Criopreservación de semen ovino utilizando aloe vera by Medicina Veterinaria JDC

CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN OVINO UTILIZANDO ALOE VERA COMO COADYUVANTE DEL PRODUCTO COMERCIAL TRILADYL®EN CONCENTRACIONES DEL 10% Y 30%

EDGAR FERNEY MESA CARO COD: 1101061036

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2011

CRIOPRESERVACIÓN DE SEMEN OVINO UTILIZANDO ALOE VERA COMO COADYUVANTE DEL PRODUCTO COMERCIAL TRILADYL®EN CONCENTRACIONES DEL 10% Y 30%

EDGAR FERNEY MESA CARO COD: 1101061036

Trabajo de grado para optar al título de Médico veterinario

DIRECTOR DANIEL FERNANDO GONZALEZ MENDOZA MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA

FUNDACION UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2011

Nota de aceptaci贸n _________________________ _________________________ _________________________ _________________________

_____________________________________ Firma del presidente del Jurado

__________________________________________ Firma del jurado

DEDICATORIA

_________________________________ A DIOS Y A LA SANTISIMA VIRGEN MARIA, A MIS PADRES, A MIS HERMANOS, A MI NOVIA Y A TODAS LAS PERSONAS QUE INTERVINIERON PARA EL DESARROLLO EXITOSO DE ESTE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN.

________________________________

AGRADECIMIENTO

A mis padres y mis hermanos, por el arduo esfuerzo de colaboración durante este largo proceso de formación profesional.

Al Dr, Daniel Fernando González Mendoza MVZ, Esp, en Producción Animal, docente de la Facultad Ciencias Agrarias de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos, por el acompañamiento y colaboración durante el desarrollo de esta investigación.

A mi novia, Ruddy Johana Rodríguez, por sus buenos concejos durante el desarrollo de este trabajo investigativo y su acompañamiento incondicional durante ésta etapa de formación.

Al Dr, Elías Carvajal, Decano de la Facultad Ciencias Agrarias de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos, por su disposición durante la asignatura Trabajo de Grado.

A todos mis compañeros de estudio, por todos estos años de amistad y colaboración, a todos mis docentes por sus enseñanzas y buenos concejos.

TABLA DE CONTENIDO

PÁG.

1. MARCO REFERENCIA

1.1 Estado De Arte

1.2 Marco Teórico

1.2.1 Anatomía del aparato reproductor ovino

1.2.2 Descripción de la célula espermática

1.2.3 Características del semen ovino

1.2.4 Características de la raza Katahdin

1.2.5 Obtención y evaluación del semen

1.2.6 Diluyentes del semen

1.2.7 Efectos de la criopreservación en la célula espermática.

1.2.8 Aloe Vera (Aloe barbadensis)

1.3 Marco Geográfico y Climático

1.4 Marco Legal

2. METODOLOGIA

2.1 Tipo de Estudio

2.2 Diseño Experimental

2.3 Materiales y Métodos

2.3.1 Métodos

2.3.1.1

Obtención del semen

2.3.1.2

Evaluación del semen

2.3.2 Descripción de los tratamientos

2.4 Descripción de la Población

2.5 Procesamiento Recolección de la información

2.5.1 Diagrama de flujo

2.6 Tratamiento y Procesamiento de la Información

3. ANALISIS Y DISCUCIÓN DE RESULTADOS

3.1 Resultados

3.1.1 Para porcentajes de motilidad progresiva

3.1.2 Para porcentajes de espermatozoides vivos

3.1.3 Comportamiento promedio de la motilidad progresiva

3.1.4 Comportamiento promedio de espermatozoides vivos.

3.1.5 Análisis de las colectas

3.2 Discusión de los Resultados

3.2.1 T0= Dilución semen 35 °C

3.2.2 TE= Finalizado el enfriamiento 5°C

3.2.3 TVN= Vapores de nitrógeno

3.2.4 TC= concluido el proceso de congelamiento -196°C

3.2.5 48H= 48 horas congelamiento

3.2.6 Discusión general

4. CONCLUSIONES

5. IMPACTO SOCIAL

100

6. RECOMENDACIONES

101

7. BIBLIOGRAFIA

102

8. ANEXOS

110

LISTA DE FIGURAS

PAG.

FIGURA No 1: Estructura del espermatozoide.

FIGURA No 2. Macho Katahdin

FIGURA No 3: Planta de Aloe Vera

LISTA DE TABLAS

PAG.

TABLA No 1. Clasificación concentración espermática.

TABLA No 2.Características del semen ovino.

TABLA No3. Constituyentes del plasma seminal.

TABLA No 4: Valoración semicuantitativa de la motilidad en masal microscópica.

TABLA No 5: Clasificación de la movilidad individual.

TABLA No 6: Concentración del semen de carnero y chivo valorada por su apariencia/color.

TABLA No 7: Principios activos del Aloe Vera

TABLANo 8: Descripción de los tratamientos a partir del diluyente triladyl® más el coadyuvante aloe vera en dos concentraciones 10%-30%.

TABLA No 9: Equivalencias (transmitancia/concentración) para ovinos (0,05 ml de semen en 5 ml de citrato de sodio al 2,9%a unalongitud de onda de 550 nm).

TABLA No 10: Resultados Obtenidos Para La Colecta 1 Y 2 Evaluando Los Porcentajes De Espermatozoides Vivos Y Porcentajes De Motilidad Progresiva En los tres grupos experimentales.

TABLA No 11: Promedios durante la fase de dilución a 35°C (TO)

TABLA No 12: Promedios durante la fase de equilibrio o enfriamiento a 5°C (TE)

TABLA No 13: Promedios durante la fase de vapores de nitrógeno (TWN)

TABLA No 14: Promedios durante la fase final de congelamiento -196 °C (TC)

TABLA No 15: Promedios durante las 48 horas de congelamiento (48H)

TABLA No 17: Evaluación de la actitud reproductiva del macho ovino

115

TABLA No 18. Información de las colectas por vagina artificial al macho katahdin

116

TABLAS NO 19, 20: Formatos empleados para los resultados obtenidos durante los porcentajes de motilidad progresiva y espermatozoides vivos.

117

LISTA DE GRAFICAS

PÁG.

Para porcentajes de motilidad progresiva

GRAFICA No 1.Comportamiento de los porcentajes de motilidad progresiva en el grupo control (Triladyl® al 100%) para cada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120-130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento -196°C y 48H= 48 horas congelamiento)

GRAFICA No 2. Comportamiento de los porcentajes de motilidad progresivapara el grupo experimental (Triladyl® 70%, Aloe vera 30 %). En cada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120 -130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento -196°C y 48H = 48 horas congelamiento)

GRAFICA No 3. Comportamiento de los porcentajes de motilidad progresivapara el grupo experimental (Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%). En cada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento -196°C y 48H= 48 horas congelamiento).

Para porcentajes de espermatozoides vivos.

GRAFICA No 4. Comportamiento de los porcentajes de espermatozoides vivos para el grupo control (Triladyl® al 100%), encada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120-130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento -196°C y 48H= 48 horas congelamiento)

GRAFICA No 5. Comportamiento de los porcentajes de espermatozoides vivos para el grupo experimental (Triladyl® 70%, Aloe vera 30%), en cada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120 -130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento -196°C y 48H= 48 horas congelamiento).

GRAFICA No 6. Comportamiento de los porcentajes de espermatozoides vivos para el grupo experimental (Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%), encada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120 -130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento -196°C y 48H= 48 horas congelamiento)

Promedios de motilidad progresiva y espermatozoides vivos

GRAFICA No 7. Porcentaje promedio de la motilidad progresiva en cada una de las fases empleando Triladyl® al 100%, Triladyl® al 70% más Aloe vera 30%, Triladyl® al 90% más Aloe vera 10%

GRAFICO No 8. Porcentaje promedio de espermatozoides vivos en cada una de las fases empleando Triladyl® al 100%, Triladyl® al 70% más Aloe vera 30%, Triladyl® al 90% más Aloe vera 10% 12

LISTA DE FOTOGRAFIAS

PAG.

Foto 1: Esterilización de materiales

110

Foto 2: Corte de la sábila.

110

Foto 3: Extracción Aloe Vera

110

Foto 4: Preparación del diluyente

110

Foto 5: Lavado prepucial.

