4 sl 2015

e-mail: medalfavit@mail.ru

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

1

2

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

Содержание

Современная лаборатория Том № 4 Медицинский алфавит

Серия журналов для специалистов

№ 18 (259) 2015 www.medalfavit.ru Издатель: издательство медицинской литературы ООО «Альфмед» Тел.: (495) 616-48-00 E-mail: medalfavit@mail.ru Учредитель и главный редактор издательства Т. В. Синицка Почтовый адрес редакции: 129344, г. Москва, ул. Верхоянская, д. 18, к. 2 Тел.: (495) 616-48-00, 221-76-48 E-mail: medalfavit@mail.ru Главный редактор серии журналов «Медицинский алфавит» А. С. Ермолов Редакционный совет журнала «Медицинский алфавит» В. Г. Акимкин, д. м. н., проф. А. Ж. Гильманов, д. м. н., проф. Е. А. Евдокимов, д. м. н., проф. А. С. Ермолов, д. м. н., проф. А. А. Кулаков, д. м. н., проф. Р. Г. Оганов, д. м. н., проф. В. И. Покровский, д. м. н., проф. С. А. Рабинович, д. м. н., проф. В. Е. Синицын, д. м. н., проф. С. К. Терновой, д. м. н., проф. Н. В. Шестопалов, д. м. н., проф. С. Н. Щербо, д. м. н., проф. Председатель редакционного совета журнала «Медицинский алфавит» серии «Современная лаборатория»: С. Н. Щербо Руководитель отдела рекламы и маркетинга: Т. Е. Чикмарева medalfavit@bk.ru Руководитель отдела продвижения, распространения и выставочной деятельности Б. Б. Будович medalfavit_pr@bk.ru Редакция оставляет за собой право сокращения и стилистической правки текста без дополнительных согласований с авторами. Мнение редакции может не совпадать с точкой зрения авторов опубликованных материалов. Редакция не несет ответственности за последствия, связанные с неправильным использованием информации. Журнал зарегистрирован Министерством РФ по делам печати, теле-, радиовещания и средств массовых коммуникаций. Рег. номер ПИ № 77–11514 от 04.01.2002 Уст. тираж 12 000. Формат А4. Цена договорная. При перепечатке ссылка на журнал «МА» обязательна. За содержание рекламы ответственность несет рекламодатель. За достоверность сведений, изложенных в статьях, ответственность несет автор. Подписан в печать 3 декабря 2015

Наш индекс в каталоге «РОСПЕЧАТЬ» 36228 (комплект) e-mail: medalfavit@mail.ru

5 Медицина 5П: прецизионная медицина С. Н. Щербо, Д. С. Щербо 11 Оптимизация деятельности лабораторной службы города Москвы А. Н. Цибин, М. Ф. Латыпова, В. Г. Стребков, Е. Л. Аверина, М. А. Годков 18 ИСО 9001 новой версии в сфере здравоохранения. Идеология и практика Е. К. Аванесов, О. В. Чередничук, В. Л. Эмануэль, Р. Бошкович, Г. А. Иванов, Е. А. Дуванова, А. В. Эмануэль 27 Клиническая лабораторная диагностика: анализ — диагноз — лечение В. В. Помазанов 32 Лабораторная диагностика альфа‑1-антитрипсиновой недостаточности при хронических заболеваниях легких М. Ю. Первакова, С. В. Лапин, А. А. Шумилов, О. Н. Титова, В. Л. Эмануэль, И. С. Ковалева, И. Б. Беляева, А. Л. Чудинов 38 Лабораторные методы оценки состояний соединительной ткани Г. А. Березовская 44 Современные возможности молекулярно-генетического анализа в диагностике хронических миелоидных опухолей И. А. Ольховский, А. С. Горбенко, Т. Н. Субботина, М. А. Столяр 47 Оценка эффективности теста определения уровня внеклеточной ДНК при диагностике онкологических заболеваний А. А. Гнеушева, В. Е. Веровский, О. В. Островский 50 Инновационные решения для диагностики, лечения и профилактики наследственных опухолевых синдромов Н. И. Беглярова, Н. А. Липатова, Е. В. Тиванова 58 Процедура валидации как инструмент расширения диагностических возможностей лаборатории на примере определения СA125 на анализаторе Access 2 и белка HE4 для расчета индекса ROMA при диагностике эпителиального рака яичников. Часть 1. Актуальность и необходимость проведения процедуры валидации теста СА 125 для расчета индекса ROMA* Н. А. Алхутова, Н. А. Ковязина, М. П. Бояркина, Н. Н. Зыбина, Н. М. Калинина, Т. А. Григорьева 63 Изучение многофункциональной системы протеина С как маркера тяжести течения хирургической инфекции и нарушения гомеостаза при синдроме системной воспалительной реакции и сепсисе В. В. Егорова, М. И. Титова, А. А. Звягин, В. С. Демидова, Н. Г. Аскеров 67 Иммунологическая оценка гемодилюции костного мозга при лабораторных исследованиях (на основании теста М. Локен) Л. Ю. Гривцова, Н. Н. Тупицын 72 Корреляция между показателями перекисного окисления липидов и выраженностью цитолитического синдрома у больных хроническими заболеваниями печени О. В. Разваляева, И. В. Родионова, В. В. Скворцов 76 Подписка

Contents 5 5P-medicine: precision medicine S. N. Shcherbo, D. S. Shcherbo 11 Optimization of laboratory service in Moscow city A. G. Tsybin, M. F. Latypova, V. G. Strebkov, E. L. Averin, M. A. Godkov 18 New version of ISO 9001 in health care. Ideology and practice E. K. Ovanesov, O. V. Cherednichuk, V. L. Emanuel, R. Boškovič, G. A. Ivanov, E. A. Duvanova, A. V. Emanuel 27 Clinical laboratory diagnostics: analysis — diagnosis — treatment V.V. Pomazanov 32 Laboratory detection of alpha‑1-antitrypsin deficiency in patients suffering from chronical lung pathology M. Yu. Pervakova, S. V. Lapin, A. L. Chudinov, A. A. Shumilov, O. N. Titova, I. B. Belyaeva, I. S. Kovaleva, V. L. Emanuel 38 Laboratory methods of assessing connective tissue G. A. Berezovskaya 44 Modern possibilities of molecular genetic analysis in diagnostics of chronic myeloid neoplasm I. A. Olkhovskiy, A. S. Gorbenko, T. N. Subbotina, M. A. Stolyar 47 Evaluation of effectiveness of test of assessment level of cell free DNA in cancer diagnostics A. A. Gneusheva, V. E. Verovsky, O. V. Ostrovsky 50 Innovative decisions for diagnostics, treatment and prevention of hereditary cancer syndromes N. I. Beglyarova, N. A. Lipatova, E. V. Tivanova 58 Validation procedure as tool of expanding laboratory diagnostic possibilities illustrated by examples of the determination of СA 125, Access 2 and protein HE4 in calculation of ROMA index under ovarian cancer diagnostics. Part 1. Actuality and necessity of a validation procedure for the test СA 125 in ROMA index calculation N. A. Alkhutova, N. A. Kovyazina, M. P. Boyarkina, N. N. Zibina, N. M. Kalinina, T. A. Grigorieva 63 Study of multi-functional protein C system as marker of severity of surgical infection and disturbance of homeostasis in systemic inflammatory response syndrome and sepsis V. V. Egorova, M. I. Titova, A. A. Zvyagin, V. S. Demidova, N. G. Askerov 67 Immunologycal detection of hemodilution in bone marrow aspirates (based on M. Loken’s test) L. Yu. Grivtsova, N. N. Tupitsin 72 Correlation of parameters of lipid peroxidation and severity of cytolytic syndrome in patients with chronic liver disease O. V. Razvalyaeva, I. V. Rodionova, V. V. Skvortsov 76 Subscription

C 2008 года журнал «Медицинский алфавит» включен в Научную электронную библиотеку и Российский индекс научного цитирования (РИНЦ), имеет Импакт-фактор.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

3

В 2015 году научно-практический медицинский рецензируемый журнал «Медицинский алфавит» включен в перечень рецензируемых научных изданий, в которых должны быть опубликованы основные результаты диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук и доктора наук (Перечень ВАК).

Председатель редакционного совета журнала серии «Современная лаборатория» Щербо Сергей Николаевич

Редакционная коллегия

Editorial Board

Вавилова Татьяна Владимировна, д. м. н., проф., зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики и генетики ФГБУ «Федеральный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» Минздрава России, г. Санкт-Петербург

Vavilova T. V., MD, DMSci, professor, North-Western State Medical University n. a. I. I. Mechnikov, St. Petersburg

Гильманов Александр Жанович, д. м. н., проф., вице-президент Российской ассоциации медицинской лабораторной диагностики, зав. кафедрой биохимии и лабораторной диагностики ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет», г. Уфа

Gilmanov A. V., MD, DMSci, professor, Bashkir State Medical University, Ufa

Годков Михаил Андреевич, д. м. н., врач высшей категории, рук. отдела лабораторной диагностики ГБУЗ «НИИ СП им. Н. В. Склифосовского», г. Москва

Godkov M. A., MD, DMSci, Research Institute of Emergency Medicine n. a. N. V. Sklifosovsky, Moscow

Долгих Татьяна Ивановна, д. м. н., проф., зав. центральной научно-исследовательской лабораторией и руководитель академического центра лабораторной диагностики Омской государственной медицинской академии, г. Омск

Dolgih T. I., MD, DMSci, professor, Omsk State Medical Academy, Omsk

Жукоцкий Александр Васильевич, д. м. н., профессор, профессор кафедры клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н. И. Пирогова», г. Москва

Zhukotsky A. V., MD, DMSci, professor, Russian Medical Academy of Postgraduate Education, Moscow

Косырев Александр Борисович, к. м. н., доцент кафедры биохимии ГБОУ ДПО «Российская медицинская академия последипломного образования», г. Москва, ген. директор ООО ТПО «Медиолаб», г. Москва

Kosyrev A. B., PhD, associate professor, Russian Medical Academy of Postgraduate Education, Mediolab, Moscow

Падюков Леонид Николаевич, проф. отделения ревматологии медицинского отдела Каролинского института, Стокгольм, Швеция

Padyukov L. N., professor of Karolinska Institute, Stockholm, Sweden

Первушин Юрий Владиславович, к. м. н., проф., зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики с курсом бактериологии ГБОУ ВПО «Ставропольский государственный медицинский университет», г. Ставрополь

Pervushin Y. N., PhD, professor, Stavropol State Medical University, Stavropol

Рысулы Мустафа Рысулович, д. м. н., проф., зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики Казахского национального медицинского университета имени С. Д. Асфендиярова (КазНМУ), президент Казахской ассоциации медицинской лабораторной диагностики (КАМЛД), г. Алматы, Казахстан

Rysuly M. R., MD, DMSci, professor, Kazakh National Medical University, president of Kazakh Medical Laboratory Diagnostics Association, Almaty, Kazakhstan

Тарасенко Ольга Анатольевна, д. м. н., проф., зам. генерального директора ФГБУ ВНИИИМТ Росздравнадзора, врач высшей квалификационной категории

Tarasenko O. A., MD, DMSci Hygiene and Epidemiology Centre, Moscow

Терёхина Наталья Александровна, д. м. н., проф., зав. кафедрой биохимии Пермской государственной медицинской академии им. акад. Е. А. Вагнера, г. Пермь

Teryokhina N. A., MD, DMSci, professor, Perm State Medical Academy n. a. acad. E. A. Wagner, Perm

Шипулин Герман Александрович, к. м. н., рук. отдела молекулярной диагностики и эпидемиологии ФБУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, г. Москва

Shipulin G. A., PhD, Central Research Institute of Epidemiology, Moscow

Щербо Сергей Николаевич, д. м. н., проф., вице-президент Российской ассоциации медицинской лабораторной диагностики, зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н. И. Пирогова», г. Москва

Shcherbo S. N., MD, DMSci, professor, Russian National Research Medical University n. a. N. I. Pirogov, Moscow

Эмануэль Владимир Леонидович, д. м. н., проф., зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, директор научно-методического центра Минздрава России по молекулярной медицине на базе СПбГМУ им. И. П. Павлова, вице-президент Российской ассоциации медицинской лабораторной диагностики, гл. специалист-эксперт по клинической лабораторной диагностике Росздравнадзора по Северо-Западному федеральному округу, г. Санкт-Петербург

Emanuel V. L., MD, DMSci, professor, First State Medical University of St. Peterburg n. a. I. P. Pavlov, St. Peterburg

ВНИМАНИЮ АВТОРОВ НАШЕГО ИЗДАНИЯ! Важная информация о форме цитирования материалов, опубликованных в журналах серии «Медицинский алфавит» В связи с требованием РИНЦ об унификации цитирования ссылки на материалы журнала следует оформлять в строгом соответствии с указанным образцом:

Например: Имельбаева Э. А., Гильманов А. Ж. Особенности эритроцитарных антигенов // Медицинский алфавит. — 2014. — Том 2 («Современная лаборатория»), № 12. — С. 14–18.)

Фамилия И. О. Название статьи. // Медицинский алфавит. — Год. — Том Х, № Х. — С. ХХ–ХХ.

Вопросы об оформлении ссылок направляйте, пожалуйста, по адресу medalfavit@mail.ru.

4

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

Медицина 5П: прецизионная медицина С. Н. Щербо, д. м. н., проф., вице-президент Российской ассоциации медицинской лабораторной диагностики, зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики Д. С. Щербо, к. б. н., научный сотрудник ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский университет имени Н. И. Пирогова» Минздрава России

С. Н. Щербо

5P-medicine: precision medicine S. N. Shcherbo, D. S. Shcherbo The Russian National Research Medical University n. a. N. I. Pirogov, Moscow, Russia

Резюме В обзоре прослеживается эволюция взглядов на развитие современной медицины и показано, что 2015 год стал переломным в формировании представлений о тенденциях и направлениях развития здравоохранения. По нашему мнению, сформировалась медицина 5П: предиктивная, превентивная, партисипаторная, персонализированная и прецизионная, которая на основе прорыва в естественных науках и информационных технологиях позволяет транслировать новейшие инновационные достижения в клиническую практику. Показана роль прецизионной, трансляционной, цифровой и лабораторной медицины, биоинформационных технологий и мобильного здравоохранения в доступности, экономичности и оптимизации оказания медицинской помощи. Особенно впечатляющими являются достижения медицины 5П, связанные с фармакологией (персонализированные лекарства), онкологией, разделением на типы, и лучшее понимание патогенеза заболеваний. Рассмотрены некоторые технологии лабораторной и функциональной диагностики, которые смогут дистационно контролировать состояние пациента в режиме семь дней в неделю и 24 часа в сутки.

Summary This review traces the evolution of views on the development of modern medicine and shows that 2015 was a turning point in the formation of ideas about the trends and directions of development of public health. Д. С. Щербо The 5P-medicine was shaped — predictive, preventive, participatory, personalized and precision, which, on the basis of the breakthrough in the biomedical sciences and information technology, allows to translate the latest innovative advances to the clinical practice. Authors show the role of the precision, translational, digital and laboratory medicine, bioinformatics and mobile health care for accessibility, efficiency and optimization of health care. Particularly impressive are the achievements of 5P-medicine in pharmacology (personalized drugs), oncology, classification a better understanding of the pathogenesis of diseases. Authors discuss certain technologies of laboratory and functional diagnostics, which allows for remote monitoring of the patient for 7 days a week and 24 hours a day.

Ключевые слова: медицина 5П, прецизионная медицина, трансляционная медицина, мобильная медицина, цифровая медицина.

Key words: 5P-medicine, precision medicine, translational medicine, mobile health, digital health.

М

едицина XXI века позиционирована, как медицина 4П: предиктивная (предсказательная); предупредительная (профилактическая); партисипаторная (participatory) (пациент — участник процесса, которого информируют, обучают, помогают в выборе и заботятся); персонализированная (индивидуальная) (Лерой Худ, США, 2008). Национальный институт здоровья (NIH, США) включил указанное направление в пятерку приоритетов развития медицины в нынешнем столетии, которое также активно поддержано еврокомиссией. В январе 2015 года в США объявлено о развитии прецизионной медицины (ПрМ), и с нашей точки зрения можно утверждать, что появилась новая медицина, и предложить новый термин: медицина 5П [1, 2]. Президент России Владимир Путин поручил правительству в 2016 году выделить из федерального бюджета e-mail: medalfavit@mail.ru

средства на поддержку программы «Национальная техническая инициатива» (НТИ, которая охватывает несколько направлений, в том числе развитие персонализированной медицины (ПМ). Финансовые вливания в Национальную технологическую инициативу составят до 10 млрд рублей. Агентство стратегических инициатив (АСИ) — структура, основной задачей которой является запуск стратегических инициатив по заказу руководства страны. АСИ перечислены основные направления НТИ, в частности, в группе «рынки» обозначено направление HealthNet (персональная медицина). В прогнозе научно-технологического развития РФ на период до 2030 года указано, что ПМ является перспективным направлением развития как в научном, так и практическом аспектах (создание национальных баз данных (БД) геномной информации и центров,

а также аппаратно-программных комплексов и лабораторных протоколов применения реагентов для целей ПМ). Рассмотрим историю и эволюцию развития медицины 5П, которая всегда была тесным образом связана с прогрессом в развитии естественных наук и прежде всего биологии. С древних времен врачи в лечении пациентов применяли индивидуализированный подход (в частности, в восточной медицине). Первый этап истории ПМ был закончен в 1953 году с открытием структуры молекулы ДНК [3]. Второй этап был закончен в 2000 году завершением проекта «Геном человека» и характеризовался стремительным развитием трансляционных генетических технологий (микробиочипы и секвенирование) [4]. Начался третий постгеномный этап, характерной чертой которого является массовое исследование пер-

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

5

сональных геномов, накоплением огромных массивов генетической информации и поиском наличий в геноме данного индивида набора достаточно распространенных измененных генов (генных вариантов), который, как предполагается, коррелирует с подверженностью определенному заболеванию (common variants / common disorder, общие варианты / общие заболевания, CV/ CD), что поможет понять механизм наследования сложных мультифакторных заболеваний (МФЗ). Однако для большинства МФЗ значимых корреляций обнаружить не удалось, или они были небольшими, поэтому к 2010 году возникла серьезная дискуссия на страницах Nature и Cell [5], и стала понятной необходимость поиска, кроме генетических полиморфизмов, других клинически значимых биомаркеров на уровне разных омов (метаболом, транскриптом, протеом и др.) [6–10]. Возникают представления об ОМИКСных технологиях [11,12] и интерактивном персональном ОМИКСном профилировании (иПОП) [13, 14] которые комбинируют геномные, экспрессионные, протеомные, метаболомные и аутоиммунные тесты, проведенные для одного человека в течение 14 месяцев, и дают возможность выявить изменяющиеся молекулярные и генетически значимые фенотипы. Геномные и экспрессионные данные самого высокого разрешения, лежащие в основе анализа, показывают значительные динамические изменения в различных молекулярных компонентах и биологических путях в условиях нормы и болезни. Поиски ответа на вопрос, как правильно распорядиться результатами генетического тестирования, могут привести к совершенно новым подходам к исследованию патогенеза заболеваний человека и выяснению способов их передачи от поколения к поколению. Одной из важных причин несоответствия являются сравнительно небольшие выборки групп больных и здоровых и ограниченное количество биомаркеров. Медицина 5П выиграет от сочетания геномной информации с регулярным мониторингом физиологического состояния организма.

6

Прецизионная медицина (ПрМ) стала одной из обсуждаемых тем в США с запуском новых государственных программ, таких как объявленная президентом Бараком Обамой в январе 2015 года инициатива по созданию медицинских БД с образцами тканей пациентов-добровольцев. Цель проекта ПрМ — разработка методологии лечения, которая учитывает, как документированную историю болезни пациентов, так и информацию о его генетических особенностях, социальном статусе и другие данные из множества источников, в том числе от мобильных устройств и приложений. В частности, исследования должны показать, почему одни и те же заболевания (например, рак, инсульт и астма) протекают по-разному у представителей разных расовых и этнических групп. В ходе проекта будет использоваться большой массив данных о состоянии здоровья и физической активности, собранный при помощи специальных приложений для смартфонов. Национальные институты здоровья США формируют группу из одного миллиона людей, которые будут участвовать с 2016 года в масштабных медицинских исследованиях. К когорте может присоединиться любой американец напрямую или через медицинскую страховку. В программе участвуют множество организаций, а NIH ведет геномные исследования и отвечает за создание когорты, в задачу которой входит: • понять причины индивидуальных отличий реакций людей на общепринятую терапию ЛС (фармакогенетика); • найти биологические маркеры, которые указывают на риск развития МФЗ; • развить новые классификации заболеваний и понять их взаимосвязи; • количественно оценить риски для ряда заболеваний, включая генетические факторы, влияние окружающей среды, а также их сочетание; • представить участникам исследования данные и информацию, которые улучшат их здоровье и создадут базу для испытаний направленной терапии; • внедрить технологии мобильного здоровья (mHealth), чтобы следить

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

за действиями участников, физиологическими параметрами и состоянием окружающей среды и искать корреляции. Данные о здоровье участников когорты будут общими, в том числе электронные медицинские записи, информация опросов и мобильных программ. От волонтеров потребуются стандартные сведения о жизненно важных показателях их здоровья, медицинских назначениях и историях болезней, образцы крови. Участники когорты получат доступ ко всем даным и результатам исследований. Отметим, что первые четыре пункта поставленных задач уже успешно решаются в рамках ПМ, поэтому ПрМ можно рассматривать, как дальнейшее развитие медицины 4П. ПрМ, в отличие от ПМ, это всегда улучшение в медицинском обслуживании для пациента. Реализация подходов ПрМ приводит к лучшему пониманию патогенеза и разделения заболеваний на типы и подтипы, выявления их носителей и особенностей протекания в различных популяциях. Важной частью ПрМ является использование мобильных технологий в режиме 24 часа в сутки и семь дней в неделю. Наибольших успехов в практическом применении ПМ достигла в фармакогенетике, целевой диагностике и лечении онкологических заболеваний. В 2013 году генетик Стивен Элледж обнаружил, что опухоли растут более агрессивно в тех случаях, когда анеуплоидия привела к потере генов-онкосупрессоров или к вставке дополнительных копий онкогенов [15]. Идея, что анеуплоидия — это не просто странная особенность опухолей, а двигатель их роста, основана на компьютерном анализе большого объема данных, собранных об опухолях. Создание подробных БД неизбежно придаст импульс современным методам диагностики и лечения онкозаболеваний. При постановке такого диагноза необходимо секвенировать геном опухоли — это поможет установить генетические вариации и подобрать эффективные препарат и методику лечения. Для контроля нужно получить геном и нормальных клеток: e-mail: medalfavit@mail.ru

биоинформатический анализ различий может выявить причину возникновения онкологии и провести сравнение с каталогами известных злокачественных мутаций. Врачи будут записывать результаты анализов и анамнез пациента (в том числе систему его питания и вредные привычки) в виде электронных историй болезни. Также желательно делать компьютерную (КТ) и магнитно-резонансную томографии (МРТ), которые помогут определить стадию заболевания. Учитывая, что в 2013 году в США 1,7 млн человек поставили диагноз «рак», понятно, насколько огромными объемами данных оперирует сегодняшняя онкология. Открытие Элледжа возникло вследствие разработки компьютерного алгоритма «исследователь опухолей» (Tumor Suppressor and Oncogene Explorer), который использовался для сканирования двух генетических БД по раку, содержащих данные о 1,2 млн мутаций из 8 207 образцов тканей, относящихся к 20 видам опухолей (атлас ракового генома [Cancer Genome Atlas], созданный Национальным институтом рака США, и каталог соматических мутаций при раке [Catalogue of Somatic Mutations in Cancer (COSMIC]) института Сенгера (Великобритания). Для выявления подозрительных генов при сканировании этих БД исследователи особенное внимание уделяли таким свойствам, как частота мутаций и соотношение «молчащих» мутаций и тех, что нарушают функцию гена. Затем они применяли статистические методы классификации для выявления генов-супрессоров и онкогенов. Около 70 генов-супрессоров и 50 онкогенов уже были известны для определенных типов опухолей, однако Элледж и его коллеги увеличили этот список до 320 и 200 соответственно и идентифицировали биохимические пути, задействованные в тех или иных типах опухолей, что может быть крайне полезным при подборе целевых ЛС. Десять крупнейших фармацевтических и биотехнологических компаний договорились о сотрудничестве с британской государственной организацией Genomics England с целью использования генетической информации пациентов Национальe-mail: medalfavit@mail.ru

ной службы здравоохранения Великобритании (NHS) в медицинских исследованиях. Две крупнейшие британские фармацевтические фирмы GlaxoSmithKline и AstraZeneca объединят усилия со швейцарской Roche и американскими AbbVie и Biogen, чтобы расшифровать геном 100 тысяч пациентов, страдающих от онкологических или редких заболеваний. Также в проекте примут участие американские фирмы Alexion, Dimension Therapeutics и Helomics, бельгийская UCB и японская Takeda. Фармкомпании будут работать вместе на протяжении года, и им предстоит найти возможную связь между генетическими мутациями и конкретными заболеваниями, что поможет в разработке более эффективных ЛС, при назначении которых врачи будут учитывать индивидуальные генетические данные пациента. О старте проекта «100 тысяч геномов» британский премьер-министр Дэвид Кэмерон объявил в 2012 году, тогда же он пояснил, что на проект британской службе здравоохранения будут выделены 100 млн евро. К 2015 году участникам проекта удалось расшифровать геном трех тысяч пациентов. Если к 2017 году компании смогут достигнуть своей цели и расшифровать 100 тысяч геномов, они соберут одну из крупнейших в мире БД генетической информации. Исследователи пытаются найти способ проанализировать миллион раковых геномов в ближайшие несколько лет, что является грандиозной затеей: скомбинированный геном опухоли и здоровых тканей от одного пациента составляет около терабайта (1012 байт) данных, тогда как для работы с миллионом таких геномов потребуется около экзабайта памяти (1018 байт). По оценке, хранение и исследование такого количества данных может стоить 100 млн долларов в год. Для того, чтобы стало проще получать информацию, разработали «облачную» (распределенную) платформу BioNimbus, обеспечивающую доступ к данным Атласа ракового генома и их анализ. Такая объединенная БД по раку может стать настоящим клондайком для онкологии, например, используя BioNimbus, найден ген, который инициирует острый миелоидный лейкоз

(ОМЛ). Ученые уже знали, что при ОМЛ у некоторых пациентов наблюдается повреждение седьмой хромосомы (миссенс-мутации в некоторых генах). Выбрали 23 пациента из БД, и с помощью компьютерной программы сравнили последовательности их РНК для поиска недостающих частей хромосомы и обнаружили, что у этих больных отсутствовала одна копия гена CUX1, кодирующего супрессор опухолей [16]. В опытах по удалению одной копии этого гена у плодовых мушек и мышей обнаруживается чрезмерно быстрое деление некоторых типов клеток крови и, как следствие, лейкемия. Открытие не переросло в создание лекарств от ОМЛ (при этом диагнозе средняя продолжительность жизни составляет менее года!), но способствовало более глубокому изучению болезни и в дальнейшем позволит создать метод ранней диагностики и лечения этого заболевания. Американское общество клинической онкологии (American Society of Clinical Oncology, ASCO) разрабатывает платформу под названием CancerLinQ, призванную интегрировать электронные истории болезни онкобольных в единую медицинскую карту. Анализируемые источники все чаще включают информацию о геноме, диагнозе, также примечания о лечении и показатели эффективности выбранной для пациента терапии. На данный момент в системе собраны сведения 177 тысяч людей с раком молочной железы. Клиффорд Худис, специалист по раку молочной железы и президент ASCO, уверен, что CancerLinQ будет совершать открытия, остающиеся без внимания при клинических испытаниях. Например, статистика по использованию лекарств позволит собрать данные о побочных эффектах, взаимодействии с другими лекарствами и эффективности лечения у разных популяций пациентов. Система также может регистрировать отклонение назначаемых дозировок от рекомендованных FDA, например, обнаруживать, что врачи достигают более заметного успеха в лечении, когда они варьируют дозировку в зависимости от возраста пациента. Сочетание геномных БД и медицинской визуализации также внесет

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

7

новизну в сферу диагностики и позволит автоматические сопоставлять информацию, полученную из разных методик: цифровые фотографии тканей с высоким разрешением, которые сравниваются с образцами других пациентов для правильной диагностики опухоли. Исследователи будут анализировать геном пациента, чтобы оценить эффективность того или иного вида терапии в его случае и подтверждать это на томографии. Сопоставление и анализ большого количества информации позволят аккумулировать весь медицинский опыт в одном месте. Разрабатывается система хранения и анализа информации о сотне тысяч онкобольных, и, по существу, врач принимает решение по диагностике и терапии, опираясь на личный опыт при лечении сотен тысяч пациентов. Одна из основных проблем с многотерабайтными данными — как работать с таким объемом информации. Медицинские изображения высокого разрешения могут занимать десяток гигабайт, а исследователь, возможно, захочет, чтобы компьютер сравнил десятки тысяч таких изображений. Обработка одного такого файла может занять более 10 минут, а копирование их по сети и вовсе может затянуться на неопределенное время. Для преодоления этих проблем информатики разрабатывают алгоритмы разбивки данных на меньшие части для параллельной обработки на отдельных процессорах и методики сжатия файлов (контролируя, конечно, чтобы оно не уничтожило важные медицинские подробности) [17]. Медицинская диагностика представляет собой набор правил, методов, решений, которые в конечном счете позволяют прийти к заключению о наличии или вероятности наличия того или иного заболевания. Предметом изучения функциональной диагностики всегда были процессы в организме, протекающие либо в состоянии относительного покоя, либо при искусственно создаваемой «существенной» нагрузке, то есть фактически это была «провокационная» функциональная диагностика. Первой удачной попыткой перейти к наблюдательной функциональной диагностике можно признать созда8

ние в 60-х годах XX века аппаратуры для непрерывного контроля ЭКГ (Н. Холтер) и артериального давления (А. Нинман) в условиях реальной жизнедеятельности. В 2014 году в США впервые разрешена для клинического использования вживляемая в легочную артерию система для непрерывного измерения и передачи в центр наблюдения данных о давлении в малом круге кровообращения в «домашних» условиях. В целом есть два перспективных направления: улучшение приборов, основанных на физических принципах, — те же томографы, а также улучшение методов молекулярной диагностики на основании присутствия в крови биомаркеров ранних стадий заболевания. Мобильное здравоохранение (mHealth), используемое в ПрМ, объединяет два параллельно развивающихся направления, которые в то же время оказывают значительное влияние друг на друга. Первое — технологии для лечения и ухода за больными, второе — устройства для контроля здоровья человека. Сегодня объектом интереса инвесторов и предпринимателей стал массовый рынок, многочисленные гаджеты и сервисы, которые меняют представление пациентов о принципах оказания медицинских услуг. Возник потребительский спрос, так как люди все более ответственно относятся к своему здоровью и ищут удобные способы его контролировать, что усиливается целенаправленной политикой многих государств на повышение здоровья нации, пропагандой правильного образа жизни, а главное, стремительным развитием новых технологий. Среди основных катализаторов — интернет и смартфоны. Первый предоставил людям недоступную им ранее возможность обмениваться знаниями, уточнять диагноз и (или) искать эффективную терапию, не прибегая к помощи доктора. Возник спрос на медицинский контент и многочисленные сервисы, ориентированные на пациента (от электронной записи к врачу до дистанционной диагностики). Смартфоны обеспечили круглосуточный доступ к медицинской информации и могут легко справляться с функцией мони-

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

торинга здоровья своего владельца: приборы для анализов в домашних условиях и другие интегрированные со смартфонами разработки рано или поздно позволят получать максимально полную картину о состоянии здоровья своих владельцев. Мощным стимулом к развитию цифровой медицины стали технологии обработки больших данных (big data), которые не только обеспечивают возможность хранения неограниченных объемов информации, но и быстро учатся эту информацию правильно интерпретировать. Так, например, сервис Watson, разработанный IBM, превзошел среднестатистического доктора по качеству диагностики ряда заболеваний. Диапазон возможностей применения Watson в отрасли простирается от выбора терапии конкретных заболеваний до поддержания здорового образа жизни. Например, решение Watson for Oncology помогает врачам при лечении четырех видов рака.

Watson for Oncology изучает историю болезни пациента и научные исследования, анализирует данные, сопоставляет множество факторов, проводит аналогии, а затем предлагает возможные диагнозы и варианты терапии. При этом он не претендует на роль лечащего врача, ответственность за принятое решение всегда лежит на человеке. Однако Watson может стать профессиональным помощником, с которым врач всегда может посоветоваться, получив ясные рекомендации с балансом плюсов и минусов по каждому варианту лечения. Возможности врача по хранению, анализу и применению информации сильно проигрывают современным компьютерам: по некоторым подсчетам, чтобы быть в курсе всех новостей в медицинском мире, доктор должен просматривать 30–80 профильных статей ежедневно. Среди наиболее ожидаемых инноваций технологии, способные предсказывать возникновение критических изменений состояния организма (инфаркт, инсульт) на основе динамического неинвазивного мониторинга: один рынок глюкометров с тестовыми полосками исчисляется сегодня 10 млрд долларов в год. Если же удастся придумать неинвазивный сенсор, который будет подключен к смартфону, e-mail: medalfavit@mail.ru

его себестоимость может оказаться на несколько порядков ниже чем у глюкометра и тестовых полосок. Создание алгоритмов искусственного интеллекта для медицинских приложений стоит огромных денег.

IBM, к примеру, вложила в Watson порядка 3 млрд долларов, при этом суперкомпьютер прошел обучение лишь по нескольким заболеваниям. Уже созданы специальные насадки, которые позволяют использовать смартфоны для микроскопии, диагностики глазных болезней, и разработана насадка и программа для смартфона, чтобы превратить его в своеобразную минилабораторию для сверхбыстрой молекулярной диагностики. Антитела снабжаются метками (флуорофором), благодаря которым их легко увидеть. Потом такие антитела добавляют к образцу, инкубируют и смывают лишние антитела. В итоге по флуоресценции связавшихся с образцом антител можно видеть, где находятся интересующие исследователя молекулы. Чтобы превратить смартфон в диагностическую лабораторию, устройство нужно будет снабдить специальной насадкой, в которой есть отделение для образца и источник света, а также приложение, которое отправляет данные для анализа на сервер, а потом демонстрирует результаты молекулярного исследования пользователю. С помощью такого устройство можно проверять наличие определенных молекул на поверхности клеток образца (например, крови). С помощью смартфона можно проводить не только качественный, но и количественный молекулярный анализ. Чтобы проверить свою систему на практике, проанализировали с ее помощью образцы тканей 25 пациенток с раком шейки матки. Для контроля образцы исследовали и традиционными гистологическими методами. Образцы разделили на категории в зависимости от тяжести заболевания (высокий риск, низкий, доброкачественная опухоль), и для двух методов — классического и нового — характеристики образцов совпали. При этом анализ с использованием новой системы для смартфона проходит очень быстро — на всю процедуру, включая приготовление образца и анализ данных, e-mail: medalfavit@mail.ru

требуются 45 минут. Другое преимущество новой системы — большой угол обзора. В одном зрительном поле камеры смартфона помещаются десятки тысяч клеток, и их можно проанализировать одновременно. При диагностике с помощью микроскопии можно одновременно изучать намного меньшие количества клеток. Чтобы проверить, есть ли в образце определенная ДНК (например, ДНК вируса), нужно использовать два типа шариков с приделанными одноцепочечными фрагментами ДНК, комплементарными целевой последовательности. Сначала целевая ДНК вылавливается из образца с помощью шариков одного типа. Затем к ним добавляются шарики другого типа. Если в образце были молекулы с концами, соответствующими последовательностям на двух разных шариках, то на выходе мы получим димеры шариков, соединенные молекулами пойманной ДНК. Такие димеры образуют характерную дифракционную картину, и если мы ее видим, значит, в образце есть целевая ДНК. Этим методом удалось детектировать аттомоли (10 –18 моля) целевой ДНК, и это без ПЦР-амплификации. Такая чувствительность сопоставима с чувствительностью самых точных методов исследования ДНК (теоретически с помощью ПЦР можно обнаружить единственную копию ДНК в пробе, на практике чувствительность метода на один-два порядка ниже — то есть 10–22–10–21 молей ДНК). Цифровую медицину можно разделить на три больших направления. Первое — это все, что связано с расшифровкой генома. Самый известный стартап в этой области — американский сервис 23andMe, который первым предложил дешевую расшифровку геномов для каждого желающего, при этом клиенты ресурса получают прогнозы по развитию своих заболеваний, и возможность найти своих родственников по всему земному шару. Начав с обработки и анализа больших массивов медицинских данных, цифровая медицина быстро становится индивидуальной и будет иметь дело не с заболеваниями, а с конкретными людьми. Второе течение — это все, что связано с информацией и взаимодействием меди-

цинских специалистов между собой, а также с пациентом (партисипаторная медицина). Прежде всего, это специализированные социальные сети, которые позволяют в интерактивном режиме взаимодействовать врачам и пациентам, накапливать информацию, БД и т. д. Большим препятствием для быстрого развития выступают законодательные и этические ограничения: различные аспекты защиты персональных данных, медицинской информации, врачебной тайны и проч. Однако очевидно, что в ближайшем будущем многие вопросы будут урегулированы, появится возможность сопоставлять данные максимального количества людей планеты, страдающих тем или иным заболеванием. В России это направление хорошо развито: известен стартап «Доктор на работе» — проект, объединяющий множество врачей и пациентов, которые обмениваются информацией и «НормаСахар» — виртуальная клиника, специализацией которой является лечение диабета. Подобные проекты предвещают переход медицины в новое качество: как только появляется возможность накапливать огромный массив данных, а пациент начинает общаться с врачом удаленно и интерактивно, возникает новая экономика медицины, которая подразумевает конкретного пациента. Третье глобальное течение в рамках цифровой медицины — это все то, что связано с биосенсорами, датчиками и гаджетами, позволяющими человеку контролировать состояние своего организма. На рынке в этой области уже сейчас огромный спектр предложений. К примеру, есть специальное приложение на iPhone, которое позволяет самому снимать кардиограмму. Медицина будет иметь дело не с болезнями, а с конкретными людьми, что является очень важным идеологическим переломом: анализ генома, работа с массивом информации или получение данных с датчиков, все это относится к медицине 5П. Цифровые технологии, связанные с искусственным интеллектом, становятся настолько совершенными, что очень многие диагностические процессы начинают пере-

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

9

ходить в компьютер. В парадигме новой медицины здоровье — это личный результат, следствие работы человека со своим организмом, своевременной диагностики и лечения ранних стадий заболеваний, превентивных мероприятий и т. д. Врач перестанет быть специалистом только по заболеваниям, он станет специалистом по людям, по ситуациям, инструментам, оптимизации жизненных процессов [18]. Меняющаяся система здравоохранения позволит человеку своевременно и правильно принимать решения. Такова новая парадигма медицины и медицина 5П, которая вместе с мобильной и цифровой медициной является ее эффективным инструментом.

Список литературы 1. Щербо С. Н. Медицина ХХI века: лабораторная, трансляционная, предиктивно-превентивная, персонализированная и прецизионная. // Журнал клинической лабораторной диагностики. — 2015. — 60. — № 9, с. 20.

