, 2.54g Tetracolor, 0.2g Alfalfa; todo para un volumen de 20mL). Agua Reconstituida El medio en el que se desarrollaron los ensayos de toxicidad es el mismo que se prepara para la cria de D. pulex en el Laboratorio de Zoología de la Universidad de Caldas (20mL NaHCO₃, 40mL MgSO₄, 10mL KCl, 1.89g CaSO4; todo para un volumen de 18L). DL50(24h) Previo a los ensayos de toxicidad crónica, se realizaron ensayos de toxicidad aguda, donde se buscaba el valor del DL50(24h) de Diclofenaco para D. pulex tomando como referente la concentración propuesta por Ferrari et al. (2003) la cual es CE50(96h)=22,43mgL-1. Esto con el fin de establecer un punto límite de concentración para preparar las soluciones stock de Diclofenaco sódico para los ensayos de toxicidad crónica. Montaje y Ejecución Experimental Una vez determinado el valor de concentración de Diclofenaco sódico correspondiente al DL50(24h), se prepararon soluciones stock a 800, 900, 1000, 1100 y
1200ppm (Fig.2), de las cuales se adicionaba 2 mL al agua reconstituida donde se encontraban los individuos de D. pulex, aforando hasta 80mL. Por cada tratamiento se contó con 3 repeticiones, y cada una contenia 10 individuos hembras de D. pulex. Igualmente se tenían 3 repeticiones con individuos contro, sin exposición al fármaco. Se tomaron registros de muertes y neonatos o efipias si se encontraban. Los datos fueron consignados en una matriz, de la cual se muestra la ultima lectura antes de desmontar el experimento.
Resultados Se llevaron a cabo ensayos preliminares para determinar el rango en el cual se llevaría a cabo el ensayo definitivo, buscando los porcentajes en los cuales todos los organismos expuestos presentaran el 100% de mortalidad y donde ninguno de los individuos expuestos se muriera. Se realizaron pruebas de concentraciones a intervalos de 25000-5.000ppm, 5.0001000ppm presentando mortalidad en todos los tratamientos, además de 200-1.000ppm con supervivencia total de la población. Con estos datos obtenidos decidimos realizar la prueba de toxicidad crónica en concentraciones de 800, 900, 1.000, 1.100 y 1.200 ppm (Fig.3).
Figura 2. Beakers de 80mL donde se depositaron las soluciones stock a diferentes concentraciones.
Replica 1
Replica 2
Replica 3
Adultos
Neonatos
Adultos
Neonatos Adultos
Neonatos
Control
9
6
10
5
9
2
800 ppm
0
0
0
0
5
0
900 ppm
0
0
3
0
5
0
1000 ppm
0
0
0
0
7
0
1100 ppm
0
0
2
0
2
0
1200 ppm
0
0
0
0
4
0
Figura 3. Resultados de ensayo de toxicidad crónica del Diclofenaco sódico en D. pulex.
Los resultados del ensayo de toxicidad crónica del Diclofenaco sódico en el medio de cultivo de D. pulex presentó datos inconsistentes en las tres réplicas
efectuadas. El control de la primera réplica solo presentó un individuo muerto y 6 neonatos partenogenéticos. Sin embargo los tratamientos con concentraciones de 800 hasta 1200ppm se encontraron los individuos muertos. Los tratamientos de la réplica 2 con
concentraciones de 900 y 1100ppm presentaron 3 y 2 individuos vivos respectivamente, en el control se encontró 10 individuos adultos igualmente a los ingresados inicialmente, además de 5 neonatos. En la réplica 3 los tratamientos con Diclofenaco sódico mostraron valores dispersos frente a la letalidad del fármaco, el cultivo con 1000 ppm fue el que presentó un mayor número de individuos vivos a pesar de ser la tercera concentración más alta, en 800 y 900ppm habían 5 adultos vivos, seguido de 1200ppm con 4 individuos vivos y por último 1100ppm con sólo 2 adultos vivos; el control no mostró muertes de individuos y además habían 5 neonatos. En ninguno de los tratamientos con las concentraciones de Diclofenaco sódico se registraron neonatos partenogenéticos ni efipias, sin embargo en la réplica 3 en las concentraciones de 1000 hasta 1200ppm presentaban huevos en su vientre, además de una apariencia robusta comparada con los individuos de los otros tratamientos. En relación a la producción de huevos epifias dependen principalmente de la temperatura, además las daphnias pueden adaptarse a ambientes nuevos en los tres y siete días, reproduciéndose partenogenéticamente (Blanco & Tacon, 1989). Los valores de supervivencia de D. púlex en los controles no presentaron variaciones anómalas de sensibilidad, sin embargo los datos de los tratamientos no corresponden a un patrón normal como ya se había expuesto anteriormente, se podría suponer que aquellos individuos con Diclofenaco sódico en su medio son más susceptibles a causas externas cuando se encuentran expuestos a esta condición de estrés, alterando sus respuestas; si observamos los resultados de la réplica 3 fueron significativamente diferentes comparada con la otras replicas, esto tal vez pudiéndose atribuir a la ubicación de los tratamientos en la zona posterior de la estantería donde se ubicaba la bandeja con los beakers del ensayo, a los cuales se les brindaba mayor protección ante cualquier
fuente de contaminación externa. Las condiciones del cultivo pudieron haber incurrido en los datos heterogéneos de las réplicas, los cultivos mostraban unas capas de polvo en la superficie y presencia de mosquitos muertos, la cortina protectora de la dicha estantería no cubría en su totalidad la bandeja donde se ubicaban los tratamientos. En los métodos de evaluación de calidad de agua de Castillo (2004) sugiere la utilización de papel Parafilm para evitar este tipo de contaminación. Para garantizar la fiabilidad de los datos en ensayos toxicológicos se hace necesario usar además del compuesto de prueba, sustancias de referencia como el Dicromato de potasio, efectuando ensayos que demuestren las condiciones experimentales de laboratorio, asegurando que la respuesta de la especie sometida al ensayo no varié significativamente (Ramírez & Mendoza, 2008).