111

Foto 6: Medición circunferencia escrotal

111

Foto 7: Vagina artificial

111

Foto 8: Flemen, intento de monta

112

Foto 9: Golpe riñón, toma eyaculado

112

Foto 10: Colecta en el baño maría

112

Foto 11: Evaluación microscópica

113

Foto 12: Dilución semen más diluyente

113

Foto 13: Fase de equilibrio

113

Foto 14: Empacado de pajillas

113

Foto 15: Sellado de pajillas

114

Foto 16: Fase de vapores de nitrógeno

114

Foto 17: Evaluación descongelamiento

114

GLOSARIO



ADN: Acido desoxirribonucleico, es un tipo de ácido nucleído, una macromolécula que forma parte de todas las células. Contiene la información genética usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos, y es responsable de su transmisión hereditaria.



Aloe vera: también conocido como sábila, sávila, aloe de Barbados o aloe de Curazao. El aloe se cultiva principalmente para uso medicinal.



Antioxidante: Sustancia que en pequeñas cantidades inhibe la oxidación de otros componentes. Las reacciones de oxidación pueden producir radicales libres que comienzan reacciones en cadena que dañan las células.



Biotecnología reproductiva: Es toda aplicación tecnológica que utilice sistemas biológicos y organismos vivos o sus derivados para la creación o modificación de productos o procesos para usos específicos



Célula haploide: Es aquella que contiene un solo juego de cromosomas o la mitad (n, haploide) del número normal de cromosomas en células diploides (2n, diploide).Las células reproductoras, como los óvulos y los espermatozoides de los mamíferos, contienen un sólo juego de cromosomas, mientras que el resto de las células de un organismo superior suelen tener dos juegos de ellos



Crioprotector: Sustancia que se añade al material biológico vivo, que se va a conservar en un estado viable mediante la congelación.



Dilución: Reducción de la concentración de una sustancia mediante la administración de un agente neutro.



Diluyente: Solución acuosa que permite aumentar el volumen del eyaculado hasta conseguir las dosis necesarias y preservar las características funcionales de las células espermáticas y mantener el nivel fertilidad adecuado.



Espectrofotómetro: Instrumento que expone una muestra a una luz de longitudes de onda definidas y mide la absorbancia. Es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos.



Espermatozoide: Célula haploide, que constituye el gameto masculino.



Eyaculado: Expulsión forzada de semen desde la uretra, que consta de de un liquido lubricante producto de las glándulas accesorias más células espermáticas.



Fenotipo: Apariencia externa de un animal en todas sus características tanto anatómicas como fisiológicas y de comportamiento.



Fertilidad: Capacidad de concebir o inducir la concepción.



Genotipo: Constitución genética total de un individuo.



Germoplasma: Conjunto de genes que se transmite por la reproducción a la descendencia por medio de gametos o células reproductoras.



Glándulas Accesorias: Las glándulas sexuales accesorias del macho secretan gran parte del liquido seminal o semen, indispensable para el transporte de los espermatozoides así como también se nutrición y amortiguador contra el exceso de acidez producto de la orina.



Glicerol: Liquido transparente, incoloro, denso, utilizado como agente humectante y disolvente. También es llamado como glicerina.



Hidrosoluble: Es una medida de la capacidad de una determinada sustancia para disolverse en otra.



Katahdin: Raza ovina tipo carne de pelo, proveniente del estado de Maine.



Mansedumbre: Cualidad de manso, que se refiere cuando algo o alguna especie presenta las características de manso.



Metabolismo: Es el conjunto de reacciones y procesos físico-químicos que ocurren en una célula y en el organismo, que permiten diversas actividades: crecer, reproducirse, mantener sus estructuras.



Motilidad individual progresivo: Este movimiento se define como el porcentaje respecto al total de mótiles, observando el porcentaje de espermatozoides (individual) que avanzan más o menos de forma rectilínea en el campo.



Motilidad masal: En este tipo de movimiento los espermatozoides presenta ondas características a la observación al microscopio, que se valoran subjetivamente de 0 a 5 puntos



Nitrógeno liquido: Nitrógeno puro en estado líquido a una temperatura igual o menor a su temperatura de ebullición, que es de –195,8 °C a una presión de una atmósfera. El nitrógeno líquido es incoloro e inoloro.



Progenitor: Antepasado directo de una especie, específicamente el padre o madre.



Rack de congelación: Soporte metálico, utilizado para pajillas durante vapores de nitrógeno.



Semen: Liquido liberado por cualquier ser del genero macho, la cual esta constituido por células espermáticas y plasma seminal, también conocido como líquido seminal.



Suis Generis: Propio de su género o especie, referente al olor.



Triladyl®: Diluyente comercial de un solo paso a base de: TRIS, Ácido cítrico, azúcar (glucosa), Glicerina, agua purísima y antibióticos (tilosina, gentamicina, espectinomicina, lincomicina).



Tris:“hidroximetilaminometano”, de fórmula (HOCH2)3CNH2. Se utiliza ampliamente en bioquímica y biología molecular. En particular para preparar disoluciones tampón.

RESUMEN

El objetivo del presente trabajo fue criopreservar material seminal de la especie ovina, a partir de un diluyente comercial más un coadyuvante no convencional. El estudio se ejecutó dentro de las instalaciones de la clínica veterinaria San Francisco de Asís de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos, localizada en el municipio de Soracá vereda Otro Lado del departamento de Boyacá. Para ello se utilizó un macho raza Katahdin como fuente de células espermáticas, de aproximadamente 3 años de edad, el cual fue colectado con vagina artificial, obteniendo un total de seis eyaculados a partir de dos colectas (tres eyaculados por colecta) con un intervalo de cuatro días. En el estudio se utilizó el diluyente comercial “Triladyl®” en mezcla con el coadyuvante “aloe vera”, donde los grupos experimentales fueron Triladyl® 70% más Aloe Vera al 30%, Triladyl® 90% más Aloe Vera 10% y como grupo testigo Triladyl® 100% para someterse a pruebas de congelación. Las variables que se tomaron para dicho estudio fueron: motilidad progresiva y espermatozoides vivos durante cinco etapas: al momento de hacer la dilución a 35C°, fase de equilibrio a 5C°, fase de vapores de nitrógeno, fase de congelación a -196°C y a las 48 horas post congelación. Se utilizo un método descriptivo a partir de los datos promédiales obtenidos de cada etapa de congelación. La mayoría de las combinaciones tuvieron dentro de los rangos aceptables hasta la fase de vapores de nitrógeno, obteniendo valores iguales o superiores al tratamiento testigo, sin embargo el diluyente Triladyl® al 70% más Aloe vera al 30% obtuvo los mejores resultados a las 48 horas con una motilidad progresiva promedio del 26% y vitalidad del 25.5%, con respecto al grupo control obteniendo

una

motilidad

progresiva

del 19.2%

y vitalidad

del 20.5%

respectivamente.

Se concluye por lo tanto, que mayor concentración de Aloe Vera en el diluyente comercial Triladyl® mejora el porcentaje de supervivencia como el de motilidad 17

progresiva individual en cada una de las fases de estudio, siendo apropiado para la preservaci贸n de semen ovino.

Palabras clave: Criopreservaci贸n, semen, Diluyente Triladyl庐, Aloe Vera, % Motilidad Progresiva, % espermatozoides vivos.

ABSTRACT

The aim of the present work was criopreservar seminal material of the sheep species, from one more commercial thinner the helping not conventional one. The study executed inside the facilities of the veterinary clinic San Francisco of You Seize of the University Foundation Juan of Castilians, located in Soracá's municipality path Another Side of Boyacá's department. For it there was in use a macho race Katahdin as source of spermatic cells, of approximately 3 years of age, who was collected by artificial vagina, obtaining a total of six ejaculated ones from two collections (three ejaculated ones for collection) with an interval of four days. In the study the commercial thinner was in use " Triladyl " in mixture with helpingly " aloe side ", where the experimental groups were Triladyl 70 more % Aloe Side to 30 %, Triladyl 90 more % Aloe Side 10 % and as group witness Triladyl 100 % to surrender to tests of freezing. The variables that took for the above mentioned study were: progressive motility and alive sperms during five stages: to the moment to do the dilution to 35C °, phase of balance to 5C °, steam phase of nitrogen, phase of freezing to-196°C and at 48 hours post freezing. The majority of the combinations had inside the acceptable ranges up to the steam phase of nitrogen, obtaining values equal or superior to the treatment witness, nevertheless the thinner Triladyl to 70 more % Aloe side to 30 % obtained the best results at 48 hours with a progressive average motility of 26 % and vitality of 25.5 %, with regard to the group control obtaining a progressive motility of 19.2 % and vitality of 20.5 % respectively.