2. Porche D. J. Precision medicine initiative. // Am. J. Mens Health. — 2015. — 9. —3. — Р. 177.

3. Щербо С. Н. Персонализированная медицина. // Медицинский алфавит. Современная лаборатория- 2012. — № 3. — С. 2–3.

11. Chen R., Mias G. I. Li-Pock-Than J. et al.

Personal Omics Profiling Reveals Dynamic Molecular and Medical Phenotypes. // Cell. — 2012. — 148. — 6. — P. 1293–1307.

4. Щербо С. Н. Трансляционная медицина. // Медицинский алфавит. Современная лаборатория- 2012. — № 2. — С. 3–4.

12. Issa A. M. 10 years of personalizing medicine: how the incorporation of genomic information is changing practice and policy. // Personalized Medicine. — 2015. — 12. — 1. — P. 1–3.

5. Щербо С. Н., Щербо Д. С. Биомаркеры персонализированной медицины. 1. Системная биология и биомаркеры. // Медицинский алфавит. Современная лаборатория. — 2013. — 4. — С. 7–9.

6. Щербо С. Н., Щербо Д. С., Кралин М. Ю., Биомаркеры персонализированной медицины. 2. Метаболомика. Медицинский алфавит. Современная лаборатория. — 2014. —1. — С. 8–10.

7. Щ е р б о С . Н . , Щ е р б о Д . С . , К о т в и ц кий А. Д., Кралин М. Ю. Биомаркеры персонализированной медицины. Часть 3. Микробиом и метагеном. Медицинский алфавит. Современная лаборатория. — 2015. — 1. — С. 5–8.

13. Carlberg C., Raunio H. From pharmacogenomics to integrated personal omics profiling: a gap in implementation into healthcare. // Personalized Medicine. — 2014. — 11. — 7. — P. 625–629.

14. Im et al. Digital diffraction analysis enables low-cost molecular diagnostics on a smartphone // PNAS. 2015. DOI:10.1073/ pnas.1501815112.

15. Davoli T., Xu A. W., Mengwasser K. E. et al. Cumulative haploinsufficiency and triplosensitivity drive aneuploidy patterns and shape the cancer genome. // Cell. — 2013. — 155. — P. 948–962.

8. Щ е р б о С . Н . , К р а л и н М . Ю . , Щ е р бо Д. С. Биомаркеры персонализированной медицины. 4. Транскриптом. // Медицинский алфавит. Современная лаборатория. — 2015. — 2. — С. 5–7.

16. McNerney M.E., Brown C. D., Wang X. et al. CUX1 is a haploinsufficient tumor suppressor gene on chromosome 7 frequently inactivated in acute myeloid leukemia. // Blood. — 2012. — 121. — P. 975–983.

9. Щербо С. Н., Щербо Д. С. МикроРНК — новый класс биомаркеров лабораторной и персонализированной медицины. Клиническая лабораторная диагностика — 2014. — 59. — 9. — С. 24–25.

17. Savage N. Bioinformatics: Big data versus the big C. // Nature. — 2014. — 509. — P. S66-S67.

10. Говорун В. М., Иванов В. Т. Протомика и пептидомика в фундаментальных и прикладных медицинских исследованиях. — 2011. — 37. — 2. — С. 199–215.

18. Щербо С. Н. Лабораторная медицина как новый этап развития клинической лабораторной диагностики. Каким быть врачу лабораторной медицины? // Медицинский алфавит. Современная лаборатория- 2014. — № 1. — С. 5–7.

Уважаемые коллеги!

01 декабря 2015 года журнал «Медицинский алфавит» был включен в Перечень Высшей аттестационной комиссии (ВАК). «Медицинский алфавит» издается с 2002 года. Издание выходит ежеквартальными сериями по различным направлениям медицины.

дом новых технологий выросла подписка на онлайн-версию. Все статьи журнала с 2008 года находятся в открытом доступе в Электронной научной библиотеке.

Серия «Современная лаборатория» была выделена в самостоятельное издание в 2007 году. Журнал приобрел верную аудиторию. За эти годы также сложился грамотный авторский коллектив.

Включение журнала в Перечень ВАК подтверждает высокий статус журнала и дает оценку нашей работе.

С приходом главного редактора Сергея Николаевича Щербо, «Современная лаборатория» получила второе дыхание: появились новые авторы и читатели, улучшилось качество материалов.

Благодарим авторов, редакционный совет и всех тех, кто помогают нам в работе и приглашаем к сотрудничеству научные сообщества, специалистов, практикующих врачей, лаборантов, производителей техники и реагентов.

Журнал стал интереснее, о чем свидетельствуют отзывы специалистов. Расширилась география его распространения: отзывы о журнале приходят из разных уголков страны и из-за рубежа. С прихо-

10

Мы уверены, что в новом году журнал станет еще интереснее и содержательнее.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

Главный редактор издательства ООО «Альфмед» Татьяна Владимировна Синицка

e-mail: medalfavit@mail.ru

Оптимизация деятельности лабораторной службы города Москвы А. Н. Цибин, главный внештатный специалист по клинической лабораторной диагностике Департамента здравоохранения города Москвы, зав. отделом организации и контроля деятельности лабораторной службы1 М. Ф. Латыпова, к. б. н., ведущий научный сотрудник отдела организации и контроля деятельности лабораторной службы1 В. Г. Стребков, главный специалист отдела организации и контроля деятельности лабораторной службы1 Е. Л. Аверина, главный врач2 М. А. Годков3 ГБУЗ «Научно-исследовательский институт организации здравоохранения и медицинского менеджмента» Департамента здравоохранения г. Москвы 2 ГБУЗ «Центр клинико-лабораторной диагностики» Департамента здравоохранения г. Москвы 3 ГБУЗ «Научно-исследовательский институт скорой помощи имени Н. В. Склифосовского» Департамента здравоохранения г. Москвы

А. Н. Цибин

1

М. Ф. Латыпова

Optimization of laboratory service in Moscow city A. G. Tsybin, M. F. Latypova, V. G. Strebkov, E. L. Averin, M. A. Godkov The Scientific Research Institute of Healthcare Organization and Medical Management Moscow Department of Healthcare, The Center for Clinical Laboratory Diagnostics, the Scientific and Research Institute of Emergency Care n. a. N. V. Sklifosovsky, Moscow, Russia Резюме Представлены результаты централизации лабораторных исследований в ЛПУ Департамента здравоохранения г. Москвы за период с 2011 по 2015 год и перспективы проведения дальнейшей реорганизации до 2018 года Сформированы три уровня единой системы лабораторной службы: пункты приема биологического материала, клинико-диагностические лаборатории первого уровня и централизованные клинико-диагностические лаборатории второгого и тртьего уровней (ЦКДЛ). Продемонстрирована динамика движения лабораторного оборудования в процессе реформ, изменения штатного расписания, количества и структуры выполняемых лабораторных исследований. Даны заключения об эффективности проведенной централизации и перспективах ее продолжения.

В. Г. Стребков

Ключевые слова: централизация лабораторных исследований, изменение штатного расписания, количество и структура лабораторных исследований.

Summary It presented the results of centralization of laboratory tests in medical facilities of the Moscow Health Department from the period from the year 2011 to 2015 and prospects for the further reorganization until 2018. It was formed three levels of the unified system of laboratory service: reception points for biological material, first level clinical diagnostic laboratories and centralized clinical diagnostic laboratories of the 2nd and 3rd levels (CCDL). We demonstrated the dynamics of movement of laboratory equipment in the reform process, changes in staffing, the number and structure performed laboratory tests. We have given the conclusions about the effectiveness of the carried-out centralization the prospects for its continuation.

Key words: the centralization of laboratory tests, changes in staffing, the number and structure performed laboratory tests.

О

дним из приоритетов концепции развития системы здравоохранения в России до 2020 года является повышение доступности и качества медицинской помощи [1]. При этом в концепции указывается, что эффективное функционирование системы здравоохранения невозможно без развития его инфраструктуры и ресурсного обеспечения, включающего финансовое, материально-техническое и технологическое оснащение лечебно-профилактичеe-mail: medalfavit@mail.ru

ских учреждений на основе инновационных подходов и принципа стандартизации. В качестве ведущих задач развития здравоохранения определены переход на современную систему организации медицинской помощи и создание эффективной модели управления финансовыми ресурсами программы государственных гарантий. Все указанные положения концепции непосредственно относятся к лабораторной службе России.

Е. Л. Аверина

М. А. Годков

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

11

Высокая диагностическая и клиническая значимость лабораторных исследований и вместе с тем значительная и неуклонно возрастающая стоимость лабораторной диагностики определяют необходимость реформирования лабораторной службы во всем мире. Основное направление реформирования лабораторной службы — централизация лабораторных исследований, то есть создание крупных автоматизированных лабораторных центров, обслуживающих многие лечебно-профилактические учреждения и выполняющих широкий перечень различных анализов [2]. Внедрение принципов централизации лабораторных исследований позволяет увеличить производительность централизованных клинико-диагностических лабораторий (ЦКДЛ) и оптимизировать расходы на лабораторную диагностику, в частности, за счет применения более рациональных методов контроля и управления ресурсами, внедрения технологий управления качеством лабораторных исследований, автоматизации процесса проведения исследований и др. [3] Централизация лабораторной службы — процесс неотвратимый. Промедление в нем ведет к существенным финансовым потерям и приводит к отставанию России в области лабораторной медицины [4]. Однако следует подчеркнуть, что централизация лабораторных исследований не может служить самоцелью, она является лишь одним из инструментов повышения доступности и качества диагностической помощи населению с учетом оптимизации финансирования. Централизация лабораторных исследований проводится дифференцированно в различных регионах Российской Федерации. Основанием для проведения централизации лабораторных исследований являются территориальные программы реформирования лабораторной службы, которые формируются с учетом медико-социальных (численность и плотность населения, заболеваемость и болезненность, смертность от определенных групп заболеваний и т. д.) и территориальных (площадь, наличие 12

транспортных коммуникаций, экономическая характеристика, количество и качество действующих медицинских учреждений и т. п. ) особенностей регионов. Территориальные программы излагаются в соответствующих приказах региональных органов управления здравоохранения, «дорожных картах» или других нормативных документах. При планировании оптимизации лабораторной службы региона могут быть использованы три модели территориального развития здравоохранения: моноцентрическая, полицентрическая и смешанная. В тех регионах, где уже произошла централизация лабораторных исследований, многие вопросы решены. В других предстоит большая работа по совершенствованию деятельности лабораторной службы [4]. По естественным причинам планирование реформ в здравоохранении города проводилось в соответствии с моноцентрической моделью. Москва — крупнейший мегаполис России: на 01 января 2015 года численно сть его постоянного населения со ставляла 12 184 015 человек или 8,33 % от численности населения всей России. В соответствии с социальной направленностью российского государства и высокой плотностью московского населения система здравоохранения города построена таким образом, чтобы любой его житель имел шаговую доступность в медицинские учреждения муниципального подчинения. С этой целью в Москве создана самая мощная, разветвленная и наиболее оснащенная в стране медицинская сеть: 268 медицинских организаций, из них 91 поликлиника, 312 филиалов. Для проведения качественной и своевременной лабораторной диагностики в городе сформирована соответствующая лабораторная служба: на 01 декабря 2014 года в Москве работали 387 лабораторий муниципального подчинения. Диагностические лаборатории располагались на различных клинических базах: амбулаторно-поликлинических учреждений, стационаров общесоматического и специализированного профиля, специализи-

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

рованных диспансеров, женских консультаций, диагностических центров и т. д. Особенностью последних пяти лет оптимизации здравоохранения в Москве является существенный рост затрат на оказание медицинской помощи, при этом вложения в систему охраны здоровья растут ежегодно и составляют существенную часть расходов бюджета города. Связано это с рядом причин. Растет население города, и пропорционально увеличивается численность пациентов, обращающихся в муниципальные медицинские учреждения. Изменение миграционных потоков в стране повлекло за собой увеличение в столице числа иностранцев и приезжих из других регионов России, а также лиц без определенного места жительства. Многие из них нуждаются в экстренной медицинской помощи, среди этой категории пациентов отмечается более высокий, по сравнению с коренными жителями Москвы, уровень пораженности инфекционными заболеваниями, в том числе ВИЧ-инфекцией и вирусными гепатитами. Рост образовательного и материального уровней коренного населения столицы увеличивает уровень запросов на качественную и высокотехнологичную медицинскую помощь. Среди горожан растет доля пожилого и старческого населения, страдающего большим количеством хронических заболеваний. Увеличивается производственный и дорожный травматизм. Вместе с тем руководством города поставлена задача не только сохранения имеющегося уровня медицинского обслуживания, но и существенного повышения как его доступности, так и качества. В полной мере это требование относится и к лабораторной службе города. Модернизация, проводившаяся в последние десятилетия, включала определенные плавные, в основном экстенсивные изменения в системе лабораторной диагностики: в городе увеличивались количество лабораторий и численность работающего в них персонала, проводились увеличение и переоснащение технологического парка, обеe-mail: medalfavit@mail.ru

спечивалось непрерывное обучение персонала. Переоснащение лабораторной службы, проведенное в городе за последние пять лет, создало реальные условия для существенного роста производительности труда в лабораториях, сокращения сроков проведения и повышения качества исследований. Однако оснащение лабораторий новым оборудованием не сопровождалось радикальной концентрацией лабораторных исследований в единых диагностических пунктах (централизацией), что не позволило достичь соответствующего роста производительности труда персонала. В то же время применение высоких технологий с использованием высокопроизводительного оборудования для обследования малого числа пациентов крайне нерентабельно. Кроме того, в последние годы произошел существенный рост стоимости импортных реагентов в рублевом эквиваленте. Дополнительным доводом в пользу централизации лабораторных исследований в Москве является круглогодичная возможность оперативно доставлять материалы на исследования из различных ЛПУ в централизованные лаборатории в течение 1–2 часов автомобильным транспортом. Перечисленные факторы сформировали предпосылки для безотлагательной реорганизации лабораторной службы города. Основным лейтмотивом проводимой реформы была избрана концентрация лабораторных исследований в ограниченном числе централизованных лабораторий. Нормативной базой, определяющей сущность и этапы реорганизации лабораторной службы, явилась группа документов, основой которых послужили пять приказов Департамента здравоохранения города Москвы: • № 752 от 19.08.2011 года «Об обеспечении доступности лабораторных исследований для пациентов медицинских учреждений амбулаторно-поликлинической сети»; • № 481 от 25.05.2012 года «О мерах по дальнейшему совершенствованию проведения лабораторных исследований населению города Москвы»; e-mail: medalfavit@mail.ru

• № 565 от 21.06.2012 года «О раскреплении административных округов города Москвы между скрининговыми лабораториями диагностики ВИЧ-инфекции»; • № 1 3 5 1 о т 3 1 . 1 2 . 2 0 1 3 г о д а «Об утверждении Регламента назначения лабораторных исследований при оказании первичной медико-санитарной помощи»; • № 405 от 22.04.2014 года «О мерах по улучшению организации лабораторных исследований жителям города Москвы в медицинских организациях государственной системы здравоохранения города Москвы». В качестве основных задач реорганизации лабораторной службы города установлены: • улучшение обеспечения лечебно-диагностического процесса современной и качественной лабораторной диагностикой; • повышение территориальной доступности услуги по приему биоматериалов у населения; • повышение эффективности использования высокотехнологичного дорогостоящего оборудования, в том числе приобретенного по программе модернизации; • повышение качества лабораторных исследований; • оптимизация расходов на лабораторные исследования; • оптимизация использования материально-технических ресурсов. Реорганизация лабораторной службы в городе начата пять лет назад и проводится поэтапно: I этап: 2011–2014 годы — централизация в рамках программы модернизации; II этап: 2015–2016 годы — реорганизация лабораторной службы амбулаторно-поликлинического звена здравоохранения; III этап: 2016 год — оптимизация выполнения специализированных исследований; IV этап: 2017–2018 годы — оптимизация работы лабораторной службы стационаров. На первом этапе реорганизации лабораторной службы проведено формирование одиннадцати центра-

лизованных окружных клинико-диагностических лабораторий (ЦКДЛ) и пяти централизованных бактериологических лабораторий. В задачи ЦКДЛ входило выполнение гематологических, биохимических, иммуногематологических, гормональных и ряда других исследований для лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) своего округа. Формирование ЦКДЛ о суще ствлялось на базе крупных многопрофильных стационаров, диагностических центров и поликлиник. Решение о формировании ЦКДЛ на базе того или иного ЛПУ принималось с учетом удобства доставки материала на данную базу из всех ЛПУ округа, наличия достаточного по количеству и соответствующих по качеству помещений, а также квалифицированного персонала. До переключения потоков материала из ЛПУ в соответствующие ЦКДЛ проведены их дооснащение необходимым оборудованием, обучение персонала, отработаны маршруты движения материала и особенности документа оборота (заявки на исследования, бланки результатов исследований, регистрационные журналы и т. д.). Своеобразным прототипом при создании сети ЦКДЛ послужила структура лабораторной службы Московского городского центра борьбы со СПИД. Данная диагностическая структура успешно функционирует более 25 лет (с 1988 года). В состав ее лабораторной службы входят шесть межокружных диагностических лабораторий (МДЛ), расположенных на базе крупных ЛПУ (НИИ скорой помощи имени Н. В. Склифосовского, ГКБ № 15, городская детская поликлиника № 121, городской диагностический центр № 1, городской кожно-венерологический диспансер, городская поликлиника г. Зеленограда). Функции головной и верификационной лаборатории выполняет лаборатория Московского городского центра борьбы со СПИД. К каждой МДЛ прикреплены ЛПУ нескольких округов. Так, например, к МДЛ, расположенной на базе НИИ скорой помощи (находится в Центральном округе города), прикреплены

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

13

Рисунок 1. Изменение штатного расписания лабораторной службы г. Москвы в 2014–2015 годах.

Рисунок 2. Движение лабораторного оборудования за период с 2013-го по 2014 год.

Рисунок 3. Динамика общего количества лабораторных исследований, выполненных лабораторной службой Департамента здравоохранения г. Москвы за 2013–2014 годы, млн.

ЛПУ Центрального, Северо-Восточного и Северо-Западного округов. Все МДЛ проводят исследования по единому алгоритму, выполняют однотипные процедуры контроля качества, обеспечивают полную доступность населению к регламентированным диагностическим услугам с гарантированно высоким качеством. На первом этапе централизации проведено переоснащение ЦКДЛ. Только за период 2011–2013 годов за счет средств Департамента здра14

воохранения города Москвы закуплены 1 102 единицы нового оборудования. Кроме того, проведена концентрация (сбор на единой базе) оборудования мелких лабораторий, располагавшихся на базе нескольких ЛПУ округа, что позволило существенно увеличить нагрузку на аппаратуру и снизить себестоимость ее эксплуатации. На втором этапе (2015–2016 годы) проводится реорганизация лабораторной службы амбулаторно-поликлинического звена здравоохранения.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

В соответствии с приказом Департамента здравоохранения города Москвы № 1051 начато формирование единой трехуровневой системы лабораторной службы медицинских организаций, оказывающих первичную медико-санитарную помощь, включающую: 1. клинико-диагностические лаборатории I уровня с сетью пунктов приема биологического материала; 2. окружные централизованные клинико-диагностические лаборатории II уровня; 3. централизованные клинико-диагностические лаборатории III уровня. С этой целью в первичном звене амбулаторно-поликлинической сети сокращаются малопроизводительные лаборатории. В этих медицинских учреждениях формируются пункты взятия биологического материала на исследования, и в некоторых ЛПУ по кустовому принципу организуются пункты первичного сбора биологического материала из нескольких близлежащих ЛПУ. Собранный биологический материал направляется санитарным транспортом в соответствующую ЦКДЛ. Формирование ЦКДЛ проводилось на базе имеющихся окружных лабораторий и при необходимости с образованием новых лабораторных подразделений. В Москве проведение реформы здравоохранения сопровождалось существенным сокращением кадров. В лабораторной службе штатное расписание сократилось за счет врачебного персонала на 238,5 единиц (25,9 %), биологов на 8 (43,2 %), среднего медицинского персонала на 760 (31,9 %), младшего медицинского персонала на 1 292 единицы (31,9 %) (рис. 1). Проведенные сокращения штатного расписания не сказались на структуре кадрового состава: соотношение численности персонала с высшим и средним образованием, а также младшего медицинского персонала осталось на прежнем уровне (25, 59 и 16 % соответственно). Следует подчеркнуть, что при формировании ЦКДЛ на базе того или иного ЛПУ учитывалось наличие в штате e-mail: medalfavit@mail.ru

данного учреждения квалифицированных кадров. В ряде случаев при формировании ЦКДЛ либо переводе его на новую клиническую базу произведен перевод наиболее квалифицированных сотрудников лабораторной службы из одного ЛПУ в другое. В связи с этим удалось сохранить от сокращения ведущих специалистов лабораторной диагностики города. Оснащение ЦКДЛ оборудованием осуществлялось как за счет приобретения новых приборов, так и перераспределения имеющейся в наличии аппаратуры из сокращаемых лабораторий (рис. 2). При этом проведено списание существенного количества морально и физически устаревшего оборудования (13,6 % или каждый седьмой прибор). Проведенная в 2014–2015 годах реорганизация лабораторной службы не только не снизила, но позволила увеличить доступность населению данного вида диагностического пособия. Так, в 2015 году по сравнению с 2014-м общее количество выполненных лабораторных исследований выросло на 2,5 %. Существенно, что наибольший рост объемов лабораторно-диагностических услуг зарегистрирован по высокотехнологичным видам исследований: микробиологическим (20,6 %), коагулологическим (8,8 %), иммунологическим (6,7 %) и цитологическим (6,3 %). Число наиболее часто выполняемых исследований — гематологических и биохимических — изменилось несущественно (+4,5 % и –2,9 %) (рис. 3). Интересно, что за один год в амбулаторно-поликлиническом (рис. 4) и стационарном (рис. 5) звеньях системы здравоохранения города снижение общего числа лабораторных исследований было сопоставимым (на 1,1 и 0,6 % соответственно). Однако в амбулаторно-поликлинической сети снижение общего числа исследований сопровождалось значительным увеличением количества выполненных высокотехнологичных анализов: микробиологических на 38,9 %, иммунологических на 10,5 %. В то же время в стационарах города зарегистрировано снижеe-mail: medalfavit@mail.ru

Рисунок 4. Динамика количества лабораторных исследований, выполненных лабораторной службой амбулаторно-поликлинических учреждений Департамента здравоохранения г. Москвы за 2013–2014 годы, млн.

Рисунок 5. Динамика количества лабораторных исследований, выполненных лабораторной службой стационарных учреждений Департамента здравоохранения г. Москвы за 2013–2014 годы, млн.

Рисунок 6. Динамика количества исследований, выполненных ЦКДЛ в 2013–2014 годах, млн.

ние числа исследований данных видов: микробиологических на 33,3 %, иммунологических на 10,3 %. Это, по-видимому, связано с тем, что в амбулаторно-поликлинической сети проведена централизация лабораторных исследований, а в стационарной сети нет. Внедрение централизации основывалось в том числе на измене-

нии механизмов оплаты лабораторных исследований. Поликлиники получили возможность назначать сложные высокотехнологичные исследований без финансового обременения, так как оплата этого вида диагностических работ для амбулаторно-поликлинического звена осуществляется непосредственно из территориального фонда обя-

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

15

зательного медицинского страхования, а не со счетов поликлиник. Таким образом, в амбулаторно-поликлинической сети повысилась доступность населению к данному виду медицинской помощи. В стационарах же лабораторные исследования для пациентов, госпитализированных в данном лечебном учреждении, выполняются на собственной базе. Количество таких исследований в каждом конкретном ЛПУ несопоставимо меньше, чем в ЦКДЛ, а следовательно, себестоимость значительно выше. Кроме того, оплата исследований, выполняемых в стационаре, осуществляется из средств данного лечебного учреждения, и руководители этих ЛПУ стремятся сократить расходы на лабораторию и побуждают медицинский персонал к сокращению данного вида диагностики. Таким образом, отсутствие централизации данных видов лабораторно-диагностической помощи в стационарах города снижает их доступность населению. Проведение централизации лабораторных исследований на уровне стационаров, планируемое на следующем этапе реорганизации лабораторной службы, возможно, позволит исправить отмеченную тенденцию. В течение одного года, несмотря на проводимую реорганизацию, перераспределение кадров, аппаратуры и ресурсов, переориентирование

маршрутов движения биологического материала, количество исследований, выполняемых в ЦКДЛ, увеличилось на 17 млн (7,4 %). По большинству видов исследований зарегистрирован рост числа проводимых анализов: гематологических на 8,2 %, цитологических на 11,1 %, коагулологических на 20,8 % и микробиологических на 37,1 %. Единственным видами анализов, по которым зарегистрировано снижение, были биохимические исследования (на 3,3 млн или 3,4 %) (рис. 6). В 2014 году по сравнению с 2013м удельное количество исследований на 100 посещений в поликлинике выросло на 34 или 12,6 %, а на одного выписанного больного в стационаре снизилось на три или 2,8 %. Причины данных противоположных тенденций связаны с очевидной выгодностью для амбулаторно-поликлинической сети выполнения большого числа исследований в ЦКДЛ и относительно высокой затратностью выполнения лабораторных исследований стационарами на собственной базе. Проведенная реорганизация существенно повысила производительность труда персонала. Только за период с 2013-го по 2014 год количество исследований на штатную единицу возросло на 68 939 анализов или 50,5 %, а количество исследований на физическое лицо возросло на 43 700 или 22,4 %.

Таким образом, в Москве проводится реорганизация лабораторной службы, основой которой является централизация лабораторных исследований. Осуществлены создание централизованных клинико-диагностических лабораторий, их переоснащение, укомплектование квалифицированным персоналом, отработаны маршруты движение биологического материала. В лабораторной службе произошло существенное сокращение кадрового состава. Однако благодаря комплексу организационных мероприятий удалось сохранить наиболее квалифицированные кадры в составе муниципальных лабораторий. Проводящаяся в городе реорганизация лабораторной службы позволила существенно повысить доступность лабораторно-диагностической помощи населению, обращающемуся в амбулаторно-поликлиническую сеть. Список литературы 1. Государственная программа развития здравоохранения Российской Федерации [Electronic resource]. URL: http://www. rosminzdrav.ru/news/2014/01/30/1686gosudarstvennaya-programma-razvitiyazdravoohraneniya-rossiyskoy-federatsii (accessed: 13.10.2015).

2. Организация преаналитического этапа при централизации лабораторных исследований. Метод.рекомендации. М.: 2014. — 112 с.

3. Иванец Н. В. Автореферат дисс. канд. мед. наук. Москва, 2015.

4. Долгих Т. И. Централизация лабораторных исследований. — Спецвыпуск № 4. — 2014 «Лаборатория ЛПУ», с. 4–5.

Российский конгресс лабораторной медицины — 2015

С

30 сентября по 02 октября 2015 года в Москве в КВЦ «Сокольники» состоялось центральное событие года в области лабораторной диагностики — «Российский конгресс лабораторной медицины — 2015» Конгресс проходил по приказу Минздрава России при поддержке Минпромторга и Департамента здравоохранения г. Москвы под эгидой Национальной медицинской палаты. Организаторы конгресса: Научно-практическое общество специалистов лабораторной медицины; ассоциация специалистов и организаций лабораторной службы «Федерация лабораторной медицины»; Российская ассоциация медицинской лабораторной диагностики. Конгресс-оператор — научно-технический центр «Медитэкс». За три дня работы конгресс и международную выставку «Лабораторный город — 2015» посетили более 4,5 тысяч специалистов. Порядка 85 компаний — разработчиков, производителей, дилеров лабораторного оборудования и расходных материалов — представили свою продукцию и современные технологии на выставочной экспозиции. Более 200 отечественных и иностран-

16

ных докладчиков приняли участие в работе 50 научных секций, дискуссионных клубов, круглых столов и семинаров. Отличительной особенностью конгресса, помимо насыщенной научной программы и постерной секции, была культурная программа, включающая экскурсии по городу, показы научно-популярных кинофильмов, фотовыставку и уникальное музыкальное сопровождение всего мероприятия. Выставочное пространство Российского конгресса лабораторной медицины было застроено как лабораторный город, разбитый на площади, улицы и проспекты. Проспект Д. П. Романовского и М. Н. Никифорова, а в центре города площадь В. В. Меньшикова. Каждая улица названа в честь известных российских ученых И. В. Давыдовского, Л. А. Зильбера, З. В. Ермольевой, Н. Ф. Гамалеи… В сквере рядом с улицей А. П. Бородина (композитора, врача, химика) — рояль. В перерывах сессионных докладов пианист исполнял музыку Бородина. Следующий, еще более масштабный конгресс пройдет также в Москве в Сокольниках с 08 по 10 сентября 2016 года.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

e-mail: medalfavit@mail.ru

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

17

ИСО 9001 новой версии в сфере здравоохранения. Идеология и практика Е. К. Аванесов, эксперт бизнес-администрирования в области менеджмента качества, гл. эксперт ООО «Тест-СПб», представитель России в ИСО/ТК 176 «Менеджмент качества и обеспечение качества», ИСО/ТК 268 «Устойчивое развитие сообществ», ИСО/ТК 207 «Менеджмент окружающей среды», гл. аудитор систем менеджмента по международным стандартам ИСО 9001, ИСО 14001, ИСО 27001, OHSAS 18001, г. Санкт-Петербург О. В. Чередничук, зав. ЦКДЛ окружной клинической больницы Ханты-Мансийского автономного округа (Югры), гл. внештатный специалист Департамента здравоохранения Югры по клинической лабораторной диагностике, г. Ханты-Мансийск В. Л. Эмануэль, д. м. н., проф., зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени акад. И. П. Павлова» (ПСПбГМУ) Минздрава России, гл. специалист-эксперт по клинической лабораторной диагностике Росздравнадзора по Северо-Западному федеральному округу, академик Метрологической академии, г. Санкт-Петербург Р. Бошкович, рук. проектов в консалтинговой компании «Международный инновационный консалтинг», член совета экспертов Фонда по культуре качества и деловому совершенству Республики Сербия Г. А. Иванов, к. м. н., гл. врач ФГБУ «Консультативно-диагностический центр с поликлиникой» Управления делами Президента, г. Санкт-Петербург Е. А. Дуванова, зам. директора ООО «Центр лабораторной диагностики», г. Вологда А. В. Эмануэль, к. т. н., эксперт по сертификации систем менеджмента качества в медицинской промышленности и медицинских лабораторий, г. Санкт-Петербург

New version of ISO 9001 in health care. Ideology and practice E. K. Ovanesov, O. V. Cherednichuk, V. L. Emanuel, R. Boškovič, G. A. Ivanov, E. A. Duvanova, A. V. Emanuel Резюме В статье дан авторский анализ основных изменений новой версии ИСО 9001 версии 2015 года. Приведено краткое сравнение новой версии ИСО 9001 с ИСО 13485 и ИСО 15189.

Summary The article presents author’s analysis of the main changes in the new version of ISO 9001: 2015. A brief comparison of the new version of ISO 9001 to ISO 13485 and ISO 15189.

Ключевые слова: системы менеджмента качества, стандартизация, кадровая политика.

Key words: quality management system, standardization, personnel policy.

Уважаемые коллеги! В данной статье мы бы хотели представить авторский обзор новой версии ИСО 9001 редакции 2014 года (2015-го в России) «Системы менеджмента качества. Требования». Статья разбита на три логические части. В первой части мы дадим свое видение ключевых изменений, на которых хотим акцентировать ваше внимание. Во второй расскажем, как эти изменения влияют на организации, работающие в сфере здравоохранения: лечебно-диагностические учреждения (государственные и частные), медицинские лаборатории и производители медицинских изделий. В третьей дадим обзор инструментов управления, которые, по мнению авторов, позволяют наилучшим образом не только выполнить требования, но и соблюсти идеологию стандарта. Но начнем мы немного издалека. Известно, что многие проекты по внедрению ИСО-стандартов, в том числе наиболее распространенного ИСО 9001, в реальную практику работы терпели неудачи. Давайте попробуем разобраться в причинах этих провалов. На наш взгляд, 18

их две. Первая — желание высшего руководства не построить действительно полезную эффективную систему менеджмента качества, а просто получить красивый сертификат. Вторая, более важная, это полное отсутствие внимания к идеологии стандарта и концентрация лишь на формальных и технических требованиях. А теперь более подробно. Считается и декларируется, что СМК на базе ИСО 9001 имеет ряд существенных преимуществ для организации. Например: • повышение удовлетворенности потребителей; • прозрачность ответственности и полномочий, отсутствие ненужного дублирования функций; • оптимизация процессов; • оптимизация затрат и т. д. В итоге организация должна работать как единый механизм, сотрудники должны всеми силами, с душой вкладывать силы в достижение целей организации, финансовые и другие показатели должны расти, а издержки падать. Это идеал. И очень редко он реально достигается.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

Дело в том, что обычно, когда организация сталкивается с ИСО-стандартами, это происходит следующим образом. Сотрудник, которому поручается ведение проекта (и хорошо, если ему выделяют необходимое время, не говоря уже о полномочиях и иных ресурсах), изучает стандарт и начинает с самого начала пытаться реализовать технические требования. Например. Стандарт требует прослеживаемости, пишем инструкцию по прослеживаемости. Стандарт требует определения полномочий: «отдел кадров, срочно обновите должностные инструкции». И все. А ведь СМК начинается не на бумаге. СМК начинается и заканчивается в головах персонала. Не зря базой систем менеджмента качества считают принципы, которые были изначально описаны в ИСО 9000, а теперь в том числе описаны в приложении к ИСО 9001. На наш взгляд, это одно из ключевых улучшений стандарта. При этом хочется отметить, что это улучшение касается не самого стандарта, а просто акцентирования внимания его пользователей на том, что и раньше подразумевалось. БАЗА СМК — это принципы системы менеджмента качества, и для реального построения СМК начинать нужно с оценки, насколько эти принципы выполняются именно в нашей организации, и как можно улучшить их выполнение. Можно сказать, что ваша СМК не будет лучше того, как реализованы семь базовых принципов. Отметим, что в прошлой версии стандарта принципов управления качеством было восемь: • ориентация на потребителя; • лидерство руководителя; • вовлеченность персонала; • процессный подход; • системный подход к управлению; • принятие решений на основе фактов; • взаимовыгодные отношения с поставщиками; • постоянные улучшения. В новой версии принципы процессного подхода и системного подхода к управлению объединены. Практический совет Начните изучение стандарта именно с анализа данных принципов. И спросите себя, насколько они реализованы у вас. Постройте работу по СМК вокруг этих принципов. Тогда в итоге вы создадите действительно полезную для организацию систему управления. Следующее принципиальное изменение стандарта — акцент на так называемом риск-ориентированном мышлении. В прошлых версиях стандарта прямо высказанного требования по управлению рисками не было. При этом важно понимать, что, к примеру, предупреждающие действия — это яркий пример именно работы с рисками. Поэтому формально новое требования по менеджменту рисков является опять таки лишь уточнением прошлых заложенных вглубь стандарта базовых подходов. В настоящее время менеджмент вообще невозможен без оценки и управления рисками, причем это касается всех без исключения сфер деятельности организации от финансовой до производства. По сути, управление процессами всегда так или иначе учитывало работу с рисками. e-mail: medalfavit@mail.ru

Что же такое менеджмент рисков? В первую очередь это понимание вероятностного характера любого нашего решения и всего того, что происходит внутри и снаружи организации. Если говорить более конкретно, то для каждой организации, каждого процесса и даже каждой процедуры можно выделить как общие, так и уникальные риски. Риск это вероятность того, что произойдет некое событие, которое определенным образом повлияет на исход работы. Причем риск может результировать как в худшую, так и в лучшую сторону от ожидаемого исхода. Обычно под риском понимают именно ухудшение результата. Существуют множество формализованных методов работы с рисками, которые проще всего разбить на две большие категории: управление финансовыми и технологическими рисками. Для каждой категории существуют свои, в том числе отраслевые, стандарты и подходы. Важно понимать, что система менеджмента качества есть в любой организации. Другое дело, насколько она результативна, оптимизирована, всеохватывающая, насколько соответствует требованиям тех или иных стандартов. Также и управление рисками. Оно присутствует всегда. Как и процессы улучшений и изменений. Вот только в одних организациях эти процессы могут происходить хаотично, бесконтрольно, а в других находиться под жестким управлением. Цель СМК — сделать так, чтобы все процессы были под управлением. И менеджмент рисков помогает в этом. Ниже мы более детально раскроем эту тему. Следующее важнейшее изменение, на наш взгляд, — детальное внимание к затратам на качество. Как ни странно, прошлые версии ИСО 9001 часто воспринимали в отрыве от финансового менеджмента. У нас это всегда вызывало недоумение, так как управление ресурсами всегда являлось частью требований ИСО 9001. Почему финансовая сфера выходила за рамки СМК, оставалось непонятным. Скорее всего дело в том, что система менеджмента качества в первую очередь нацелена на результативность. То есть на достижение запланированного результата. Продукт (услуга) должны быть качественными, то есть соответствовать как минимум тем обязательствам, которые взяла на себя фирма по отношению к ним (например, это выражается в соответствии с техническими характеристиками, но может выражаться и в соответствии и ожиданиями потребителя). При этом, если мы возьмем две совершенно одинаковые с технической точки зрения компании, то получаемый результат может быть разным, так как умение пользоваться ресурсами у руководителей этих компаний может быть разным. То есть разная управленческая компетентность. Зачастую люди, занимающиеся качеством, особенно в рамках ИСО-стандартов, говорили, что, мол, их дело — качество. А уж сколько это стоит, не их проблема. Это грубейшая ошибка. И в новой версии ИСО 9001 этот всегда подразумевающийся подход обозначен более точно и прямо. Тем не менее идеология стандарта всегда учитывала затраты на качество. Все имеет свою цену и глупо говорить, что менеджмент качества — отдельная от финансового менеджмента система. Следующее важное изменение. Во всех версиях стандарта ИСО 9001 всегда говорилось, что документация

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

19

конкретного учреждения уникальна и зависит от множества факторов, в том числе компетентности персонала, размера организации, сложности процессов, сферы деятельности, наличия законодательных требований и отраслевых стандартов и т. д. Также в стандарте указывалось, что термин «документированная процедура» собирательный, и каждая организация вправе создавать систему документооборота такую, какая удобна именно ей. Но к сожалению из года в год, в том числе с подачи недобросовестных консультантов, в организациях плодились шесть документов, которые назывались именно документированными процедурами и руководством по качеству, которые по своему содержанию полностью соответствовали содержанию стандарта. Объяснение здесь простое. Гораздо легче заставить организацию писать документы по существующим шаблонам, чем вникнуть в суть работы и создать уникальную, но удобную и эффективную систему именно в данном учреждении. В новой версии ИСО 9001 требования по документообороту значительно прояснились и стали менее формальны. Во-первых, ушел привычный, но приносивший излишний бюрократизм, термин «документированная процедура». Во-вторых, требования по наличию документов и записей объединены и введен новый термин «документированная информация». Здесь тоже стандарт стал более понятным. Ведь если вдуматься, документ это инструмент управления. Когда в стандарте мы наблюдаем требование по наличию какого-либо документа, то по сути стандарт как бы говорит нам: процесс или процедура, где требуется наличие регламентирующего документа, принципиально значим для организации и для обеспечения качества работы. Проанализируйте, все ли вас устраивает в том, как работа выполняется, какие результаты достигаются, какие затраты вы несете. Если нет, выявите причины наблюдаемых проблем. Устраните их. Добейтесь, чтобы процесс стал управляемым, результативным. Оптимизируйте издержки. И тогда опишите, как необходимо выполнять работу, чтобы соответствовать требованиям. В японской терминологии стандартная операционная процедура это наилучший способ выполнять работу. А очень часто встречается ситуация, когда ИСО-стандарты воспринимают единственно как необходимость написать несколько документированных процедур. Абы

Рисунок 1.