Discusión Daños Sódico
fisiológicos
por
Diclofenaco
Debido a la dificultad que existe al comparar las diferentes respuestas en los distintos niveles de organización biológica como son: el celular, el individual, y finalmente, el nivel de ecosistema así como los complejos estudios necesarios para estudiar estas relaciones, la realización de estudios simultáneos de fisiología y parámetros ecológicos aporta una importante información para entender los mecanismos de acción de los contaminantes en los seres vivos (Knops et al., 2001). De particular importancia, son los compuestos y sustancias que afectan el sistema endocrino, debido a que esta interferencia puede traer consigo efectos negativos en el crecimiento, desarrollo, comportamiento y reproducción, incluso a bajas concentraciones ambientales (Daughton and Ternes, 1999; Petrovic, 2004).
La estrecha relación entre las alteraciones fisiológicas de los organismos y los efectos en los niveles superiores de organización biológica (por ejemplo, efectos en la población) rara vez han sido evaluados, sin embargo, las sustancias que alteran el control hormonal reproductivo, se consideran particularmente consecuentes en términos de potencial sobre las poblaciones (Hewitt et al., 2000). Específicamente, los problemas ambientales debido a compuestos estrogénicos están relacionadas con los ambientes acuáticos (Rosa et al.,2010). En los últimos años, alteraciones en el desarrollo sexual de dáfnidos han sido usados como criterio de valoración tras la exposición a compuestos disruptores endocrinos. Autores como, Olmstead & LeBlanc (2000), demostraron que tanto Dietilbestrol (DES) y metopreno, aumenta el tamaño abdominal en relación con el cuerpo (Baer et al., 2009). Los resultados evidencian un efecto positivo en el crecimiento abdomen/cuerpo de hembras expuestas al 5% del efluente (aguas residuales expuestas a contaminantes de industria papelera), relacionando estos efectos con alteraciones endocrinas. Por otra parte, se ha demostrado que los contaminantes orgánicos e inorgánicos son capaces de alterar las tasas de alimentación de Daphnia sp, rápidamente. Un proceso que puede estar relacionado a la absorción de contaminantes por las algas o partículas de alimento ingerido (Barata et al., 2006). Según Alanis (2009), los efectos directos del Diclofenaco Sodico, se reflejan en el estrés oxidativo, formación de radicales libres y el efecto oxidativo sobre biomoleculas, tales como la lipoperoxidación, daño a proteínas, daño al ADN y daños a las defensas antioxidantes (superoxido dismutasa, catalasa y glutatión peroxidasa). La acción farmacológica de este compuesto es debida a la inhibición de la enzima ciclooxigenasa (COX2) y en consecuencia de la síntesis de prostaglandinas. Este fármaco
es biotransformado en el hígado mediante la acción del citocromo P450 produciendo 4hidroxidiclofenaco, entre otros metabólitos. Diversos estudios realizados en mamíferos, han demostrado que el diclofenaco puede generar daño celular, así como apoptosis, debido a la producción de radicales libres y especies reactivas de oxígeno durante su biotransformación, por lo que la evaluación del estrés oxidativo puede ser un buen biomarcador de daño. Resultados obtenidos muestran que el diclofenaco a concentraciones subletales produce incrementos significativos en LPX (lipoperoxidacion) y PO (proteínas oxidadas) y modificaciones de la actividad de las enzimas antioxidantes evaluadas en ambos organismos de prueba (Galar et al., 2009). El daño directo a las proteínas o la modificación química de sus aminoácidos producido por estrés oxidativo puede dar lugar a un incremento en el contenido de proteínas carboniladas (Parvez y Raisuddin, 2005; Bagnyukova et al., 2006) y por lo tanto de las proteínas oxidadas (Shacter, 2000). La oxidación de proteínas trae como consecuencia la perdida de grupos sulfhídricos y reacomodo en la resonancia de los aminoácidos, modificando su función y por lo tanto la integridad del organismo (Parvez y Raisuddin, 2005) De manera general se ha observado que los organismos más sensibles a cualquier toxico son aquellos que se encuentran en los extremos de la vida, dado que los sistemas enzimáticos de los individuos más jóvenes no se encuentran totalmente desarrollados y de los viejos comienzan a fallar. Sin embargo cuando los metabólitos son mas tóxicos que en xenobiotico origina, esta condición enzimática puede resultar favorable dado que al no ser posible su completa y eficaz biotranformación dichos metabólitos no son obtenidos y por lo tanto su toxicidad decrece (Analis, 2009). En síntesis, los resultados obtenidos por este estudio a simple vista parecen no seguir un
patrón definido que pueda interpretarse como una respuesta contemplada dentro de las predicciones establecidas al inicio del experimento, las cuales apuntaban a definir un rango de concentraciones subletales de Diclofenaco sódico que posiblemente generasen un grado tal de estrés en D. pulex para cambiar su tipo de reproducción; lo que se tiene, posiblemente sea producto de
disrupción endocrina actuando a niveles pre reproductivos, tales como la síntesis de hormonas sexuales, o los factores liberadores de estas, también como el desarrollo de caracteres sexuales; además esta imposibilidad reproductiva pueda verse facilitada por el daño a nivel estructural ocasionado por la lipoperoxidación y la liberación de algunos radicales libres.
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