One concludes therefore, that major concentration of Aloe Side in the commercial thinner Triladyl improves the percentage of survival as that of progressive individual motility in each of the phases of study, being adapted for the preservation of sheep semen.

Key words: Criopreservatión, semen, Thinner Triladyl, Aloe Side, % Progressive Motility, % alive sperms. 19

INTRODUCCIÓN

En el departamento de Boyacá la ovinocultura se encuentra en un creciente desarrollo, teniendo en cuenta que su manejo se ha mantenido con pocos niveles de tecnificación. Para tal fin, es necesario implementar nuevas formas que garanticen el rendimiento productivo en la especie ovina, por medio del uso de biotecnologías aplicadas a la reproducción.

La aplicación hoy en día de las biotecnologías reproductivas en los ovinos, hace referencia al uso de semen fresco para programas de inseminación artificial, permitiendo de esta manera mejorar las características reproductivas en cuanto al número de crías se refiere, con respecto a las que se obtendrían en servicio natural, método de mayor aplicación en la región Boyacense. Esto podría mejorar gracias al uso de semen criopreservado, que es una técnica que permite disponer de células espermáticas por un periodo largo de tiempo y además de preservar recursos genéticos de razas superiores que garanticen una alta productividad (Barbas, 2008).

En la especie ovina esta técnica ha tenido un éxito limitado, debido a una reducción de células móviles pos descongelamiento (Waston, 2000. En Cosme, 2005) además de ocasionar daños estructurales, bioquímicos y funcionales, por ende, bajos porcentajes de motilidad, alteraciones en el transporte y vitalidad espermática (Salamon y Marwell, 1995 En Brito et al, 2004). Existiendo todavía muchos puntos por investigar sobre la particularidad del semen criopreservado en la especie ovina (Aguirre Reyes, 2006).

Es así como a través de los años se han implementado diluyentes comerciales que nos permiten mantener la integridad física y funcional de los espermatozoides durante el proceso de congelación-descongelación. El uso de estos diluyentes, es

muy atractivo debido a su calidad que representan en otras especies domésticas, especialmente en los bovinos. Pero en la especie ovina no han demostrado las mejores condiciones presentando limitaciones en cuanto a su eficiencia postcongelamiento (Brito,2004).

El presente estudio tuvo como fin, indagar sobre un protocolo de criopreservación de semen para la especie ovina, donde se experimento con un diluyente comercial Triladyl® más un coadyuvante Aloe Vera en dos concentraciones (10% y 30%), con el objetivo de mejorar la motilidad progresiva y el porcentaje de viabilidad espermática durante el proceso de congelación. Para ello, se evaluaron cinco etapas (al diluir el semen, finalizado el equilibramiento a 5°C, fase de vapores de nitrógeno, concluido el proceso de congelamiento a -196 °C y a las 48 horas de postcongelación) utilizando como fuente de células espermáticas un macho de la raza Katahdin, cumpliendo los criterios mínimos de referencia en cuanto a las características del eyaculado para esta especie, además, por presentar un alto merito reproductivo y productivo en la manada y por su gran mansedumbre. .

JUSTIFICACIÓN

Los métodos comúnmente aplicados en la reproducción de ovinos en la región Boyacense son la monta directa y el uso de semen fresco en programas de inseminación artificial. Por esto surge la necesidad de brindar al productor nuevas alternativas reproductivas que busquen masificar la producción ovina de la región, de tal forma que facilite acelerar considerablemente el flujo de material genético superior, evitando así los costos que representan el traslado de los reproductores de alto valor genético y a la vez disminuir los riesgos sanitarios que estos presentan durante la movilización.

Por esta razón, y dado que en la región son mínimos los estudios realizados para el procesamiento de semen en ovinos, el presente estudio pretende evaluar un protocolo de criopreservación de semen para la especie, que garantice un buen porcentaje de supervivencia y motilidad durante el proceso de congelacióndescongelación, de tal manera que se pueda desarrollar un banco de germoplasma de ovino, en especial del macho ovino de raza Katahdin perteneciente a la Fundación Universitaria Juan De Castellanos, ya que posee características genotípicas y fenotípicas ideales, además, por su rusticidad y alta capacidad reproductiva y mansedumbre, siendo éste de gran alternativa para el desarrollo de la ovinocultura en la región Boyacense.

Para el estudio, se pretende establecer un protocolo de criopreservación con el uso de Aloe Vera en dos concentraciones 10% y 30% como coadyuvante de un diluyente comercial Triladyl®, ya que se a observado que el Aloe vera por si sola posee propiedades isotónicas, energéticas y cicatrizantes (Ferrero,2009); emoliente, regenerador de tejidos, antibiótico, laxante, y hasta inductor de estro y ovulación (Rodríguez 1988 y Jiménez et al., 1995 EN Cosme, 2005 y

Sanabreaa,2008),contribuyendo favorablemente en la integridad de la cĂŠlula espermĂĄtica, y por ende mejorar la calidad del semen ovino criopreservado.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La célula espermática es el producto de un largo proceso de desarrollo a través de los órganos reproductivos del macho, que a su vez esta acompañada por secreciones de las glándulas anexas que contribuyen a la formación del plasma seminal donde éste se favorece con el mantenimiento y supervivencia del espermatozoide, para así formar el eyaculado.

Una vez formada la célula espermática, necesita de condiciones adecuadas para su supervivencia en el medio externo, ya que al ser expulsado durante el eyaculado en un sitio diferente a aquel que la naturaleza reproductiva tiene designado, estas células sufren cambios que afectan su integridad y su actividad metabólica alterando su fertilidad (López, 2008).

Cuando el semen del ovino se congela y se conserva a muy baja temperatura (196°C), las reacciones metabólicas de los espermatozoides se detienen, a la vez que se genera daños irreversibles debido a la formación de cristales de hielo a nivel intracelular o se comprometerá la vida celular por aumento de concentración de solutos en el citoplasma generado por estrés osmótico ocasionando la muerte celular (Aisen, 2004). Esto se atribuye al deterioro de la membrana espermática, provocando alteraciones estructurales, bioquímicas y funcionales, que resultan en una disminución de la motilidad y vitalidad, además, de las tasas de concepción cuando se comparan con las obtenidas con semen fresco o refrigerado (Hidalgo, 2004). Por lo tanto, las lesiones producidas por la congelación-descongelación pueden disminuirse con la utilización de diluyentes crioprotectores que minimizan los efectos causados durante el proceso de preservación.

A pesar de que se han empleado una gran cantidad de diluyentes para la congelación del semen del ovino, no existe un consenso acerca de cual es el que

proporciona mejores resultados al descongelar (Salamon y Maxwell, 1995 En Brito, 2004), pero los diluyentes a base de tris y yema de huevo son los que más se han experimentado (Brito, 2004).

En la actualidad se vienen desarrollando protocolos para criopreservación de material seminal ovino, por lo cual es necesario indagar sobre la efectividad que se genera al adicionar Aloe Vera en concentraciones del 10 y 30% como coadyuvante al diluyente comercial Triladyl®, con el fin buscar mejoras en la calidad espermática de los ovinos, ya que en la región se cuenta con poca investigación sobre los efectos que poseen estos coadyuvantes directamente sobre la viabilidad espermática por lo cual se evaluó, si estas concentraciones son las que brindan mejor resultado en la efectividad del material seminal puesta a prueba con efectividad de generar preñeces lo cual representa mayores ingresos en la economía del productor.

FORMULACIÓN DEL PROBLEMA

¿Es posible mejorar la vitalidad espermática y motilidad progresiva con la adición de Aloe Vera como coadyuvante utilizando dos concentraciones del 10% y 30% en el diluyente comercial triladyl® para criopreservar semen en la especie ovina?

HIPOTESIS.

H.I: La adición de Aloe Vera en concentraciones del 10% y 30% como coadyuvante del diluyente comercial Triladyl®, influirá positivamente en los porcentajes de viabilidad y motilidad espermática durante los procesos de criopreservación de semen ovino.