20

как. Часто без особой привязки к реальной работе. Это не СМК. Это профанация, причем профанация в первую очередь самих ИСО-стандартов. Тут же скажем, что убрано требование по наличию ответственного представителя в области качества. Теперь более детально обо всех изменениях и о том, почему и как они возникли. В 2009 году в рамках ИСО/ТК 176 (комитета ИСО, который отвечает за актуализацию стандартов на системы менеджмента качества) была образована группа из 80 экспертов, которым сказали: «Не обращайте внимание на ИСО 9001. Ваша задача — выявить все современные тенденции в мире менеджмента качества, которые могут представлять интерес для его стандартизации». В результате были определены 18 направлений, которые вошли в отчет под названием «Концепции менеджмента качества» [1]. Вот они.

01. Интеграция риск-менеджмента.

02. Расширенный фокус на соответствие продукции.

03. Финансовые ресурсы организации.

04. Поддержание инфраструктуры.

05. Связь с практикой бизнеса.

06. Менеджмент процессов.

07. Менеджмент знаний.

08. Менеджмент жизненного цикла.

09. Принципы менеджмента качества.

10. Компетентность.

11. Менеджмент цепочки поставок (и аутсорсинг).

12. Инструменты качества.

13. Коммуникации.

14. Улучшения и инновации.

15. Структура СМК и связь с другими стандартами на системы менеджмента.

16. Время, скорость, быстрота адаптации и аспекты СМК.

17. Влияние технологий информационного менеджмента.

18. Расширение концепции «Потребитель» В дальнейшем эти идеи вкупе с мнениями других заинтересованных сторон, как, например, представителей бизнеса, органов по стандартизации, аккредитации, сертификации, других технических комитетов ИСО, стали основой для составления технического задания на пересмотр ИСО 9001. Не все они так или иначе попали в спектр рассмотрения окончательной проектной спецификации на пересмотр, но основные темы, связанные с управлением рисками, интеграции с другими стандартами на системы менеджмента, управлением знаниями, согласованностью с практикой бизнеса, конечно, невозможно было оставить без внимания. Также входными данными для пересмотра ИСО 9001 явились результаты интернет-опроса пользователей стандарта, который прошел в 2011 году [2]. Масштабное исследование мнений пользователей проводилось в он-лайн-режиме на сайте ИСО. Вот некоторые результаты, представляющие интерес. Прежде всего следует обратить внимание на безусловную (91 % ответивших) положительную оценку актуальности стандарта ИСО 9001 (см. рис. 1). При этом 64 % опрошенных считают, что необходимы улучшения.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

В качестве основного побудительного мотива сертификации СМК на соответствие ИСО 9001 бόльшая часть пользователей показала желание достичь удовлетворенности потребителей (рис. 2). Среди наиболее важных преимуществ от применения ИСО 9001 (см. рис. 3) названы повышение удовлетворенности потребителей и стандартизация бизнес-процессов. Самым значительным толчком к пересмотру ИСО 9001 стал факт Рисунок 2. появления в рамках ИСО и не только большого количества руководящих указаний и стандартов на системы менеджмента в самых различных отраслях человеческой деятельности: от аэрокосмической до медицинской промышленности, от организации выборов до уборки снега и льда. Кроме того, стандарты стали распространяться на экологическую, социальную, информационную подсистемы менеджмента организации, сферу обеспечения безопасности и охраны труда (но мы то знаем, кто был их отцом). Не во всех случаях появляющиеся документы были гармонизиРисунок 3. рованы между собой, что создавало дополнительные трудности для организаций, у которых, на самом деле, всего одна система менеджмента как принятый способ управления и достижения целей. Бизнес-сообщество не раз обращалось в ИСО с просьбой разработать стандарт на интегрированные системы менеджмента. Ответом стали пересмотренные директивы ИСО, устанавливающие правила разработки, принятия и пересмотра стандартов. Так родилось специальное Приложение SL «Структура высокого уровня» к директивам ИСО, в котором жестко поставлены требования к терминологии, структуре и большей части текста стандартов на системы менеджмента. Отныне ИСО 9001, ИСО 14001, ИСО 45001 (выйдет вместо OHSAS 18001) и другие приобретут портретное сходство, отличаясь лишь названием и некоторыми аксессуарами. Проще говоря, Приложение SL — шаблон для работы писателей стандартов, которые теперь могут сосредоточить свои усилия на требованиях к конкретным дисциплинам, специфика которых будет отражена преимущественно в восьмой главе (каждого) стандарта под названием «Функционирование» (Operation). Организациям-пользователям стандартов теперь будет гораздо проще выбирать стандарты, подходящие к своей специфике, не заботясь о том, как их придется интегрировать в единую систему. Для аудиторов тоже настанет райская жизнь, и они, наконец, смогут сосредоточиться на повышении своей компетентности в отдельных секторах экономики и применимых законодательных требованиях, не заботясь особо о различиях в общих требованиях стандартов на системы менеджмента. e-mail: medalfavit@mail.ru

С чем уже точно определились, так это с принципами менеджмента качества. Они были тщательно проанализированы, пересмотрены и вошли в Приложение Б к стандарту. Почитатели принципов сразу заметят основное изменение: их стало семь за счет долгожданного слияния принципов «Процессного подхода» и «Системного подхода к менеджменту» в единый принцип «Процессный подход». Не могу удержаться, чтобы его не процитировать: «Последовательные и предсказуемые результаты достигаются более эффективно и результативно, когда деятельность понимается и управляется как взаимосвязанные процессы, функционирующие в виде целостной системы». В целом формулировки принципов менеджмента качества стали более отточенными, и настоящие гурманы почувствуют их возросшую привлекательность для понимания духа стандарта. В начале процесса пересмотра была создана проектная спецификация (или техническое задание) на пересмотр ИСО 9001, цели которого следующие: • создать стабильную систему требований на следующие 10 лет; • несмотря на достаточно общий характер, быть все еще актуальным для всех типов и размеров организаций, независимо от сектора экономики; • сохранить нынешний акцент на результативном управлении процессами для достижения желаемых результатов; • принять во внимание изменения в практике менеджмента качества, так как последний крупный пересмотр состоялся в 2000 году;

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

21

• отразить изменения во все более сложной и динамичной среде, в которой действуют организации; • использовать простые формулировки, чтобы обеспечить общее понимание и интерпретацию требований; • применить общую структуру, текст и определения, изложенные в Приложении SL к Директиве ISO для обеспечения совместимости с другими системами менеджмента (например, ISO 14001). Итог двухлетней кипучей работы — Проект международного стандарта ISO/DIS 9001 «Системы менеджмента качества — требования». Структура стандарта разработана в соответствии с Приложением SL с учетом специфики объекта стандартизации. Предисловие 0. Введение 1. Область применения 2. Нормативные ссылки 3. Термины и определения 4. Контекст деятельности организации 4.1. Понимание организации и ее контекста.

4.2. Понимание потребностей и ожиданий заинтересованных сторон.

4.3. Определение области применения системы менеджмента качества.

4.4. Система менеджмента качества и ее процессы.

5. Лидерство 5.1. Лидерство и обязательства.

5.2 Политика в области качества.

5.3. Организационные роли, ответственность и полномочия.

6. Планирование системы менеджмента качества 6.1. Действия в отношении рисков и потенциальных возможностей.

6.2. Цели в области качества и планирование их достижения.

6.3. Планирование изменений.

7. Обеспечение 7.1. Ресурсы.

7.2. Компетентность.

7.3. Осведомленность.

7.4. Коммуникации.

7.5.Документированная информация.

8. Функционирование 8.1. Планирование и управление функционированием.

8.2. Определение требований для продуктов и услуг.

8.3. Проектирование и разработка продуктов и услуг.

8.4. Управление продуктами и услугами внешнего происхождения.

8.5. Производство и предоставление услуг.

8.6. Выпуск продуктов и услуг.

8.7. Управление несоответствующими результатами процесса, продуктами и услугами.

9. Оценка результатов деятельности (Performance evaluation) 9.1. Мониторинг, измерение, анализ и оценка.

9.2. Внутренний аудит.

9.3. Анализ со стороны руководства.

22

10. Улучшение 10.1. Общие положения.

10.1. Несоответствия и корректирующие действия.

10.2. Постоянное улучшение. Приложение А (справочное). Пояснения по новой структуре, терминологии и концепциям Приложение B (справочное). Принципы менеджмента качества Приложение С (справочное). Портфолио стандартов менеджмента качества ИСО серии 10 000 Еще раз следует повторить, что какие-то подразделы могут поменяться на следующей стадии работы над стандартом. Основные изменения по сравнению с предыдущей версией стандарта уже рассматривались в недавно вышедших статьях [3]. Рискнем предложить свой вариант Top‑10 хитов новой версии ИСО 9001.

1. Измененные структура, текст, термины в соответствии с Приложением SL (директивы ИСО).

2. Контекст деятельности организации.

3. Учет потребностей заинтересованных сторон.

4. Риск-ориентированное мышление.

5. Лидерство руководства.

6. Интеграция требований системы менеджмента качества в бизнес-процессы организации.

7. Организационные знания.

8. Документированная информация.

9. Продукты и услуги внешнего происхождения.

10. Пересмотренные принципы менеджмента качества. Если помните, то в существующем ИСО 9001:2008 основной блок требований начинается с требований к процессам. Новая версия начинается иначе и, пожалуй, более осмысленно. Для того чтобы начать планирование СМК, надо сначала определиться, в каком окружении действует организация, каковы условия ее существования и развития или, говоря словами стандарта, каков ее контекст, который имеет как внутреннее, так и внешнее содержание. Внешний контекст охватывает понимание и учет вопросов, связанных с конкуренцией, с юридической, технологической, культурной, социальной, экономической и окружающей средами, будь то на международном, национальном, региональном или местном уровнях. То есть нужно дать ответ на вопрос, какие внешние силы имеют отношение к бизнесу, и как они влияют на способность удовлетворять потребности клиентов. Вот тут самое время вспомнить о бенчмаркинге, о развертывании функции качества (QFD) и о других инструментах исследования рынка. Внутренний контекст относится к пониманию ценностей и культуры организации, возможностей людей, зрелости процессов и т. д. В рамках такой вот подготовительной работы организация должна также получить общее понимание потребностей и ожиданий тех внутренних и внешних заинтере-

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

e-mail: medalfavit@mail.ru

Act — внедрять улучшения (по необходимости

Входы

Plan — планировать процесс (глубина планирования зависит от рисков)

Do — выполнять процессы

Выходы

Check — проводить мониторинг / измерения функционирования процессов

Взаимодействие с другими процессами

Вся эта информация в дальнейшем учитывается при работе с рисками в рамках СМК. Внимательный читатель обязательно заметит, что в новой версии отсутствует раздел, формулирующий особые требования к «предупреждающим действиям». Это связано с тем, что одно из ключевых назначений надлежаще функционирующей системы менеджмента состоит в том, чтобы действовать как инструмент предупреждения. Подготовка персонала, поддержание инфраструктуры, внутренние аудиты — все это предупреждающие действия. Эти действия заложены в самом духе стандарта. И в новой версии это дух будет выражаться в виде «риск-ориентированного мышления». Данная концепция всегда была заложена в ISO 9001, но в новой версии она более явно встраивается во всю систему менеджмента. Вот одно из упоминаний о рисках в тексте проекта новой версии стандарта: «Организация должна определить риски и возможности, планировать и проводить соответствующие действия по обращению с этими рисками». Обратите внимание на слово возможности. Риск часто воспринимается только в негативном смысле, но риск-ориентированное мышление может также помочь определить возможности для улучшения, что может рассматриваться как положительная сторона риска. Не все процессы системы менеджмента качества представляют один и тот же уровень риска с точки зрения способности организации выполнять свои задачи, и последствия несоответствий процесса, продукта, услуги или системы не одни и те же для всех организаций. Для некоторых организаций последствия предоставления несоответствующей продукции и услуги могут привести к незначительным причиняемым заказчику неудобств, для других последствия могут быть фатальными. Риск-ориентированное мышление, следовательно, означает учет риска в аспекте влияния на качество при определении уровня требований, необходимых для планирования и управления системой менеджмента качества, а также ее составных процессов. Текст документа требует применения риск-ориентированного подхода на всех этапах (P-D-C-A) функционирования системы менеджмента качества. Однако, хотя риски должны идентифицироваться и учитываться, нет никаких требований для формального внедрения системы менеджмента рисков или документированного процесса управления рисками. Стало заметным усиление позиций процессного подхода в модели СМК. Так, в дополнение к существующим требованиям к процессам добавились прямые требования об:

Взаимодействие с другими процессами

сованных сторон, которые могут повлиять навыполнение своих обязательств. Среди этих заинтересованных сторон могут оказаться: а) непосредственные клиенты; б) конечные пользователи; в) поставщики, дистрибьюторы, ритейлеры или другие, вовлеченные в систему поставок; г) регулирующие органы и д) любые другие значимые заинтересованные стороны: сотрудники, владельцы (акционеры), общество, партнеры.

Рисунок 4.

• установлении требуемых входов и ожидаемых выходов; • распределении ответственности и полномочий для этих процессов; • определении рисков для их функционирования. Кроме всем известного рисунка процессной модели, показывающей связи между главами стандарта, добавился еще один скетч, напоминающий о порядке управления отдельно взятым процессом в системе (рис. 4). Также одной из обязанностей высшего руководства станет «продвижение понимания процессного подхода» в организации. Как это продемонстрировать? Представляется, что повторение руководством мантры Деминга P-D-C-A на утренних планерках вкупе с реальными примерами поможет искоренить функциональный эгоизм руководителей некоторых подразделений. Кстати, возможно, очень непросто будет некоторым руководителям демонстрировать лидерские качества. Кроме существующих обязательств, они должны: • принять ответственность за результативность СМК; • обеспечить интеграцию требований системы менеджмента качества в бизнес-процессы организации; • задействовать, направлять и поддерживать персонал, который вносит свой вклад в результативность СМК. Топ-менеджмент, как ожидается, должен создать культуру и среду, которые поощряли бы линейных руководителей-лидеров активно добиваться выполнения требований системы менеджмента и стремиться достичь целей. Так что задушевные беседы аудиторов с руководителями организаций в недалеком будущем станут еще более интересными и продолжительными. А вот без представителя руководства по качеству, оказывается, можно обойтись. Требования о его назначении в стандарте нет, хотя ничто не мешает определить роль ПРК и поручить ему выполнение известных задач. При этом хотим обратить внимание пользователей стандарта, что принцип лидерства руководства сохраняется и без идеолога и ответственного за СМК со стороны управленческого звена обойтись будет трудно. При разработке и внедрении СМК часто путались между исполнителями работ по СМК и ответственным за СМК. В задачи ответственного входит принятие управленческих решений

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

23

по системе качества, мотивации персонала, выделению ресурсов и т. д. Исполнение же этих решений может и должно быть передано другим сотрудникам. Безусловной «фишкой» новой версии станут требования к управлению потенциалом знаний организации, необходимых для функционирования процессов и достижения соответствия продуктов и услуг. Эта база знаний должна поддерживаться и быть доступной в необходимом объеме. Хотя предвижу определенные трудности в реализации этих требований, ведь люди не всегда охотно делятся своими знаниями и опытом. Хорошим подспорьем для организаций также станет применение одних и тех же требований как к закупкам продукции и услуг, так и к аутсорсинговым процессам. Теперь будут применяться единые требования к управлению «продуктами и услугами внешнего происхождения». Ну и подлинным подарком, как мы уже обозначили выше, является предоставляемая свобода в части документирования системы менеджмента. Уходят в прошлое обязательные документированные процедуры. Вводится новый термин «документированная информация» (то есть документы и записи), и сама организация должна принять решение по объему и составу «документированной информации, необходимой для обеспечения результативности системы менеджмента качества». В стандарте будут только расставлены в разных местах акценты на необходимость ведения такой информации. Например, «организация должна поддерживать соответствующую документированную информацию, как свидетельство компетентности персонала». Теперь рассмотрим все эти изменения применительно к сфере здравоохранения. Начнем с производителей. В ИСО 13485 менеджмент рисков на базе ИСО 14971 требовался всегда, поэтому в этом ключевом изменении в ИСО 9001 ничего принципиально нового для производителей МИ нет. ИСО 9001 стал просто ближе к идеологии ИСО 13485. При этом для производителей медицинских изделий рекомендуется использовать различные формализованные инструменты по управлению рисками, такие как FMEA-анализ и другие [4]. Требование по постоянному улучшению, формально убранное из ИСО 13485, тем не менее всегда присутствовало в нем в виде более стандартизованного подхода того же менеджмента рисков. Поэтому формальное отличие ИСО 13485 и ИСО 9001 на практике отсутствует. Подтверждением тому является ИСО/ТО 22869, где однозначно сказано, что деятельность по улучшениям можно планировать и осуществлять в соответствии с ИСО 14971 [5]. Требования к документации для производителей МИ всегда были жестче, чем в ИСО 9001. Но и в медицинском стандарте подчеркивается, что документация СМК в первую очередь зависит от конкретной организации, в том числе от компетентности персонала. Для медицинских лабораторий ситуация несколько сложнее, потому что формально структура ИСО 15189 построена в соответствии со структурой ИСО/МЭК 17025. Тем не менее, если вникнуть в суть ИСО 15189, становится понятым, что никаких противоречий с ИСО 9001, особенно в его новой редакции, нет [6].

24

Менеджмент рисков стал требованием в ИСО 15189 версии 2012 года, и здесь никаких различий с ИСО 9001 не наблюдается. Требования по документообороту ИСО 15189 версии 2012 года также более клиентоориентированы, как и в ИСО 9001 версии 2015 года. Так как ИСО 15189 во многом идеологически похож на GLP и GCP, обычно под документацией СМК медицинской лаборатории понимают наличие множества стандартных операционных процедур. При этом надо четко понимать, что степень детализации работ в СОПах зависит в первую очередь от компетенции персонала, автоматизации процедуры, ее сложности. То есть СОПы одной лаборатории будут отличаться от СОПов другой. Та же идеология заложена в требования по документации ИСО 9001. Если говорить о записях, как о подтверждении соответствия, то и в ИСО 9001, и в ИСО 13485, и в ИСО 15189 заложена единая идеология — обеспечить: а) прослеживаемость информации, б) объективную доказательную базу по подтверждению соответствия требованиям. В этом все три стандарта полностью идентичны. И для производителей МИ, и для лабораторий, какими бы техническими ни были основные требования по СМК, важно понимать, что без применения принципов менеджмента качества повсеместно внутри организации построить грамотную эффективную (в том числе экономически) СМК просто невозможно. И здесь вам поможет в первую очередь ИСО 9001, а также все гармонизированные с ним стандарты: серии ИСО 9000 и ИСО 10000 (детально об этом смотрите в приложении к ИСО 9001 версии 2015 года). Если говорить об ЛПУ и других учреждениях здравоохранения, новая версия 9001 существенно поможет главному врачу и его заместителям выстроить эффективную управленческую систему, особенно в новых непростых условиях. К примеру, выполнение базовых требований ИСО 9001 ориентирует вас на такие доказавшие свою эффективность инструменты, как система сбалансированных показателей, ключевые показатели эффективности персонала (в более известной нам терминологии «эффективный контракт»), анализ сильных и слабых сторон организации (SWOT-анализ), управление по целям (MBO) и т. д. Набор управленческих инструментов будет, естественно, разниться от ЛПУ к ЛПУ, ведь в ИСО 9001 нет конкретных требований по применению данных инструментов. Но сам стиль мышления в рамках ИСО 9001 позволит выживать, развиваться и процветать в непростых условиях функционирования системы государственного здравоохранения. Одна из ошибок, которая часто встречается, состоит в непонимании методики создания результативной и эффективной системы менеджмента. Начинать разработку такой системы с внедрения стандарта ИСО 9001 для организации может оказаться не самым лучшим решением. Она прежде всего должна осознать, какие проблемы управления качеством присущи ее работе и оценить, является ли внедрение ИСО 9001 решением этих проблем. Может быть, применение другого инструмента было бы более действенно?

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

При анализе стандарта необходимо прежде всего обратить внимание на его вводную часть, где напоминается, что внедрение системы менеджмента качества надо рассматривать как стратегическое решение организации. Такие решения принимает верхний уровень управления, и совсем не потому, что тут потребуются деньги, а потому, что это влечет за собой переориентацию всей организации на новое направление. Например, вместо того, чтобы ограничиться простым выполнением стандартов и порядков оказания медицинской помощи, организация должна пойти навстречу своим пациентам, устраняя из процессов все, что отрицательно влияет на их удовлетворенность. Не все организации готовы к такому резкому повороту: вместо того, чтобы быть ориентированным на себя, стать полностью ориентированным на пациента. Если посмотреть, как в ИСО 9001 описывается область применения того стандарта, тогда можно увидеть, что их две: • демонстрация способностей организации поставлять продукцию и услуги в соответствии с требованиями клиентов и закона и • повышение степени удовлетворения клиентов организации. Очевидно, что получение внутренних выгод не является целью стандарта. Они, конечно, есть, но получаются косвенно в результате грамотного применения принципов управления качеством. Второй пункт, повышение степени удовлетворения клиентов, в случае медицинских организаций не вызывает сомнений. Проблематичен первый пункт — демонстрация способностей. Кому и зачем? Вроде бы это ясно, имеются в виду клиенты и государственные органы? Но в сфере здравоохранения требования клиентов учитываются только косвенно, через объединение этих требований в законы и правила оказания услуг, регулирующие медицинскую деятельность. Законы и правила применяются на всех клиентов организации. Не будет же больница каждому отдельно взятому пациенту демонстрировать, что она способна его лечить! Вдобавок тому, требования закона проверяются уполномоченными государственными органами, например Росздравнадзором, Роспотребнадзором и другими, но эти органы не принимают во внимание стандарт ИСО 9001. Поэтому неясно, кому необходимо «демонстрировать способности», про которые говорит стандарт. С появлением инструмента сертификации органам, которые этим занимаются, медицинские организации демонстрируют, что требования стандарта ИСО 9001 удовлетворены. Является ли тогда получение сертификата демонстрацией того, что медицинская организация способна удовлетворять требования пациентов? Конечно, нет. В стандарте ясно написано, что его требования являются общими, и что они применимы к любой организации и к любой деятельности. В случае медицинских организациях одних только общих требований недостаточно, они должны быть дополнены специфическими требованиями, которые относятся к управлению фармацевтическими средствами, лабораторным испытаниям, непрерывному e-mail: medalfavit@mail.ru

медицинскому образованию, управлению внутрибольничными инфекциями и рядом других областей. Некоторые из этих требований урегулированы законом, а некоторые считаются надлежащей практикой, но не прописаны нигде. Напрашиваются следующие выводы: • стандарт позволяет извлечь пользу от внедрения СМК (что описано в его вводной части), хотя его назначение совсем другое — демонстрация способностей поставлять продукцию и услуги и повышение уровня удовлетворенности клиентов. Кому демонстрировать способность и как это сделать, остается неясным; • внутренние потребности организации не могут быть удовлетворены на основании одних только требований стандарта ИСО 9001. Организация должна выявить требования, которые относятся ко всем аспектам ее деятельности (определить контекст); • медицинская организация должна улучшать все аспекты своей деятельности, не только качество услуг. Система менеджмента качества, сколь бы она ни была грамотно построена, не охватывает ряд областей, например внутрикорпоративную культуру, рабочую мотивацию персонала, управление активами организации и т. д. Поэтому стандарт ИСО 9001 надо считать только отправной точкой на пути непрерывного улучшения. Можно сказать, что новая редакция стандарта ИСО 9001 медицинским организациям будет значительно более понятна, чем существующая, но в то же самое время она потребует освоения некоторых навыков и инструментов управления которые не изучаются в системе профильного обучения медперсонала. Можно, конечно, воспользоваться услугами консультантов, но тех, которые одновременно понимают и специфику здравоохранения, и методы построения системы менеджмента качества, очень и очень мало. Какие же инструменты управления полезно применять для соответствия требованиям ИСО 9001, а также отраслевым стандартам ИСО 13485 и ИСО 15189?

• Определение контекста деятельности организации: SWOT- и PEST- анализы.

• Стратегическое управление: система сбалансированных показателей (BSC), управление по целям (MBO), модель «идеальной» организации.

• Мотивация: ключевые показатели деятельности (KPI), что сейчас реализуется в системе управления ЛПУ через эффективные контракты.

• Управление рисками.

• Управление внутренними аудитами. Пример из практики. Здесь мы хотим порекомендовать использовать подход современному гуру менеджмента Эльяху Голдратта и разработанную им теорию ограничений. Суть теории предельно проста. Любую организацию можно представить в виде взаимосвязанных звеньев одной цепи. Если цепь растягивать, порвется самое слабое звено. Подход Голдратта позволяет определить в организации это слабое звено. И этот же подход можно применять при выявлении причин найденных несоответствий после проведенного внутреннего аудита. Цель внутреннего аудита не только

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

25

в том, чтобы устранить конкретно найденную проблему (несоответствие), а в том, чтобы аналогичных проблем больше не возникало. Для этого надо понять, какая причина вызвала данный сбой. Причем зачастую причина выявленного несоответствия лежит совершенно в другом процессе, далеком от того подразделения, где конкретное нарушение было выявлено. Приведем пример. В крупном медицинском центре стал поступать шквал жалоб на сотрудниц регистратуры. Наверно, подобная ситуация знакома многим. Но что такое регистратура? Это «острие угла». Именно сюда идет пациент, если он чем-то недоволен. Долгое ожидание врача — виновата регистратура. Не дозвониться — виновата регистратура. Сотрудницы регистратуры хамят, долго ищут документы, отвлекаются и т. д. Анализируя жалобы и обращения пациентов, очень часто можно увидеть, что пациент недоволен работой регистратуры. Но что за этим стоит? Действительно ли виновато данное подразделение и им надо заниматься? В нашем примере основной поток жалоб касался плохой записи на прием к врачу и длительное время ожидания специалиста. Внедрение МИС, обучение сотрудниц регистратуры, последующее введение штрафных санкций ни к чему не привело. В итоге выяснилось, что дело было совсем не в них. Основная масса лечащих врачей мед центра работала по совместительству. Врачи часто опаздывали на прием, не очень ответственно относились к работе в данном центре. Было принято решение по изменению

кадровой политики. Оно касалось установки минимум 80 % специалистов перевести на постоянную работу. Когда это было сделано, жалобы на регистратуру иссякли. Поиск реальной причины проблемы может быть достаточно прост, но может быть осложнен множеством факторов как технической, так и человеческой природы (человеческий фактор). Если вы понимаете, что реальная причина проблемы ускользает от понимания, полезно применить формализованный подход Э. Голдратта.

Список литературы 1. Аванесов Е. К. первые идеи о будущем стандарте ISO 9001:20XX. // Методы менеджмента качества. — 2009. — № 8. — С. 24–36.

2. Чайка И. И., Галеев В. И., Аванесов Е. К. Вглядываясь в будущее ИСО 9001// Стандарты и качество. — 2012. — N 2. — С. 82–85.

3. Чайка И. И. Стандарт ИСО 9001:2015. Что нас ожидает? // Стандарты и качество. — 2014 . — № 6. — С. 60–63.

4. Зубков Ю. П. // Менеджмент риска в производстве медицинских изделий. // Ю. П. Зубков, В. А. Новиков, А. В. Эмануэль. // Компетентность, 2010, № 4–5, С. 66–71.

5. Эмануэль А. В. // Применение менеджмента рисков на основе стандарта ИСО 14971: методические подходы. // А. В. Эмануэль, Г. А. Иванов, М. Д. Гейне. // Вестник Росздравнадзора, 2013, № 3, С. 45–60.

6. Эмануэль А. В. // Проблемы внедрения системы менеджмента качества в лабораторной медицине / А. В. Эмануэль, Г. А. Иванов. // Клиническая лабораторная диагностика, 2010, № 9, С. 40.

7. А. В. Эмануэль. // Особенности новой версии стандарта ИСО 15189:2012. // А. В. Эмануэль, Г. А. Иванов и др. / Справочник заведующего КДЛ, 2015, № 4.

РОССИЙСКАЯ АССОЦИАЦИЯ МЕДИЦИНСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

План мероприятий, проводимых Российской ассоциацией медицинской лабораторной диагностики в 2016 году Конференции и выставки 10–11 марта 2016 года Научно-практическая конференция «Лабораторная медицина России: полноценная реализация клинического потенциала и современного технологического процесса медицинских лабораторий» и специализированная выставка «Лабораторная медицина — 2016» Место проведения: г. Белгород. Организатор: РАМЛД

07–08 сентября 2016 года Научно-практическая конференция «Инновационные технологии и клиническая значимость лабораторных тестов» и специализированная выставка «Лабмедицина — 2016» Место проведения: г. Ростов-на-Дону Организатор: РАМЛД

27–28 апреля 2016 года Научно-практическая конференция «Инновационная лабораторная медицина: новые клинико-диагностические решения и современные аналитические технологии» и специализированная выставка «Клиническая лаборатория — 2016» Место проведения: г. Тюмень. Организатор: РАМЛД

26–27 октября 2016 года Научно-практическая конференция «Современная лабораторная медицина: инновационные технологии лабораторного анализа и новые возможности их клинического применения» и специализированная выставка «МедЛабТех — 2016» Место проведения: г. Пенза Организатор: РАМЛД

25–26 мая 2016 года Научно-практическая конференция «Современная лабораторная медицина: инновационные технологии лабораторного анализа и новые возможности их клинического применения» и специализированная выставка «МедЛабТех‑2016» Место проведения: г. Пермь Организатор: РАМЛД

25–26 ноября 2016 года Российско-белоруский форум «Диагностическая лаборатория — клиника: значимость инновационных и традиционных лабораторных тестов» и специализированная выставка «Интерлаб — 2015» Место проведения: г. Минск, Республика Беларусь Организатор: РАМЛД

Российская ассоциация медицинской лабораторной диагностики:

26

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

119526, Россия, Москва, а/я 117 Е-mail: ramld@ramld.ru.

e-mail: medalfavit@mail.ru

Клиническая лабораторная диагностика: анализ — диагноз — лечение В. В. Помазанов, проф., генеральный директор НП СРО ООПРХ «ЦентрРеаxим», г. Москва Clinical laboratory diagnostics: analysis — diagnosis — treatment V.V. Pomazanov

Резюме В статье рассматривается роль современной лабораторной медицины, подготовки профессиональных кадров, создание отечественного приборостроения и современной базы реагентов.

Summary The article discusses the role of the modern laboratory medicine, professional training, the establishment of domestic instrument and contemporary base reagents.

Ключевые слова: клиническая лабораторная диагностика, концепция развития службы, анализ, диагноз, лечение, стоимость анализа, подготовка кадров, образовательная деятельность, паспорт специальности, диссертационный совет, приборное оснащение, диагностикумы, неудовлетворительная статистика заболеваний, инфекции torch-группы, диагностический комплекс, ЗАО «Эколаб».

Key words: clinical laboratory diagnostics, the concept of service development, analysis, diagnosis, treatment, analysis cost, training, educational activities, Dissertation Council, instrumentation, diagnosticum, an unsatisfactory statistics of diseases, infections of the torch-group, diagnostic equipment, Ecolab.

К

лючевыми моментами, формирующими профиль современной лабораторной медицины, на сегодняшний момент являются вопросы подготовки профессиональных кадров, создание отечественной приборостроительной и реагентной базы. Особое место в этом профиле занимает лабораторная аналитика, эффективность действий которой зависит от вовлечения в сферу ее влияния большого сегмента специальностей, как правило, не входящих в перечень медицинских дисциплин. Кадровые и материальные ресурсы лабораторий, входящих только в систему Минздрава России, позволяют ежегодно выполнять более 2,6–2,7 млрд лабораторных анализов. Если прибавить к этому ведомственные, частные и другие клинико-диагностические лаборатории (КДЛ), то эту цифру необходимо увеличить по крайней мере в 1,5 раза. По экспертным данным, в каждом районе Москвы успешно функционируют порядка 18–22 частных медицинских центров, обслуживаемых 3–5 лабораториями. При этом стоимость анализов довольно высока. Например, общий анализ крови обойдется жителю Москвы в 1,5–3 тыс. руб.; сероe-mail: medalfavit@mail.ru

логический анализ на инфекции TORCH-группы — 3–6 тыс. В амбулаторно-поликлиническом звене на 100 посещений выполняются 120 лабораторных анализов, а на одного стационарного больного приходятся в среднем 39 [1, 5, 7]. Основной задачей и условием развития клинической лабораторной диагностики является получение объективных данных о качестве здоровья отдельно взятого пациента, выделенной группы или населения региона в целом. Получение и реализация таких данных определяется триадой взаимосвязанных и последовательных технологий: анализ — диагноз — лечение. При этом если аналитические технологии разрабатываются и применяются специалистами крайне широкого круга специальностей (химических, физических, технических, биохимических, биологических, микробиологических и многих других, в том числе медицинских), то формирование диагноза и последующего лечения является прерогативой исключительно специалистов медицинских дисциплин. Это в определенной степени подтверждается данными реестра КДЛ: из 69 регионов России за 2013 год, где общее количество специалистов, занятых

в сфере клинической лабораторной диагностики, составляло по штатному расписанию 75 953 человека, из них врачей КДЛ — 13 696 [6, 7]. Приблизительно такое же соотношение наблюдалось и в 2003 году [1, 5, 6]. Заказчиком лабораторных исследований является лечащий врач или врач, проводящий диспансерное обследование. Именно он определяет круг исследований, организует сбор и взятие материала. Номенклатура лабораторных исследований (как и перечень используемых методик, штатного оборудования и др.) составляет более 1,5 тыс. наименований [1, 4, 5,]. Таким образом, формирование тематики медицинского приборостроения и технического оснащения аналитико-диагностических лабораторий находится в полной зависимости от специалистов медицинского профиля, получающих информацию об уровне существующей лабораторной техники и реагентов в основном из специализированных журналов медицинской направленности. В настоящее время плачевно обстоит дело с приборным парком, его сервисным обслуживанием, обеспечением расходным, вспомогательным оборудованием

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

27

и материалами. В среднем на одну лабораторию приходится 0,2–0,3 спектрофотометра или биохимического анализатора (в то же время имеются КДЛ, где дорогостоящая импортная аппаратура годами стоит нераспакованной, в том числе и изза отсутствия квалифицированных специалистов) [1, 5, 7]. Использование в клинико-лабораторной практике специалистов немедицинского профиля диктуется прежде всего сложностью и крайним разнообразием методов и технических средств, требующих специальных знаний в различных областях науки и техники. История полна примерами, когда методы и приборы, широко вошедшие в практику лабораторных исследований, были открыты изобретателями и учеными далеко не медицинских специальностей Клиническая лабораторная диагностика является комплексной медицинской специально стью, включающей более десяти основных субдисциплин: клиническая биохимия, гематология, цитология, лабораторная генетика, общеклинические исследования, иммунология, изосерология, молекулярная биология, бактериология (паразитология, вирусология), токсикология, коагулология. Объединяющим началом перечисленных субдисциплин является использование в качестве основного носителя аналитической информации биоматериала человека, исследуемого in vitro в лабораторных условиях и сложной аналитической техники [1, 4]. Теоретической основой лабораторной диагностики являются как медицинские, так и фундаментальные науки, прежде всего физика, химия, биофизика, биохимия, молекулярная биология, микробиология, математика, развитие которых определяет прогресс возможностей и качества лабораторных исследований. Это формирует профе ссиональную подготовленность исследователя, который может иметь любое образование: химическое, биологическое и даже техническое образование, то есть отнюдь не медицинское. Тем не менее только специалисты с высшим медицинским образованием, имеющие подготовку в области 28

клинической лабораторной диагностики, позиционируются как врачи клинической лабораторной диагностики. От уровня их мировоззрения зависит не просто правильно поставленный диагноз на данных правильно поставленного анализа, но и формирование текущего и перспективного методического, технического и реагентного обеспечения КДЛ. В соответствии с действующим приказом Минздрава [8], «клиническая лабораторная диагностика» предусматривает уровень профессионального (высшего) образования как специалитет по одной из специальностей: «лечебное дело», «педиатрия», «стоматология», «медико-профилактическое дело», «медицинская биохимия», «медицинская биофизика», «медицинская кибернетика». Дополнительное профессиональное образование — профессиональная переподготовка по специальности «клиническая лабораторная диагностика» при наличии высшего образования (интернатура или ординатура) по одной из основных специальностей или специальности, требующей дополнительной подготовки. Подготовленный специалист может занимать должности: врач клинической лабораторной диагностики, руководитель структурного подразделения — врач клинической лабораторной диагностики. Формально сотрудники КДЛ должны иметь исключительно медицинское образование. На практике высшее медицинское образование имеют не более 20 % служащих КДЛ, что объясняется также нехваткой дипломированных врачей [1, 5–7]. Еще более неопределенная процедура, не стимулирующая развитие отечественной лабораторной диагностики, сложилась при получении высшего послевузовского образования (кандидата и доктора наук). В соответствии с паспортом (формулой) специальности ВАК 14.03.10, «клиническая лабораторная диагностика — научная специальность (медицинские и биологические науки), занимающаяся: • разработкой лабораторных методов объективного химического и морфологического анализа био-

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

логических материалов (жидкостей, тканей, клеток) человеческого организма; • оценкой с помощью этих методов состояния органов, физиологических систем организма и их резервных возможностей; • выявлением отклонений от нормы и патологических нарушений в деятельности органов, систем организма человека; • установлением диагнозов болезней и осуществлением лабораторного контроля за динамикой патологического процесса, результатами лечения и реабилитацией». Исходя из первого пункта формулы специальности, в диссертации соискателя на ученую степень (кандидата или доктора наук) представляются материалы, посвященные разработке метода анализа биоматериала in vitro и лишь затем диагностике патологии (2–4-й пункты). Разработанный (усовершенствованный) метод может основываться на всех известных и неизвестных многочисленных явлениях и законах природы (химических, физических, биологических), не являющихся основными предметами изучения в медицинских вузах. Методы не предусматривают в качестве объекта исследования человека, а лишь дают качественные или количественные значения неких параметров состава или свойств биоматериала человека. Лишь затем эти параметры интерпретируются дипломированным диагностом. Для этого в паспорте специальности дается пояснение, что «Совершенствование методов клинической лабораторной диагностики будет способствовать правильной диагностике и эффективности лечения заболеваний, обеспечивать сохранение здоровья населения, сокращение сроков временной нетрудоспособности и реабилитации заболевших». Практика показывает, что большинство диссертационных советов при приеме диссертации к защите руководствуются не основополагающим пунктом формулы специальности, а пояснениями к ней, изложенными выше, требуя от соискателя не столько «разраe-mail: medalfavit@mail.ru

ботки метода объективного химического и морфологического анализа биологических материалов», сколько результатов «правильной диагностики и результатов лечения». Рассмотрение каче ства и количества диссертаций защищенных (представленных к защите) по специальность «клиническая лабораторная диагностика» за последние 10–15 лет показывает их сравнительно незначительное количество: за 13 лет были представлены всего 427 работ (17 % — докторские диссертации), тогда как по медицинским наукам за один только 2010 год — 362, по биологическим наукам — 237, по физико-математическим наукам — 371, по химическим наукам — 1 046, по техническим наукам — 12 459. Всего в 2010 году были защищены 31 477 диссертаций [9, 10]. До конца 2014 года в стране работали пять диссертационных советов, имеющих право принимать к защите диссертации на соискание ученой степени кандидата и доктора наук по специальности 14.03.10, а также по ряду других медицинских специальностей, не имеющих прямого отношения к лабораторной диагностике (табл. 1). В настоящее время функционируют всего два диссертационных совета: Д 208.072.08 и Д 205.001.01. При этом необходимо отметить, что из 26 членов совета Д 208.072.08 абсолютное большинство (19 членов) не являются специалистами в области клинической лабораторной диагностики, что не может стимулировать развития этой важнейшей для здравоохранения отрасли знаний. В 2014–2015 годах этот совет принял к защите 15 работ, из которых специальности 14.03.10. соответствовали всего две работы: кандидатская и докторская. Если в 2000– 2013 годах приведенные в табл. 1 диссертационные советы принимали в среднем по 31 ± 3 работы в год, то за последние 1,5–2 года таких работ практически нет [10]. Таким образом, развитие клинической лабораторной диагностики теперь в значительной степени будет зависеть от привлечения к сотрудничеству специалистов широкого круга специальностей: химиков, биоe-mail: medalfavit@mail.ru

химиков, физиков, биотехнологов и других ученых и специалистов, заинтересованных в создании новых методов и конструкций, способных существенным образом расширить наши знании о химическом составе и строении биологического материала — животных, растений, микроорганизмов. Особая роль отводится подготовке (переподготовке) кадров высшей квалификации (врачей, биологов кандидатов и докторов наук по специальности «клиническая лабораторная диагностика»), что, очевидно, потребует существенного пересмотра программ обучения и паспортов специальностей. На данном этапе гармоничное решение триединой проблемы «анализ — диагностика — лечение» возможно путем корпоративного объединения интересов всех трех участников триады. В качестве иллюстрации такого единения является создание методологического комплекса клинической лабораторной диагностики (на примере инфекций TORH-группы), объединяющего задачи и возможности нескольких учреждений и предприятий, работающих по единому плану и взаимовыгодным договорным обязательствам.