H.O: La adición de Aloe Vera en concentraciones del 10% y 30% como coadyuvante del diluyente comercial Triladyl®, no influye en los porcentajes de viabilidad y motilidad espermática durante los procesos de criopreservación de semen ovino.

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Evaluar la efectividad de criopreservación de semen ovino utilizando Aloe vera (Aloe babadensis) como coadyuvante del producto comercial Triladyl® en concentraciones del 10% y 30%.

OBJETIVOS ESPECIFICOS 

Caracterizar los parámetros macroscópicos y microscópicos de las

colectas de semen del macho ovino de raza Kathadin. 

Evaluar la efectividad del aloe vera como coadyuvante de semen

ovino en concentración del 10% en el diluyente comercial Triladyl® empleando parámetros de evaluación microscópicos (motilidad individual progresivo

viabilidad

espermática)

diferentes

fases

criopreservación. 

Evaluar la efectividad del aloe vera como coadyuvante de semen

ovino en concentración del 30% en el diluyente comercial Triladyl® empleando parámetros de evaluación microscópicos (motilidad individual progresivo

viabilidad

espermática)

criopreservación.

diferentes

fases

1. MARCO REFERENCIAL

1.1 ESTADO DEL ARTE

Los criopreservadores son sustancias hidrosolubles y de baja toxicidad que tiene como objetivo el mantenimiento de la viabilidad de las células espermáticas a temperaturas bajas y mediante el uso de sustancias protectoras que minimicen el daño celular (Ávila,et al, 2006 y Merino 2003). Los diluyentes más usados comúnmente en la criopreservación de semen tiene como base la yema de huevo con glucosa y Tris, un agente protector que minimiza los daños durante la congelación y un antibiótico para impedir la diseminación de enfermedades (López, 2008), sin embargo aunque se han implementado múltiples protocolos para la criopreservación de semen en ovinos, aún no se tienen los ideales para la mayoría de los casos.

Uno de los principales componentes dentro de los diluyentes para la criopreservación de semen en toros, carneros y machos cabríos son los diluyentes a base de tris (Purdy, 2006 En Barbas 2008). En carneros los espermatozoides pueden tolerar concentraciones de 250 a 400 mililitros siendo la glucosa mejor componente de azúcar en un medio tris que la fructosa, lactosa o rafinosa (Salomon y Maxwell, 2000 En Barbas, 2008). Por lo tanto el Triladyl® un diluyente a base de Tris, dio lugar a una fertilidad razonable después de la inseminación artificial en ovejas (Barbas, 2008).

Confirmando lo anterior, Aguirre en el 2006, realizo un estudio en el cual tuvo como objetivo comparar las diferencias de motilidad e integridad acromática en el semen ovino descongelado, utilizando dos diluyentes comerciales Triladyl® y Andromed® mediante dos técnicas de congelación, “rápida” (a vapores de nitrógeno) y “lenta” (con una congeladora automática). Las diferencias entre los 29

dos tratamientos empleados determina que el diluyente Triladyl® mantuvo un porcentaje de motilidad significativamente mayor que el semen congelado con Andromed® durante los dos tiempos de congelación, y a la vez, obtuvo el mayor porcentaje en cuanto a la integridad acrosomal, siendo este un diluyente aceptable para congelar semen en la especie ovina.

La criopreservación del semen involucra una serie de pasos: dilución, crioprotección,

refrigeración

congelamiento,

almacenamiento

descongelamiento los cuales afectan la estructura y funcionalidad de la célula. considerando que el momento mas crítico para la criopreservación del semen es al inicio de la congelación y al momento del descongelado, puesto que es aquí donde se presentan un sinnúmero de procesos físico-químicos regidos por las diferencias de temperatura y transporte de agua entre las células y el medio (Ávila, Carlos. 2006)

En las memorias del VI seminario de producción de ovinos en el trópico, de la Universidad de Juárez Autónoma de Tabasco, se expuso los problemas persistentes en la inseminación artificial con semen congelado en ovinos, la cual se afirman que el semen congelado en esta especie ha sido limitada por bajos porcentajes preñez, 20 a 40% con inseminación peri o transcervical y un 40 y 60% con inseminación intrauterina en comparación con los datos obtenidos con semen fresco, 35 y 50% con inseminación pericervical y un 70 y 80% con inseminación intrauterina (Rodríguez, A., et al 2008). Esto se atribuye al deterioro de la membrana

plasmática

los

espermatozoides

durante

congelación-

descongelación, por ende una baja viabilidad espermática donde se altera la actividad metabólica del espermatozoide, reduciendo así los porcentajes de fertilidad. (Cosme, 2005, Rodríguez, A., et al.2008, Sandoval, 2007 y Ávila, Carlos 2006). Ahora bien, con la implementación de la inseminación artificial por laparoscopia, la barrera natural que presenta el cérvix, de los pequeños rumiantes ha sido

superada al depositar el semen dentro del lumen uterino (Maxwell y Salamon, 1993 En Brito, 2004). Además con la inseminación intrauterina se ha renovado el interés por la congelación de semen, ya que permite la reducir la cantidad de espermatozoides por dosis para obtener niveles óptimos de de fertilidad (Ruiz, 2007).

Por esta razón, Gibbson y Cueto, 2010. Afirman que para aceptar una pajuela o pajilla de forma comercial, ésta debe poseer una motilidad individual progresiva igual o superior a 2.5%, y un porcentaje de espermatozoides vivos igual o superior al 3.0%.

Es así como en Latinoamérica se ha buscado mejorar la calidad seminal del ovino con la combinación de diferentes protocolos de congelación utilizando diluyentes comerciales y no comerciales, como: agua de coco, aloe vera, opuntia, y nopal, sin obtener resultados satisfactorios, o que brinden una alternativa más a los productores ovinos (López, 2008).

Diferentes estudios afirman las teorías que causan el deterioro de la integridad funcional de la célula espermática, entre ellas están; las alteraciones por el incremento en la producción de especies de oxigeno durante el proceso de criopreservación causada por los daños oxidativos en la biomolecula que componen al espermatozoide (Ruiz, 2007); el efecto de la temperatura y la presión osmótica ocurriendo cambios en la organización morfológica, tales como la permeabilidad, composición lipidica, la desnaturalización proteica, los cristales de hielo a nivel intracelular y la rupturas de las membranas.(Ávila et al, 2006 y Cabrera, P. y Pantoja, C. 2008).

Un estudio realizado por Brito et al. (2004), donde comparo la motilidad al descongelar semen de carnero congelado en pellets utilizando dos diluyentes, uno a base de Tris-glucosa-yema de huevo y el otro a partir de Lactosa-yema de

huevo. Siendo la motilidad espermática al descongelar significativamente mayor en el semen diluido con Lactosa-yema (45.8%), que con Tris-glucosa-yema de huevo (40.2%).

En la Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia de Tunja Boyacá, se hizo una investigación donde se evaluó el agua de coco en diferentes concentraciones para la congelación de semen en ovinos. Los resultados obtenidos

mostraron

porcentajes

mínimos,

evaluar

porcentaje

espermatozoides vivos y el porcentaje de motilidad progresiva en las diferentes variables de estudio, las cuales fueron: en el grupo I evaluó el semen más diluyente sin agua de coco, mostrando resultados MP 17,5% y un PV de 18.1%; en el grupo II evaluó el semen más diluyente con agua de coco al 20%, mostrando resultados MP 19.4% y un PV 19.72%;en el grupo III evaluó el semen más diluyente con agua de coco al 40%, mostrando resultados MP de 24% y un PV de 20.5%; en el grupo IV evaluó es semen más diluyente con agua de coco al 60%, mostrando resultados MP de 26.6% y un PV de 22.1% y finalmente en el grupo V evaluó semen más diluyente comercial Continental® obteniendo resultados MP 19.3% y un PV 18.6% (López, 2008).

Un estudio realizado en el Perú, se analizo el efecto de los diluctores tris-glucosa y yema de huevo y OvineFreezingsobre la motilidad e integridad de la membrana citoplasmática de los espermatozoides durante el proceso de congelación de semen ovino evaluando la motilidad progresiva con semen refrigerado y congelado, obteniendo que el uso del OvineFreezing tuvo una mejor respuesta en la calidad espermática durante el proceso de congelación con respecto al trisglucosa (Cabrera, P. y Pantoja, C. 2008).

De igual forma en el Perú, se evaluó el efecto de dos antioxidantes (Tempo y Tempol) en la criopreservación de semen ovino empleando un diluctor como controla base de Tris en concentraciones de 0.5, 1.0 y 2.5 para evaluar el efecto

que postdescongelamiento que pudiera tener sobre la motilidad progresiva la viabilidad e integridad acrosomal. Los resultados obtenidos se concluyo que el Tempo a una concentración de 0.5 mejora significativamente la calidad de semen criopreservado en comparación del grupo control (Ruiz, 2007).

Así mismo en el país Peruano, también fue evaluado el semen ovino empleando tres diluctores y cuatro combinaciones de agentes crioprotectores permanentes y no permanentes sobre la calidad seminal postdescongelamiento. En la primera fase se evaluaron los diluctores A,B,C y a el más adecuado se evaluó en la segunda fase, donde se evaluaron las siguientes combinaciones de agentes crioprotectores permanentes y no permanentes: 1) Glicerol - Trehalosa, 2) Glicerol - Sacarosa, 3) Etilenglicol - Trehalosa y 4) Etilenglicol - Sacarosa. Los resultados obtenidos a partir de este método demostraron que el glicerol es un mejor crioprotector permanente en comparación con el etilenglicol, sin embargo, no hubo diferencia en el uso de sacarosa o trehalosapara la criopreservación de semen en ovinos(Sandoval, 2007).

En Chihuahua México, fue utilizado agua de coco, suero fetal bovino, aloe vera y sus combinaciones para criopreservar semen en ovino, se evaluaron motilidad progresiva y espermatozoides vivos en cinco etapas: al diluir el semen a 35 °C, finalizado

equilibramiento,

concluida

congelación,

las

posdescongelamiento.La mayoría de las combinaciones alcanzaron valores ideales para la preservación de semen en ovino. El diluyente base para estudio fue 50p.100de agua de coco y50p.100 de citrato de sodio con 10, 20, 30, 40, 50, 60 y 70p100 de suero fetal bovino y aloe vera. La mayoría de los resultados obtuvieron valores iguales o superiores a las del testigo siendo valores apropiados para el congelamiento de semen en ovinos, señalando que el porcentaje de Aloe Vera no exceda el 50% ya que es perjudicial para la vitalidad de los espermatozoides (Cosme, 2005).

Es así como Rodríguez 1998, en Cosme, 2005, reportó excelentes resultados con la combinación 40% de gel aloe vera en citrato de sodio al 3%, obteniendo un 49.5% de motilidad progresiva al descongelamiento y tasas satisfactorias de fertilidad con inseminación intrauterina, situándolo como un buen diluyente para el semen ovino.

De igual manera en Chihuahua México,seexperimento con agua de coco, opuntia, leche y sus combinaciones para criopreservar semen en ovinos, se evaluaron motilidad progresiva y espermatozoides vivos en cinco etapas: al diluir el semen a 35 °C, finalizado el equilibramiento, concluida la congelación, y a las 48 posdescongelamiento. La mayoría de las combinaciones alcanzaron valores adecuados para la preservación de semen de ovino a largo plazo. El diluyente base para estudio fue 50p.100de agua de coco y50p.100 de citrato de sodio con 10, 20, 30, 40, 50, 60 y 70p100 de leche de vaca y nopal (Gutiérrez, A. et al., 2006).

Así mismo, en México en el Centro de Selección y Reproducción ovina del instituto tecnológico agropecuario, se realizo un estudio en ovejas de pelo inseminadas con semen congelado rediluido con plasma seminal, en el cual se pretendía determinar la viabilidad espermática. Los resultados obtenidos muestran que la adición de plasma seminal en el semen fresco no mejora la fertilidad, obtenida vía cervicalintrauterina, por el contrario, el semen congelado rediluido con plasma seminal, tanto en su aplicación cervical como intrauterina, mejora los índices de fertilidad en un 41

20% y un 50

16%, respectivamente.

Resultados que permiten

concluir que la redilución del semen congelado con plasma seminal proporciona una mayor recuperación de los espermatozoides dañados por el choque frío, lo cual se ve reflejado en un mayor porcentaje de fertilidad (Domínguez Robolledo, 2007) .

En la universidad Austral de Chile, se comprobó el efecto de la adición de un tensido comercial “surfactante” (Equex STM® a diluyentes tris y citrato de sodio) en la sobrevivencia de semen ovino, evaluando la integridad acrosomatica de los espermatozoides para determinar el porcentaje de espermatozoides vivos y el índice de motilidad, y se pudo concluir que tanto el tris como el citrato de sodio provocaron un efecto favorable del tensido sobre la integridad de los acrosomas(Hellemann, 1997).

1.2MARCO TEORICO.

1.2.1ANATOMÍA APARATO REPRODUCTOR OVINO

a) Testículos:

Son los órganos primarios del aparato reproductor del macho, cuya función es producir espermatozoides y las hormonas masculinas. Los testículos, deben ser firmes, grandes y se encuentran dentro el pliegue llamado escroto. El tamaño de los testículos va a depender de la edad, de la raza y del tamaño del macho, pero se puede considerar una circunferencia media de 30 cm aproximadamente (Angulo, 2003).

El tamaño de los testículos ha demostrado ser un buen indicador de la capacidad espermatogénica de un buen semental. La medida mas práctica para evaluar el tamaño de los testículos es la circunferencia escrotal, la cual tiene una alta correlación con el peso y el volumen testicular (Rojas, 2010).

La función endocrina la componen las células intersticiales (de Leydig) que se encuentran en los túbulos que son la fuente de la hormona masculina (testosterona).

epitelio

los

túbulos

compone

células

espermatogéneticas de soporte y de sostén (de Sertoli) (Ashdown y Hancock, 1986).

La función exocrina, los espermatozoides abandonan los testículos en una importante secreción líquido reticular. La producción diaria de esperma por gramo de testículo en el ovino es de 24 a 31 x 106 (Ashdown y Hancock, 1986).

Para un funcionamiento más eficaz, los testículos de los mamíferos deben mantenerse a una temperatura menor que la del cuerpo (4°C). Las características anatómicas de los testículos y del escroto permiten la regulación de la temperatura (Ashdown y Hancock, 1986).

La piel escrotal es delgada y elástica, presenta pelos finos diseminados o lana, y está abundantemente provista de glándulas sudoríparas y cebáceas. Además de alojar y proteger a los testículos, el escroto permite mantenerlos entre 4-7°C por debajo de la temperatura interna corporal lo que es indispensable para que se efectué la espermatogénesis (Asien, 2004).

b) Vías espermáticas:

Epidídimo: Es un conducto flexuoso adosado íntimamente al testículo. La primera parte, ubicada en el borde superior, es la cabeza, que recibe los conductos eferentes del testículo. Continúa el cuerpo, prolongación delgada que recorriendo la cara interna del testículo, desemboca en un ensanchamiento conocido como cola. Sus funciones son las del transporte, concentración, almacenamiento y maduración de los espermatozoides, con un ciclo completo de maduración alrededor de los dos meses (Angulo, 2003. Asien, 2004).

Un morueco en buenas condiciones puede tener 100.000 millones de espermatozoides por epidídimo, de los cuales el 75% están en la cola. En consecuencia, las alteraciones que sufra el epidídimo pueden ser causa de esterilidad (Folch, 2000).

Conducto deferente: Es el tubo que sale del extremo de la cola de cada epidídimo, es por donde los espermatozoides pasan del epidídimo a la uretra.El conocimiento anatómico del conducto deferente es de primordial importancia para la operación de la vasectomía, que consiste en la amputación de un trozo del mismo, y se logran así los carneros retajos, que identifican las ovejas en celo. La dilatación de cada conducto deferente, en la mayoría se conoce como ámpula o ampolla y sirve como reservorio espermático (Asien, 2004).

Uretra: Es el conducto del aparato reproductor y el aparato urinario, por este conducto es por donde los espermatozoides son expulsados al exterior (Angulo, 2003).