1. Анализ in vitro биопроб крови, обеспеченный соответствующим методическим, реагентным и приборным сервисом, выполняется специалистами ЗАО «ЭКОлаб» (медицинского центра El”Klinic); • себестоимость анализа на пять инфекций TORCH-группы составляет 400–460 руб., для жителей Электрогорска анализы выполняются бесплатно; • разработка, производство и поставка аналитического оборудования, оснащенного видеоцифровой регистрацией результатов анализа, устройствами для архивирования качественных и количественных измерений и передачей их на расстояние, программным обеспечением, вспомогательным оборудованием, проводится ЗАО «ЭКОлаб» (OOO «ЭКОлаб-Тех»); • разработка, испытание, государственная регистрация и поставка реагентов (диагностических наборов и тест-систем) всем заинте-

ресованным клинико-диагностическим лабораториям Российской Федерации и Таможенного союза проводится ЗАО «ЭКОлаб» и его дистрибьюторами; • подготовка кадров реализуется на базе факультета, учрежденного ЗАО «ЭКОлаб», Московским государственным областным гуманитарным институтом (кафедра фармакологии), Академией стандартизации, метрологии и сертификации; • метрология и стандартизация методик, реагентов и оборудования; • подготовка специалистов высшей квалификации по специальностям «клиническая лабораторная диагностика», «микробиология» (или «вирусология»), выполняется на базе ведущих исследовательских и учебных организаций Москвы и научно-производственных подразделений ЗАО «ЭКОлаб»; • всего за последние пять лет ЗАО «ЭКОлаб» разработало, испытало и поставило в региональные лаборатории 405 484 наборов для диагностики инфекций TORCH-группы: в 2010 году — 78 584 штуки; в 2011–102 068; в 2012–82 178; в 2013–65 448; в 2014–77 206 штук. Количество исследований, выполненных с использованием этих наборов, составляло ежегодно от нескольких десятков тысяч при анализах на токсоплазмоз, краснуху, ЦМВИ и простой герпес до сотен тысяч и миллионов при исследованиях на сифилис.

2 . Д и а г н о с т и ка и н ф е к ц и й TORCH-группы — токсоплазмоза, краснухи, цитомегаловирусной и герпетической инфекций, сифилиса (при этом разработаны еще 53 наименования иммунохимических диагностических наборов, из которых 22 прошли государственную регистрацию) — проводится специалистами медицинского центра El”Klinic и Электрогорской городской больницы на основании полученных данных лабораторных анализов и измерений.

3. Лечение осуществляется на базе Электрогорской городской больницы, в случае системы (комплекса клинической лабораторной диагностики)

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

29

на базе ЗАО «ЭКОлаб» или лечебных учреждений по месту жительства. Слежение за динамикой процесса подавления инфекционного процесса или полного излечения больного осуществлялось на базе аналитического центра ЗАО «ЭКОлаб» или соответствующих КДЛ. Учитывая, что высокий показатель вирусной инфицированности населения не является реальным показателем его заболеваемости и не подлежит обязательному лечению, тем не менее организация профилактических оздоровительных мер, использование укрепляющих средств, качественных продуктов питания, так не любимых официальной медициной биологически активных добавок, продуктов пчеловодства, фитопрепаратов и других иммуногенов было бы крайне полезным и эффективным. Разработанный и внедренный в КДЛ ряда регионов Российской Федерации методологический Комплекс клинической лабораторной диагностики инфекций TORCH-группы реализовал максимальную эффективность и достоверность обнаружения

искомых аналитов (антител возбудителя), в 1,5–2 раза снизил стоимость иммунохимического анализа, создал предпосылки для организации скрининговых эпидемиологических исследований внутриутробных инфекций, вскрыл упущения в подготовке (переподготовке) высококвалифицированных кадров для осуществления и развития службы лабораторной клинической диагностики. Список литературы 1. Концепция развития Службы клинической лабораторной диагностики Российской Федерации на 2003–2010 годы.

2. Марданлы С. Г., Симонов В. В., Помазанов В. В. Задачи и перспективы создания комплекса реактивных и технических средств клинической лабораторной диагностики инфекций TORCH-группы. — Владимир — Электрогорск: Транс-ИКС, 2012. — 9 с.

3. Круглый стол на тему «Смертность в Российской Федерации: соотношение медицинских и немедицинских факторов», 04 сентября 2015, http://ria-аmi.ru/ read/16273; www.rosminzdrav.

4. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство: в 2 т. под ред. В. В. Долгова, В. В. Меньшикова. М.: ГЕОТАР-Медиа, 2012. — Т. 1. — 928 с. — Т.

2. — 808 с.

5. Помазанов В. В., Марданлы С. Г., Долгов В. В. О роли клинической лабораторной диагностики внутриутробных инфекций. // Компетентность. — 2013. — № 7 (108) . — С. 50–53.

6. Кочетов А. Г. Страница главного внештатного специалиста Минздрава России по клинической лабораторной диагностике web-local.rudn.ru>veb-local/prep/rj/.

7. Помазанов В. В. Индустрия аналитических и диагностических услуг в России. Проблемы развития // Компетентность. — 2014. —№ 6 (117) . — С. 43–49.

8. Приказ министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 26 декабря 2011 года N 1644н «О внесении изменений в Квалификационные требования к специалистам с высшим и послевузовским медицинским и фармацевтическим образованием в сфере здравоохранения, утвержденные приказом Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 7 июля 2009 года N 415н».

9. Евдокимов В. И., Зыбина Н. Н., Трегубов Э. Ю. Состояние проблемы совершенствования массива оцифрованных отечественных диссертационных исследований по специальности 14.03.10. // Вестник медицинских технологий. — 2014. — Т. 21. — № 1. — С. 98–103.

10. Электронная библиотека диссертаций dissforall.com.

Итоги XIX Форума «Национальные дни лабораторной медицины России — 2015»

Е

жегодный XIX Форум «Национальные дни лабораторной медицины России — 2015», посвященный памяти профессора В. В. Меньшикова, состоялся 23–25 сентября 2015 года традиционно на базе спортивного комплекса «Олимпийский». Организация форума и подготовка научной программы осуществлялись при участии Ассоциации производителей средств клинической лабораторной диагностики, Научного общества нефрологов России, Национального научного общества инфекционистов, Национальной академии микологии, института повышения квалификации Федерального медико-биологического агентства, Государственного научного центра прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора, Московского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии имени Г. Н. Габричевского Роспотребнадзора.

30

Программа форума включала: • Общероссийскую научно-практическую конференцию «Консолидация лабораторной медицины и клинической практики. Традиции и инновации»; • Национальный конгресс бактериологов «Состояние и тенденции развития лабораторной диагностики инфекционных заболеваний в современных условиях: доступность и качество»; • специализированную выставку «Интерлабдиагностика — 2015». Впервые в работе мероприятия приняли участие пять действительных членов РАН и три главных специалиста Минздрава. На открытии выступили академики РАН А. М. Егоров, Г. Г. Онищенко, Н. А. Мухин и Ю. Т. Калинин. Программа конференции была построена по основным направлениям клинической медицины с учетом ин-

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

тересов клиницистов к возможностям лабораторной медицины. Симпозиальные заседания проходили под руководством ведущих специалистов — ученых и практиков — в области нефрологии, фтизиатрии, инфектологии, микробиологии и антимикробной химиотерапии, внутренних болезней, онкологии, кардиологии, педиатрии, акушерства и гинекологии. Особый интерес участников форума вызвали заседания, посвященные интерпретации результатов лабораторных исследований клиницистами, качеству и централизации лабораторных исследований. Всего в работе форума приняли участие 2 097 специалистов: 2 037 из 75 регионов Российской Федерации и 60 делегатов из 13 стран.

XX Форум «Национальные дни лабораторной медицины России — 2016» пройдет 12–14 сентября 2016 года в Москва по адресу: Олимпийский проспект, 16. e-mail: medalfavit@mail.ru

e-mail: medalfavit@mail.ru

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

31

Лабораторная диагностика альфа‑1антитрипсиновой недостаточности при хронических заболеваниях легких

М. Ю. Первакова

М. Ю. Первакова1, врач КЛД, лаборатория диагностики аутоиммунных заболеваний С. В. Лапин1, к. м. н. , зав. лабораторией диагностики аутоиммунных заболеваний А. А. Шумилов1, м. н. с. отдела хронической обструктивной патологии легких НИИ пульмонологии О. Н. Титова1, д. м. н., проф., директор НИИ пульмонологии, гл. пульмонолог комитета по здравоохранению правительства Санкт-Петербурга В. Л. Эмануэль1, д. м. н., проф., зав. кафедрой клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, директор НМЦ по молекулярной медицине Минздрава России И. С. Ковалева2, врач КЛД, специалист технологического Департамента И. Б. Беляева3, д. м. н., проф. кафедры терапии и ревматологии1 им. Э. Э. Эйхвальда А. Л. Чудинов4, врач-ревматолог

ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» (ПСПбГМУ) Минздрава России, г. Санкт-Петербург, 2 ООО «Независимая лаборатория Инвитро», г. Москва 3 ГБОУВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет имени И. И. Мечникова» (СЗГМУ) Минздрава России, г. Санкт-Петербург 4 Клиническая ревматологическая больница № 25, Санкт-Петербург 1

С. В. Лапин

Laboratory detection of alpha‑1-antitrypsin deficiency in patients suffering from chronical lung pathology И. С. Ковалева

M. Yu. Pervakova, S. V. Lapin, A. L. Chudinov, A. A. Shumilov, O. N. Titova, I. B. Belyaeva, I. S. Kovaleva, V. L. Emanuel The First State Medical University of Saint-Petersburg n. a. I. P. Pavlov; the Scientific and Methodological Center for Molecular Medicine; the North-West State Medical University n. a. I. I. Mechnikov, SaintPetersburg, Russia

Резюме Альфа‑1-антитрипсиновая недостаточность (А1АТН) обусловливает предрасположенность к хроническим заболеваниям легких. Наиболее характерной патологией легких при А1АТН является эмфизема, отмечаются другие формы поражения легких, как интерстициальные заболевания и васкулит с поражением легких. Взаимосвязь дефицита А1АТ с различными формами легочной патологии свидетельствует о необходимости проведения скрининга А1АТН у таких И. Б. Беляева больных. Диагностика А1АТН ограничена низкой чувствительностью количественного определения А1АТ. Для эффективной оценки А1АТ мы применили фенотипирование методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ). Мы исследовали фенотипы А1АТ у 129 человек, составивших следующие группы: лица со снижением альфа‑1-фракции (А1Ф) на протеинограмме (n = 25), больные с хронической обструктивной болезнью легких (ХОБЛ, n = 45), больные гранулематозом с полиангиитом (ГПА, n = 29), и здоровые доноры (n = 30). Распределение фенотипов А1АТ в исследуемых группах оказалось следующим: 76 % (19/25) патологических фенотипов А1АТ у пациентов со снижением А1Ф в сыворотке крови, 20 % (9/45) у больных ХОБЛ, 20,7 % (6/29) у группы с ГПА, 6,6 % (2/30) у здоровых доноров. Из всех образцов с патологическим фенотипом А1АТ только у 29.4 % (10/34) было обнаружено снижение концентрации А1АТ. Таким образом, фенотипирование А1АТ является эффективным методом скрининга А1АТН. Клиницистам следует помнить о возможности наличия А1АТН у больных не только эмфиземой, но и другими формами легочной патологии.

Summary Alpha‑1-antitrypsin deficiency (A1ATD) predisposes to chronic lung injury. The most typical form of A1ATD is primary emphysema, though there’s a possibility of other pulmonological conditions, such as interstitial lung diseases or granulomatous vasculitides with lung parenchyma involvement. The relation between A1ATD and different lung pathology types defines the relevance of screening of A1ATD in such patients. The importance of A1ATD detection is determined by possibility of effective augmentation therapy which results in slowing of pathological process progression. However, diagnostics of A1ATD in routine practice is complicated because of low sensitivity of used methods of A1AT detection. We used A1AT phenotyping with commercial kit for isoelectrofocusing (IEF) as the reference method for effective A1AT evaluation. We studied A1AT phenotypes in 129 sera, collected from following groups: persons with decreased alpha‑1 fraction (A1F) at serum protein electrophoresis(n = 25), patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD, n = 45), granulomatosis with polyangiitis (GPA, n = 29) and healthy donors (n = 30). We obtained the following distribution of A1AT phenotypes: 76 % (19/25) in persons with decreased serum A1F, 20 % (9/45) in COPD patients, 20.7 % in GPA group and 6.6 % (2/30) in healthy donors. We observed the decreased serum A1AT concentration level only in 29.4 % (10/34) samples with pathological A1AT phenotype. Thereby, A1AT phenotyping is effective screening assay for A1ATD. Clinicians should be aware of probability of A1ATD in patients not just with emphysema, but also with another types of lung pathology, and in case of suspicion A1ATD should order phenotyping.

Ключевые слова: альфа‑1-антитриспин, альфа‑1-фракция, альфа‑1-антитрипсиновая недостаточность, фенотипирование, эмфизема, гранулематоз с полиангиитом.

Key words: alpha‑1 antitrypsin, alpha‑1 fraction, alpha‑1-antitrypsin deficiency, phenotyping, emphysema, granulomatosis with polyangiitis.

32

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

Введение Альфа‑1-антитрипсин (А1АТ) представляет собой синтезируемый печенью острофазный белок, относящийся к семейству серпинов (ингибиторов сериновых протеиназ), который обеспечивает защиту клеток и тканей организма от деградации протеиназами в процессе воспаления [1]. В 1955 году Schultze впервые выделил из сыворотки крови человека белок, мигрирующий при электрофорезе в составе альфа‑1-фракции и проявляющий ингибиторную активность по отношению к панкреатическому трипсину, что и легло в основу названия: альфа‑1-антритрипсин [2]. Со временем стало известно, что спектр ферментов, подлежащих нейтрализации молекулой А1АТ, существенно шире и включает протеазы нейтрофилов, такие как нейтрофильная эластаза; протеиназа 3; миелопероксидаза; катепсин G; α-дефензины; ферменты панкреатоцитов, в частности, панкреатическую эластазу и трипсин; содержимое гранул тучных клеток, включающее химазу и триптазу; гранзим-В и другие ферменты лимфоцитов; ферменты, обеспечивающие инвазию бактерий; а также протеолитические факторы каскада коагуляции, например, плазмин, тромбин, урокиназу, фактор Xa [3]. Помимо антипротеазной активности, доказана способность молекулы ААТ препятствовать апоптозу, регулировать хемотаксис нейтрофилов через IL‑8 и лейкотриен В‑4 [4]. В 1963 году Laurell и Eriksson впервые обнаружили взаимо связь между легочной эмфиземой и снижением альфа‑1-фракции (А1Ф) на протеинограмме, которая представлена преимущественно А1АТ [5]. Общепризнанной причиной хронической обструктивной болезни легких (ХОБЛ), особенно ее эмфизематозного фенотипа, является наследственная предрасположенность, которая обусловлена нарушением ингибирования протеаз, прежде всего нейтрофильной эластазы, дефектным белком А1АТ[6]. Интересно, что поражение легких при дефекте функции А1АТ обусловлено не только избыточным e-mail: medalfavit@mail.ru

протеолизом эластина межальвеолярных перегородок, но и эндотелиальной дисфункцией. В норме функциональная молекула А1АТ также связывается с эндотелием сосудов с образованием полимеров и оказывает ангиопротективное действие [7], которое обусловлено различными механизмами. А1АТ ингибирует эффекторные каспазы и препятствует апоптозу эндотелиоцитов под действием сигаретного дыма [8], нормализует васкуляризацию, препятствуя разрушению васкуло-эндотелиального фактора роста (VEGF) и обеспечивает его сохранность и недоступность для действия протеаз в стенке сосудов [9]. А1АТ уменьшает нейтрофильную нагрузку на эндотелий при воспалении, действуя как на уровне факторов хемотаксиса (IL‑8 и лейкотриен B4), так и самого эндотелия, модулируя его экспресиию молекул адгезии, таких как sE-selectin и sICAM под действием тумор-некротизирующего фактора-альфа (TNF-α) [7, 10]. Состояние качественной или количественной недостаточности А1АТ называют альфа‑1-антитрипсиновой недостаточностью (А1АТН). Причина ее состоит в наследственных особенностях гена А1АТ, обусловленной присутствием более ста аллельных вариантов. Многофункциональность молекулы А1АТ обусловливает широкий спектр заболеваний, которые могут развиться у лиц с носительством мутантных фенотипических форм А1АТ. В зависимости от действия дополнительных генетических, иммунологических, токсических, инфекционных и воспалительных факторов, проявления А1АТ-недостаточности (А1АТН) могут варьировать от классической ХОБЛ до болезней аутоиммунной природы и профессиональной патологии [11]. Информация о структуре молекулы А1АТ закодирована в гене Pi (protease inhibitor, англ.), нормальным аллелем которого является PiM, а нормальный генотип — PiMM. Обычно проявления А1АТН связаны с наиболее часто встречающимися мутантными аллелями PiZ и PiS.

По аналогии с названием нормального аллеля гена нормальный фенотип также обозначается как PiMM, а в случае гетерозиготности PiMS или PiMZ. Буквенные обозначения M, S, Z указывают на характер миграции при зональном электрофорезе белков, хотя для точного определения фенотипа А1АТ используются другие методы электрофореза [12] (см.ниже). Фенотип не дает прямой информации о структуре гена Pi и присутствии мутаций, однако отражает характеристики различных генетических вариантов А1АТ, присутствующих в сыворотке крови человека и обладающих различными функциональными свойствами [13]. Преимущества и недостатки методов детекции А1АТ Существуют качественные и количественные методы лабораторной оценки А1АТ. Для количественного определения концентрации А1АТ в сыворотке крови применяются нефелометрические и турбидиметрические тесты, реже иммуноферментный анализ [14]. При интерпретации результатов необходимо учитывать, что использование количественных методов имеет ряд ограничений, поэтому эксперты из European Respiratory Society (ERS) предупреждают о вероятности завышенного результата из-за возможной перекрестной реакции с липидами и гемоглобином [11]. Поскольку А1АТ относится к реактантам острой фазы и его концентрация при остром воспалении увеличивается в несколько раз, сывороточный уровень А1АТ возрастает при обострении ХОБЛ, которое обычно сопровождается выраженным воспалением. Повышение концентрации А1АТ, индуцированное воспалением, может приводить к ложно-отрицательным результатам количественных тестов для определения концентрации А1АТ [15]. К качественным методам определения А1АТ относят генотипирование с помощью молекулярно-биологических технологий и молекулярное фенотипирование. В европейских странах для скрининга дефицита А1АТ широко используется метод аллель-специфической гибри-

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

33

дизации с Z и S аллелями. Несмотря на его сравнительную простоту и надежность, метод не учитывает возможности наличия у больного иных аллельных вариантов гена синтеза А1АТ [16]. Для анализа фенотипов А1АТ широкое распространение получил метод изоэлектрофокусирования (ИЭФ), который позволяет определять более ста различных фенотипических вариантов А1АТ, не прибегая к дорогостоящему секвенированию полной последовательности гена Pi (14q31–32.3). Метод ИЭФ представляет собой модификацию электрофореза с разделением белков не по массе и заряду, а по изоэлектрической точке (pI), что значительно повышает разрешение и позволяет охарактеризовать микрогетерогенность молекулы А1АТ, разделив ее на пять фракций, характер миграции которых будет определять фенотип А1АТ [17]. Современные технологии фенотипирования А1АТ подразумевают селективную окраску А1АТ с помощью антител к А1АТ, представляя собой, таким образом, комбинацию ИЭФ с иммуноэлектрофорезом [18]. Влияние мутантных форм А1АТ на развитие и прогрессирование ХОБЛ Известно, что ХОБЛ занимает одно из ведущих мест в мире по причинам летальности. По официальным данным Министерства здравоохранения России, в 2003 году в стране зарегистрированы 2,4 миллиона больных ХОБЛ. Учитывая последние данные эпидемиологических исследований, число больных ХОБЛ в России может превышать 11 миллионов человек [19]. Учитывая тот факт, что, как минимум 10 % больных ХОБЛ являются носителями мутантных генетических вариантов А1АТ, можно предположить, что более 1 миллиона жителей России являются носителями мутации гена синтеза А1АТ, среди которых более 100 тысяч составляют лица, страдающие от тяжелой А1АТН. Полагают, что развитие ХОБЛ под действием агрессивных факторов внешней среды, главным образом сигаретного дыма, обусловлено 4–5-кратным увеличением в бронхиальном лаваже нейтрофилов 34

и макрофагов после курения, что приводит к увеличению продукции нейтрофильной эластазы и повышению протеазной нагрузки на легочную паренхиму. Изменение протеазно-антипротеазного баланса усугубляется нарушенной функциональной активностью А1АТ при наличии мутации в гене Pi [20]. Кроме того, по данным ВОЗ, у 20–27 % больных с дефицитом А1АТ нарушена реактивность бронхов, и развивается бронхиальная астма. У таких пациентов отмечаются выраженное прогрессирование обструктивных нарушений и увеличение степени необратимого компонента обструкции [14, 20]. Известно, что стандартная медикаментозная терапия при ХОБЛ не замедляет прогрессирования заболевания, а лишь снижает частоту и тяжесть обострений, улучшает переносимость физических нагрузок, повышает качество жизни [21]. Между тем доказано, что терапия заместительными препаратами А1АТ у пациентов с эмфиземой и подтвержденным дефицитом А1АТ способствует замедлению снижения спирометрических показателей и прогрессирования степени выраженности эмфизематозных изменений легочной ткани, по данным компьютерной томографии легких [22–23]. Таким образом, наличие показаний к заместительной терапии препаратами А1АТ позволяет клиницисту использовать метод фармакологической терапии, оказывающий влияние на прогноз. Спорным вопросом является назначение заместительной терапии пациентам с гетерозиготным PiMZ фенотипом с тяжелыми легочными проявлениями и неэффективностью стандартной терапии. Существуют исследования, свидетельствующие о целесообразности назначения заместительной терапии пациентам с PiMZ фенотипом и тяжелой ХОБЛ [24], а также документированный случай успешного лечения препаратами А1АТ тяжелой бронхиальной астмы, резистентной к стандартным методам лечения, у пациентки с PiMZ-фенотипом с улучшением динамики спирометрических показателей [25]. Несмотря на отсутствие четкого согласия между экспертами

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

по поводу целесообразности назначения препаратов А1АТ PiMZ гетерозиготам [26], использование этих препаратов может быть оправданно для тех пациентов, у которых при PiMZ фенотипе А1АТ наблюдается тяжелое прогрессирующее поражение легких, а стандартные методы лечения неэффективны. Выявление А1АТН у больных с системными васкулитами Исследования, направленные на выяснение роли мутантного А1АТ в развитии ревматических заболеваний, проводились неоднократно. Было отмечено, что несколько повышена встречаемость мутантных форм А1АТ у больных ревматоидным артритом, целиакией, а также при некоторых неревматических заболеваниях, таких как аневризмы внутричерепных сосудов, панкреатит, гломерулонефрит и др. [11] Настоящим открытием стало обнаружение взаимосвязи дефицита А1АТ при гранулематозе с полиангиитом (ГПА), ранее известном как гранулематоз Вегенера. Существует значительное количество работ, подтверждающих повышенную встречаемость мутантных фенотипов А1АТ у больных с этим системным васкулитом [27–29]. В зависимости от региона встречаемость мутантных аллелей гена А1АТ при ГПА варьирует от 5 до 27 % [28]. Центральной особенностью иммунопатогенеза ГПА является появление в крови таких пациентов антинейтрофильных цитоплазматических антител (АНЦА), направленных против ферментов азурофильных гранул нейтрофилов [36]. Для выяснения причины этой взаимосвязи потребовалось понимание патогенетической роли фермента азурофильных гранул нейтрофилов протеиназы 3 (ПР3), которая является основным аутоантигеном АНЦА аутоантител при ГПА [30]. При развитии острого воспалительного процесса (например, при остром респираторном заболевании) нейтрофилы экспрессируют на своей мембране ПР3, что приводит к окислительному взрыву и частичной дегрануляции нейтрофилов [31] Также ПР3 стимулирует продукцию IL‑8 e-mail: medalfavit@mail.ru

эндотелиоцитами и моноцитами, способствует увеличению содержания эйкозаноидов и высвобождению лейкотриена B4, которые запускают каскад агрессивного некротизирующего воспалительного процесса при ГПА [31–33]. В норме активность ПР3, как и любой сериновой протеиназы, модулируется А1АТ. В 1992 году De Wiel, Dolman и др. выявили, что цАНЦА, направленные против ПР3, подавляют образование комплекса А1АТ с ПР3, что приводит к ее неконтролируемой активации [34]. Поскольку при дефиците А1АТ модулирующее действие молекулы А1АТ на ПР3 ослаблено, как и местное протективное действие А1АТ на ткань при воспалении, интенсивность вторичного тканевого повреждения при обострениях ГПА будет выше. Эти данные свидетельствуют о необходимости обсуждения целесообразности назначения заместительной терапии препаратами А1АТ пациентам с ГПА с выявленной А1АТН. Существуют клинические исследования, подтверждающие эффективность лечения больных ГПА с выявленным дефицитом А1АТ заместительными препаратами А1АТ. Назначение заместительной терапии больным ГПА с А1АТН способствует стойкой ремиссии ГПА, регрессии кожных проявлений васкулита, нормализации функции легких [35]. Фенотипирование А1АТ при различных состояниях Мы отобрали пациентов с состояниями, ассоциированными с А1АТН, и получили следующие группы: 25 образцов со снижением А1Ф на протеинограмме, поступивших в лабораторию для выполнения электрофореза белков сыворотки крови; 45 больных ХОБЛ, находящихся на стационарном лечении в городской больнице № 32; 29 больных ГПА, обследованных в Клинической ревматологической больнице № 25; а также 28 здоровых доноров. Нами был налажен метод ИЭФ с иммунофиксацией для фенотипирования А1АТ в нашей лаборатории с использованием коммерческого набора реактивов для иммунофиксации e-mail: medalfavit@mail.ru

1

2

3

4

5

6

Рисунок 1: примеры электрофоретической миграции А1АТ следующих фенотипов, определенных методом ИЭФ (слева направо): дорожка 1. PiMS; дорожка 2. PiZZ; дорожка 3. PiMM; дорожка 4. PiMZ; дорожка 5. PiMF; дорожка 6. PiMM.

А1АТ (Helena Biosciences, Великобритания). После внесения и сорбции на геле образцов осуществляется ИЭФ в камере для горизонтального электрофореза в течение одного часа при напряжении 450 В (Pharmacia, Швеция). После электрофореза агарозный гель с фокусированными молекулами А1АТ инкубируется во влажной камере со специфической антисыворот-

кой к А1АТ, а затем высушивается и окрашивается согласно инструкции производителя. Результаты фенотипирования мы дополняем данными количественного определения А1АТ в сыворотке крови, которое осуществляется на биохимическом анализаторе А15 (Biosystems, Испания) методом иммунотурбидиметрии (реактивы Sentinel Diagnostics, Италия). Основные варианты электрофоретической миграции наиболее частых фенотипов А1АТ представлены на рис. 1. Для сравнения эффективности используемых методов качественной и количественной оценки А1АТ мы проанализировали 25 образцов сыворотки крови, в которых при зональном электрофорезе было выявлено снижение альфа‑1-фракции, не связанное с диспротеинемией, обусловленной нарушением белково-синтетической функции печени, признаками системного воспаления или потерей белка, такими как гипоальбуминемия, увеличение альфа‑2-фракции и др. В набранном материале было проведено фенотипирование А1АТ методом ИЭФ (реактивы для ИЭФ Helena Biosciences, Великобритания) и определение концентраций А1АТ турбидиметрическим методом (Sentinel Diagnostics,

Рисунок 2: Взаимосвязь турбидиметрического определения концентрации А1АТ и оценки величины А1Ф методом электрофореза (r = 0,7873, P < 0,0001). Расшифровка сокращений: А1АТ — альфа‑1-антитрипсин; А1Ф — альфа‑1-фракция электрофореограммы; РЗ — референсные значения.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

35

Италия). Результаты фенотипирования были сопоставлены с данными контрольной группы из 28 здоровых доноров сыворотки крови. Общая частота патологических фенотипов в группе со снижением А1Ф составила 76,0 % (19/25), что достоверно отличалось (χ2, р < 0,0001) от показателей группы № 2–7,1 % (2/28). Интересно, что лишь у 26,3 % (5/19) образцов с мутантным фенотипом А1АТ было зафиксировано снижение концентрации А1АТ ниже референсных значений производителя, хотя средняя величина концентрации А1АТ в группе с мутантными фенотипами А1АТ была достоверно ниже. Результаты сопоставления количественного метода оценки А1АТ и фенотипирования представлены на рис. 2. Для оценки значимости выявления мутантных форм А1АТ у контингента больных ХОБЛ в Северо-Западном регионе мы обследовали 45 больных с ХОБЛ. Результаты фенотипирования А1АТ у больных ХОБЛ состоят в следующем: у 20 % больных выявлены мутантные фенотипические варианты А1АТ (9/45), и только у трех из них зафиксировано снижение концентрации А1АТ в сыворотке крови. Мы сравнили значения концентраций А1АТ в группах больных с нормальным и патологическим фенотипом, результаты представлены на рис. 3. Средняя концентрация А1АТ в группе больных с патологическим фенотипом А1АТ составила 1 258 мг/л ± 145,6 и была достоверно (P = 0,0116) ниже, чем в группе больных с нормальным фенотипом А1АТ (1 686 мг/л ± 72,47). Мы сопоставили результаты фенотипирования А1АТ с клиническими данными. Оказалось, что у больных ХОБЛ с мутантными фенотипами А1АТ более выражены признаки дыхательной недостаточности (α < 0,05; p = 0,0106, точный тест Фишера), хотя степень снижения объема форсированного выдоха за первую секунду (ОФВ1) и частота возникновения осложнений, таких как легочное сердце, вторичный эритроцитоз, достоверно не отличались от данных группы носителей нормального фенотипа А1АТ. Наконец, мы обследовали 29 человек с активным ГПА. Общая часто36

та патологических фенотипов А1АТ у больных ГПА составила 20,7 % (6/29). Как и в случае с результатами группы со снижением А1Ф и больных ХОБЛ, снижение концентрации А1АТ в сыворотке крови было зафиксировано только у небольшого числа (2/6) больных ГПА с патологическими фенотипами А1АТ. При сравнении концентраций А1АТ выяснилось, что у лиц с патологическим фенотипом А1АТ ее количественные значения были достоверно ниже (P = 0,0012, t = 3.608). Мы сопоставили результаты фенотипирования А1АТ с клиническими данными. Концентрация АНЦА к ПР3 была достоверно выше у больных ГПА с патологическим фенотипом А1АТ, чем у больных с нормальным фенотипом (159,4 ± 32,34 и 72,60 ± 18,06; P = 0,0392). Вовлечение в патологический процесс легких при ГПА наблюдалось чаще у больных с патологическим фенотипом А1АТ (5/6, 83,3 %), чем с нормальным (12/23, 56,5 %), хотя различие между данными группами оказалось статистически недостоверным (P = 0,3746, точный критерий Фишера). Заключение Патогенетическая значимость А1АТ в развитии хронической легочной патологии несомненна. Данные наших исследований подтверждают тот факт, что для скрининга дефицита А1АТ у больных с хронической легочной патологией наиболее информативным методом является определение фенотипа А1АТ, а не его концентрации. Мы проанализировали встречаемость мутантных фенотипов А1АТ в двух группах больных с разными заболеваниями, при которых развиваются морфологически отличающиеся формы поражения легочной паренхимы: ХОБЛ и ГПА. В обоих случаях частота мутантных фенотипов А1АТ была примерно одинакова и оставила около 20 %. У больных с патологическим фенотипом А1АТ отмечались некоторые особенности течения заболевания: более выраженные проявления дыхательной недостаточности при обострениях ХОБЛ, более высокий сывороточный уровень антител к ПР3 и тенденция

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

к увеличению частоты поражения легких у больных ГПА. Полученные данные свидетельствуют о том, что при клиническом наблюдении лиц с данными заболеваниями необходимо определять степень нарушения протеазно-антипротеазного баланса, в том числе с помощью оценки фенотипа А1АТ, и учитывать эти данные при подборе персонализированной терапии. Благодарим компании ООО «Хелена РУС» за предоставленные реактивы для изоэлектрофокусирования альфа‑1-антитрипсина, а также ООО «Независимая лаборатория ИВИТРО» за серии биообразцов. Список литературы 1. Jonigk D., et al. Anti-inflammatory and immunomodulatory properties of alpha1-antitrypsin without inhibition of elastase. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA, 2013. 110 (37): p.

15007–12.

2. Janciauskiene S. M., et al. The discovery of alpha1-antitrypsin and its role in health and disease. Respir. Med., 2011. 105 (8): p. 1129–39.

3. de Serres F. and I. Blanco. Role of alpha‑1 antitrypsin in human health and disease.

J. Intern. Med., 2014.

4. Brantly M. Alpha1-antitrypsin: not just an antiprotease: extending the half-life of a natural anti-inflammatory molecule by conjugation with polyethylene glycol. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2002. 27 (6): p. 652–4.

5. Fregonese L. and J. Stolk. Hereditary alpha‑1-antitrypsin deficiency and its clinical consequences. Orphanet. J. Rare Dis., 2008.

3: p. 16.

6. Vidal R., et al. [Guidelines for the diagnosis and management of alpha‑1 antitrypsin deficiency]. Arch. Bronconeumol., 2006. 42 (12): p. 645–59.

7. Aldonyte R., et al. Polymerized alpha-antitrypsin is present on lung vascular endothelium. New insights into the biological significance of alpha-antitrypsin polymerization.

Histopathology, 2004. 45 (6): p. 587–92.

8. Petrache I., et al. A novel antiapoptotic role for alpha1-antitrypsin in the prevention of pulmonary emphysema. Am. J. Respir. Crit.

Care Med., 2006. 173 (11): p. 1222–8.

9. Bellacen K., et al. Revascularization of pancreatic islet allografts is enhanced by alpha‑1-antitrypsin under anti-inflammatory conditions. Cell Transplant, 2013. 22 (11): p. 2119–33.

10. Lockett A. D., et al. alpha(1)-Antitrypsin modulates lung endothelial cell inflammatory responses to TNF-alpha. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2013. 49 (1): p. 143–50.

11. American Thoracic Society / European Respiratory Society statement: standards for the diagnosis and management of individuals with alpha‑1 antitrypsin deficiency.

Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2003. 168 (7): p. 818–900.

e-mail: medalfavit@mail.ru

12. Keren D. F., ed. Protein electrophoresis in clinical diagnosis., ed. A. London. 2003. 71–77.

13. Ljujic M., et al. Isoelectric focusing phenotyping and denaturing gradient gel electrophoresis genotyping: a comparison of two methods in detection of alpha‑1-antitrypsin variants. Transl. Res., 2008. 151 (5): p. 255–9.

14. Craig T. J., Suspecting and Testing for Alpha‑1 Antitrypsin Deficiency — An Allergist’s and/or Immunologist’s Perspective. J. Allergy Clin. Immunol. Pract., 2015.

15. Poplawska B., S. Janciauskiene and J. Chorostowska-Wynimko, [Genetic variants of alpha‑1 antitrypsin: classification and clinical implications]. Pneumonol. Alergol.

Pol., 2013. 81 (1): p. 45–54.

16. Balduyck M., et al. [Development of a laboratory test on dried blood spots for facilitating early diagnosis of alpha‑1-antitrypsin deficiency]. Ann. Biol. Clin. (Paris), 2014. 72 (6): p. 689–704.

17. Jeppsson J. O. and B. Franzen, Typing of genetic variants of alpha 1-antitrypsin by electrofocusing. Clin. Chem., 1982. 28 (1): p. 219–25.

18. Greene D. N., et al. Facilitating the laboratory diagnosis of alpha1-antitrypsin deficiency.

Am. J. Clin. Pathol., 2013. 139 (2): p. 184–91.

19. Статистика ХОБЛ. Официальный сайт «Российское респираторное общество».

2004; Available from: http://www.society. pulmonology.ru; http://www.hobl.ru/stat.html.

20. Alpha‑1-antitrypsin deficiency: memorandum from a WHO meeting. Bull. World Health Organ., 1997. 75 (5): p. 397–415.

e-mail: medalfavit@mail.ru

21. Gomez F. P. and R. Rodriguez-Roisin. Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease (GOLD) guidelines for chronic obstructive pulmonary disease. Curr. Opin. Pulm.

Med., 2002. 8 (2): p. 81–6.

22. Abboud R. T., G. T. Ford and K. R. Chapman. Emphysema in alpha1-antitrypsin deficiency: does replacement therapy affect outcome? Treat. Respir. Med., 2005.

4 (1): p. 1–8.

23. Chapman K. R., et al. Augmentation therapy for alpha1 antitrypsin deficiency: a meta-analysis. COPD, 2009. 6 (3): p. 177–84.

24. Reddy N. M., et al. Disruption of Nrf2 impairs the resolution of hyperoxia-induced acute lung injury and inflammation in mice. J. Immunol., 2009. 182 (11): p. 7264–71.

25. Blanco I., et al. Long-term augmentation therapy with alpha‑1 antitrypsin in an MZAAT severe persistent asthma. Monaldi Arch.

Chest Dis., 2008. 69 (4): p. 178–82.

26. Sandhaus R. A., et al. alpha1-Antitrypsin augmentation therapy for PI*MZ heterozygotes: a cautionary note. Chest, 2008. 134 (4): p. 831–4.

27. Savige J. A., et al. Alpha 1-antitrypsin deficiency and anti-proteinase 3 antibodies in anti-neutrophil cytoplasmic antibody (ANCA)-associated systemic vasculitis. Clin.

Exp. Immunol., 1995. 100 (2): p. 194–7.

28. Mahr A. D., et al. Alpha(1)-antitrypsin deficiency-related alleles Z and S and the risk of Wegener’s granulomatosis. Arthritis Rheum., 2010. 62 (12): p. 3760–7.

29. Chorostowska-Wynimko J., et al. Incidence of alpha‑1 antitrypsin Z and S alleles in pa-

tients with granulomatosis with polyangiitis — pilot study. Pneumonol. Alergol. Pol., 2013.

81 (4): p. 319–22.

30. Jenne D. E., et al. Wegener’s autoantigen decoded. Nature, 1990. 346 (6284): p. 520.

31. Grimminger F., et al. Neutrophil activation by anti-proteinase 3 antibodies in Wegener’s granulomatosis: role of exogenous arachidonic acid and leukotriene B4 generation. J. Exp. Med., 1996. 184 (4): p. 1567–72.

32. Berger S. P. , et al. Proteinase 3, the major autoantigen of Wegener’s granulomatosis, enhances IL‑8 production by endothelial cells in vitro. J. Am. Soc. Nephrol., 1996. 7 (5): p. 694–701.

33. Ralston D. R., et al. Antineutrophil cytoplasmic antibodies induce monocyte IL‑8 release. Role of surface proteinase‑3, alpha1-antitrypsin, and Fcgamma receptors.

J. Clin. Invest., 1997. 100 (6): p. 1416–24.

34. van de Wiel B. A., et al. Interference of Wegener’s granulomatosis autoantibodies with neutrophil Proteinase 3 activity. Clin. Exp. Immunol., 1992. 90 (3): p. 409–14.

35. Hernandez Perez J. M., S. Fumero Garcia and A. Alvarez Pio. Successful alpha1-antitrypsin replacement therapy in a patient with alpha1-antitrypsin deficiency and granulomatosis with polyangiitis. Rheumatology (Oxford), 2013. 52 (4): p. 755–7.

36. Лапин С. В., Тотолян А. А. Диагностика аутоиммунных заболеваний с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции Медицинская иммунология. 2000. Т. 2. № 2. С. 174.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

37

Лабораторные методы оценки состояний соединительной ткани Г. А. Березовская,, к. м. н., ассистент кафедры факультетской терапии1, с. н. с. НИЛ острого коронарного синдрома2 ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» (ПСПбГМУ) Минздрава России, г. Санкт-Петербург 2 ФГБУ «Северо-Западный федеральный медицинский исследовательский центр имени В. А. Алмазова» (СЗФМИЦ) Минздрава России, г. Санкт-Петербург

1

Laboratory methods of assessing connective tissue G. A. Berezovskaya The First State Medical University of Saint-Petersburg n. a. I. P. Pavlov; The Federal North-West Medical Research Center n. a.

V. A. Almazov, Saint-Petersburg, Russia

Резюме Данная лекция посвящена лабораторным методам оценки состояний соединительной ткани. В ней также содержится краткая информация о ее структуре, функциях и роли различных компонентов в развитии патологических процессов. Ключевые слова: внеклеточный матрикс, гидроксипролин, коллаген, гликозаминогликаны, фибронектин, матриксные металлопротеиназы, гемостаз.

Summary This lecture is devoted to laboratory methods for assessment of the state of connective tissue. It also contains a summary of its structure, the functions and roles of various components in the development of pathological processes.

Key words: extracellular matrix, hydroxyproline, collagen, glycosaminoglycans, fibronectin, matrix metalloproteinase hemostasis.

Б

ольшинство лабораторных показателей, изменение которых выявляется при нарушениях в структуре и функции соединительной ткани (СТ), не относятся к числу диагностических критериев, а лишь отражают состояние соединительнотканных структур. Однако перечень их чрезвычайно широк. Так, например, хорошо известно, что в развитии клинической симптоматики при патологических состояниях СТ определяющим является нарушение образования коллагена, его структуры, количества и соотношения различных типов. В основе этих процессов лежат нарушение аминокислотной последовательности в полипептидной цепи, ферментативного превращения проколлагена в коллаген и образование перекрестных связей при формировании пространственной структуры этих белков [64]. Интенсивность обмена коллагена, основного фибриллярного белка СТ, оценивают по содержанию в биологических жидкостях (крови, моче, желудочном соке, синовиальной жидкости) гидроксипролина (ГОП) 38

или оксипролина, образующегося при гидроксилировании пролина [19]. Содержание ГОП в моче определяют методом J. Bergman и R. Loxley (1969) в модификациях Е. И. Дайхина с соавт. (1983) и П. Н. Шараева (1990) [5, 35]. Однако эти методы свидетельствует только об изменении обмена коллагена в целом, но не дают представления о том, какие именно процессы играют в этом главную роль [19, 36]. Повышение суточной экскреции ГОП с мочой у детей с синдромом дисплазии соединительной ткани (СДСТ) отмечено в исследованиях Н. А. Золотаревой (2003) [12], при СДСТ сердца, по данным Н. М. Коренева с соавт. (2004) [20] и Л. Н. Богмат с соавт. (2005) [5]. При этом более значительное повышение ГОП было выявлено у пациентов с миксоматозной дегенерацией митрального клапана. В настоящее время разработан метод одновременного определения свободного и белково-связанного ГОП в сыворотке крови с использованием принципа окисления ГОП

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

хлорамином Б и конденсации продуктов его окисления p-диметиламинобензальдегидом [36]. Считается, что содержание свободного ГОП позволяет оценить степень катаболизма коллагена, а белково-связанного ГОП — как процессы распада, так и биосинтеза коллагена. При этом отмечается количественное превосходство свободного ГОП над белково-связанным. Изменение этого соотношения используется для оценки процессов биосинтеза коллагена и характеризуется коэффициентом свободный / белково-связанный ГОП. Процесс гидроксилирования пролина и лизина осуществляется в присутствии молекулярного кислорода, аскорбиновой кислоты, двухвалентного железа и α-кетоглютаровой кислоты. При дефиците аскорбиновой кислоты происходит нарушение созревания коллагена, биосинтеза хондроитин-сульфатов (блокада процесса эпимеризации глюкозамина в галактозамин) [27], а также высвобождение каталитически активных ионов Fe2+ из ферритина [41], что характерно для больных e-mail: medalfavit@mail.ru

ННСТ [20, 5]. В настоящее время разработаны высокочувствительные методики определения аскорбиновой кислоты в биологических субстратах с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [50]. К числу других биохимических маркеров обмена коллагена относится галактозилоксилизин (ГОЛ), который образуется в остеобластах в результате гидроксилирования лизина с последующим его гликозилированием (присоединением галактозы). Он находится исключительно в коллагене I типа и отсутствует в коллагеновых пропептидах. Именно поэтому он не высвобождается из костной ткани при ее формировании, сопровождающейся отщеплением конечных пропептидов от коллагена, а появляется в крови исключительно при деградации коллагена. Поскольку гидроксилизиновые гликозиды преимущественно располагаются в костной ткани, принято считать, что выделение ГОЛ с мочой является более чувствительным маркером разрушения кости, чем выделение ГОП. Для определения ГОЛ используется ВЭЖХ с последующим флюоресцентным анализом [42]. Дефицит активности лизил-4-гидроксилазы 1 (LOX), участвующей в гидроксилировании лизина, выявляется у пациентов с индромом Элерса-Данло [63]. В составе молекулы коллагена наряду с водородными связями содержатся поперечные соединения («сшивки», cross-links), имеющие свои особенности в различных типах коллагена. В коллагене I, II, III и IX типов их структура расшифрована: это пиридинолин (ПИД) (оксилизилпиридинолина) и дезоксипиридинолин (пирилинкс-Д, ДПИД) (лизилпиридинолина). Поскольку удельный вес коллагена и скорость метаболизма в кости превышает другие ткани, считается, что источником ПИД и ДПИД в биологических жидкостях является именно коллаген костного происхождения. В различных типах ткани соотношение ПИД и ДПИД неодинаково, для кости оно равно трем. Данные соединения высвобождаются из костного матрикса при резорбции, они не метаболизируe-mail: medalfavit@mail.ru

ются и выводятся почками в свободной форме (около 40 %) и связанной с пептидами (60 %). Экскреция ПИД и ДПИД с мочой не зависит от характера употребляемой пищи, но подчиняется циркадным ритмам: увеличивается ночью и уменьшается днем, что, вероятно, связано с усилением процессов обмена костной ткани и ее резорбции в ночное время. Содержание ПИД и ДПИД в моче определяется методом иммуноферментного анализа (ИФА) или методом ВЭЖХ с последующим флюоресцентным анализом [42, 66]. Для оценки резорбции используется такой параметр, как отношение концентрации пирилинков (ПИД и ДПИД) к концентрации креатинина в моче. Биомаркерами повреждения коллагена являются также С-телопептиды (карбокситерминальные телопептиды коллагена I типа, КТТКI) и N-телопептиды (аминотерминальные телопептиды коллагена I типа, АТТКI), которые помимо кости находятся во всех тканях, содержащих коллаген I типа [48]. В кровь из костей телопептиды выходят исключительно в процессе резорбции. Концентрация КТТКI возрастает при остеопорозе с высоким уровнем костного оборота. Для его определения в крови применяют радиоиммунологический метод с использованием поликлональных антител и Serum CrossLaps-тест (ИФА), а в моче — Urine Beta CrossLaps-тест (ИФА).

Cross-Laps это термин, который используется для характеристики пептида, состоящего из восьми аминокислот, образующегося при ферментативной деградации коллагена и лишенного дальнейшего разрушения. Ранним предиктором переломов костей при ННСТ принято считать АТТКI [49]. В сыворотке крови или моче его определяют с помощью ИФА [13, 42, 66]. Проце сс о стеогене за характеризуют такие показатели, как карбокси- и аминотерминальные пропептиды проколлагена I типа (КТППКI и АТППКI). Проколлаген представляет собой большую молекулу, содержащую с К- и А-концов частично глобулярные фрагменты

(КТППКI и АТППКI), которые отделяются от основной молекулы с помощью специфических пептидаз (С- и N-терминальных пептидаз проколлагена I) после выхода проколлагена из клетки. Освобожденная от пропептидов молекула коллагена I типа включается в построение фибрилл костного матрикса, а КТППКI и АТППКI выбрасываются во внеклеточную жидкость. Соотношение между количеством коллагена, откладываемого в кости, и количество КТППКI (АТППКI), поступающего в кровоток, практически равно. Это обстоятельство позволяет оценивать способность остеобластов продуцировать коллаген I типа по уровню КТППКI (АТППКI). Содержание КТППКI (АТППКI) в крови не зависит от состояния клубочковой фильтрации, поскольку молекулярная масса данных соединений составляет 100 KD, и, следовательно, они не фильтруются почками. Оба пропептида метаболизируются в печени. Период их полураспада короткий, всего 6–8 минут. Уровень КТППКI в крови коррелирует с данными гистоморфометрии кости и интенсивностью формирования кости, оцененным с помощью радиоактивного Са47. Определяются КТППKI и АТППКI в крови с помощью РИА и ИФА [42, 45, 58]. Остеокальцин — самый распространенный неколлагеновый кальций-связывающий белок кости. Наличие выраженных корреляционных связей между уровнем остеокальцина в крови и данными инвазивных методов оценки состояния кости при различных метаболических поражениях скелета (гистоморфометрией и кинетикой радиоактивного кальция в организме) позволяет рассматривать его как один из самых информативных биохимических маркеров формирования кости и скорости ее ремоделирования. Сывороточный остеокальцин определяется РИА и ИФА, но его уровень зависит от многочисленных воздействий: возраст, дефицит витаминов К и D, менструальный цикл, время года, употребление алкоголя и т. д. [42, 45] К числу маркеров образования кости при остеопорозе различного происхождения относится щелочная

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

39

фосфатаза (ЩФ). Она является одним из самых ранних маркеров работы остеобластов. Однако причиной низкой чувствительности и специфичности данного показателя относительно процессов костеобразования является существование нескольких фракций этого белка. У пациентов с различными вариантами ННСТ целесообразно определение костной щелочной фосфатазы (КЩФ), о чем свидетельствует наличие корреляционных связей между уровнем КЩФ в крови и данными инвазивных методов исследования скорости формирования кости у человека: (гистоморфометрией и кинетикой радиоактивного кальция в организме). Определение КЩФ осуществляется с помощью РИА и ИФА с использованием моноклональных антител [42, 68]. Содержание в крови ионов кальция, фосфора, а также кальций-регулирующих гормонов (система паратгормон — кальцитонин — витамин D: паратгормона, соматотропного гормона, пролактина и кальцитонина) и витамина D3 (25-OН-витамина D) позволяет получить дополнительную информацию о состоянии костной ткани при ННСТ. Содержание пентосидина и гомоцистеина в моче и крови также позволяет оценить риск переломов костей независимо от минерального обмена и плотности кости [60]. Содержание свободных аминокислот (заменимых и незаменимых) в крови также относится к числу биохимических маркеров, отражающих метаболизм СТ у пациентов с ННСТ. Установлено, что у данной категории больных содержание свободных аминокислот в крови значительно снижено [8, 13, 39]. У таких пациентов, в том числе и при MASS-фенотипе, выявлено нарушение соотношения различных классов аминокислот [13]. Так, например, лизин, аргинин и аспарагин участвуют в регуляции апоптоза [32], а цистеин наряду с этим является инактиватором иммунных комплексов и участником синтеза сульфатированных гликозаминогликанов [67]. Определение свободных аминокислот осуществляется методом ВЭЖХ [13].

40

Оценка изменения соотношения различных типов коллагена, как наиболее значимой характеристики ННСТ, возможно лишь при патоморфологическом исследовании биоптатов, методом непрямой иммунофлюоресценции по Sternberg L. A. (1982) с использованием поликлональных антител к коллагенам различных типов [13]. К числу наиболее важных компонентов основного вещества СТ отно сятся гликозаминогликаны (ГАГ), которые существуют в виде комплексных соединений с белками, именуемые протеогликанами. Другая группа углеводсодержащих белков внеклеточного матрикса, кроме коллагена и эластина, известна под названием «гликопротеины». В плазме крови 80 % ГАГ связаны с белками и лишь 20 % находятся в свободной форме [6]. Наличие у многих сахаров остатков сульфатных или карбоксильных групп (или тех и других) придает ГАГ большой отрицательный заряд. Второй сахар обычно является гексуроновой кислотой (глюкуроновой или идуроновой). Различают несульфатированные ГАГ (гиалуроновая кислота и хондроитин), содержащие в своем составе только карбоксильные группы, и сульфатированные ГАГ (хондроитин‑4-сульфат, хондроитин‑6-сульфат, дерматан-сульфат, кератан-сульфат, гепаран-сульфат, гепарин), содержащие наряду с карбоксильными группами сульфатные [25]. Установлено, что антиоксидантные свойства у ГАГ обусловлены степенью их сульфатирования [40]. Данные соединения обеспечивают наличие у соединительной ткани таких свойств, как создание гидратированного гелеобразного пространства между клетками, проницаемости, ее направления и селективности. Известно также о способности ГАГ влиять на липидную пероксидацию [40, 55] и фибриллогенез [21, 25]. Кроме того, протеогликаны регулируют активность протеаз и являются резервуаром ростовых факторов. Повышенное содержание ГАГ в крови и суточной моче свидетельствует о катаболизме основного вещества соединительной ткани. Определение ГАГ может

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

о суще ствляться по гексозаминам (с орцином) [6] либо по гексуроновым кислотам (с карбазолом), по уроновым кислотам [16], а сульфатированных — по методу Е. В. Карякиной [17]. Однако определение суммарных ГАГ является недостаточно корректным, а результаты могут оказаться заниженными. В настоящее время тонкослойная хроматография является наиболее информативным методом определения отдельных классов данных соединений. У пациентов с различными клиническими вариантами ННСТ отмечается, как правило, повышенное выведение ГАГ с мочой. При этом установлено, что изменение содержания ГАГ коррелирует со степенью пролапса митрального клапана [30]. С целью стандартизации результатов исследований необходимо производить перерасчет содержания ГОП и ГАГ на 1 г креатинина на 1 м2 поверхности тела. Уровень экскреции ГОП и ГАГ зависит от возраста, а максимальные значения выявляются в возрасте до семи лет [34]. Хорошо известно, что основная роль в катаболизме коллагена принадлежит группе специфических ферментов, способных гидролизовать также все основные белки матрикса, — матриксным металлопротеиназам (ММП) [44]. ММП в обычных условиях находятся в соединительной ткани в латентной форме благодаря сдерживающему влиянию тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ (ТИММП), обеспечивая тем самым баланс между синтезом и распадом коллагена. Активация ММП происходит под воздействием различных факторов, действующих на поверхность клетки (интегрины, эстроген, прогестерон и др.), ряд химических соединений (липополисахариды, простагландин Е и др.), цитокины (контроль на уровне транскрипции), интерфероны, протеолитические ферменты. Известно, что синтез ММП может быть индуцирован гепарином, а синтез ТИММП‑1 — холестерином [53]. При этом в обоих случаях наблюдается увеличение количества фибробластов. Кроме того, данные ферменты играют важe-mail: medalfavit@mail.ru

ную роль в процессах ангиогенеза, пролиферации, миграции и дифференциации и апоптоза клеток. Многообразие функций данных ферментов, играющих важную роль в процессе ангиогенеза, пролиферации, миграции и дифференциации клеток, а также апоптоза клеток. Особенности строения коллагена делают его устойчивым к действию протеиназ. Исключение составляет ММП‑1, расщепляющая молекулу коллагена на два фрагмента, доступных дальнейшему распаду. ММП‑1 называют также интерстициальной коллагеназой, чтобы подчеркнуть её способность гидролизовать три интерстициальных коллагена: типов I, II и III, которые существенно отличаются друг от друга. Этот фермент также гидролизует минорные коллагены типов VII и X, а также желатины разных коллагенов, гликопротеин энтактин (связывающийся с ламинином и коллагеном IV типа), и агрекан [43]. Особенностью желатиназ является способность гидролизовать коллаген не только IV типа, но и коллагены других типов (V, XIV типа), а также ряд белков и гликопротеинов внеклеточного матрикса (фибронектин, эластин и энтактин). ММП‑7 — достаточно сильная протеиназа, гидролизующая фибронектин, эластин, агрекан и коллаген V типа, но не влияющая на интерстициальные коллагены I, II и III типа и коллаген базальных мембран IV типа [28]. Поскольку дисбаланс в системе ММП / ТИММП приводит либо к избыточному фиброзу, либо к несостоятельности СТ, активность данных ферментов может быть использована для оценки ремоделирования соединительнотканных структур при различных патологических состояниях. Определение активности ММП и ТИММП производится с помощью ИФА. К числу ММП относится и семейство тенасцинов, среди которых наиболее важными являются ТN-C, ТN-X, тенасцин-R, тенасцин-Y и тенасцин-W [51, 52]. В настоящее время только два из них (TN-C и TN-X) идентифицированы как регуляторы активности ММП. Известно, что ТN-Х принимает непосредственe-mail: medalfavit@mail.ru

ное участие в синтезе коллагена [57] и обладает рядом других свойств, а его дефицит способствует клинической манифестации синдрома гипермобильности суставов и одного из вариантов синдрома Элерса-Данло [61]. Чрезвычайно важна роль микроэлементов (кальция, фосфора, магния, железа, меди, серы, кобальта, селена, цинка, марганца, фтора, ванадия, кремния и бора) в обменных процессах и в развитии патологических состояний соединительной ткани. Ионы данных веществ не только непосредственно входят в состав соединительнотканных структур, но и регулируют активность большого количества ферментов, влияющих на состав и свойства внеклеточного матрикса: фибриллярных белков, клеточных элементов и основного вещества. Наибольшее количество исследований посвящено изучению роли магния в нарушениях СТ при ННСТ [7, 14, 26, 29, 62]. Достоверно известно о влиянии гипомагниемии на изменение механических свойств артерий [15, 48, 56]. Известно также, что дефицит магния приводит к понижению активности гиалуронансинтетаз при одновременном повышении активности гиалуронидаз, что способствует изменению свойств гиалуронана, компонента основного вещества СТ. Активность ММП также повышается в условиях дефицита этого микроэлемента, что приводит к усилению катаболизма белков внеклеточного матрикса, прежде всего коллагена, и уменьшению прочности СТ [47, 65, 59, 69]. О запасах микроэлементов в организме судят по их содержанию в биологических жидкостях (цельной крови, сыворотке и моче) и дериватах кожи (волосах и ногтях). В последние годы стало известно о наличии у пациентов с ННСТ признаков нарушения энергетического обмена, что позволило отнести ряд наследственных синдромом (Марфана, Элерса-Данло и др.) в группу так называемых вторичных митохондриальных заболеваний. При этих патологических состояниях происходит нарушение β-окисления жирных кислот, о чем свидетельствует повышение уров-

ня молочной и пировиноградной кислот при высоком соотношении лактат / пируват, увеличение содержания продуктов перекисного окисления липидов на фоне снижения активности антиоксидантной системы, а также снижение активности энергетического обмена в лимфоцитах периферической крови. При патоморфологическом исследовании у таких пациентов обнаруживается увеличение количества «рваных» красных мышечных волокон в биоптатах мышечной ткани [11, 23, 24]. Одним из условий развития данных изменений принято считать дефицит L-карнитина [22]. Определение общего карнитина в крови осуществляется энзиматическим методом с помощью стандартных наборов. Особое положение среди компонентов внеклеточного матрикса, благодаря его гетерогенности и мультифункциональности, занимает гликопротеин фибронектин, который известен как адгезивный гликопротеин, обеспечивающий межклеточные и межмолекулярные связи, способный регулировать продукцию супероксидного анион-радикала, стимулировать фагоцитарную активность макрофагов, способствовать миграции фибробластов и вызывать их пролиферацию. Наличие двух форм фибронектина, растворимого (циркулирующего в крови) и нерастворимого (находящегося в соединительной ткани), а также возможность перехода из одной в другую, позволяет предположить существование единой фибронектиновой системы. Его способность к миграции в ткани из сыворотки крови в ответ на повреждение внеклеточного матрикса была отмечена в ряде клинических и экспериментальных исследований [9, 18, 37]. Кроме того, изменение содержание фибронектина в крови отмечено при ННСТ. Принято считать, что именно со снижением синтеза данного гликопротеина при синдроме Элерса-Данло X типа связано развитие геморрагических осложнений у пациентов, страдающих этим заболеванием. Содержание фибронектина в крови определяют с помощью ИФА.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

41

Разнообразные нарушения в системе гемостаза при ННСТ легли в основу концепции гематомезенхимальных дисплазий (ГМД), сформулированную З. С. Баркаганом [2, 3, 4]. Изменения со стороны сосудисто-тромбоцитарного и плазменно-коагуляционного звеньев гемостаза чаще сопровождаются развитием геморрагического синдрома [54, 46], реже — тромботических осложнений [31]. В соответствии с этой концепцией в основе патогенеза геморрагического синдрома при ГМД лежит наличие телеангиэктазий без других нарушений гемостаза, нарушение тромбоцитарного звена гемостаза (дисфункция тромбоцитов и тромбоцитопения), дефицит фактора Виллебранда и других факторов свертывания крови (факторов VII и X), а также диспротромбинемия и дисфибриногенемия. Ситуация осложняется наличием повышенной трабекулярности и добавочных хорд в камерах сердца, структурных изменений сосудистой стенки, способствующих формированию дефектов эндотелия и его дисфункции. Для оценки агрегационной способности тромбоцитов используют агрегатометрию с различными индукторами агрегации (АДФ в различных концентрациях, коллагеном, арахидоновой кислотой, тромбином, ристомицином), а также морфофункциональную оценку внутрисосудистой активации тромбоцитов [38]. Установлено, что у 72 % детей при ННСТ имеется нарушение АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов [1, 33]. У пациентов с различными вариантами ННСТ отмечено также усиление спонтанной агрегации тромбоцитов, лабораторным маркером которой является феномен «преждевременного высвобождения» кальция из тромбоцитов в плазму при центрифугировании (swelling-эффект). О состоянии плазменно-коагуляционного звена гемостаза судят по содержанию в крови факторов свертывания крови (X и VII), а также протромбина и фибриногена. Определение содержания и активности фактора Виллебранда позволяет судить о состоянии обоих звеньев свертывающей системы крови.

42

Таким образом, несмотря на то, что приведенные лабораторные показатели лишь характеризуют состояние соединительнотканных структур, их определение может дать дополнительную информацию как о динамике самого патологического процесса, так и об эффективности проводимого лечения. Благодарности. Автор благодарит доктора медицинских наук, профессора, заведующего кафедрой клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, директора научно-образовательного центра «Институт лабораторной медицины» ПСПбГМУ имени академика И. П. Павлова, вице-президента Российской ассоциации медицинской лабораторной диагностики, главного специалиста-эксперта по клинической лабораторной диагностике Росздравнадзора по Северо-Западному федеральному округу, академика Метрологической академии Эмануэля В. Л. за помощь в работе над текстом. Список литературы 1. Арсентьев В. Г., Арзуманова Т. И., Асеева М. В. и др. Полиорганные нарушения при дисплазиях соединительной ткани у детей и подростков. // Педиатрия. — 2009. — 87 (1). — С. 135–138.

2. Баркаган З. С., Перегудова И. Г., Суханова Г. А. и др. О нарушениях свертывания крови у больных мезенхимальными дисплазиями. // Гематология и трансфузиология. — 1993. — 38 (5). — С. 28–30.

3. Баркаган З. С., Белых В. И., Моисеева Н. В. Невритическая кровоточивость и нераскрытые механизмы регуляции системы гемостаза. // Терапевтический архив. — 2001. — 73 (5). — С. 45–48.

4. Баркаган З. С., Суханова Г. А. Геморрагические мезенхимальные дисплазии: новая классификация нарушений гемостаза. // Тромбоз, гемостаз и реология. — 2004. — № 5 (1). — С. 14–16.

5. Богмат Л. Ф., Лебец И. С., Ахназарянц Е. Л. и др. Лечение и профилактика осложнений при отдельных вариантах дисплазии соединительной ткани у подростков. // Совр. педиатрия. — 2005. — № 1 (6). — С. 147–150.

6. Бурдули Н. Н., Бурдули Н. М. Влияние внутривенного лазерного облучения крови на динамику гликозаминогликанов у больных ревматоидным артритом. // Вестник новых медицинских технологий. — 2014. — № 1 — Электронный журнал.

7. Громова О. А. Магний и пиридоксин: основы знаний. — М.: ПротоТип, 2006. — 234 с.

8. Губский Ю. І. Біологічна хімія. — Київ — Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. — 507 с.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

9. Гуриев С. Б. Ультраструктурная и иммунофлюоресцентная характеристика. // Мед.журнал. Узбекистана. — 1989. — № 5. — С. 84–87.

10. Дайхин Е. И., Козлова Н. И., Сиванова Л. А. Некоторые актуальные проблемы биохимической диагностики патологии соединительной ткани. // Педиатрия. — 1983. — № 4. — С. 68–70.

11. Дисплазия соединительной ткани: Материалы симпозиума. // Под ред. Г. И. Нечаевой. — Омск: ОГМА, 2005. — 250 с.

12. Золотарева Н. А. Особенности метаболизма наследственных соединительнотканных дисплазий. // Укр. ревм. журн. — 2003. — № 3 (13). — С. 53–54.

13. Кадурина Т. И., Горбунова В. Н. Дисплазия соединительной ткани. Руководство для врачей. — СПб.: Элби-СПб, 2009. — 704 с.

14. Кадурина Т. И., Аббакумова Л. Н. Оценка степени тяжести недифференцированной дисплазии соединительной ткани у детей. // Медицинский вестник Северного Кавказа. — 2008. — № 2. — С. 15–21.

15. Капелько В. И. Внеклеточный матрикс миокарда и его изменения при заболеваниях сердца. // Кардиология. — 2000. — № 9. — С. 78–90.

16. Карякина Е. В., Косягин Д. В. Определение гликозаминогликанов сыворотки крови. // Лаб. дело. — 1982. — № 10. — С. 591–593.

17. Карякина Е. В. Определение гликозаминогликанов синовиальной жидкости. // Лабораторное дело. — 1987. — № 1. — С. 51–53.

18. Ким Л. Б., Березовская Г. А., Лайвин А. Н. и др. Динамика содержания фибронектина у больных в процессе раннего постинфарктного ремоделирования миокарда левого желудочка. // Бюл. СО РАМН. — 2002. — № 4. — С. 63–66.

19. Клиническое руководство по лабораторным тестам. // Под ред. Н. Тица (пер. с англ.). // Под ред. В. В. Меньшикова. — М.: Лабинформ, 2003. — 960 с.

20. Коренев Н. М. Патология соединительной ткани у детей и подростков — проблемы и перспективы. // Мат-лы науч. — практ. конф. «Патологія сполучної тканини — основа формування хронічних захворювань у дітей та підлітків». — Харків, 2004. — С. 3–5.

21. Лазарев В. А. Коллагено-полисахаридный гель как модель межклеточного вещества соединительной ткани. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. — 1976. — № 10. — С.

1216–1218.

22. Николаева Е. А., Семячкина А. Н., Воздвиженская Е. С. и др. Коррекция недостаточности карнитина у детей с наследственными заболеваниями обмена веществ. // Педиатрическая фармакология. — 2003. — № 4. — С. 1–4.

23. Семячкина А. Н., Николаева Е. А., Новиков и др. Нарушение процессов клеточной биоэнергетики у детей с моногенными заболеваниями соединительной ткани (синдромы Марфана и Элерса-Данло) и методы их терапевтической коррекции. // Мед. генетика. — 2002. — № 4. — С.

186–190.

24. Семячкина А. Н., Николавева Е. А., Семячкина С. В. и др. Медикаментохная коррекция нарушений клеточной биоэнергетики

e-mail: medalfavit@mail.ru

у больных с моногенными заболеваниями соединительной ткани) синдром Марфана и Элерса-Данло). // Педиатр. фармакология. —2003. — № 1. — С. 41–44.

25. Серов В. В., Шехтер А. Б. Соединительная ткань. — М: Медицина. — 1981. — 312 с.

26. Скальный А. В. Референтные значения концентрации химических элементов в волосах, полученные методом ИСП-АЭС. // Микроэлементы в медицине. — 2003. — № 4. — С. 55–56.

27. Слуцкий Л. И. Биохимия нормальной и патологически измененной соединительной ткани. — М.: Медицина, 1969. — 375 с.

28. Соловьева Н. И.. Матриксные металлопротеиназы и их биологические функции. // Биоорганическая химия. — 1998. — 24. — С. 217–220.

29. Спасов А. А. Магний в медицинской практике. — Волгоград, 2000. — 272 с.

30. Сукачева А. И., Панфилова Е. А. К вопросу о синдроме дисплазии соединительной ткани сердца в педиатрической практике. // Врачебн. практика. — 2000. — № 2. — С. 75–75.

31. Суханова Г. А., Баркаган З. С., Котовщикова Е. Ф. и др Тромботические мезенхимальные дисплазии и их связь с другими тромбофилиями. // Гематол. и трансфузиол. 2003. — № 6. — С. 13–14.

32. Чалисова Н. И., Пеннияйнен В. А., Хаазе Г. Регулирующая роль некоторых аминокислот при развитии апоптоза в органотипической культуре нервной и лимфоидной ткани. // РоС. физиологический журн. — 2002. — № 5. — С. 627–629.

33. Шабалов Н. П., Арсентьева В. Г. Наследственные болезни соединительной ткани. // Педиатрия: национальное руководство. М.: ГЭОТАР-Медиа, 2009; т. 1: 298–320.

34. Шамхалова В. Г. Значение биохимических методов исследования функционального состояния соединительной ткани в оценке физического развития здоровых детей. // Функциональные методы исследования в педиатрии: Сб. науч. тр. — М., 1976. — С. 18–19.

35. Шараев П. Н. Определение свободного и белковосвязанного гидроксипролина в моче. // Лабораторное дело. — 1990. — № 12. — С. 23–25.

36. Шараев П. Н., Сахабутдинова Е. П., Лекомцева О. И. и др. Определение свободного и пептидно-связанного гидроксипролина в сыворотке крови. // Клиническая лабораторная диагностика. — 2009. — № 1. — С. 7–9.

37. Шехонин Б. В., Гуриев С. Б., Иргашев Ш. Б., и др. Фибронектин и фибриноген/фибрин в очаге экспериментального инфаркта миокарда. // Архив патологии. — 1989. — № 9. — С. 14–20.

38. Ш и т и к о в а А . С . Т р о м б о ц и т о п а т и и , врожденные и приобретенные. Под редакцией Л. П. Папаян, О. Г. Головиной. СПб.: ИИЦ ВМА, 2008. — 320 с.

39. Яковлев В. М., Нечаева Г. И. Кардио-респираторные синдромы при дисплазии соединительной ткани. — Омск: ОГМА, 1994. — 217 с.

40. Albertini R., Passi A., Abuja P. M. et al. The effect of glycosaminoglycans and proteoglycans on lipid peroxidation. // Int. J. Mol. Med. — 2000. — 6. — P. 129–136.

e-mail: medalfavit@mail.ru

41. Ambrosio G., Zweier J. L., Duilio C. еt al. Evidence that mitochondrial respiration is a source of potentially toxic oxygen free radicals in intact rabbit hearts subjected to ischemia and reflow. // J. Biol. Chem. — 1993. — Vol. 268. — P. 18532–18541.

42. Bettica P. , Moro L. Biochemical markers of bone metabolism in the assessment of osteoporosis. // JIFCC 1995. V. 7, issue 1, p. 16–22.

43. Borkakoti N. Matrix metalloprotease inhibitors: design from structure. // Biochem. Soc. Trans. 2004 Feb; 32 (Pt. 1): 17–20.

44. Dostal D. E. Regulation of cardiac collagen: angiotensin and cross-talk with local growth factors. // Hypertension. 2001 Mar; 37 (3): 841–4.

45. Ebeling P. R., Peterson J. M., Riggs B. L. Utility of type I procollagen propeptide assays for assessing abnormalities in metabolic bone diseases. // J. of Bone and Mineral Research 1992, v. 7, № 11, р.1243–1250.

46. Estes J. W. Platelet size and function in the heritable disorders of connective tissue. // Ann. Intern. Med., 1968; 68 (6): 1237–1249.

47. Guo H., Lee J. D., Uzui H. et al. Effects of folic acid and magnesium on the production of homocysteine–induced extracellular matrix metalloproteinase‑2 in cultured rat vascular smooth muscle cells. // Circ. J. 2006; 70 (1): 141–146.

48. Indumati V., Patil VS. Biochemical markers of bone remodeling. // Journal of Clinical and Diagnostic Research. 2010 Feb; (4): 2089–2097.

49. Ishikawa T., Sacuraba K. Biochemical markers of bone turnover. New aspect. Bone metabolism movement in various sports and physical activities. // Clin. Calcium. 2009 Aug; 19 (8): 1125–31.

50. Jameson M., Dai F. X., Luster T. et al. Endothelium-derived contracting factors in resistance arteries of young spontaneously hypertensive rats before development of overt hypertention. // Hypertention. — 1993. — Vol. 21. — P. 280–288.

51. Jones F. S., Jones P. L. The tenascin family of ECM glycoproteins: structure, function, and regulation during embryonic development and tissue remodeling. Dev. Dyn., 2000; 218 (2): 235–259.

52. Jones P. L., Jones F. S. Tenascin-C in development and disease: gene regulation and cell function. Matrix Biol., 2000; 19 (7): 581–596.

53. Kakkar R, Lee RT. Intramyocardial fibroblast myocyte communication. // Circ. Res. 2010 Jan 8; 106 (1): 47–57.

54. Kashiwagi H., Riddle J. M., Abracham J. P. et al. Function and ultrastructural abnormalities of platelets in Ehlers-Danlos syndrome. // Ann. Intern. Med., 1965; 63 (2): 249–254.

55. Kolset S. J., Salmivirta M. Cell surface heparin sulfate proteoglycans and lipoprotein metabolism. // Cell. Mol. Life Sci. 1999. — 56. — P. 857–870.

58. Oikarinen A., Autio P. , Vuori J. et al. Systemic glucocorticoid treatment decreases serum concentrations of carboxyterminal propeptide of type I procollagen and aminoterminal propeptide of type III procollagen. // British J. of Dermatology 1992, v. 126, р. 172–178.

59. Pages N., Gogly B., Godeau G. et al. Structural alterations of the vascular wall in magnesium–deficient mice. A possible role of gelatinases A (MMP‑2) and B (MMP‑9). // Magnes Res. 2003; 16 (1): 43–48.

60. Saito M. Biochemical markers of bone turnover. New aspect. Bone collagen metabolism: new biological markers for estimation of bone quality. // Clin. Calcium. 2009. Vol. 19. No. 8. P. 1110–1117.

61. Schalkwijk J., Zweers M. C., Steijlen P. M. et al. A recessive form of the Ehlers–Danlos syndrome caused by tenascin-X deficiency. // N. Engl. J. Med. 2001. 345 (16): 1167–1175.

62. S e n n i K . , F o u c a u l t - B e r t a u d A . , G o deau G. Magnesium and connective tissue. // Magnes Res. 2003. Vol. 16. No. 1.

P. 70–74.

63. Steinmann В., Royce P. M., Superti-Furga A. Connective Tissue and its Heritable Disorders: Molecular, Genetic, and Medical Aspects Eds P. M. Royce, B. Steinmann New York. — 1993. — Р. 351–407.

64. Temtamy S. A., Aglan M. S., El-Gammal M.A. et al. Genetic heterogeneity in spondylo-epimetaphyseal dysplasias: a clinical and radiological study. // Egypt. J. Hum. Genet Vol. 8 (2) 2007: Р. 147–172.

65. Ueshima K., Shibata M., Suzuki T. et al. Extracellular matrix disturbances in acute myocardial infarction: relation between disease severity and matrix metalloproteinase‑1, and effects of magnesium pretreatment on reperfusion injury. // Magnes Res. 2003; 16 (2): 120–126.

66. Valimaki M. J., Tantela R., Jones J. D. et al..

Bone resorption in healthy and osteoporotic postmenopausal women: comparison markers for serum carboxy-terminal telopeptide of type I collagen and urinary pyridinium cross-links. // Eur. J. Endocrinol. 1994, v. 131, p. 258–262.

67. Waterlow J. C. Whole-body protein turnover in humans past, present and future. // Annu.

Rev. Nutr. — 1995. — Vol. 15. — P. 57–94.

68. Withold W., Degenhardt S., Castelli D. et al.

Monitoring of osteoblast activity with an immunoradiometric assay for determination of bone alkaline phosphatase mass concentration in patients receiving renal transplan-tats. // Clinica Chimica Acta 1994, v. 225, p. 137–146.

69. Yue H., Lee J. D., Shimizu H., Uzui H. et al.

Effects of magnesium on the production of extracellular matrix metalloproteinases in cultured rat vascular smooth muscle cells. // Atherosclerosis. 2003; 166 (2): 271–277.