Pene: Está constituido por tejido eréctil y especialmente adaptado para depositar el semen dentro de la vagina de la hembra. Es el órgano copulador de los machos; presenta una flexura sigmoidea, la que permite que se retraiga dentro del cuerpo y no se observe por fuera el pene de un macho durante el descanso. El pene está formado por: Cuerpo del pene, el glande y el proceso uretral. El glande es el extremo externo del pene, está formado por tejido fibroelástico, una pequeña cantidad de tejido eréctil y un gran número de terminaciones nerviosas. El proceso uretral es una extensión de la uretra, en forma de una pequeña manguera, que permite que el eyaculado del macho llegue al fondo de la vagina a modo de aspersión(Angulo ,2003).

c) Glándulas accesorias:

Las glándulas vesiculares, bulbouretrales o de Cowper y la próstata, vierten sus secreciones en la uretra donde, en el momento de la eyaculación, se mezclan con la suspensión de espermatozoides y las secreciones ampulares del conducto deferente. Las glándulas accesorias tienen como función proporcionar el vehículo líquido para el transporte de espermatozoides, la glándula vesicular vierte fructosa y acido cítrico como componente en la secreción (Ashdown y Hancock, 1986).

La vesículas seminales se encuentran situadas a cada lado de la parte posterior dorsal a ala vejiga y son las responsables de secretar la mayor parte del liquido seminal, la próstata es la única glándula impar y se encuentra ubicada sobre el cuello de la vejiga, las glándulas bulbouretrales o de Cowper están ubicadas en la región caudal de la uretra (Asien, 2004).

1.2.2DESCRIPCIÓN DELA CELULA ESPERMATICA

a) Los espermatozoides

El espermatozoide es una célula haploide, producto final del proceso de la gametogénesis en el macho, portadora de la información genética paterna. Morfológicamente el espermatozoide se distingue la cabeza, preparada para penetrar el ocitoy transmitir la información genética; y el flagelo, provisto de la maquinaria metabólica y de los mecanismos de propulsión para adoptar el movimiento del espermatozoide (Hidalgo, 2004).

FIGURA No 1: Estructura del espermatozoide.

(Hidalgo, 2004).

La cabeza del espermatozoide en el ovino es de forma ovoide y plana, de tamaño es de 8.06 μm x 3.66 μm, encontrándose dos estructuras fundamentales el acrosoma y el núcleo espermático donde contiene el material acrosómico o ADN, responsable de la transmisión hereditaria. Su flagelo o cola comprende cuatro regiones principales: el cuello, la pieza intermedia, los segmentos principal y terminal (Hidalgo, 2004).

Se trata de una célula con escaso citoplasma, donde la posición anterior del núcleo esta cubierto por un saco membranoso delgado, de doble capa denominado acrosoma, siendo este similar a un capuchón con enzimas hidrolíticas, como la acrosina, la hialuronidasa y varias hidrolasas acidas para posibilitar el proceso de fertilización (Aisen, 2004).

Los espermatozoides constituyen aproximadamente el 25% del volumen del eyaculado (semen normal) y lo restante es secreción de tubos y glándulas. Físicoquímicamente están integrados por un 86% de agua; sustancias inorgánicas: sodio, potasio, calcio, magnesio, fósforo y otras; sustancias orgánicas: proteínas,

hidratos de carbono (fructosa), ácido láctico y cítrico, vitaminas y, otros, en menor cuantía (Inseminación artificial en ovinos, 2010).

El desarrollo del espermatozoide desde el estado de célula germinal hasta que alcanza el centro del túbulo seminífero, dura 31 días. A continuación, tarda 3 días y medio hasta llegar al epidídimo y otros 14 días hasta llegar a la cola del epidídimo. En total, desde que un espermatozoide empieza a formarse para ser colocado en la vagina, tarda 49 días. Este tiempo no se puede acelerar (Folch,2000).

1.2.3 CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN OVINO

El análisis del semen es un examen primordial para comprobar la capacidad funcional del mismo. El semen de carnero se caracteriza por tener eyaculaciones bajas de volumen 1ml (0.7ml-3ml), y su concentración varía a entre los 2 y 6 millones/ml, dependiendo de la edad, raza y método de extracción. (Gómez, 2010) No es recomendable emplear aquellos cuya concentración sea inferior a 2.5x10 9 espermatozoides/ml (Hidalgo, 2004)..

El color seminal, debe estar salvo a contaminaciones por pus y sangre, además está condicionado por la concentración espermática. Es decir, que si la concentración espermática es alta, el color presentaría unas características específicas de viscosidad, pero si por el contrario su concentración es mala el color del eyaculado seria de forma translucido, tal como se presentan en la siguiente tabla:

TABLA No 1. CLASIFICACIÓN CONCENTRACIÓN ESPERMATICA Alto

Cremoso: 3 a 5.000.000 esp/mm3

Bueno

Lechoso: 2 a 3.000.000 esp/mm3

Regular Malo

Leche aguachenta: 700.000 a 2.000.000 esp/mm3 Translucido, menos de 700.000 esp/mm3 (Gómez, 2010)

Los eyaculados de macho se caracterizan por presentar alto porcentaje de espermatozoides móviles (70-90%).Entre estos parámetros cinéticos, hay dos que parecen destacar sobre los demás como principales indicadores del movimiento espermático, que son la velocidad rectilínea (VSL) y el desplazamiento lateral de la cabeza (Hidalgo, 2004)..

El eyaculado de macho se caracteriza por presentar un bajo porcentaje de morfoanomalías (15-20%), Entre las morfoanomalías asociadas con fertilidad reducida, se encuentran las cabezas anormales, espermatozoides decapitados, anormalidades de la pieza intermedia y colas dobladas o enrolladas en espiral, así como determinadas anomalías heredables (Hidalgo, 2004). A continuación se presentan los promedios normales que debe tener el semen ovino, a partir de la evaluación macro y micro, siendo indispensable para determinar un buen eyaculado.

TABLA NO 2.CARACTERÍSTICAS DEL SEMEN OVINO Las características normales del semen ovino. Color

Blanco cremoso

Volumen (ml)

0.8-2 ml (1ml)

6.3-7.3

Concentración

2-5 x 109(4x109) epz/ml

Motilidad masal

0-4 (mayor o igual a 3)

Motilidad progresiva

60%-80% (70%)

Morfología

No más del 20% de anormales (Angulo, 2003)

Diversos estudios han buscado determinar la cantidad de masa testicular(mt), el volumen testicular (vt)y la circunferencia escrotal (ce)que se requiere para servir un número determinado de ovejas, observando variaciones importantes en los resultados de los mismos (entre 271.5 gr- 342.2 gr (mt); 307.99 cm3- 483.30 cm3 (vt); 25.0 cm- 29.0 cm, indicando que existen diversos factores que influyen en los resultados como: raza, época de nacencia, edad, dieta y peso corporal (Rojas, 2010).

a) Plasma seminal

plasma

seminal

está

constituido

por

secreciones

las

glándulas

bulbouretrales, próstata, las vesículas seminales, el epidídimo y de los conductos deferentes, siendo este un vehículo isotónico, nutritivo y protector, permaneciendo normalmente neutro (5.9-7.3). Además contiene agentes antimicrobianos como la seminalplasmina e inmunoglobulinas, principalmente IgA y una gran variedad de hormonas como andrógenos, estrógeno, FSH, LH, gonadotropina coriónica, hormona de crecimiento, insulina, glucagón, prolactina, relaxina, destacando entre ellas las prostaglandinas, y minerales (Angulo, 2003)

Por lo tanto el plasma seminal es el resultado de secreciones procedentes del testículo, epidídimo y de las glándulas sexuales accesorias (vesículas seminales, próstata y glándulas bulbouretrales de Cowper). En el plasma seminal se encuentran componentes específicos de cada glándula, que son utilizados como marcadores bioquímicos de la función glandular. Estos marcadores se agrupan según su procedencia en: 

Vesiculares: fructosa y prostaglandinas



Prostáticos: Ácido cítrico, fosfatasa ácida, zinc y glutamiltransferasa.



Epidimarios: L-carnitina libre y glicerilfosfocolina. (Cortés Gallego, S.F)

Además el plasma seminal cuenta con una serie de componentes que hacen posible el transporte y supervivencia de los espermatozoides, donde Angulo en 2003 reporta unos parámetros de referencia, que a continuación se describen en la tabla No 3.