56. Laurant P. , Hayoz D., Brunner H. et al. Dietary magnesium intake can affect mechanical properties of rat carotid artery. // Br. J. Nutr. 2000; 84 (5): 757–764.

57. Mao J. R., Taylor G., Dean W. B. et al. (2002) Tenascin-X deficiency mimics Ehlers–Danlos syndrome in mice through alteration of collagen deposition. // Nat. Genet., 30 (4): 421–425.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

43

Современные возможности молекулярногенетического анализа в диагностике хронических миелоидных опухолей

И. А. Ольховский

И. А. Ольховский, к. м. н., доцент, директор1, с. н. с.2 А. С. Горбенко, научный сотрудник1 Т. Н. Субботина, к. б. н., с. н. с.1, доцент кафедры медицинской биологии3 М. А. Столяр, научный сотрудник1,3 Красноярский филиал ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России, г. Красноярск 2 ФГБУН «Красноярский научный центр Сибирского отделения РАН», г. Красноярск 3 ФГАОУ ВПО «Сибирский федеральный университет», г. Красноярск 1

Modern possibilities of molecular genetic analysis in diagnostics of chronic myeloid neoplasm А. С. Горбенко

М. А. Столяр

Х

I. A. Olkhovskiy, A. S. Gorbenko, T. N. Subbotina, M. A. Stolyar Krasnoyarsk Branch of the National Research Center for Hematology; Krasnoyarsk Scientific Center of the Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; the Siberian Federal University, Krasnoyarsk, Russia Резюме В современной классификации хронических миелоидных опухолей (ХМО) наряду с данными морфологического исследования костного мозга предусматривается обязательная оценка наличия патогенетических соматических мутаций. В настоящей работе представлены результаты разработки диагностических наборов и алгоритма выявления соматических мутаций в генах JAK2, CALR, MPL при исследовании образцов периферической крови у 590 пациентов с подозрением на наличие хронических миелоидных опухолей. Использование молекулярно-генетических методов анализа позволило подтвердить клональный характер заболевания у 329 пациентов до получения результатов морфологического исследования костного мозга. Среди пациентов с ХМО мутация V617F JAK2 была выявлена у 240 (71,1 %), мутации в генах CALR у 57 (15,5 %) и MPL у 9 (2,5 %) пациентов. У двух была выявлена мутация в 12 экзоне гена JAK2, а у трех человек обнаружено сочетанное носительство двух мутаций V617F JAK2 и CALR. В 44 случаях (11,9 %) мутации не выявлялись. Молекулярно-генетическое тестирование периферической крови следует использовать в качестве первого диагностического теста для подтверждения ХМО.

Summary The detection of pathogenic somatic mutations is provided at the modern classification of chronic myeloproliferative neoplasms (MPN) addition to bone marrow morphological studies. We describe elaboration of real-time PCR kits and algorithm its used for detecting somatic mutations in JAK2, CALR and MPL-genes. Using molecular-genetic analysis by real-time allele-specific PCR promoted confirms the diagnosis in 329 of 590 patients sent by haematologists and suspected of having the MPNs. JAK2 V617F mutation were found in 240 (71.1 %), CALR mutations were found in 57 (15.5 %) and MPL mutations were found in 9 (2.5 %) patients with MPN. We found two patients with mutation in exon 12 of the gene JAK2, and three of them had two mutations of V617F JAK2 and CALR contemporaneously. So these sensitive and specific real-time allele-specific PCRs developed in this study will be helpful in establishing the diagnosis in routine practice of clinical diagnostic laboratories.

Ключевые слова: хронические миелоидные опухоли, соматические мутации, V617F JAK2, CALR, MPL.

Key words: somatic mutations, chronic myeloid neoplasm, V617F JAK2, CALR, MPL.

ронические Ph-негативные миелоидные опухоли (ХМО) в соответствии с классификацией ВОЗ подразделяют на три основных нозологических формы: истинную полицитемию (ИП), эссенциальную тромбоцитемию (ЭТ) и первичный миелофиброз (ПМФ) [1]. Пролиферативная активность миелоидного ростка кроветворения при ХМО связана с отдельными соматическими мутациями в кроветворных клетках костного мозга. Так, мутация V617F в гене янус-киназы 2 (JAK2) присутствует у 95 % пациентов при ИП и у 60 % при ЭТ и ПМФ. Опи-

44

санные в декабре 2013 года соматические мутации в гене кальретикулина (CALR) определяются у 20 % пациентов при ЭТ и в 25 % случаев при ПМФ, но не при ИП. Соматическая мутация в гене рецептора тромбопоэтина (myeloproliferative leukemia virus — MPL) не выявляется у пациентов при ИП, но характерна для 3 и 7 % случаев ЭТ и ПФМ соответственно [2]. Поскольку лишь менее 12 % случаев клинически и морфологически верифицированных ХМО не ассоциированы с описанными выше специфическими мутациями, их идентификация

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

является достаточно чувствительным диагностическим тестом. Надежность молекулярно-генетического тестирования проб периферической крови определяется также высокой степенью соответствия уровня аллельной нагрузки мутаций с определяемой в биоптатах костного мозга [3, 4]. Целью работы являлась разработка методов выявления соматических мутаций в генах JAK2, CALR, MPL и алгоритма тестирования проб венозной крови пациентов при подозрении на ХМО. e-mail: medalfavit@mail.ru

Материалы и методы В настоящее исследование включены данные обследования 590 пациентов с подозрением на хроническое миелопролиферативное заболевание, и поступивших в период с 01.09.2012 по 30.08.2015 на консультативный прием врача-гематолога в амбулаторно-поликлинические учреждения г. Красноярска и в Красноярскую краевую клиническую больницу. Основанием для обследования служили клинические проявления эритрои тромбоцитоза, высокие значения гемоглобина и гематокрита, а также подозрение на первичный миелофиброз. Окончательный диагноз устанавливался на основании критериев ВОЗ 2008 года [1]. Гистологическое исследование костного мозга проводилось специалистами лаборатории КГУЗ «Красноярское краевое патологоанатомическое бюро». Взятие крови для молекулярно-генетических исследований осуществлялось из локтевой вены утром натощак в вакутейнер с ЭДТА. Анализ параметров гемограммы проводили на автоматическом гематологическом анализаторе ХТ‑2000i (Sysmex Corporation). Выделение ДНК из лейкоцитов цельной крови проводили с использованием реагентов «ДНК-сорб-В» (ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии»), а также c использованием реагента «ДНК-экспресс-кровь» (НПО «Литех»). Концентрацию ДНК измеряли с использованием набора dsDNA HS Assay Kit на флуориметре Qubit (Invitrogen). С целью выявления мутации V617F в гене JAK2 выполняли аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (ПЦР-РВ). Использовали праймеры, указанные в работе [5]. Метод анализа был оптимизирован для проведения на амплификаторе iQ5 (Bio-Rad, США). Предел аналитической чувствительности, рассчитанный на основании тестирования 395 заведомо отрицательных образцов, составил 0,04 % уверенно (р > 0,001) выявляемой аллельной нагрузки в пробах венозной крови. Для оценки качественного совпадения результатов использовалась коммерческая тест-система НПО «Литех». Более редкие мутации в 12 e-mail: medalfavit@mail.ru

Таблица 1 Результаты генетического обследования пациентов с подозрением на ХМО

Диагноз

ХМО

Прочие онкогематологические заболевания

Вторичный эритротромбоцитоз

Количество пациентов, всего

367

69

154

С мутацией JAK2 (V617F)

261*

0

0

С мутацией JAK2 в 12 экзоне

2

0

0

С мутациями MPL (W515L/K)

9

0

0

С мутацией CALR (c.1092_1143del)

40*

0

0

С мутацией CALR (c.1154_1155insTTGTC)

17

0

0

Без мутаций

44

69

154

Примечание: * — три пациента с сочетанием двух мутаций в генах CALR и JAK2.

экзоне JAK2, характерные исключительно для ИП, определяли в рамках совместной работы со специалистами ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора. Н а л и ч и е м у т а ц и й c.1154_1155insTTGTC (p.K385fs*47) и c.1092_1143del (p.L367fs*46) в гене CALR определяли методом аллель-специфической полимеразной цепной реакции (ПЦР-РВ) в режиме реального времени с зондами TaqMan. Использовались праймеры и зонды, разработанные в нашей лаборатории. В связи с отсутствием доступных коммерческих наборов для определения мутаций в гене CALR, верификацию 20 отрицательных проб проводили методом секвенирования по Сэнгеру в независимой лаборатории (ООО «Бигль»), образцы с выявленной мутацией были направлены в лабораторию доктора A. M. Vannucchi (Department of Experimental and Clinical Medicine, University of Florence, Италия), а также в лабораторию молекулярной гематологии ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздрава России (заведующий доктор медицинских наук А. Б. Судариков). Качественный анализ на наличие мутаций W515L/K в гене MPL (rs121913615 и rs121913616 соответственно) проводили с использованием праймеров и условий амплификации аллель-специфической ПЦР-РВ, описанных в работе [6] после оптимизации для прибора iQ5 (Bio-Rad, США). Для оценки качественного совпадения результатов использовалась коммерческая тест-система SNP-Скрин (НПО «Синтол»).

Результаты и обсуждение Сопоставление результатов тестирования отрицательных и положительных образцов при использовании разработанных нами наборов и соответствующих коммерческих тест-систем выявления мутаций V617F JAK2 и MPL продемонстрировало их полное совпадение. Результаты двух положительных проб, обнаруженные в нашем наборе на определение мутаций в гене CALR, были подтверждены в лаборатории Department of Experimental and Clinical Medicine (University of Florence, Италия) с использованием различных молекулярно-диагностических технологий. В 20 отрицательных пробах секвенирование по Сэнгеру не выявило наличие мутации CALR. В табл. 1 представлены результаты выявления соматических мутаций в генах JAK2, CALR, MPL среди обследованных пациентов. В пользу достаточной специфичности и чувствительности наших тестов также свидетельствуют статистические данные, совпадающие с литературными: отсутствие выявления мутаций при ХЛЛ, ХМЛ и при других гемобластозах. Процент выявленных мутаций при ХМО также совпадает с описанными в литературе данными [2, 7]. С целью сокращения сроков постановки диагноза мы предлагаем использовать молекулярно-генетическое тестирование периферической крови, придерживаясь следующего алгоритма обследования пациентов с подозрением на ХМО (рис. 1). После исследования на гематологическом анализаторе все пробы сразу тестируются на выявление мутации

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

45

V617F JAK2. Выявление данной мутации однозначно свидетельствует о наличии ХМО, и с учетом данных гемограммы при высоком уровне гемоглобина и гематокрита можно с высокой долей вероятности склоняться в пользу ИП или в пользу ЭТ при высоком тромбоцитозе. Последующее тестирование на выявление мутации в генах CALR и MPL дополнительно выявляет пациентов с ЭТ и ПМФ и исключает диагноз ИП. Вместе с тем окончательная верификация диагноза с учетом последней коррекции [2] рекомендаций ВОЗ требует морфологического подтверждения, в том числе для выявления вариантов «префибротического ПМФ» с высоким тромбоцитозом, а также «скрытой ИП». Отсутствие всех трех мутаций выделяет группу пациентов, среди которых вероятность клонального заболевания не превышает 12 %, остальные — это вторичные (реактивные) эритро- и тромбоцитозы, которые часто могут быть идентифицированы без необходимости пункции костного мозга, в частности, при повышенных уровнях циркулирующего эритропоэтина. Таким образом, использование молекулярно-генетического тестирования у пациентов с подозрением на наличие ХМО хотя и не приводит к полному отказу от необходимости морфологического исследования костного мозга, позволяет в короткие сроки в 90 % случаев определиться с клональным характером заболевания. Кроме того, определение отдельных соматических мутаций необходимо для более точной оценки риска тромбогенных осложнений и прогноза развития заболевания. Учитывая отсутствие на рынке доступных диагностических тест-систем для выявления отдельных клинически значимых соматических мутаций, следует обратить внимание на зарубежный порядок допуска подобных тест-систем, предусматривающих использование in house-наборов в клинической практике [8]. Раскрытие конфликта интересов Конфликт интересов отсутствует: авторы публикации не получали фи46

Пробы пациентов с подозрением на ХМО

Тест на мутацию V617F JAK2

Мутации нет

Тест на мутации в гене CALR

Мутации нет

Мутация обнаружена Клональный характер болезни (ХМО); для диф. диагноза необходима морфология КМ

Мутация обнаружена ЭТ или ИП; для диф. диагноза необходима морфология КМ

Тест на мутации в гене MPL

Мутация обнаружена Мутации нет Определение уровня эритропоэтина для выявления реактивных состояний Выявление мутаций в 12 экзоне гена JAK2 для подтверждения ИП Морфология костного мозга для выявления тринегативных (JAK2-, CALR-, MPL-) ХМО

ЭТ или ИП; для диф. диагноза необходима морфология КМ

Рисунок 1. Алгоритм молекулярно-генетического выявления соматических мутаций при лабораторной диагностике ХМО.

нансового вознаграждения и не являются сотрудниками учреждений, интересы которых могли бы влиять на достоверность представленных данных. Источники финансирования: бюджетные программы НИР КНЦ Сибирского отделения РАН, Сибирского федерального университета, а также фонд инноваций региональной общественной организации «Красноярская краевая ассоциация медицинской лабораторной диагностики». Список литературы 1. Tefferi A., Vardiman J. W. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms: The 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms. // Leukemia. — 2008. — Vol. 22, № 1. — С. 14–22.

2. Tefferi A., Pardanani A. Myeloproliferative Neoplasms: A Contemporary Review. // JAMA Oncol. — 2015. — Vol. 1, № 1. — P. 97–105.

3. Larsen T. S., Pallisgaard N., Muller M. B. et al.

Quantitative assessment of the JAK2 V617F allele burden: equivalent levels in peripheral blood and bone marrow. // Leukemia. — 2008. — Vol. 22, № 1. — P. 194–195.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

4. Koichi T., Keyur P. P. , Hagop K. et al. JAK2 p.V617F detection and allele burden measurement in peripheral blood and bone marrow aspirates in patients with myeloproliferative neoplasms. // Blood First Edition paper. — 2013. — Vol. 122, № 23. — P. 3784–6.

5. Larsen T. S., Christensen J. H., Hasselbalch H. C. et al. The JAK2 V617F mutation involves B- and T-lymphocyte lineages in a subgroup of patients with Philadelphia-chromosome negative chronic myeloproliferative disorders. // Br. J. Haematol. — 2007. — Vol. 136, № 5. — P. 745–51.

6. Alessandro P. , Paola G., Vanessa P. et al. A sensitive detection method for MPLW515L or MPLW515K mutation in chronic myeloproliferative disorders with locked nucleic acid-modified probes and real-time polymerase chain reaction. // J. Mol. Diagn. — 2008. — Vol. 10, № 5. — P. 435–441.

7. Ольховский И. А., Горбенко А. С., Столяр М. А. и др. Определение мутации в гене кальретикулина у пациентов с подозрением на хронические миелопролиферативные неоплазии. // Гематология и трансфузиология. — 2014. — Vol. 59, № 4. — P. 12–15.

8. Sun F., Bruening W., Uhl S., et al. Quality, Regulation and Clinical Utility of Laboratory-developed Molecular Tests [Internet]. Rockville (MD): Agency for Healthcare Research and Quality (US); 2010. Available at: https://www. cms.gov/Medicare/Coverage/DeterminationProcess/downloads/id72TA.pdf.

e-mail: medalfavit@mail.ru

Оценка эффективности теста определения уровня внеклеточной ДНК при диагностике онкологических заболеваний А. А. Гнеушева, аспирант кафедры теоретической биохимии с курсом клинической биохимии, врач КЛД В. Е. Веровский, к. х. н., доцент кафедры теоретической биохимии с курсом клинической биохимии О. В. Островский, д. м. н., проф., зав. кафедрой теоретической биохимии с курсом клинической биохимии

А. А. Гнеушева

Кафедра теоретической биохимии с курсом клинической биохимии ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» (ВолгГМУ) Минздрава России, г. Волгоград Evaluation of effectiveness of test of assessment level of cell free DNA in cancer diagnostics A. A. Gneusheva, V. E. Verovsky, O. V. Ostrovsky The Volgograd State Medical University, Volgograd, Russia В. Е. Веровский Резюме Проведена оценка диагностической эффективности теста оценки уровня внеклеточной ДНК в плазме и сыворотке крови. Определены такие характеристики, как диагностическая чувствительность и специфичность, прогностическая значимость отрицательного и положительного результатов, оптимальный порог принятия клинического решения. Ключевые слова: внеклеточная ДНК, диагностическая эффективность.

С

одержание свободных циркулирующих нуклеиновых кислот в плазме и сыворотке крови при онкологических заболеваниях различной локализации заметно возрастает [5, 6]. Поэтому измерение уровня внеклеточной ДНК (вкДНК) в периферической крови может быть потенциально полезным и информативным маркером для оценки риска развития онкологического процесса и прогноза течения заболевания [8]. Однако для практического внедрения анализа уровня вкДНК необходима оценка диагностической эффективности данного теста [7]. В соответствии с требованиями доказательной медицины клиническая валидация лабораторных тестов должна включать расчет таких операционных характеристик, как диагностическая чувствительность (ДЧ) и специфичность (ДС), предсказательная ценно сть положительных (ПЦПР) и отрицательных e-mail: medalfavit@mail.ru

Summary We evaluated diagnostic efficacy test of assessment level cell free DNA in plasma and serum. We explored the following characteristics: diagnostic sensitivity and specificity, predictive value positive and negative results, the optimal level for making clinical decision.

Key words: cell free DNA, diagnostic efficacy.

результатов (ПЦОР), оптимальные пороги принятия клинического решения [1, 2, 4]. Несмотря на большое количество исследований в области применения оценки уровня вкДНК в зарубежной практике, полной информации по данным показателям нами найдено не было [5]. Цель данного исследования заключалась в оценке основных операционных характеристик диагностической эффективности теста определения уровня вкДНК у больных онкологическими заболеваниями наиболее распространенных локализаций. Материалы и методы Выделение вкДНК из образцов производили набором ДНК-сорб В (Интерлабсервис, Россия) с последующим флюориметрическим определением концентрации ДНК на флюориметре Qubit 2.0 (Invitrogen, США), ис-

пользуя набор Qubit dsDNA О. В. Островский HS Assay Kit (Invitrogen, США). Исследованы 85 образцов плазмы и 83 образца сыворотки крови больных злокачественными новообразованиями молочной железы, легких, поджелудочной железы, кишечника, мочевого пузыря, желудка, почек, а также 51 образец плазмы и 40 образцов сыворотки крови здоровых добровольцев (контрольная группа). Расчет параметров диагностической эффективности производили с использованием метода четырехпольной таблицы [1] и расчетных формул [3, 4]. Для выбора оптимального порога принятия клинического решения мы применяли ROC- анализ (Receiver Operating Characteristics) с построением ROC-кривой — зависимость

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

47

Рисунок 1. ROC-кривая при исследовании образцов плазмы и сыворотки. Таблица 1 Результаты анализа образцов плазмы больных онкологическими заболеваниями и здоровых добровольцев Диагноз ЗНО

Уровень цДНК, нг/мл

Есть (≥ 50 нг/мл) Нет (< 50 нг/мл)

Есть

Нет

74

8

Всего 82

ПЦПР = 90,2 ПЦОР = 79,6

11

43

54

85

51

136

ДЧ = 87,1

ДС = 84,3

Всего

Таблица 2 Результаты анализа образцов сыворотки больных онкологическими заболеваниями и здоровых добровольцев Диагноз ЗНО Есть Уровень цДНК, нг/мл

Всего

Есть (≥ 90 нг/мл)

61

1

62

ПЦПР = 98,4

Нет (< 90 нг/мл)

22

39

61

ПЦОР = 63,9

83

40

123

ДЧ = 73,5

ДС = 97,5

Всего

ДЧ от (1-ДС) при плавном изменении порога принятия клинического решения. Оптимальный выбор порога принятия клинического решения состоит в выборе точки на ROC-кривой, которая ближе всех к левому верхнему углу, то есть точке 0,1. С помощью ROC-кривой также можно рассчитать параметр AUC (Area Under ROC, площадь под кривой), который характеризует эффективность теста. Результаты и обсуждение С помощью ROC-анализа установлено, что для образцов плазмы оптимальное пороговое значение содержания вкДНК составило более 50 нг/мл, в то время как для образцов сыворотки более 90 нг/мл (рис. 1).

48

Нет

Параметр AUC оказался практически равным при использовании сыворотки и плазмы и составил 0,85 и 0,87 соответственно. То есть можно заключить, что выбор биологического материала не оказывает существенного влияния на диагностическую эффективность метода оценки уровня вкДНК крови. С учетом установленных оптимальных пороговых значений принятия клинического решения параметры диагностической чувствительности и специфичности составили 87,1; 84,3 для плазмы и 73,5; 97,5 для сыворотки соответственно (табл. 1, 2). Можно заключить, что вкДНК, как биомаркер, по диагностической чувствительности и специфичности

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

не уступает показателям эффективности других онкомаркеров. Так, например, по данным различных исследований, чувствительность теста определения уровня онкомаркера СА‑125 составляет 71–78 %, а специфичность 75–94 %, чувствительность теста определения уровня простатического специфического антигена (ПСА) составляет 73–91 %, а специфичность — 55–81 % (http://www.biochemmack.ru). Таким образом, тест определения уровня вкДНК в плазме и сыворотке крови обладает соизмеримыми с общепринятыми биомаркерами онкологических заболеваний показателями диагностической эффективности, но при этом он достаточно простой в исполнении и не требует дорогостоящего оборудования. Однако с точки зрения клинической диагностики для практикующего врача более важными и информативными показателями являются прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов. Учитывая распространенность онкологических заболеваний (0,368 % по региону), прогностическая ценность положительного результата составляет всего 2,2 %, в то время как прогностическая ценность отрицательного результата — 99,9 %. Таким образом, при уровне вкДНК плазмы, не превышающем пороговое значение, можно практически со стопроцентной вероятностью утверждать отсутствие онкологического заболевания у обследуемого. При распространенности заболевания 62 %, как в исследуемой нами выборке, прогностическая ценность положительного результата составила 90,2 %, отрицательного — 79,6 %. Аналогично в случае с использованием образцов сыворотки: при учете распространенности онкозаболеваний прогностическая ценность отрицательного результата составляет 10,2 %, положительного — 99,9 %, в то время как в исследуемой выборке прогностическая ценность положительного результата — 98,4 %, а отрицательного — 63,9 %. Таким образом, учитывая распространенность онкозаболеваний, при низкой прогностической ценности положительного результата и очень высокой прогностической ценности e-mail: medalfavit@mail.ru

отрицательного тест определения уровня вкДНК крови может быть перспективным для диспансерного обследования населения с целью выявить отсутствие онкозаболеваний различных локализаций. Однако для практического применения данного биомаркера в лабораториях онкологических диспансеров, где распространенность новообразований примерно как в исследуемой нами выборке, тест может быть многообещающим для мониторинга течения и выявления возможных рецидивов при онкологических заболеваниях. Заключение Можно заключить, что выбор биоматериала не влияет на диагностическую эффективность теста. Однако

сыворотка является более предпочтительным биологическим образцом, так как тест оценки уровня вкДНК в сыворотке обладает более высокой специфичностью и прогностической ценностью отрицательного результата с учетом распространенности онкозаболеваний. Таким образом, вкДНК может стать перспективным биомаркером для внедрения в клиническую практику. Список литературы 1. ГОСТ Р 53022.3–2008. Требования к качеству клинических лабораторных исследований. Часть 3. Правила оценки клинической информативности лабораторных тестов.

2. Т . С . Д ь я ч е н к о , В . Е . В е р о в с к и й , О. В. Островский. Оценка диагностической значимости показателей малого биохимического набора при сердеч-

но-сосудистой патологии. — Материалы III Съезда Научного общества специалистов клинической лабораторной диагностики. — М., 2005. — С. 44.

3. Маршалл В. Дж. Клиническая биохимия: Пер. с англ. / В. Д. Маршалл. — М.: Бином, 2001. — 373 с.

4. Флетчер Р., Флетчер С., Вагнер Э. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины. — М.: Медиа Сфера, 1998. — 352 с.

5. Kohler C., Barekati Z. Cell-free DNA in the Circulation as a Potential Cancer Biomarker.

Anyicancer Research. — 2011; 31: 2623–2628.

6. Swaminathan R., Butt A. N. Circulating nucleic acids in plasma and serum. Ann. N. Y. Acad. Sci. 2006; 1075: 1–9.

7. Tong YK, Lo YM. Diagnostic developments involving cell-free (circulating) nucleic acids.

Clin Chim Acta. — 2006, 363: 187–196.

8. Wong I. H., Lo Y. M., Johnson P. J. Epigenetic tumor markers in plasma and serum: Biology and applications to molecular diagnosis and disease monitoring. Ann. N. Y. Acad.

Sci. — 2001; 945: 36–50.

Актуальные вопросы инновационного подхода к охране труда и технике безопасности при выборе хирургических перчаток в операционном блоке Круглый стол под таким названием провела компания Ansell, глобальный лидер в области охраны труда и техники безопасности. Мероприятие открылось докладом врача аллерголога-иммунолога НИИ иммунологии ФМБА России Сергея Захарова на тему «Латексная аллергия и различные пути минимизации и предотвращения аллергических рисков среди медицинских работников и пациентов». Докладчик сообщил, что под латексной аллергией следует понимать реакции, развившиеся после контакта с латексом, обусловленные участием иммунных механизмов. Интересен факт, что в операционной, где проводят шесть хирургических операций в день, и использются в среднем пять пар опудренных перчаток на операцию, общая масса циркулирующей в воздухе пудры достигает 2 кг в год. Выступающий обратил внимание на то, что качество Ansell доказано независимыми исследованиями. Компанией Ansell выбран Fit Kit-тест в связи с его высокочувствительностью и высокой специфичностью. Благодаря этим показателям Fit Kit-тест в настоящее время лидирует в определении латексспецифических аллергенов. В продолжение круглого стола Александра Марченко (клинический консультант компании) и Оксана Марченко (ведущий специалист по охране труда в медицине) провели мастер-класс по мытью рук. Было доказано, что не все умеют мыть руки качественно. Это удалось выявить с помощью лампы, которая показала количество загрязнений на руках, которое осталось после нанесения специального крема на руки и после мытья рук мылом. С докладом выступила Александра Марченко, клинический консультант компани. Она сообщила, что перчатки Ansell защищают от вирусов и цитостатиков. Главной особенностью перчаток является то, что они тоньше на пальцах, чуть толще на ладонях и еще толще на манжете. Особое внимание было уделено использованию двойных перчаток.Технологические решения Ansell: Hydrasoft — увлажнение кожи рук, двойные перчатки — классическая защита, АМТ — защита от микроорганизмов, Сенсопрен — чувствительность и защита от аллергии. Игорь Войцеховский, медицинский директор благотворительной организации «Операция улыбка», рассказал, что компания Ansell сотрудничает с благотворительной организацией, снаб-

e-mail: medalfavit@mail.ru

жает ее перчатками для хирургических операций. В течение всего 2015 года хирурги-волонтеры работали в перчатках Ansell линейки Encore. «Операция улыбка» — благотворительная общественная организация, созданная изменить жизнь детей и молодежи с расщелинами губы, нёба и другими лицевыми деформациями через оказание им бесплатной медицинской помощи высочайшего уровня. Операции проводятся в различных городах России. Ежегодно в России рождаются до 2 500 детей с таким дефектом. Продолжила тему Ольга Кудаманова, директор «Операция улыбка». Она рассказала как проходят акции: дети с врожденными дефектами лица получают помощь опытных специалистов по челюстно-лицевой хирургии в пределах своего региона. Организация «Операция улыбка» уже 20 лет дарит детям улыбки — всего это более трех тысяч улыбок! В заключение был показан документальный фильм о том, как работает команда благотворительной организации.

Ansell — мировой лидер в области производства средств барьерной защиты из натурального латекса и синтетических полимеров. Компания работает в четырех основных сегментах: medical solutions, industrial solutions, new verticals and sexual wellness. В компании работают более 11 тысяч человек в Европе, Азии, Северной и Южной Америке. Информацию о компании Ansell и ее продукции можно найти на сайте http://www.ansell.eu.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

49

Инновационные решения для диагностики, лечения и профилактики наследственных опухолевых синдромов Н. И. Беглярова, специалист по лабораторной диагностике в онкогенетике, член AACR, член ESMO Н. А. Липатова, к. м. н. Е. В. Тиванова, врач высшей категории ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Роспотребнадзора, г. Москва Innovative decisions for diagnostics, treatment and prevention of hereditary cancer syndromes N. I. Beglyarova, N. A. Lipatova, E. V. Tivanova The Scientific and Research Institute for Epidemiology, Moscow, Russia

Резюме Достижения молекулярной генетики и онкологии последних десятилетий оказали огромное влияние на понимание природы возникновения злокачественных новообразовании. Процесс роста раковой опухоли начинается тогда, когда один или несколько генов в клетке подвергаются процессу мутации. В результате ген либо начинает кодировать белок с новыми свойствами, либо изменяется настолько, что вовсе перестает кодировать белок. Большинство злокачественных заболеваний развиваются как следствие случайной мутации в единственной клетке. Мутация эта определяет свойства неконтролируемого роста и способности к метастазированию, таким образом, вызывая развитие опухоли. Кроме того, генетические изменения, которые вызывают рак, могут передаваться по наследству от родителей к детям, что значительно увеличивает риск образования опухоли. Эти современные знания открыли принципиально новые возможности в диагностике и лечении злокачественных новообразований. Наличие наследственных генетических изменений, лежащих в основе опухолевого роста, позволило разработать тесты для оценки риска развития ракового состояния. Диагностика наследственных опухолей позволяет использовать превентивный подход ведения пациентов, преимуществом которого является возможность снизить риски развития опухолевого заболевания от крайне высоких до минимальных (ниже рисков развития рака в общей популяции). Правильно подобранная терапия с учетом генетических нарушений организма более эффективна, позволяет значительно снизить общий токсический эффект, а значит, позволяет увеличить как продолжительность, так и качество жизни.

Summary Advances in molecular genetics and oncology have had a huge impact on the understanding of the nature of malignant neoplasms during last decades. The process of tumor growth starts when one or more genes in the cell undergo a mutation process. As a result, a gene encoding a protein gets new properties or changes the way the protein does no longer encode. Most malignant diseases are developed as a result of random mutations in a single cell. This mutation defines the property of the uncontrolled growth and metastatic potential, thus causing tumor development. In addition, the genetic changes that cause cancer can be inherited from parents to children, what notably increases the risk of tumor formation.

The study of human genetics has provided substantial insight into cancer biology, diagnostics and treatment of malignant neoplasms. The presence of inherited genetic alterations underlying tumor growth, allowed developing tests for assessment of the risk of cancer appearance. Hereditary cancer diagnostics allows using preventive approach for the patient’s management. The advantage of this approach is the ability to reduce the risk of cancer development from the highest to the minimal (even lower than risk of developing cancer in general population). Properly chosen therapy based on genetic defects is more efficient and can significantly reduce overall toxicity thus allowing increase the quantity as well as quality of life.

Ключевые слова: наследственные опухолевые синдромы, наследственный рак, РМЖ/РЯ, генетическое тестирование, генетическая диагностика, BRACAnalysis, MyRisk, предрасположенность к развитию рака.

Key words: hereditary cancer syndromes, hereditary cancer, Hereditary breast-ovarian cancer syndrome, genetic testing, genetic diagnostics, BRACAnalysis, MyRisk, cancer predisposition.

Введение Онкологические заболевания занимают второе место среди причин смертности. При этом число пациентов с разными видами рака ежегодно растет: за 10 лет с 2002-го до 2012 год прирост заболевших составил 18 %. Высокий уровень смертности в России от онкологических заболеваний обусловлен поздней диагностикой. В странах Европы и Америке более 80 % пациентов выживают не только в первый год, но и проходят пятилетний рубеж после постановки диагноза. Если выявить новообразование на первой-второй стадии, то вылечить его можно примерно в 95 % случаев [1].

50

Наследственные опухолевые синдромы обусловлены присутствием генетического дефекта с самого рождения, поэтому представляют собой группу опухолевых заболеваний, для которых ранняя и превентивная диагностика не только актуальна, но и наиболее возможна, являясь первым этапом предупреждения и лечения опухоли у данной группы пациентов. Молекулярно-генетическое исследование наследственных опухолевых синдромов Это применение методов молекулярной генетики с целью опреде-

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

ления индивидуальных признаков человека на уровне геномной ДНК, а также единственная на нынешний день возможность выявить генетическую предрасположенность к наследственным опухолевым синдромам до их возникновения. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) позволяет идентифицировать наличие гена и обнаружить в нем известную ранее мутацию. Главный недостаток всех методов ПЦР-диагностики: невозможность обнаружить мутации, находящие «за пределами» амплифицируемого фрагмента, а значит, недостаточная чувствительность метода диагноe-mail: medalfavit@mail.ru

стики. Таким образом, когда выполняется исследование определенного участка гена, и в этом участке мутации не обнаружено, это абсолютно не означает, что у данного пациента мутации нет. Секвенирование ДНК является самым объективным методом регистрации мутаций, при котором точно идентифицируется молекулярный характер повреждения. Метод секвенирования является «золотым стандартом» молекулярной генетики. Поиск новых, редких и подтверждение известных мутаций можно провести с помощью этого метода. Диагностика наследственных заболеваний должна подразумевать проведение секвенирования. Любые типы мутаций можно обнаружить путем прямого секвенирования мутантной ДНК или отдельных экзонов. Первичный поиск нарушений в кодирующих областях гена осуществляют именно таким образом. Технология секвенирования широко применяется в области диагностики наследственных опухолевых синдромов. Важной задачей диагностики является не только применение чувствительного метода, но и правильная интерпретация данных, полученных при молекулярно-генетическом тестировании: определение вклада каждой мутации в развитие патологии. Например, компания Myriad Genetics одна из первых применила метод секвенирования, и в 1994– 1995 годах исследователи из этой компании впервые отсеквенировали гены BRCA1 и BRCA2, ассоциированные с наследственными опухолями молочной железы и яичников. За время работы компании были диагностированы более двух миллионов пациентов, и обнаружены более 16 тысяч мутаций. Это, в свою очередь, позволило создать уникальную базу данных мутаций. Эта база содержит исчерпывающую информацию о тестируемых генах. За время работы компании удалось добиться самой низкого процента аллельных вариантов неуточненной значимости (изменение в нормальной последовательности гена, значение которого остается неясным) (рис. 1). Высокооптимизированные условия e-mail: medalfavit@mail.ru

Рисунок 1. Снижение процента аллельных вариантов неуточненной значимости к 2012 году.

Рисунок 2. Эффекты точечных мутаций на состав полипептидной цепи.

А 3’

А А Ц

Г

Т А А

Ц Г

Т

Г

Фен-Ала-Лейн-Асн Пептидная цепь

5’

Кодогенная цепь ДНК Вставка одного нуклеотида А А А А Ц

3’

Г

Т А А

Ц Г

Т

Кодогенная цепь ДНК

Г 5’

Фен-Цис-Иле-Асп Пептидная цепь

Рисунок 3. Мутации типа сдвига рамки считывания приводят к синтезу измененной полипептидной цепи.

секвенирования — аналитическая чувствительность теста для диагностики рака молочной железы и яичников составляет 99,98 %. Типы мутаций и значимость однонуклеотидных изменений в последовательности гена Мутации — внезапные наследуемые изменения генетического материала, вызывающие изменения каких-либо признаков и свойств организма. В классификации, основанной на размерах сегментов генома, подвергающихся преобразованиям, мутации разделяют на геномные, хромосомные и генные. Генные мутации встречаются наиболее часто. В результате генных мутаций происходят замены, делеции и вставки одного или нескольких нуклеотидов, транслокации, дупли-

кации и инверсии различных частей гена. Если под действием мутации изменяется один нуклеотид, говорят о точковых мутациях. Замена одного нуклеотида может не приводить к замене аминокислоты (сеймсенс мутации), может приводить к аминокислотной замене (мисенс мутации), а также может приводить к образованию стоп-кодона (UAG, UAA или UGA) и прекращению биосинтеза белка с измененного гена (нонсенс мутации) (рис. 2). Делеции или вставки нуклеотидов, число которых не кратно трем, изменяют смысл синтезируемой полипептидной цепи, что связано с триплетностью генетического кода (рис. 3). Различные изменения в нуклеотидной последовательности транскрибируемых областей ДНК могут

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

51

по-разному проявляться в фенотипе. Часть из них не оказывает никакого влияния на структуру и функцию соответствующего белка. Примером могут служить замены нуклеотидов, не приводящие к замене аминокислот в силу вырожденности генетического кода. Мутантные аллели, в свою очередь, могут быть подразделены на три класса: 1. мутации, ведущие к полной потере функции (loss-of-function); 2. мутации, сопровождающиеся количественными изменениями соответствующих мРНК и первичных белковых продуктов; 3. доминантно-негативные мутации (gain-of-function), изменяющие свойства белковых субъединиц таким образом, что они оказывают повреждающее действие на жизнеспособность или функционирование экспрессирующих типов клеток [12]. Таким образом, замена даже одного нуклеотида может играть значительную роль в функциональной активности синтезируемого белка, что может привести к риску развития того или иного заболевания. Наследственные опухолевые синдромы Рак — это генетическое заболевание, которое возникает из-за накопленных мутаций, которые способствуют клональной селекции более агрессивных клеток. Подавляющее большинство мутаций — соматические и обнаруживаются в отдельных опухолевых клетках. Но все же до 10 % от всех случаев онкологических заболеваний

Рисунок 4. Механизм возникновения наследственных раковых синдромов. 2х ударная модель.

52

возникают у людей с наследственным опухолевым синдромом. Такие индивидуумы несут конкретную зародышевую мутацию в каждой клетке их организма. Наследственные опухолевые синдромы (НОС) — группа заболеваний, проявление которых связано с передачей из поколения в поколение крайне высокой предрасположенности к тому или иному виду рака. Несмотря на нечастую встречаемость, НОС имеют огромную биологическую значимость. Исследование мутаций, отвечающих за эти синдромы и изучение сигнальных путей, которые нарушены у таких пациентов, внесли беспрецедентный вклад в понимание причин возникновения и патогенез как наследственных, так и спорадических форм рака. Генетический анализ специфических генов, ассоциированных с повышенным риском развития рака, позволил напрямую диагностировать НОС. Необходимо отметить, что до 2 % здоровых людей — носители мутаций, которые многократно повышают риск развития злокачественных новообразований. Биологические основы наследственных опухолевых синдромов В результате мутации в определенных генах в единичной клетке клетка начитает приобретать свойства неконтролируемого ро ста, перестает поддаваться контролю клеточного цикла, в результате чего образуется опухоль. Большинство генов, отвечающих за развитие рака, делятся на две категории: онкогены и гены-опухолевые супрессоры. Подавляющее большинство наследственных опухолей связано с дефектами в генах-супрессорах. Эти гены участвуют в репарации спонтанных повреждений ДНК и негативно регулируют деление и рост клеток, а также уход от апоптоза (запрограммированной клеточной гибели), таким образом, блокируя избыточную пролиферацию, а значит, развитие опухоли. Когда в соматической клетке повреждается лишь один аллель, это не имеет фенотипического проявления, и клетка продолжает функцио-

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

нировать нормально (рис. 4, слева). Если мутация одного из генов-супрессоров передалась через половые клетки, как в случае НОС, то достаточно повреждения одного интактного аллеля, чтобы клетка приобрела потенциал к злокачественному росту (рис. 4, справа). Наследственный рак молочной железы и яичников Первое место как среди вновь диагностируемых злокачественных новообразований, так и среди причин смерти от онкологических заболеваний у женщин после 40 лет занимает рак молочной железы. Наследственный рак молочной железы и (или) яичников (РМЖ/РЯ) и в среднем в популяции составляет 5–20 % от всех случаев [11]. В России ежегодно регистрируются более 50 тысяч новых случаев заболеваний РМЖ / РЯ. Показано, что рак имеет «вертикальный», аутосомно-доминантный тип наследования (напрямую от родителей к детям). Чаще всего эта болезнь обнаруживается у женщин, у которых родственники первой линии родства болеют или умерли от рака [2, 3]. Важно отметить, что возраст пациенток с РМЖ / РЯ на момент диагностики значительно моложе (35–45 лет), чем в остальных случаях (более 50 лет), что, в свою очередь, может вызвать серьезные проблемы репродукции женщин. Гены предрасположенности к РМЖ / РЯ Говоря о генах предрасположенности, стоит отметить, что в настоящее время установлено, что более чем в 80 % случаев РМЖ / РЯ мутация обнаруживается в одном из двух генов: BRCA1 или BRCA2 (рис. 5) [3].

Рисунок 5. Роль мутаций BRCA в развитии наследственного РМЖ / РЯ.

e-mail: medalfavit@mail.ru

Мутации в этих генах ассоциированы с высоким риском возникновения РМЖ / РЯ. Среди больных раком молочной железы без учета семейного анамнеза доля BRCA-ассоциированного РМЖ не превышает 6 %, тогда как у пациенток, в семьях которых были случаи заболевания раком молочной железы или яичников, заболевание было связано с наследованием мутации в генах BRCA в 25–30 %. При таком сценарии риск развития рака молочной железы очень высок, по данным различных авторов, от 60 до 85 % (при среднем общепопуляционном показателе 5–7 %) (Huang and Huang, 2009; Wiesner et al., 2009).У носительниц этих мутаций риск развития рака яичников колеблется от 27 до 60 %, тогда как общепопуляционный показатель не превышает 1 % (рис. 6).

BRCA1 и BRCA2 — это гены-супрессоры опухолевого роста, которые в норме участвуют в репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и поддержании стабильности генома. Мутации в этих генах приводят к экспрессии белков с нарушенной функцией, в результате чего поврежденная ДНК не может восстанавливаться должным образом. Это, в свою очередь, приводит к накоплению мутаций и развитию онкологических заболеваний, и в первую очередь к раку молочной железы и (или) яичников. Индивидуальный риск возникновения злокачественной трансформации тканей молочной железы и (или) яичников у носительниц мутаций в генах BRCA может достигать 95 % (рис. 6). [3, 4] Гены BRCA1 и BRCA2 были изучены еще в начале 90-х годов. За несколько лет были идентифицированы и отсеквенированы оба гена BRCA. Первые данные об ассоциации генов BRCA и развитии РМЖ и РЯ были получены на пациентках, проживающих в Европе и Северной Америке. Оказалось, что спектр мутаций в этих генах исключительно широк. Это обстоятельство значительно затрудняет диагностику соответствующих нарушений нуклеотидной последовательности, поэтому полноценный анализ BRCA1 и BRCA2 должен представлять собой полное секвенирование всех кодирующих участков этих, e-mail: medalfavit@mail.ru

достаточно протяженных, генов. Например, у евреев-ашкенази наиболее часто встречаются мутации и являются специфическими, поэтому еврейским женщинам такой анализ настоятельно рекомендуется. В России массовые исследования по мутациям проводились лишь в некоторых этнических группах (например, в Южном федеральном округе), поэтому достоверной статистики, соответствующей масштабам страны, нет. Результаты отдельных работ идентифицировали, что в целом по России довольно часто выявляются пять мутаций в гене BRCA1 (185delAG, 300T>G [C61G], 2080delA, 4153delA, 5382insC) и одна мутация в гене BRCA2 (6174delT), также в ряде исследований обнаружены мутации в генах CHEK2 (IVS2+1G>A) и NBS1 (с. 657del5). Эти мутации характерны для славянской популяции и связаны с так называемым «эффектом основателя» (founder effect). Эффект основателя — это отклонение генных частот изолированной популяции от средних частот вида или расы, обусловленное происхождением рассматриваемой популяции от небольшого числа предков (родоначальников) [5]. Ввиду неоднородности российской популяции и распространенности смешанных браков, выявление наиболее часто встречающихся мутаций, характерных для славянской популяции, является неточным методом с большой вероятностью ложно-отрицательных результатов (рис. 7). Подобный подход не исключает возможности ложно-отрицательного результата и, как следствие, неверной тактики профилактики и лечения рака молочной железы. Одним из примеров полноценного анализа BRCA1 и BRCA2 генов, представляющего собой полное секвенирование всех кодирующих

Рисунок 6. Увеличение риска рака груди и яичников при наличии мутации генов BRCA.

участков, является BRACAnalysis (1996), являющийся на данный момент «золотым» стандартом в диагностике BRCA-ассоциированного наследственного рака молочной железы и (или) яичников. Анализ BRACAnalysis оценивает риск развития наследственного рака груди и (или) яичников (РМЖ / РЯ) у женщины, основываясь на выявлении мутаций в генах BRCA1 и BRCA2. Важно отметить, что для того, чтобы достичь наибольшей чувствительно и не упустить ни одну клинически значимую мутацию, в основу теста легли два метода: секвенирование (секвенируется и анализируется весь ген полностью, а не отдельные его участки) и MLPA (метод мультиплексной лигазозависимой амплификации для анализ крупных внутригенных перестроек). Для обеспечения возможности полноценной интерпретации результатов теста BRACAnalysis понадобилось создать уникальную генетическую базу данных, насчитывающую в настоящее время порядка 16 тысяч мутаций, ассоциированных с наследственным РМЖ / РЯ. Следует отметить, что только при полном анализе всех возможных мутаций в BRCA1 и BRCA2 чувствительность теста превышает 98 %. Любое упрощение

Рисунок 7. Спектр мутаций в гене BRCA1 при РМЖ / РЯ в А) Московском регионе и Б) Республике Мордовия.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

53

Рисунок 8. Основная дилемма при диагностике наследственных опухолевых синдромов.

Рисунок 9. Ассоциация генов, включенных в панель myRisk (в столбик), с риском развития различных наследственных заболеваний (в строчку).

Рисунок 10. Диаграммы встречаемости мутаций у пациентов с наследственными опухолевыми синдромами.

методики исследования приводит к неминуемым потерям диагностически значимых мутаций. Новейший подход к выявлению риска развития наследственных опухолевых синдромов Рак имеет комплексную природу: в процессе развития участвуют несколько клеточных сигнальных путей. Поэтому необходимо исследовать глобальные уровни экспрессии генов и сигнальных путей в контексте оценки риска возникновения новообразо54

ваний. Как уже было отмечено ранее, мутации в BRCA1 и BRCA2 ассоциированы лишь с частью случаев РМЖ / РЯ; остальные случаи РМЖ / РЯ могут быть связаны с другими генами, например, MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EPCAM, PALB2, STK11, PTEN, ТР53, CDH1, ATM, BARD1, BRIP1, CHEK2, NBN, RAD51C, RAD51D. Возможности, появившиеся благодаря развитию медицинской генетики и молекулярной биологии, позволили более детально понимать влияние генетических особенностей и факто-

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

ров на процессы заболеваний (Ku et al., 2010). Данные обо всей последовательности генома, полученные с помощью технологий ДНК-секвенирования нового поколения, могут стать неоценимым источником информации для будущих врачей и патологов. В ходе полногеномных исследований в последние годы были идентифицированы несколько сотен риск-факторов для опухолевых заболеваний [13]. Открытие и изучение этих факторов позволяет глубже узнать природу заболеваний и создать новые стратегии лечения и предотвращения заболеваний. Также подобная информация поможет выяснить комплексную картину возникновения и эволюции рака [14–18]. Как было упомянуто выше, одно заболевание может вовлекать множество генов. Также важно отметить, что один ген может быть ассоциирован с множеством заболеваний (рис. 8). Например, мутации гена опухолевого супрессора TP53- наиболее распространены в опухоли и встречаются при раке молочной железы, яичников, желудка, толстого кишечника, поджелудочной железы и др. [10]. Это обстоятельство привело к новому подходу к диагностике наследственных раковых синдромов: созданию мультигенных панелей. Одна из таких принципиально новых уникальных диагностических систем — тест myRisk, который содержит панель из 25 генов (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, EPCAM, APC, MUTYH, CDKN2A, PALB2, STK11, PTEN, ТР53, CDH1, BMPR1A, SMAD4, ATM, BARD1, BRIP1, CDK4, CHEK2, NBN, RAD51C, RAD51D), связанных с восемью основными видами наследственного рака, включая меланому, рак молочной железы (гены BRCA1 и BRCA2), толстой кишки, яичников, эндометрия, поджелудочной железы, предстательной железы и желудка (рис. 9) [6]. Клинические исследования myRisk Как показано на рис. 10. Выборка пациентов с РМЖ / РЯ Был обследован 1 781 пациент с РМЖ и с ранее выявленной мутацией в генах BRCA1 и BRCA2. e-mail: medalfavit@mail.ru

Результат Тест myRisk показал, что у 32 % (244 мутации) обследованных больных были выявлены не являющиеся мутациями генов BRCA. Выборка пациентов с синдромом Линча (наследственный неполипозный рак толстой кишки) Были обследованы 1 260 пациентов с отягощенным семейным анамнезом по синдрому Линча. Результат Тест myRisk показал, что у 27 % (157 мутаций) обследованных больных, помимо мутаций в генах, ассоциированных с синдромом Линча, были другие мутации. Выборка пациентов с РЯ Были обследованы 648 пациентов с раком яичника. Результат Тест myRisk показал, что у 34 % (104 мутации) обследованных больных были обнаружены мутации, которые находятся за пределами генов BRCA или ассоциированных с синдромом Линча. Кроме того, были обследованы 1 260 пациентов с отягощенным семейным анамнезом по наследственному РМЖ / РЯ и с ранее выявленной мутацией в генах BRCA1 и BRCA2. Тест myRisk показал, что у 27 % обследованных больных, помимо мутаций в генах BRCA, были выявлены мутации, ассоциированные с наследственной формой рака толстой кишки [7]. Клинические исследования показали, что существуют значительные перекрытия между наследственными синдромами рака, например, между наследственным раком молочной железы и яичников и наследственным раком толстой кишки и синдромом Линча [6, 7]. Следует также подчеркнуть, что мутации в генах BRCA1 и BRCA2 связаны не только с повышенным риском развития РМЖ / РЯ, но также значительно повышают риск развития меланомы, рака предстательной железы, рака поджелудочной железы и рака кишечника [8, 9]. e-mail: medalfavit@mail.ru

Критерии для диагностики наследственных опухолевых синдромов и дальнейшие стратегические рекомендации Главная цель диагностики наследственных опухолевых синдромов — выявление мутаций предрасположенности к наследственным онкологическим заболеваниям. Своевременное выявление генного дефекта позволит здоровым носителям мутаций предотвратить образование опухоли либо диагностировать опухоль на ранних поддающихся лечению стадиях ее развития, когда сам пациент в силу бессимптомного течения заболевания не знает о его начале. Прохождение диагностического теста рекомендовано при: • наличии в семейном анамнезе двух и более родственников первой и второй степени родства, страдающих злокачественными новообразованиями; • раннем возрасте манифестации заболевания; • первичной множественности новообразований у пробанда или его родственников, специфические опухолевые синдромы. А также для диагностики синдрома РМЖ / РЯ: • если в семье было не менее трех случаев заболевания РМЖ или раком яичников; • есть РМЖ и рак яичников независимо от возраста на момент постановки диагноза; • если в семье среди близких родственников был хоть один случай двустороннего (билатерального) РМЖ; • если были случаи РМЖ у мужчин в семье; • если в семье были случаи РМЖ в возрасте до 45 лет; • если в семье была ранее выявлена мутация в генах BRCA1 и BRCA2. Медицинская организация при НОС Следует помнить, что наличие генетической предрасположенности не означает обязательного развития заболевания, а означает то, что человек относится к группе повышенного риска по тому или иному заболеванию, и ему необходимы

особенное диспансерное наблюдение специалиста и первичная профилактика. Зарубежные рекомендации включают применение определенных препаратов для профилактики развития рака груди, например, тамоксифен или гормональные препараты. Генетическая характеристика может дать больше информации для выбора оптимального и специфичного методов лечения. Женщины, у которых обнаруживаются мутации в генах BRCA1 и BRCA2, подвергаются регулярным обследованиям на предмет ранней диагностики РМЖ / РЯ. Сюда входят регулярные осмотры у врача-маммолога и проведение таких исследований, как маммография, УЗИ молочных желез и МРТ. Помимо классических методов обследования, носительницам мутаций в генах BRCA рекомендуется выполнение профилактических операций, направленных на удаление тканей молочной железы. Показано, что такие операции могут снизить не только риск развития рака молочной железы, но и в значительной степени рака яичников. В то время как проведение профилактических операций считается компонентом повседневной клинической практики во всем мире (в Америке риск развития рака, составляющий 25 %, считается достаточным для проведения профилактической мастэктомии), в России данная проблема связана с отсутствием критериев формирования групп риска населения, недостаточностью технического оснащения и экономическими обстоятельствами. Заключение Наследственные опухоли — единственная группа онкологических заболеваний, которые можно предсказать и предотвратить. Обнаружение мутации позволяет предпринять целый ряд профилактических мер, направленных на предотвращение или на максимально раннюю диагностику заболевания. Отличающийся спектр мутаций в различных этнических группах и этническая разнородность страны делают диагностику ПЦР-методами неточной. Направленность данных методов на конкретные участки гена (прицельная диагностика наиболее

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

55

распространенных мутаций в славянской популяции) упускает возможность обнаружить важные присущие отдельному этносу или менее распространенные мутации. Таким образом, полноценный анализ должен представлять собой полное секвенирование всех кодирующих участков генов, ассоциированных с тем или иным наследственным опухолевым синдромом. Своевременная диагностика таких мутаций позволит выявить группу пациентов и их родственников, которые могут избежать фатальных рисков развития новообразований, обнаружить наследственную онкологию на ранних стадиях, повлиять на выбор терапии и добиться излечения от страшного заболевания «рак». Список литературы 1. Каприн А. Д., Старинский В. В. Петрова Г. В. Злокачественные новообразования в России в 2012 году (заболеваемость и смертность). М., 2014. 131 c.

2. Lalwani N., Prasad S. R., Vikram R. et al. Histologic, molecular, and cytogenetic features of ovarian cancers: implications for diagnosis and treatment. // Ra diographics. — 2011. — V. 31. — P. 625–646.

56

3. Любченко Л. Н. Наследственный рак молочной железы и (или) яичников: ДНК-диагностика, индивидуальный прогноз, лечение и профилактика: дис. д-ра мед. наук / Любченко Людмила Николаевна. — М., 2009. — 281 с.

4. Lynch H. T., Snyder C., Lynch J. Hereditary breast cancer: practical pursuit for clinical translation. // Ann. Surg. Oncol. — 2012. — V. 19. — P. 1723–1731.

5. Ferla R., Calò V., Cascio S. et al. Founder mutations in BRCA1 and BRCA2 genes. // Ann. Oncol. — 2007. — V. 18 (Suppl. 6). — P. 93–98.

6. Saam J. et al., Evaluating the Personal and Family History Overlap Between Hereditary Cancer Syndromes. Presented at NCCN Annual Conference. March 2014.

7. Prevalence of Gene Mutations Among Hereditary Breast and Ovarian Cancer Patients Using a 25-gene Panel. Nadine Tung et al.

Presented at ACMG. March 2014.

Wilson R. K., Raphael B. J., Ding L. Presented at Nature. October 2013.

11. Имянитов Е. Н. Наследственный рак молочной железы. // Практическая онкология. 2010. Т. 11, № 4. С. 258–264.

12. База знаний по биологии человека http:// humbio.ru/humbio/genexp/000a954e.htm.

13. Teri A. Manolio, Lisa D. Brooks, and Francis S. Collins. A Hap Map harvest of insights into the genetics of common disease J. Clin.

Invest. 2008; 118 (5): 1590–1605. doi:10.1172/ JCI34772.

14. Chapman M. A. et al., Initial genome sequencing and analysis of multiple myeloma.

Nature. 2011 Mar 24; 471 (7339): 467–72. doi: 10.1038/nature09837.

15. Stransky N. et al., The mutational landscape of head and neck squamous cell carcinoma, Science. 2011 Aug 26; 333 (6046): 1157–60. doi: 10.1126/science.1208130. Epub 2011 Jul 28.

8. Multi-gene Panel Testing in Patients Suspected to Have Lynch Syndrome. Matthew B. Yurgelun et al. Presented at ASCO. June 2014.

16. Sohrab P. Shah et al., Mutational evolution in a lobular breast tumour profiled at single nucleotide resolution, Vol. 461. 8 October 2009. doi:10.1038/nature08489.

9. A study of Ovarian Cancer Patients Tested with a 25-gene Panel of Hereditary Cancer Genes. Lucy R. Langer et al. Presented at ASCO. June 2014.

17. Schweiger M. R. et al., The power of NGS technologies to delineate the genome organization in cancer: from mutations to structural variations and epigenetic alterations. Cancer Metastasis Rev. 2011 Jun; 30 (2): 199–210. doi: 10.1007/s10555–011–9278-z.

10. Mutational landscape and significance across 12 major cancer types. Kandoth C., McLellan M.D., Vandin F., Ye K., Niu B., Lu C., Xie M., Zhang Q., McMichael J.F., Wyczalkowski M. A., Leiserson M. D., Miller C. A., Welch J. S., Walter M. J., Wendl M. C., Ley T. J.,

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

18. John S. Welch et al., Use of Whole-Genome Sequencing to Diagnose a Cryptic Fusion Oncogene, JAMA. 2011; 305 (15): 1577–1584. doi:10.1001/jama.2011.497.

e-mail: medalfavit@mail.ru

e-mail: medalfavit@mail.ru

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

57

Н. А. Алхутова

Процедура валидации как инструмент расширения диагностических возможностей лаборатории на примере определения СA125 на анализаторе Access 2 и белка HE4 для расчета индекса ROMA при диагностике эпителиального рака яичников Часть 1. Актуальность и необходимость проведения процедуры валидации теста СА 125 для расчета индекса ROMA*

Н. А. Ковязина

М. П. Бояркина

Н. А. Алхутова, к. б. н., с. н. с лаборатории серологических исследований и аллергодиагностики отдела лабораторной диагностики¹ Н. А. Ковязина, к. м. н., зав. лабораторией серологических исследований и аллергодиагностики отдела лабораторной диагностики¹ М. П. Бояркина, врач-эндокринолог высшей квалификационной категории¹ Н. Н. Зыбина, д. б. н., гл. специалист по клинической лабораторной диагностике МЧС России, зав. отделом лабораторной диагностики¹ Н. М. Калинина, д. м. н., проф., гл. научный сотрудник отдела лабораторной диагностики¹ Т. А. Григорьева, к. м. н., зав. клинико-диагностической лабораторией² ¹ФГБУ «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А. М. Никифорова» (ВЦЭРМ) МЧС России, г. Санкт-Петербург ² Медицинский центр ОАО «Адмиралтейские верфи», г. Санкт-Петербург Validation procedure as tool of expanding laboratory diagnostic possibilities illustrated by examples of the determination of СA 125, Access 2 and protein HE4 in calculation of ROMA index under ovarian cancer diagnostics Part 1. Actuality and necessity of a validation procedure for the test СA 125 in ROMA index calculation

Н. Н. Зыбина

Н. М. Калинина

N. A. Alkhutova, N. A. Kovyazina, M. P. Boyarkina, N. N. Zibina, N. M. Kalinina, T. A. Grigorieva The All-Russian Centre for Emergency and Radiation Medicine n. a. A. M. Nikiforov, Medical Centre of ‘Admiralteiskie verfi’ Co., Saint-Petersburg, Russia

Резюме В настоящее время внедрены и широко используются различные методические и статистические инструменты для обеспечения надлежащего качества исследований, одним из которых является процедура валидации. Использование данной процедуры, несомненно, является шагом в сторону доказательной медицины и незаменимо в случае, если лаборатории в силу клинической необходимости требуется ввести в практику нестандартные новые методы исследования либо модифицировать стандартные методики. В первой части статьи представлен алгоритм проведения и обоснования процедуры валидации комбинации тестов: определения опухолевого антигена CA 125 на анализаторе Access 2 (Beckman Coulter, США) и белка HE4 (Fujirebio, Швеция) с целью расчета индекса ROMA. Ключевые слова: валидация, опухолевый антиген CA 125, белок НЕ 4, индекс ROMA. Summary Nowadays various methodical and statistical tools are applied and widely used to provide a proper quality of laboratory testing including such tool as a validation procedure. The use of the procedure is by all means a step forward to the evidence based healthcare and is indispensable when a laboratory needs either to apply unconventional and new testing methods or to modify standard methods due to some clinical demand. The first part of the article gives an algorithm of carrying out and substantiation of a validation procedure for the combination of tests СA 125 Access 2 (Beckman Coulter, USA) and protein HE4 (Fujirebio, Sweden) with the view of ROMA calculation.

Key words: validation, СA 125, НЕ 4, ROMA index.

Т. А. Григорьева

58

*Продолжение, части 2 и 3, читайте в следующих номерах.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

В

настоящее время остается актуальной проблема ранней диагностики рака яичников (РЯ), что стимулирует поиск новых, более чувствительных и специфичных методов исследования, в том числе лабораторных. В Европе смертность от рака яичников составляет 3,6–9,3 случая на 100 тысяч женщин и занимает четвертое место среди наиболее частых причин смерти женщин. Около 70 % вновь выявленных случаев РЯ представляют собой распространенный опухолевый процесс. Данное обстоятельство является причиной низкой пятилетней выживаемости больных РЯ (35 % для всех стадий) [1, 2, 4]. Рак яичников не имеет явно выраженных и специфичных симптомов, часто воспринимается как проявление аднексита и других неопухолевых заболеваний малого таза. В связи с этим главная задача диагностических процедур при выявлении образований в малом тазу — определение злокачественной или доброкачественной природы заболевания. Несмотря на то что большую часть выявленных случаев образований в малом тазу составляют доброкачественные опухоли, для правильного выбора тактики лечения очень важно до проведения оперативного вмешательства оценить риск наличия злокачественной опухоли [2, 16]. В этих целях традиционно используется диагностическая триада тестов: комбинация физического осмотра, определение уровня СA 125 в сыворотке крови и метод визуализации. Сравнительно недавно появился тест для определения опухолевого антигена HE4, который может дать дополнительную информацию о динамике опухолевого процесса при РЯ, тем более что, по мнению многих авторов, именно повышенная концентрация белка HE4 сегодня является наиболее точным лабораторным предиктором злокачественного процесса [2, 8]. HE4 (белок 4 эпидермиса человека) принадлежит семейству ингибиторов протеаз. Это кислый гликопротеин с четырьмя дисульфидными связями в ядре с предполагаемыми свойствами ингибитора трипсина. Ген НЕ 4 кодирует белок с молекулярной массой e-mail: medalfavit@mail.ru

20–25 кДа. Биологическая функция HE4 неизвестна. Предполагается, что он обладает антипротеазной и противовоспалительной активностью. Белок HE4 в небольших количествах присутствует в нормальном эпителии репродуктивных органов, верхних дыхательных путей и поджелудочной железы. Повышенная продукция белка выявлена при раке яичников и эндометрия, редко при распространенной форме аденокарциномы легких. Отдельные гистологические типы рака яичника, такие как герминогенные и мукоидные, редко экспрессируют HE4 [8, 9, 10, 11, 12, 13, 14]. Показано, что чувствительность определения белка HE4 для выявления РЯ (особенно на ранних стадиях заболевания) составляет 67 % при специфичности 96 %. При этом комплексное использование HE4 и СA 125 повышает диагностическую чувствительность до 76 % при сопоставимой специфичности. Применение комплекса HE4 и Ca125 позволяет снизить количество ложноположительных результатов лабораторного обследования по сравнению с использованием только одного СA 125 [2, 15]. Американскими учеными разработан алгоритм расчета риска злокачественных опухолей яичника (Risk of Ovarian Malignancy Algorithm, ROMA) у женщин с образованиями малого таза. Алгоритм учитывает значение концентраций белка HE4 и опухолевого антигена Ca125, а также менопаузальный статус пациентов [5]. Американская FDA (U. S. Food and Drug Administration) ограничила перечень тест-систем для определения СA 125, пригодных для расчета индекса ROMA [5, 6, 7]. Определить индекс ROMA можно, используя или открытую иммуноферментную систему фирмы Fujirebio HE4 и СA 125 (Fujirebio, Швеция) или закрытую систему Architect СA 125 и Architect HE4, (Abbott, США) со встроенной в анализатор компьютерной программой расчета индекса ROMA [5]. Таким образом, в случае, если лаборатория оснащена автоматическими анализаторами других производителей, то согласно указанному перечню, определение индекса ROMA

возможно только в ИФА-варианте с применением комбинации тестов Fujirebio HE4 и Fujirebio Ca125. Использование для расчета индекса ROMA комбинации Fujirebio HE4 и Fujirebio СA 125 несет определенные трудности. Оба теста выполняются в ручном варианте, что занимает более трех часов рабочего времени и диктует необходимость формировать группу для исследования по мере накопления пациентов, откладывая выдачу результатов на несколько дней. Ручной вариант выполнения тестов также приводит к увеличению общей аналитической ошибки за счет суммирования погрешностей аликвотирования, разведений, промывок, считывающих устройств, смены операторов и др. Система Architect позволяет минимизировать ошибки аналитического этапа, но является закрытой и требует установки дорогостоящего оборудования. До ст аточно узкий перечень тест-систем, пригодных по рекомендации FDA для расчета индекса ROMA, несомненно, ограничивает диагностические возможности пациентов и врачей-клиницистов. Возможной причиной формирования данного перечня является тот факт, что калибраторы для теста Architect СA 125 произведены волюметрически и соотнесены со стандартом, изготовленным компанией Fujirebio Diagnostics Inc. Тем не менее для расчета индекса ROMA FDA допускает расширение предложенного перечня тест-систем при условии проведения собственной процедуры валидации. FDA в этом случае рекомендует специалистам лабораторной диагностики на основании проведенного валидационного исследования с использованием рекомендованных производителем формул и данных о диагнозе и менопаузальном статусе пациентов самостоятельно определить критический уровень ROMA [5]. На основании вышесказанного сформулировали цель и задачи настоящего исследования. Цель исследования Оценить возможность использования комплекса тест-систем СA 125

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

59

Access 2 и HE4 Fujirebio для расчета индекса ROMA и расширения диагностических возможностей лаборатории. Задачи исследования 1. Выполнить собственную процедуру валидации тестов CA 125 Access 2 (Beckman Coulter, США) относительно теста Architect CA 125 (Abbott, США) в комбинации с тестом HE4 Fujirebio для расчета индекса ROMA. 2. Оценить изменение индекса ROMA в зависимости от установленного диагноза с учетом статуса мено Вывод первой части Проведение процедуры валидации возможно только при условии использования в лаборатории стандартизованных аналитических технологий, позволяющих получить аналитически, биологически и клинически достоверную информацию. Несомненно, что доступность таких технологий может рассматриваться как одно из средств расширения диагностических возможностей и обеспечения клинической безопасности пациентов [3].

Список литературы 1. Н о в и к о в а Е . Г . , Р о н и н а Е . А . , К о р н е ева И. А. Злокачественные опухоли яичников. // Онкология. Национальное руководство. Под ред. В. И. Чиссова, М. И. Давыдова. — М.: ГЭОТАР Медиа. — 2008 г. — С. 812–819.

2. Сергеева Н. С., Маршутина Н. В. Опухолеассоциированные маркеры в скрининговых программах, направленных на активное выявление рака яичников: реальность, проблемы и перспективы. // Практическая онкология. Проблемы скрининга в онкологии. — 2010. № 11 (2). — С. 110–119.

3. Стандартизация в клинической лабораторной медицине. Организационные и метрологические аспекты (под ред. В. В. Меньшикова). М.: Лабора — 2005 г. — С. 37–105.

4. Чиссов В. И., Старинский В. В., Петрова Г. В., ред. Злокачественные новообразования в России в 2009 году (заболеваемость и смертность). М. — 2011 г. — 259 с.

5. Algeciras-Schimnich A. A review of current serum markers and their clinical applications. // Clinical Laboratory News. — 2013. MAR. 1.

6. Baldwin L. M., Trivers K. F., Matthews B., et al. Vignette-based study of ovarian cancer screening: Do U. S. physicians report adhering to evidence-based recommendations? // Ann. Intern. Med. — 2012. 156. — P. 182–194.

7. Buys S. S., Partridge E., Black A., et al. Effect of screening on ovarian cancer mortality: The Prostate, Lung, Colorectal and Ovarian (PLCO) Cancer Screening Randomized Controlled Trial. JAMA. — 2011. 305. — P. 2295–2303.

8. Bouchard D., Morisset D., Bourbonnais Y. et al. Proteins with whey-acidic-protein motifs and cancer. // Lancet Oncol. — 2006. — Vol. 7. — P. 167–174.

9. Chan D. W., Booth R. A., Diamandis E. P. Tumor markers. In: Burtis CA, Ashwood ER, Bruns DE, eds. Tietz. // Textbook of Clinical Chemistry and Molecular Diagnostics. 4th ed. Philadelphia, PA: Saunders. — 2005. — P. 745–795.

10. Clarke5Pearson D. L. Screening for Ovarian Cancer. // N. Engl. J. Med. — 2009. — Vol. 361. — P. 170–177.

11. Drapkin R., von Horsten H. H., Lin Y. et al. Human epididymis protein 4 (HE4) is a secreted glycoprotein that is overexpressed by serous and endometrioid ovarian carcinomas. // Cancer Res. 2005. 65 — P. 2162–2169.

12. Galgano M. T., Hampton G. M., Frierson H. F. Comprehensive analysis of HE4 expression in normal and malignant humantissues. // Mod. Pathol. — 2006. — Vol. 19. — P. 847–853.

13. Gilks C. B., Vanderhyden B. C. Distinction between serous tumors of low malignant potential and serous carcinomasbased on global mRNA expression profiling. // Gynaecol. Oncol. 2005. — Vol. 96. — Р. 684–694.

14. Hellstrom I., Raycraft J., Hayden-LedbetterM. et al. The HE4(WFDC2) protein is a biomarker for ovarian cancer. // Cancer Res. 2003.

63. — P. 3695–3700.

15. Skates S. J., Menon U., MacDonald N. et al.

Calculation of the risk of ovarian cancer from serial СA 125 values for preclinicaldetection in postmenopausal women. // Clin.

Oncol. — 2003. — Vol. 21. Suppl. — P. 206–210.

16. Ueland F. R., Desimone C. P. , Seamon L. G., et al. Effectiveness of a multivariate index assay in the preoperative assessment of ovarian tumors. // Obstet. Gynecol. — 2011.

117. — P. 1289–1297.

Лабораторные исследования: точность диагностики — успех лечения 30 сентября 2015 года в рамках Российского конгресса лабораторной диагностики состоялось заседание «Комплексные решения для современной лаборатории». Мероприятие проводится по приказу Министерства здравоохранения Российской Федерации, Департамента здравоохранения г. Москвы, Министерства промышленности и торговли РФ и является значимым событием года в области лабораторной диагностики. Компания BD (Бектон, Дикинсон энд Компани) представила свои разработки для оптимизации деятельности клинических лабораторий.

О

решениях для преаналитического этапа в отделениях неотложной помощи сообщил заведующий кафедрой лабораторной диагностики ИПО БГМУ (г. Уфа), профессор, доктор медицинских наук Александр Жанович Гильманов. Он привел данные мировой статистики, согласно которым от 32 до 75 % лабораторных ошибок происходят на преаналитическом этапе, при этом около 34 % всех ошибок приходятся на процедуру взятия образцов биоматериала. Важной проблемой, стоящей перед специалистами клинической лаборатории, является точное определение микробного возбудителя при постановке диагноза и лечении пациентов с инфекционными процессами. Использование современных методик позволяет повысить качество диагностики, оптимизировать работу персонала, существенно снизить риск человеческого фактора при оценке результатов исследования. С этой целью специалистами компании BD была разработана автоматизированная микробиологическая лаборатория BD Kiestra WCA‑3. Ее важнейшим преимуществом стали высокая скорость и точность определения возбудителя уже на следующий день после получения образца, в то время как обычная микробиологическая лаборатория предоставляет антибиотикограмму примерно на 5–7-й

60

день. Об опыте использования BD Kiestra WCA‑3 в столичной ГКБ № 67 имени Л. А. Ворохобова рассказала заведующая микробиологической лабораторией Ольга Евгеньевна Орлова. Она сообщила, что обработка материала в автоматизированной системе происходит непрерывно, диагностика и назначение этиотропной терапии осуществляются быстрее, что позволяет повысить эффективность лечения. Повышение точности лабораторных исследований играет важную роль в диагностике опухолевых заболеваний крови, где методика проточной цитометрии в постановке диагнозов лейкозов и лимфом является наиболее информативной. Данной проблеме было посвящено исследование Н. Н. Тупицына, заведующего лабораторией иммунологии и гемопоэза централизованного клинико-лабораторного отдела НИИ КО ФГБУ «РОНЦ имени Н. Н. Блохина» Минздрава России и Л. Ю. Гривцовой, кандидата медицинских наук, старшего научного сотрудника лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ клинической онкологии РОНЦ имени Н. Н. Блохина «Диагностика острых лейкозов в соответствии с концепцией EUROFLOW». Эта общепризнанная в крупнейших гематологических центрах Европы и мира концепция зарекомендовала себя как мощный диагностический инструмент.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

e-mail: medalfavit@mail.ru

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

61

62

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

Изучение многофункциональной системы протеина С как маркера тяжести течения хирургической инфекции и нарушения гомеостаза при синдроме системной воспалительной реакции и сепсисе В. В. Егорова, с. н. с., к. м. н. М. И. Титова, проф., д. м. н. А. А. Звягин, проф., д. м. н. В. С. Демидова, д. б. н., зав. КДО Н. Г. Аскеров, с. н. с., к. м. н. ФГБУ «Институт хирургии имени А. В. Вишневского» Минздрава России, г. Москва Study of multi-functional protein C system as marker of severity of surgical infection and disturbance of homeostasis in systemic inflammatory response syndrome and sepsis V. V. Egorova, M. I. Titova, A. A. Zvyagin, V. S. Demidova, N. G. Askerov The Institute of Surgery n. a. A. V. Vishnevsky, Moscow, Russia

Резюме Работа посвящена исследованию значения системы протеина С и нарушений процессов гемостаза у больных с раневым процессом в критических состояниях при синдроме системной воспалительной реакции и сепсисе. Определение активности системы протеина С необходимо включать в программу гемостазиологического обследования больных с раневой инфекцией. Резкое падение уровня показателей системы протеина С является надежным маркёром определения тяжести течения хирургической инфекции и выявления сепсиса. Ключевые слова: гемостаз, свертывающая система, система протеина С, воспаление, хирургия раневого процесса, апоптоз, раневой процесс.

Р

аботы последнего времени показывают все большую значимость взаимодействия механизмов процессов воспаления, гемокоагуляции и эндотелиально-клеточной дисфункции для генерализации раневого процесса и трансформации его в сепсис [1, 6, 12, 18, 28]. При этом особое значение отводится изучению многофункциональной системы протеина С (ПрС), которая может влиять на целостность системы гомеостаза через процессы гемокоагуляции, фибринолиза, протеолиза и процессы воспаления [3, 4, 7, 13, 17]. Активно развивается представление о противовоспалительном и антиапоптическом действии системы ПрС на эндотелиальные клетки и макрофагальный барьер, а также о его протекторном действии при синдроме системной воспалительной реакции (ССВР) и сепсисе [9, 10, 16, 22, 24]. Открыты комплексные формы этого e-mail: medalfavit@mail.ru

Summary This paper is devoted to research of high impact of protein C system and role of violations of hemostasis processes in patients with wound healing process in critical conditions with syndrome of systematic inflammation reaction and sepsis. The study shows that analysis of protein C system activity should be included in the program of hemostasiological examination of patients with wound infection. The study justifies that sharp decline of protein C indicators is a reliable marker for determining the severity of surgical infection and one of the methods of sepsis detection.

Key words: hemostasis, blood coagulation, protein C system, inflammation, surgery wound healing process, apoptosis and wound process.

белка и липопротеидов очень низкой плотности у больных в критических состояниях, что важно учитывать при прогнозировании неблагоприятных исходов заболевания у тяжелых больных с раневым процессом [2, 14, 23, 25, 26]. Система ПрС включает в себя: • протеин С, который синтезируется в печени в неактивной форме и является витамин К-зависимой протеазой; • протеин S — кофактор ПрС; • тромбомодулин (ТМ) — трансмембранный протеин, локализованный на эндотелии; • эндотелиальный рецептор ПрС, располагающийся на эндотелиальных клетках; • С4-связывающий протеин (С4-CП), который ингибирует кофакторную функцию протеина S.

Схематически механизм действия ПрС представлен на рис. 1. Активация ПрС происходит, когда тромбин (Тр) связывается с ТМ, и в присутствии ионов Са ++ этот комплекс повышает активность ПрС. Будучи активированным в случае диссоциации от эндотелия и связывания с протеином S (ПрS), активированный ПрС (АПрС) в крови инактивирует факторы Va и VIIIа, что и предупреждает ранний этап тромбинообразования [5, 19, 21, 30]. Связывая Е-селектины эндотелиальных клеток, ПрС приводит к дозозависимому угнетению лейкоцитов в очаге воспаления [15, 26, 27]. АпрС, ингибируя образование тромбина, снижает вызванные тромбином воспалительные процессы, защищает эндотелий от повреждения, препятствует апоптозу эндотелиальных клеток и способствует их выживаемости [11, 19, 29].

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

63

Референсные значения НО для данного метода находятся в диапазоне от 0,7 до 1,3 ед. Показатели НО меньше 0,7 ед. свидетельствуют о значительных нарушениях в системе ПрС (сниженный синтез протеина С, протеина S, их функциональная неполноценность) или о наличии мутантного фактора V (Лейден), резистентного к действию ПрС.

Рисунок 1. Механизм действия протеина С.

Целью исследования явило сь изучение изменения активности системы ПрС для идентификации тяжести течения раневого процесса и развития нарушений гомеостаза при сепсисе. Материал и методы исследования Обследован 91 больной с хирургической инфекцией. Больные были подразделены на группы со средней и тяжелой формой течения раневого процесса. Активность системы ПрС исследовали коагулогическим методом по определению нормализованного отношения (НО). Для данного мето-

да использовались реактивы фирмы «РЕНАМ». Значения НО рассчитывали по формуле, указанной в инструкции к набору реагентов: НО =

(АЧТВакт / АЧТВ) больного (АЧТВакт / АЧТВ) нормы

× НОкалибр.