TABLA No3. CONSTITUYENTES DEL PLASMA SEMINAL. Agua

75 %

Fructuosa

250 mg/100 ml

Acido cítrico

110- 260mg/100ml

Sorbitol

26- 170mg/100ml

Inositol

7- 14/100ml

Glicerilfosforilcolina

1100-2100mg/100ml

Sodio

178 mg /100ml

Potasio

89mg /100ml

Calcio

6 mg/ 100ml

Magnesio

6 mg /100ml

Cloro

86 mg / 100ml

Prostaglandinas

740 ug /ml

Proteínas

5 g /100 ml (Angulo, 2003)

1.2.4 CARACTERÍSTICAS DE LA RAZA KATAHDIN

a) Origen

El desarrollo de esta raza comenzó a finales de la década de los 50 cuando Michael Piel oriundo del estado de Maine importo un pequeño número desde el Caribe. La granja de Piel tenía en ese tiempo varios miles de ovejas. Piel pensó que " El progreso en la selección de la producción de carne como característica importante, seria eliminando la lana como el mayor factor de selección". El comenzó a experimentar con cruzas entre las ovejas con pelo, y varias especies Británicas, especialmente las Suffolk. Después de casi 20 años de realizar cruzas, Piel, de los híbridos resultantes; luego de usar todas las combinaciones posibles; selecciono

los

animales

individuales

que

poseían

combinación

características deseadas y eventualmente reunió un rebaño de ovejas que llamo Katahdins, nombradas así por el Monte Katahdin en Maine. A mediados del año 1970, el Wiltshire Horn, una raza de Inglaterra que pierde el pelo, fue incorporada al rebano para agregar tamaño y mejorar la calidad del animal para consumo. (KatahdinHairSheep International, 2009).

b) Fenotipo

La raza katahdin no es lanar, sino de tipo carne. El pelaje de las katahdin no requiere esquila y esta preferentemente completamente libre de fibras de lana, el pelaje puede ser de cualquier color y diseño. Son de estatura mediana fuertes y musculosas, con un peso promedio en pie de 125 a 180 libras; su cabeza erecta y bien definida, con o sin la presencia de cuernos, sus ojos están separados entre sí y las orejas no son caídas ni erectas; su cuello fuerte, de mediana longitud, en machos puede estar cubierto con mechones de pelo; sus hombros se mezclan suavemente con el cuello y espalda; su pecho es amplio y lo suficiente mente

profundo como para proveer un amplio lugar para el funcionamiento del corazón y pulmones; su espalda es fuerte, suave y ancha; largo lomo, amplio, profundo y bien carnoso; costillas, buena curvatura ancha y profundas; abdomen, gran capacidad de consumir forraje; ancas amplias y bien carnosas, apariencia redondeada, y profundas; patas con huesos proporcionales con la estatura, los miembros posteriores tienen una proporcionada inclinación, sus miembros anteriores son derechas, fuertes coyunturas; sus cascos son derechos y libres de defectos; los músculos de los muslos sonde espesor mediano, con musculatura obvia en la parte interior y exterior que del musculo que se prolonga hasta el anca; tiene dos testículos bien desarrollados y balanceados(KatahdinHairSheep International, 2009).

c) Rusticidad y temperamento

La raza Katahdinpuede demostrar su poder de adopción en diferentes áreas geográficas, temperatura, humedad, alimentación fuente de forraje y sistema de manejo.En tiempo frio, desarrollan una capa de pelo de invierno muy gruesa la cual la pierden durante las estación más cálidas. El suave pelaje y otras características de adaptación les permiten tolerar bien el calor y la humedad. Las Katahdins son también significantemente más tolerante a los parásitos que las ovejas lanares y si se manejan con cuidado, requieren solamente un mínimo tratamiento para los parásitos. Su temperamento es dócil y de fácil manejo (KatahdinHairSheep International, 2009)..

FIGURA No 2. MachoKatahdin

(Mesa, 2011)

1.2.5 OBTENCIÓN Y EVALUACIÓN DEL SEMEN

a) Vagina artificial Para este procedimiento es necesario el adiestramiento del macho, por la cual será utilizada una hembra como señuelo estrogenizada, teniendo en cuenta que el libido es determinante para esta maniobra (Palma, 2008). La vagina artificial es una imitación de la vagina de la hembra, que mediante un estimulo térmico y mecánico, desencadena la eyaculación. Consta, normalmente, de un cilindro que puede ser de goma y es rígido de 10 a 15 cm de largo y alrededor de 5 cm de diámetro en el cual se hace un orificio provisto de un tapón de rosca, en el centro de la vagina que es por donde se le introducirá el agua caliente a 55 °C y aire para dar la presión y la temperatura adecuada, entre el tubo de la vagina y el agua caliente(para alcanzar una temperatura interna de 45°),(Aisen, 2004). Ésta está construida de la misma manera que la vagina para bovinos, salvo naturalmente las menores dimensiones (Angulo, 2003).

La frecuencia con la cual se puede recolectar el semen como regla general puede indicarse de 3-5 extracciones diarias, seguidas por descansos de 2-3 días (Aisen, 2004). b) Evaluación del semen

La evaluación del semen para su congelación es una condición indispensable para estimar su posible capacidad fertilizante después de la congelación y en consecuencia determinar su aptitud para la congelación (Palma, 2008). Una vez recogido el semen es necesario que no sea expuesto a condiciones desfavorables que afecten su viabilidad.

a) Evaluación macroscópica.

Para la evaluación macroscópica del semen colectado se tendrán en cuanta los siguientes parámetros. 

Color y olor: El semen de carnero es normalmente blanco cremoso. Deben destacarse los eyaculados que presentan coloración blanco-rosácea que indica existencia de sangre, o gris que indica algún tipo de infección en el aparato reproductor. La presencia de orina es un suceso frecuente y le confiere un olor característico, la cual no debe procesarse (Aisen, 2004, Roldan, 2003).Siendo por tanto el olor propio de la especie “Suis Generis” (Palma, 2008).



Volumen: Cuando la colecta es realizada por medio de vagina artificial, el volumen promedio del eyaculado para ovinos es de 1,0 cc, que dependerá de la edad, condición corporal, frecuencia de la colecta y habilidad del operario (Mellisho, 2006). Este se realiza mediante observación directa del

semen sobre un tubo graduado, que posteriormente se registra. Su promedio es de 1 ml (0.3-1.5), en general para los trabajos de rutina se descartan aquellos eyaculados con un volumen menor a 0.4 ml (Aisen, 2004). 

Movimiento en masa macroscópico: Los espermatozoides en movimiento vigoroso de desplazan creando ondas que son visibles a corta distancia. En una maniobra rápida, se observa el tubo recolector con el eyaculado, tratando de determinar el movimiento en remolino u ondas, y de manera grosera, la motilidad de la muestra (Aisen, 2004).

b) Evaluación microscópica

El examen microscópico del semen debe realizarse dentro de los primeros 15 minutos siguientes a la recolección del eyaculado, con el objetivo de determinar con el mínimo error la movilidad espermática, que puede rápidamente por el choque frío, el pH, la morfología espermática y la presencia de elementos extraños, como células epiteliales, leucocitos, grumos de pus, suciedades, etc (Roldan, 2003). 

Motilidad masal: El semen de ovino presenta ondas características a la observación al microscopio, que se valoran subjetivamente de 0 a 5 puntos. Antes de proceder a su utilización, este debe presentar una motilidad masal igual o superiora 3 (Gibbsony Cueto, 2010), pero Palma (2008) recomienda que para obtener las mejores tasas de preñez se recomienda que para destinar a la congelación los eyaculados deben comprender entre las categorías 4 y 5. Esta evaluación permite determinar además impurezas en el eyaculado, que puede hacerlo no apto para su congelación (palma, 2008)

TABLANo 4: VALORACIÓN SEMICUANTITATIVA DE LA MOTILIDAD EN MASAL MICROSCÓPICA VALOR

CLASE

DESCRIPCIÓN

Muy buena

Hondas densas de movimiento muy rápido. No puede observarse espermatozoides individuales. 90% o más de los espermatozoides son activos.

Buena

Hondas y remolinos vigorosos pero no tan rápidos. Alrededor del 70% y 85% son activos.

Regular

Hondas de movimiento lento, espermatozoides individuales pueden ser observados 45% a 65%.