В основу формулы положены измерения АЧТВ больного, когда активация системы ПрС происходит под действием фракции яда щитомордника, что удлиняет время свертывания плазмы в тесте АЧТВ. НОка— нормализованное отношение либр. плазмы-калибратора приводится в инструкции к набору реагентов.

Таблица 1 Изменения показателей плазменного гемостаза при острой гнойной хирургической инфекции в зависимости от тяжести состояния больных Состояние больных Показатели гемостаза

Контрольная группа (доноры), n = 20

Средняя тяжесть, n = 17

Тяжелое состояние, n = 13

Фибринолитическая активность, мин.

212 ± 17,0

370,5 ± 3,41*

327,27 ± 9,83*

Фибриноген, г/л

2,4 ± 0,21

4,41 ± 0,15*

4,47 ± 0,23*

ХIII фактор, %

93,71 ± 19,62

82,75 ± 7,04

33,93 ± 2,24*

Тромбиновое время, с

18,3 ± 1,34

28,78 ± 1,14*

13,44 ± 0,92*

Антитромбин III, %

95,4 ± 2,13

67,89 ± 2,42*

52,12 ± 2,6*

Протромбиновый индекс, %

92 ± 2,04

76,67 ± 0,58*

68,38 ± 1,67*

Протеин С (НО), ед.

1,0 ± 0,3

0,86 ± 0,03

0,63 ± 0,03*

Примечание: * — указывает на достоверность различий по отношению к контрольной группе показателей, Р < 0,05.

64

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

Результаты и их обсуждение У пациентов с гнойной хирургической инфекцией исследованы показатели плазменного звена гемостаза, представленные в табл. 1. Полученные результаты показывают, что уровень снижения активности системы ПрС (НО) зависит от характера и тяжести течения раневого процесса. У больных при средней тяжести течения раневого процесса НО в среднем составил 0,86 ± 0,03 ед., что на 14 % ниже такового у доноров. Анализ активности системы ПрС у больных в тяжелом состоянии позволил выявить более резкое ее падение. Активность системы ПрС была снижена в 69 % наблюдений, среднее значение НО в этой группе составило 0,63 ± 0,03 ед., что на 37 % ниже по сравнению с этими показателями у доноров. Как показывают представленные данные, между двумя группами больных имеются различия по активности системы ПрС. Однако, если такие факторы гемостаза как фибриноген, фибринолитическая активность, антитромбин III быстро реагируют на возникновение гнойно-хирургической инфекции, то активность системы ПрС (НО) снижается постепенно: в соответствии с развитием органной недостаточности (наиболее часто печеночной); под воздействием токсических метаболитов, образующихся в ходе раневого процесса. У больных с трофическими язвами на фоне варикозного расширения вен (ВРВ), которые лечились в отделении ран, НО в среднем составило 0,96 ± 0,03 ед. У больных же с посттромбофлебитическим синдромом e-mail: medalfavit@mail.ru

(ПТФС) снижение активности было более выраженно и составило 0,72 ± 0,03 ед., что на 28 % ниже донорского уровня (р < 0,05). При этом критический уровень ПрС (НО) ниже 0,7 ед. был отмечен у больных с ВРВ только в трех из 32 случаев, в то время как у больных с ПТФС значения НО ниже критической цифры (0,7) встречались в 14 из 29 случаев. Эти данные указывают на то, что при ПТФС стенки венозных сосудов повреждены более значительно, что создает благоприятные условия для активации процесса тромбообразования. Мы установили, что резкое падение активности системы ПрС наблюдалось у реанимационных больных с тяжелым течением гнойной хирургической инфекцией с ССВР и при развитии сепсиса. Активность системы ПрС у этих групп больных снижалась на 45– 50 % уже в 1–2-е сутки нахождения их в отделении реанимации, что явилось новым дополнительным тестом для подтверждения клинико-лабораторной манифестации ССВР и сепсиса в клинике реанимационных больных. При системной воспалительной реакции, которая характерна для сепсиса, система ПрС истощается за счет увеличения его потребления (коагулопатия потребления) и нарушения синтеза этого антикоагулянта в гепатоците. Повреждение эндотелия приводит к нарушению активации и функции системы ПрС вследствие усиления экспрессии тромбомодулина и эндотелиального рецептора воспалительными цитокинами [15, 20, 27]. В итоге недостаточный уровень компонентов системы ПрС способствует развитию сосудистой и капиллярной дисфункции и развитию полиорганной недостаточности при манифестации синдрома диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС) и определяет неблагоприятный исход заболевания. Активированный ПрС является важным модулятором процесса свертывания и воспаления, сопровождающих течение сепсиса. Конверсия ПрС в активированный ПрС e-mail: medalfavit@mail.ru

Таблица 2 Изменение показателей гемостаза у больных с ХВН Показатели гемостаза

Контрольная группа (доноры, n = 20)

ВРВ (n = 32)

ПТФС (n = 29)

Фибринолитическая активность, мин.

212 ± 17,0

286 ± 12,6

301 ± 13,2

Фибриноген, г/л

2,4 ± 0,2

2,95 ± 0,2

2,86 ± 0,2

АЧТВ, с

32,0 ± 0,6

40,4 ± 2,3*

33,1 ± 2,1*

Фактор XIII,%

93,7 ± 19,6

105,2 ± 12,9*

75,4 ± 7,3*

Тромбиновое время, с

18,3 ± 1,3

20,2 ± 0,7

21,7 ± 1,03

Протромбиновый индекс,%

92 ± 2,04

69,3 ± 3,0

72,1 ± 2,8

Антитромбин III,%

95,4 ± 2,13

81,2 ± 8,9

82,0 ± 8,5

Протеин С (НО), ед.

1,0 ± 0,3

0,96 ± 0,03*

0,72 ± 0,03*

Примечание: * — достоверное различие показателей между группами больных ВРВ и ПТФС, Р < 0,05.

Рисунок 2. Механизм действия активированного протеина С при тяжелом сепсисе.

при сепсисе уменьшается [9, 16, 23]. На рис. 2. отражена концепция механизма действия активированного ПрС в модулировании системных, воспалительных, прокоагулянтных и фибринолитических реакций организма на инфекцию. Клинические исследования показывают, что для больных сепсисом, вызванным различными микроорганизмами, типично наличие дефицита компонентов системы ПрС. При этом низкий уровень ПрС часто коррелирует с неблагопри-

ятным исходом тяжелого течения сепсиса и септического шока, оставаясь стойко низким [5, 8, 22, 28]. У больных с сепсисом с благоприятным исходом заболевания нормализация активности системы ПрС отмечается к 7–10-му дню лечения на фоне патогенетической проводимой интенсивной терапии [6, 8, 14]. Коррекция ПрС обычно осуществляется переливанием донорской плазмы, гепатопротектеров с использованием «малых доз» гепарина

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

65

по КаККаr и низкомолекулярного гепарина (фраксипарин, клексан) [12, 13, 28]. Антикоагулянты непрямого действия (варфарин, фенилин) противопоказано использовать у этой группы больных при низком уровне протеина С, так как их использование истощает исходно низкое содержание протеина С и способствует усилению развитию повторных рикошетных тромбозов [6, 21]. При лабораторной и клинической диагностике ДВС синдрома у септических больных и при ССВР необходимо обязательно включать в показатели коагулограммы определение активности системы протеина С и ее компонентов, как маркера тяжести течения хирургической инфекции и нарушения процессов гемостаза и гомеостаза. Выводы Изучение изменения активности системы ПрС у больных с раневой инфекцией представляет практический интерес для диагностики нарушений свертывающей системы крови, оценки тяжести состояния пациентов, прогноза развития ССВР и сепсиса. Определение активности системы протеина С необходимо включать в программу гемостазиологического обследования больных с раневой инфекцией как надежный маркер определения тяжести течения хирургической инфекции, выявления ССВР и сепсиса. Список литературы 1. Амирасланов Ю. А. «Изменение факторов общего и местного гемостаза и их коррекция у больных с гнойной хирургической инфекцией». Автореферат дис. канд. мед. наук, М. 1978.

2. Галстян Г. М., Берковский А. Л., Васильев С. А., Дрожжин А. А., Сергеева Е. В. «Влияние активированного протеина С на систему гемостаза при сепсисе». «Инфекция в хирургии», 2004, т. 2, № 4, с. 7–13.

5. Егорова В. В., Титова М. И., Демидов а В . С . А м и р а с л а н о в Ю . А . , А с к е ров Н. Г. Звягин А. А., Назаренко Н. А., Берковский А. А. «Современные методологические аспекты лабораторной диагностики системы протеина С и значение ее исследования в хирургии». Современная лаборатория, 2013, № 3 (16), с. 12–17.

17. Esmon C. T. Protein C: biochemistry, physiology and clinical implications. Blood, 1983, № 2. p. l155–1158.

6. Егорова В. В., Звягин А. А., Титова М. И., Демидова В.С «Изменения уровня протеина С при оценке тяжести течения раневого процесса у больных с хирургической инфекцией». Сборник материалов II Международного конгресса «Раны и раневые инфекции» 2014, с. 131–133.

20. Esmon C. T. Inflammation and activated protein C anticoagulant pathway. Semin.

Thromb. Haemost., 2006, № 1, p. 49–60.

7. Ена Я. М., Платонова Т. Н., Сушко Е. А. и др. «Биологическая роль и клиническое значение протеина С». «Врачебное дело», 1992, № 6, с. 20–25.

8. Ерин Д. Н. «Роль снижения уровня протеинов C, S и антитромбина III при инфекционно-септическом ДВС-синдроме и коррекция их дефицита криосупернатантом». Автореферат дис. канд. мед. наук. Барнаул. 1999, 26 с.

9. Макарова А. М. «Протекторное действие активированного протеина С при воспалении и репарации тканей». Автореферат дис. канд. мед. наук., М. 2007.

10. Струкова С. М. «Роль тромбоцитов и сериновых протеиназ в сопряжении свертывания крови и воспаления». «Биохимия», 2004, т. 69, с. 1314–1331.

11. Суханов В. А. «Воспалительный коагуляционный ответ как часть синдрома системной воспалительной реакции (SIRS)». «Интенсивная терапия», 2006, № 1.

12. Титова М. И., Руднева В. Г., Земляной А. Б., «Программы лабораторной диагностики нарушений системы гемостаза при гнойной хирургической инфекции и пути их медикаментозной коррекции». Гл. № 23 в кн. «Избранный курс лекций по гнойной хирургии». Миклош М., 2008.

13. Титова М. И., Амирасланов Ю. А., Земляной А. Б., Доронина Л. П., Руднева В. Г., Егорова В. В., Демидова В. С., Аскеров Н. Г. «Программы антитромботической коррекции нарушений системы гемостаза при гнойной хирургической инфекции в до- и послеоперационном периоде». «Вестник национального медико-хирургического центра им. Н. И. Пирогова», 2013, т. 8, № 2, с. 119–124.

19. Esmon C. T. The protein C pathway. Chest; 2003, 124 (3 Suppl): 26s‑32s.

21. Griffin J. H., Fernandez J. A., Gale A. J. et al.

Activated protein C. J. Thromb. Haemost., 2007, № 1, p. 73–80.

22. Grinnell B. W., Joyce D. “Recombinant human activated protein C: a system modulator of vascular function for treatment of severe sepsis”. Crit. Care Med., 2001, Vol. 29, № 7, p. 53–61.

23. LaRosa S. P. Vincent J. L., Bellomo R. et al.

Baseline characteristics of patients enrolled in the phase III trial of rh/YPC in severe sepsis.

Crit. Care Med., 2000, 28, A48.

24. Mosnier L. O., Zlokovic B. V., Griffin J. H. The cytoprotective protein C pathway. Blood.

2007, № 109, p. 3161–3172.

25. N e v r i n c k A . P . , K a t h l e e n D . L i u , James P. Howard and Michael A. Matthay.

Protective mechanisms of activated protein C in severe inflammatory disorders.

British J. Pharmacology 2009, vol. 58, 34, p.

1034–1047.

26. Rezaie A. R. Regulation of the protein C anticoagulant and anti-inflammatory pathways.

Curr. Med. Chem., 2010, № 17, p. 2059–2069.

27. Sarangi P. P. , Lee H. W., Kim M. Activated protein C action in inflammation. Br. J. Haematol., 2010, vol. 48, № 6, p. 817–833.

28. Vincent J. L., Dhainant J. F., LaRosa S.P. et al.

Effect of baseline Protein C, antithrombin and IL‑6 levels on the mortality reduction associated with recombinant human activated protein С in patients with severe sepsis. Am. J. Resp. Crit. Care Med., 2001, № 163, A17.

29. Weiler H. Multiple receptor-mediated functions of activated protein C. Haemostaseologie. 2011, № 31, p. 185–195.

30. Yan S. B., Grinnell B. W. Antithrombotic and anti-inflammatory agents of the protein C anticoagulant pathway. Ann. Rep. Med. Chem., 1994, vol. 11, p. 103–112.

14. Barie P. S., Hydo L. J., Shou J. et al. Efficacy of therapy with recombinant human activated protein C of critically ill surgical patients with infection complicated by septic shock and multiple organ dysfunction syndrome.

Surg. Infect. (Larchmt). 2011, vol. 12, № 6, p. 443–449.

3. Доронина Л. П. «Принципы современной профилактики и коррекции тромботических осложнений в комплексном лечении больных с гнойной хирургической инфекцией». Автореферат дис. канд. мед. наук, М. 2006.

15. Bouwens E. A. Stavenuiter F. L. O. Mechanisms of anticoagulant and cytoprotective actions of protein C pathway.

J. Thromb. Haemost. 2013, Jun; Suppl. 1, p. 242–253.

4. Егорова В. В. «Клиническое значение определения Протеин С — зависимых нарушений гемостаза у хирургических больных». Автореферат дис. канд. мед. наук, М. 1989, 25 с.

16. Dhainaut J. F. Yan S. B., Carion A et al. Sjluble thrombomodulin, plasmaderived unactivated protein C and recombinated human activated protein C in sepsis. Crit. Care Med., 2002, vol. 30, № 5, p. 318–324.

66

18. Esmon С. Т., Fuku dome K. Mather T. еt al.

Inflammation, sepsis and coagulation. Haematologica, 1999, vol. 84, p. 254–259.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

Иммунологическая оценка гемодилюции костного мозга при лабораторных исследованиях (на основании теста М. Локен) Л. Ю. Гривцова, к. м. н., с. н. с. лаборатории иммунологии гемопоэза Н. Н. Тупицын, д. м. н., проф., зав. лабораторией иммунологии гемопоэза ФГБУ «Российский онкологический научный центр имени Н. Н. Блохина» Минздрава России, г. Москва Immunologycal detection of hemodilution in bone marrow aspirates (based on M. Loken’s test)

Л. Ю. Гривцова

L. Yu. Grivtsova, N. N. Tupitsin Federal State Budgetary Institute “N. N. Blokhin Cancer Research Center” under Ministry of Health Russian Federation Резюме Костный мозг является основным объектом лабораторных исследований в онкогематологической практике. Точность лабораторных исследований, в частности, оценка пропорции малых клеточных популяций (клетки-предшественники, остаточная опухоль в процессе лечения) зависит от степени разбавления диссоциированных клеток костного мозга клетками периферической крови. Степень гемодилюции может быть оценена иммунологически с использованием методов проточной цитометрии и моноклональных антител к антигену CD16b. Антиген гиперэкспрессирован на клетках гранулоцитарного ростка периферической крови, тогда как созревающие клетки гранулоцитарного / миелоидного ростков в костном мозге демонстрируют слабую экспрессию маркера. Выявление гемодилюции и внесение соответствующих поправок позволят повысить степень достоверности результатов.

Summary The bone marrow is a mean subject of research in oncogematology. The results of accurately estimation and enumeration of small cells population (progenitor cells, cells of minimal residual disease, blasts) may be dependent on dilution of bone marrow with peripheral blood. Hemodilution is measured by flow cytometry using intensity of CD16b. Expression of antigen distinguishes mature neutrophils and maturating granulocytic cells. Detecting hemodilution reduces variability introduced in results and make a measurement of rare cell population more precious.

Ключевые слова: костный мозг, периферическая кровь, клетки-предшественники, проточная цитометрия.

Key words: bone marrow, peripheral blood, progenitor cells, flow cytometry.

Введение Результаты исследования костного мозга зависят от множества различных факторов на всех этапах анализа и пробоподготовки, потому необходимо стандартизовать каждый этап и минимизировать влияние причин, искажающих результаты исследований. Одной из серьезных проблем в случае характеристики клеток костного мозга является разбавление диссоциированных клеток костного мозга зрелыми элементами периферической крови. Массивное загрязнение образца кровью не позволяет провести точный количественный анализ клеточного состава образцов костного мозга, существенно снижает статистическую значимость анализа и его информативность при патологических состояниях. Основной параметр анализа аспиратов костного мозга — это пропорция незрелых клеток в образце. При микроскопическом исследовании оценивается пропорция незрелых / бластных форм по отношению к ядросодержащим клеткам, подсчет проводится, как правило, на 500 клеток и менее [1]. При использовании метода проточной цитометрии оценка клеток-предшественников проводится на основании иммунологического фенотипа и характеристик светорассеяния [2, 3]. Обсуждение и результаты При подсчете миелограммы костного мозга проблемы гемодилюции можно избежать путем оценки клеточного состава костного мозга на щетке мазка, где отчетливо e-mail: medalfavit@mail.ru

выражена морфологическая структура и хорошо представлены все элементы костного мозга. В случае проточной цитометрии, когда оценивается вся клеточная популяция, и часто анализируются большие объемы образца, поправка на гемодилюцию необходима. Проблема разведения костного мозга периферической кровью может быть несущественной, например, при первичной диагностике гемобластоза в случае выраженной пропорции бластов, если речь идет о лейкозе или опухоль-трансфомированных лимфоидных элементах в случае поражения костного мозга при лимфомах. Гемодилюция принципиальна в случае характеристики малых клеточных популяций костного мозга. Особенно это касается случаев оценки количества клеток-предшественников [4], выявления минимальной остаточной болезни (необходима качественная и количественная оценка именно клеток костного мозга) и характеристики диссеминированных опухолевых клеток, когда необходима точная уверенность в том, что исследуются клетки костного мозга, а не периферической крови. На факт разбавления костного мозга периферической кровью обратили внимание довольно давно, так еще в 1974 году французскими учеными был детально проанализирован гранулоцитарный росток нормального костного мозга в зависимости от объема получаемого аспирата [5]. При объеме образца менее 1 мл миелоидный росток костного мозга демонстрирует нормальный состав.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

67

Таблица 1

Рисунок 1. Увеличение пропорции полиморфноядерных клеток (прерывистая линия) и снижение числа клеток-предшественников (сплошная линия) в образцах костного мозга по мере увеличения объема образца (ось ординат: количество клеток; ось абсцисс: объем образца) [5].

Рисунок 3. Интенсивность экспрессии антигенов CD13 (сиреневая линия) и CD16b (зеленая линия) в ходе созревания нейтрофилов Экспрессия CD13 наиболее выражена на этапе ранних предшественников, практически отсутствует на уровне миелоцитов, промиелоцитов и постепенно нарастает до ярких уровней на палочкоядерных нейтрофилах. Экспрессия CD16b характерна только для зрелых нейтрофилов и отсутствует на этапе ранних предшественников.

Рисунок 2. Пример стандартной миелограммы лаборатории иммунологии гемопоэза. Образец аспирата костного мозга, разбавленного периферической кровью.

Абсолютно четко показано, что при увеличении объема образца костного мозга количество гранулоцитарных предшественников пропорционально снижается, тогда как число зрелых нейтрофилов возрастает (рис. 1). Данный факт находит отражение в индексе созревания нейтрофилов при оценке стандартной миелограммы (рис. 2). Кроме индекса созревания нейтрофилов, то есть соотношения незрелых и полихроматофильных нейтрофилов, который в норме должен быть не меньше 0,5, факт разбавления в миелограмме отражает также лейко-эритробластическое соотношение. Однако необходимо комплексно оценивать состав миелограммы в отношении 68

количества нормобластов и учитывать клеточность образца, поскольку изменение соотношения может оказаться истинным и отражающим патологические процессы (высокая клеточность, присутствие незначительного количества нормобластов) и относительным, характеризующим наличие примеси крови (отсутствие нормобластов, невысокая клеточность, схожая с периферической кровью). Для оценки контаминации образца костного мозга периферической кровью и соответственного правильного подсчета клеточности костного мозга предложены несколько иммунологических подходов. Основой является различие профилей антигенов клеточной мембраны зрелых элементов периферической крови и созревающих элементов костного мозга (табл. 1) [6]. При изучении миелоидного ростка костного мозга методом проточной цитометрии с использованием широкой панели моноклональных антител оптимальными в отношении характеристики различий зрелых и незрелых клеток миелоидного ростка оказались только две молекулы: CD13 и CD16b. Спектр экспрессии данных антигенов в отношении созревающих клеток миелоидного ряда позволял различать миелоидные предшественники и зрелые нейтрофилы по интенсивности флуоресцентного сигнала; оба антигена демонстрировали яркую экспрессию на зрелых клетках. Но часть ранних миелоидных предшественников также экспрессируют CD13 достаточно ярко (рис. 3).

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

Таблица 2

Рисунок 4. Экспресcия различных клонов анти-CD16 моноклональных антител на клетках периферической крови: а) клон В73.1 экспрессирован на популяции NK-клеток (антиген-позитивные клетки выделены красным, остальные лимфоциты зеленым цветом); б) клон 3G8 демонстрирует одинаково яркую экспрессию на части NК-клеток (выделены красным) и на зрелых нейтрофилах (обведены синим) [4, 8].

Поэтому оптимальным для определения примеси периферической крови является антиген CD16b. Молекула представляет собой низкоаффинный FCR III рецептор. Существуют две изоформы антигена, выявляемые различными антителами, и это принципиальный момент в отношении использования данного антигена для оценки гемодиллюции (табл. 2). Изоформа NA‑1 наиболее специфична для лимфоцитов, тогда как антитела изоформы NA2 — доминанта гранулоцитарного ростка [7]. С точки зрения выявления разбавления костного мозга, необходимо выявлять вторую изоформу и подбирать соответствующий клон анти-CD16b моноклональных антител. Моноклональные антитела к антигену CD16b клона B73.1 (рис. 4 а) выявляют лимфоциты и практически не экспрессируются на клетках гранулоцитарного ростка, а антитела клона 3G8 (рис. 4 б) имеют необходимую специфичность и ярко экспрессированы на полихроматофильных нейтрофилах. На основании факта экспрессии CD16 М. Loken и соавт. предложили оригинальный и очень простой способ нормализации состава костномозговых пунктатов с учетом гемодилюции при подсчете клеток-предшественников [8]. Авторами исследования был проанализирован состав гранулоцитарного ростка трепанобиоптатов (рис. 5 A, B) и аспиратов костного мозга (онкогематологические больные, рис. 5 E, F), и данные по экспрессии CD16 сопоставлены с образцами периферической крови на 33 образцах здоровых доноров (рис. 5 C, D). В образцах трепанобиоптатов процент CD16++-клеток составил менее 20,0 %, а в пунктатах превышал 40 %. В периферической крови практически все клетки гранулоцитарного ростка демонстрировали очень выраженную экспрессию CD16 (CD16++). При детальном анализе 33 образцов трепана (рис. 6 A) и аспиратов костного мозга онкогематалогических больных установлен пороговый уровень, отражающий факт разбавления: 30,0 % CD16++-клеток. Важно, что более 70,0 % аспиратов содержат больше 38 % CD16++-гранулоцитов, то есть являются разбавленными ПК (рис. 6 B). Известно, что нормальный костный мозг содержит в среднем 17,0 % зрелых нейтрофилов, все остальное (80–83 %) — созревающий миелоидный росток (рис. 7). e-mail: medalfavit@mail.ru

Рисунок 5. Сопоставление экспрессии антигенов CD13 и CD16 на образцах трепанобиоптатов (A, B), аспиратов костного мозга (C, D) и периферической крови (E, F), подтверждающее мономорфную экспрессию CD16 нейтрофилами периферической крови [8].

На образцах доноров при разведении костного мозга в определенной пропорции периферической кровью продемонстрировано пропорциональное снижение количества незрелых нейтрофилов в зависимости от разбавления [8]. С учетом данных исследований при подсчете количества клеток-предшественников была предложена простая формула поправки на разбавление костного мозга периферической кровью с учетом интенсивности экспрессии CD16b антигена: 80,0 % × число клетокпредшественников Процент клеток со слабой экспрессией CD16 (CD16 dim)

=

нормализованное количество клетокпредшественников

При сопоставлении различных клонов моноклональных антител на одном и том же образце неразбавленного костного мозга предпочтительным выбран клон NKP15 (рис. 8). Это подтверждено при сопоставлении уровней экспрессии различных клонов анти-CD16 МКА на клетках периферической крови и неразбавленного (морфологически подтверждено) костного мозга (рис. 9).

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

69

Рисунок 8. Cопоставление экспрессии различных клонов анти-CD16b моноклональных антител клетками гранулоцитарного ростка (выделено красным) в образцах аспиратов костного мозга (опыт лаборатории иммунологии гемопоэза РОНЦ имени Н. Н. Блохина). Оптимальными выбраны моноклональные антитела клона NKP‑15.

Рисунок 6. Сопоставление экспрессии CD16 антигена на клетках трепанобиоптатов (A) и аспиратов (B) костного мозга онкогематологических больных для выявления порогового критерия разбавления костного мозга клетками периферической крови [8].

Рисунок 9. Сопоставление экспрессии анти-CD16b NKP‑15 клона на клетках периферической крови и аспирата костного мозга онкогематологических больных (опыт лаборатории иммунологии гемопоэза РОНЦ имени Н. Н. Блохина).

Рисунок 7. Демонстрация на примере образцов доноров снижения пропорции клеток костного мозга со слабой экспрессией CD16 (CD16dim) по мере разбавления образца периферической кровью. Образец А — разведение костного мозга периферической кровью 1 : 5, образец В — 1 : 10, образец С — 1 : 20 и образец D — 1 : 40. Количество CD16dim клеток снижалось равномерно от 64,0 до 23,0 % [8].

Необходимо отметить, что оценка степени разбавления костного мозга важна не только при цитометрической оценке количества клеток МОБ или предшественников / бластов в случае, например, постановки диагноза МДС [9]. Важно это и при молекулярных исследованиях, поскольку примесь клеток крови может привести к ложно-негативным результатам.

Заключение В условиях современной клиники поправка на гемодилюцию чрезвычайно важна. Особенно это может сказаться на подсчете клеток — предшественников костного мозга в случае оценки количества клеток минимальной остаточной болезни (МОБ) при острых лейкозах. В данных случаях результаты лабораторных исследований непосредственно влияют на тактику дальнейшего лечения больного. Так, например, при оценке МОБ в пунктате костного мозга выявлено 0,005 % В-линейных предшественников. Но если пропорция незрелых нейтрофилов (CD16 dim) составляет только 30,0 % (то есть костный мозг разбавлен), тогда при пересчете с поправкой на гемодилюцию случай из негативных перейдет в МОБ-позитивный (80,0 %/30,0 % × 0,005 = 0,02), и количество остаточных опухолевых клеток составит 0,02 %.

Список литературы 1. Swerdlow S., Campo E., Harris N. L., et al. // WHO Classification of Tumors of Hematopoietic and Lymphoid Tissues. Lyon: IARC, 2008.

2. Л. Ю. Андреева, Н. Н. Тупицын. // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии, 2002, т. 1, № 1, с. 60–65.

3. Л. Ю. Андреева, Н. Н. Тупицын / Пособие для врачей. Определение периферических стволовых кроветворных клеток. // Москва. 2003.

4. Loken M., Wells D. A. // Haematopoiesis Immunol. — 2010, V. 1. — p. 8–22.

5. Dresch C., Faille A., Poierier O., et al. // J. Clin. Path. — 1974. — V27. — p. 106–108.

6. Loken M., Wells D. A. /Normal antigen expression in hematopoiesis: Basis for immunophenotyping of interpreting leukemia phenothypes.

In Steward C., Nicholson J., eds Immunophenothyping. // NY: Wiley Liss, Inc.; 2000; p. 133–160.

7. Schmidt R. E., Perussia B. // In Leucocyte thyping IV (ed W. Knapp et al.). — Oxford. — 1989. — P. 575–577.

8. Loken M. R., Chu S. C., Fritsche W., et al. — Cytometry B Clin. Cytom. — 2008. — V76B. — p. 27–36.

9. Van de Loosdrecht A., Alhan C., Bene M. C., et al. // Haematologica. — 2009. — V.94. — p. 1124–1134.

70

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

e-mail: medalfavit@mail.ru

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

71

Корреляция между показателями перекисного окисления липидов и выраженностью цитолитического синдрома у больных хроническими заболеваниями печени О. В. Разваляева

О. В. Разваляева, к. м. н. И. В. Родионова, к. м. н. В. В. Скворцов, д. м. н., доцент ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» (ВолгГМУ) Минздрава России, г. Волгоград Correlation of parameters of lipid peroxidation and severity of cytolytic syndrome in patients with chronic liver disease

И. В. Родионова

O. V. Razvalyaeva, I. V. Rodionova, V. V. Skvortsov The Volgograd State Medical University, Volgograd, Russia

Резюме Обследовано 30 здоровых лиц и 48 больных гепатитом. Показано, что показатели ПОЛ и АОЗ коррелируют с маркерами цитолитического синдрома. Ключевые слова: гепатит, перекисное окисление липидов, цитолиз.

В. В. Скворцов

Цель работы Выявление степени корреляции между показателями перекисного окисления липидов (ПОЛ) и выраженностью цитолитического синдрома для диагностики хронических заболеваний печени и возможности контроля эффективности проводимой терапии. Материалы и методы Согласно современным концепциям, одним из универсальных механизмов повреждения и гибели клеток являются процессы перекисного окисления липидов. ПОЛ — цепная свободнорадикальная реакция окисления липидов с образованием перекисей, кетонов, альдегидов. Активатором перекисного окисления служат активные формы кислорода. Под АФК понимают продукты его восстановления (супероксид-анион O2•, перекись водорода H2O2, гидроксильный радикал НО• и синглетный кислород 1O2), образующиеся при окислительно-восстановительных 72

Summary 30 healthy persons and 48 patients with chronic hepatitis were examinated. It was established, that parameters of lipid peroxidation and severity of cytolytic syndrome in theese patients are strongly correlated.

Key words: hepatitis, lipid peroxidation, cytolysis.

процессах в организме. Наиболее агрессивны гидроксильный радикал и синглетный кислород. Гидроксильный радикал с очень высокой скоростью реагирует практически со всеми макромолекулами клетки, включая ДНК, белки, липиды и углеводы (константа скорости окисления липидов для НО• составляет 109М‑1с‑1, что в 106 раз выше, чем для O2• и H2O2). Радиационно-химические исследования, проведенные в последние годы, показали, что супероксид-анион в водных растворах не очень реакционно-активен и дает ограниченный оксидантный эффект. Основным субстратом перекисного или свободнорадикального окисления являются полиненасыщенные жирные кислоты клеточных мембран, особенно легко окисляются ненасыщенные ацильные остатки фосфолипидов. На начальных этапах ПОЛ появляются диеновые коньюгаты, гидроперекиси липидов обнаруживаются на более поздних этапах перекисного окисления и, наконец, малоновый диальдегид — один из наиболее важных конечных продуктов.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

В первые часы окисления гидроперекиси составляют 98 % всех продуктов окисления. Первичные продукты, обладающие поглощением при длине волны 233 нм, являются диеновыми соединениями (молекулы с двумя сопряженными двойными связями), и обнаружение диеновой коньюгации может быть чувствительным тестом на появление гидроперекисей. Таким образом, перекиси липидов представляют собой высокотоксичные соединения, вызывающие денатурацию белков, подавляющие активность ферментов и изменяющие их субстратную специфичность, тормозящие гликолиз и цикл трикарбоновых кислот и разобщающие окислительное фосфорилирование. Кроме того, они нарушают активный транспорт ионов и внутриклеточную компартментализацию, в частности, распад лизосом с выходом лизосомальных ферментов в клетку, что ведет к ее лизису, разрушению, гемолизу, торможению клеточного деления и гемопоэза, способствуют накоплению биологически инертных полимеров. e-mail: medalfavit@mail.ru

Результаты У больных с хроническими заболеваниями печени наблюдается значительное достоверное повышение продуктов ПОЛ по сравнению со здоровыми лицами: МДА на 164,9 % (р < 0,05) и ДК на 37,8 % (р < 0,05). При изучении показателей антиоксидантной защиты у здоровых лиц и больных хроническими заболеваниями печени наблюдается снижение активности СОД на 27,8 % (р > 0,05), каталазы на 16,9 % (р > 0,05), ГП на 26,9 % (р < 0,05). Для определения степени пролиферации соединительной ткани в печени и выраженности цитолитического синдрома исследовалась активность NAG-фермента лизосом, маннозосодержащий кислый гликопротеид. Отмечается повышение активности общей NAG у больных с хроническими заболеваниями печени на 154,7 % (р < 0,05) по сравнению со здоровыми лицами. Обращают на себя внимание высокие уровни высокоспецифичных печеночных ферментов: уроканиназы и гистидазы, которые составили соответственно 1,12 ед. и 0,94 ед. (при норме 0 ед.)., повышение фруктозо‑1-фосфатальдолазы на 113,3 % (р < 0,05) по сравнению со здоровыми лицами.

e-mail: medalfavit@mail.ru

Таблица 1 Показатели цитолитического синдрома у здоровых лиц и больных хроническим гепатитом Данные здоровых лиц (n = 30), M ± m

Данные больных с ХАГ (n = 48), M ± m

Уроканиназа, ед.

0

1,12 ± 0,13

–

Гистидаза, ед.

0

0,97 ± 0,12

–

Фруктозо‑1-фосфат альдолаза, ед.

0,60 ± 0,03

1,28 ± 0,14*

113,3

NAG, нмоль/мл/мин.

9,67 ± 1,26

24,63 ± 2,73*

154,7

Показатель

Процентное соотношение,%

Примечание: * — достоверные изменения (р < 0,05). Таблица 2 Показатели ПОЛ и АОЗ у здоровых лиц и больных хроническим гепатитом Показатель

Данные здоровых лиц (n = 39), M ± m

Данные больных с ХАГ (n = 48), M ± m

Процентное соотношение,%

МДА, мкмоль/л

5,78 ± 0,27

15,31 ± 1,30*

164,9

ДК, ед/мл

0,82 ± 0,03

1,13 ± 0,04*

37,8

СОД, ед/мл

2,12 ± 0,25

1,53 ± 0,15*

27,8

ГП, мкмоль/мл/мин.

1,86 ± 0,17

1,36 ± 0,13*

26,9

Каталаза, мкмоль/мл/мин.

19,80 ± 0,64

16,45 ± 0,80*

16,9

Примечание: * — достоверные изменения (р < 0,05).

Выводы Уровень активности органоспецифических ферментов печени — уроканиназы, гистидазы, фруктозо‑1-фосфатальдолазы, трансаминаз, а также активность NAG соответствует выраженности ПОЛ, что позволяет достаточно надежно опираться на показатели ПОЛ при диагностике заболеваний гепатобилиарной системы. Список литературы 1. Недогода В. В., Разваляева О. В., Свириденко О. Ю., Скворцов В. В. Показатели

перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты в диагностике ХДЗП. // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Физиологические науки — клинической гастроэнтерологии». Ессентуки, 23–25 мая 2001. — С. 99–100.

2. Иванова С. В. Оценка структурного состояния липидной фазы мембран эритроцитов при заболеваниях печени флуоресцентным методом. // Вестник Витебского государственного медицинского университета. — № 3. Т 7. — 2008. — С. 1–8.

3. Некрасов Э. В. Методы анализа перекисного окисления липидов в медико-биологических исследованиях. // Бюллетень физиологии и патологии дыхания. — № 46. — 2012. — С. 99–103.

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

73

74

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

e-mail: medalfavit@mail.ru

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

75

Подписка Заказ электронной версии журнала: всего 100 рублей за номер!

Присылайте, пожалуйста, запрос на адрес: medalfavit@mail.ru.

БЛАНК-ЗАКАЗ на подписку на журнал 2016 год

Название организации (или Ф.И.О.) ______________________________________________________________________________________________________ Адрес (с почтовым индексом) _________________________________________________________________________________________________________________________ _________________________________________________________________________________________________________________________________________________________ Телефон:___________________________E-mail: ___________________________Контактное лицо: ________________________________________________________________

Подписка

_________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

□ «Медицинский алфавит. Стоматология» — 4 выпуска в год (1 600 руб. ) □ «Медицинский алфавит. Современная лаборатория» — 4 выпуска в год (1 600 руб. в год) □ «Медицинский алфавит. Эпидемиология и гигиена» — 4 выпуска в год (1 600 руб. в год) □ «Медицинский алфавит. Больница — все для ЛПУ» — 4 выпуска в год (1 600 руб. в год) □ «Медицинский алфавит. Неотложная медицина» — 4 выпуска в год (1600 руб. в год) □ «Медицинский алфавит. Диагностика и онкотерапия» — 2 выпуска в год (800 руб. в год) □ «Медицинский алфавит. Фармакотерапия» ― 2 выпуска в год (800 руб в год) □ «Медицинский алфавит. Кардиология» ― 4 выпуска в год (1 600 руб в год) □ «Медицинский алфавит. Практическая гастроэнтерология» ― 4 выпуска в год (1 600 руб в год) □ «Медицинский алфавит. Неврология и психиатрия» ― 4 выпуска в год (1 600 руб в год) Извещение

Наш индекс в каталоге «РОСПЕЧАТЬ» 36228

НДС — 0 %

ООО «Альфмед» (наименование получателя платежа)

7716213348

(ИНН получателя платежа)

Рс № 40702810738090108773

(номер счета получателя платежа)

в Московский Банк Сбербанка России

(наименование банка и банковские реквизиты)

Subscription

ОАО «СБЕРБАНК РОССИИ» г. МОСКВА К/с 30101810400000000225 БИК 044525225 Годовая подписка на журнал «Медицинский алфавит. _______________________ _________________________________________________________» на 2016 год (наименование платежа)

Кассир Квитанция

Дата______________ Сумма платежа_____________________ Плательщик (подпись) ________________ Адрес доставки: __________________ _____________________________________________________________________ ООО «Альфмед» (наименование получателя платежа)

7716213348

(ИНН получателя платежа)

Рс № 40702810738090108773

(номер счета получателя платежа)

в Московский Банк Сбербанка России

(наименование банка и банковские реквизиты)

ОАО «СБЕРБАНК РОССИИ» г. МОСКВА К/с 30101810400000000225 БИК 044525225 Годовая подписка на журнал «Медицинский алфавит. _______________________ _________________________________________________________» на 2016 год (наименование платежа)

Кассир

Дата______________ Сумма платежа_____________________ Плательщик (подпись) ________________ Адрес доставки: __________________ _____________________________________________________________________

Как подписаться

1. Заполнить прилагаемый бланк-заказ и квитанцию об оплате. 2. Оплатить квитанцию.

3. Отправить бланк-заказ и квитанцию (или их копии) по почте по адресу: 129344, Москва, ул. Верхоянская, д.18 к. 2; или по факсу: (495) 616-48-00, 221-76-48, или по e-mail: medalfavit@mail.ru

76

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru

e-mail: medalfavit@mail.ru

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

77

78

Медицинский алфавит № 18 / 2015, том № 4 Современная лаборатория

e-mail: medalfavit@mail.ru