Pobre

No aparecen hondas, pero se ven movimientos espermáticos, solo el 20% a 40% de los espermatozoides están vivos y su motilidad es pobre

Muy pobre

Muy pocos espermatozoides 10% que muestran algún signo de vida

Muertos

Sin movimiento (Evan, y Maxwell, 1987 En Mellisho, 2006).



Motilidad Individual progresivo: Es uno de los parámetros mas utilizados en la valoración del semen. Es una técnica de evaluación subjetiva, que permite identificar el movimiento individual de los espermatozoides, luego de la dilución. Su comparada relación con la fertilidad de los machos la constituye en un método práctico de valor en la evaluación de semen diluido, particularmente antes, pero también después de la congelación (Palma, 2008).

El movimiento progresivo se define como el porcentaje respecto al total de motiles , observando el porcentaje de espermatozoides que avanzan más o menos de forma rectilínea en el campo. Los espermatozoides que giran sobre sí mismos pueden estar indicando que sufren un choque térmico o 49

que el medio no es isotónico con el semen (Aisen, 2004). Únicamente se utilizaran eyaculados con una motilidad progresiva mínima del 70% (Córdova, et al. En Brito,2004 y Palma, 2008)

TABLANo 5: CLASIFICACIÓN DE LA MOVILIDAD INDIVIDUAL. Muy buena

80 a 100%

buena

60 a 80%

Regular

30 a 60%

Mala

Menos del 30% (Roldan, 2003)



Concentración: Para determinar este valor expresado como el número de células espermáticas por centímetro cubico de semen, se realizará por medio del espectrofotómetro

Un método rápido de medición de la concentración es la utilización del espectrofotómetro,

calibrado

distintas

concentraciones

sus

correspondientes absorbancias, de acuerdo a su nivel de transmitancia mediante una curva de calibración (Aisen, 2004). Un semen de carnero de buena calidad contiene de 3.5 a 6.0 mil millones de espermatozoides por ml (Mellisho, 2006).

Por otra parte, la concentración se puede calcular mediante pruebas basadas en su consistencia o apariencia, siendo un poco impreciso pero de rápida aplicación en campo. A continuación se describe dicha aplicación (tabla No 6).

TABLANo 6: CONCENTRACIÓN DEL SEMEN DE CARNERO Y CHIVO VALORADA POR SU APARIENCIA/COLOR (Avans y Maxwell, 1987)

VALOR

COLOR/CONSISTENCIA

CONCENTRACIÓN ESPERMÁTICA(X 10

PROMEDIO 6

(x 10 )

ML)

Cremosa espesa

5000

4.5 a 6.0

Cremosa

4000

3.5 a 4.5

Cremosa suave

3000

2.5 a 3.5

Lechosa

2000

1.0 a 2.5

Nubosa

700

0.3 a 1.0

Acuosa

Insignificante

______ (Mellisho, 2006)



Porcentaje de espermatozoides vivos: Se determina a partir de una coloración (Giemsa)que tiñe los espermatozoides muertos, (rosa pálido) y dejan incoloros a los íntegros (Palma, 2008).



Morfología espermática: Cada eyaculado contiene una serie de espermatozoides anormales, pero si su proporción es muy alta, entonces estaremos ante un semen de baja fertilidad. Las muestras que contengan más de 15% de anomalías no deben usarse en programas de I.A. (Roldan, 2003 y Córdova, et al. En Brito, 2004, Aisen, 2004).

1.2.6DILUYENTES DEL SEMEN.

El plasma seminal suministra a los espermatozoides los nutrientes necesarios para mantener la actividad metabólica necesaria para el proceso de transporte espermático a través del genital femenino. En el eyaculado, esta actividad

metabólica solo puede mantenerse durante un periodo de tiempo muy limitado. Para poder conservar los espermatozoides durante periodos prolongados es necesario que se reduzca la actividad metabólica de los espermatozoides, mediante la dilución en un medio adecuado y la reducción de la temperatura (Gadea, 2003)

Existen una gran variedad de diluyentes y métodos empleados en la conservación de semen, sin embargo todos los medios para este fin deben de cumplir con unas características propias del diluyente, las cuales deben ser: 

Ser isotónico con el plasma seminal (320 mOsm/kg) cuando es utilizado en refrigeración, e hiperosmótico (400 mOsm/Kg) en congelación.



Poseer un pH próximo a 7 y capacidad tampón con el fin de mantener el pH en la neutralidad, compensando la producción de ácido láctico durante la congelación.



Contener moléculas que protejan a los espermatozoides frente al frío, entre estas sustancias están la yema de huevo, leche y/o glicerol.



Contener en su constitución una fuente de energía, siendo la glucosa y fructosa las más utilizadas.



Estar libre de bacterias y contaminación, para lo cuál se utilizan antibióticos en su composición.



Aumentar el volumen substancialmente con el fin poder realizar múltiples inseminaciones (Barbas, 2008y Merino, 2003).

Los diluyentes deben poseer los puntos antes citados además de ser de preparación fácil, estables y económicos (Salisbury, 1982 En Aguirre Reyes, 2006)

Los diluyentes comerciales del mercado actual, que se usan para congelar semen ovino, originalmente fueron hechos para semen bovino, aunque existen algunos diluyentes específicos para el primero, pero su uso se limita al menen fresco (Aguirre reyes, 2006)

A pesar de que se han probado una gran cantidad de diluyentes para la congelación del semen del carnero, no existe un consenso acerca de cual es el que proporciona mejores resultados al descongelar, siendo los diluyentes a base de Tris-yema de huevo o de Lactosa-yema de huevo los que más se han experimentado (Angulo, 2003).

a) Nutrientes

El espermatozoide tiene la capacidad de producir la energía necesaria para mantener su metabolismo celular y generar el movimiento del flagelo, principalmente por vías glucolíticas a nivel mitocondrial. La fuente mitocondrial más frecuente en la composición de los diluyentes es la glucosa, aunque se han usado otros azucares como (galactosa, fructosa, ribosa) sin que los resultaos supere a la glucosa. (Gadea, 2003).

b) Sustancia buffer.

El pH del semen recién eyaculado se encuentra próximo a 7.4+0.2, al igual que otros fluidos orgánicos, y cuando se reduce este pH al mismo tiempo se reduce el metabolismo energético del espermatozoide y su motilidad. El metabolismo glucolítico que desarrolla el espermatozoide (carbohidrato principal es glucosa),

hace que el pH intracelular disminuya y el metabolismo celular quede reducido. El acido láctico es el principal metabolito de este proceso y ha sido utilizado como índice de calidad seminal. (Gadea, 2003). El pH de los diluyentes normales utilizados oscila entre 6.8 y 7.2 ayudando a controlar el pH del medio. La adición de agentes tamponadores ayudan, por tanto, a controlar el pH del medio y a proteger a los espermatozoides de una lesión criogénica (Barbas,2008), Entre los tamponadores más simples se encuentran el bicarbonato y el citrato (sódico), ácido cítrico que presentan una capacidad de tamponar limitada, mientras que otros tamponadoresmás complejos (Tes, Hepes, Mops, Tris) pueden regular el pH en un rango más amplio y no son dependientes de la temperatura (Gadea, 2003).

c) Protección contra el choque térmico.

La yema de huevo es un componente común en los diluyentes de semen ya que protege a los espermatozoides contra el choque frio protegiéndolos durante el congelamiento-descongelamiento, por otra parte recomiendan que la cantidad de agregar yema de huevo a un diluyente depende de la composición del mismo y varia desde un 4% a un 20% (Salamon y Maxwell, 2000 en Cosme, 2005).Para corroborar lo anterior Garcia et al., 1998 realizaron estudios con diversas concentraciones de yema de huevo (1,5%, 2% y 12%) mostraron una mejora en la calidad del semen descongelado conforme aumentaba la proporción de yema en el diluyente.

d) Antibióticos. Los antibióticos se agregan a los diluyentes con el fin de prevenir la proliferación microbiana en el semen, la combinación de penicilina-estrectomicina (500.000UI + 625 mg/l) es un ingrediente estándar en los diluyentes utilizados para semen en rumiantes(Anel, et al,. 1998)

e) Crioprotectores

Bioquímicamente se distinguen tres tipos de crioprotectores, los alcoholes (metanol, etanol, propanol, 1-2 propaneidol y glicerol), los azucares (glucosa, lactosa, sucrosa y sacarosa) y el dimetilsulfóxido (DMSO). También pueden clasificarse en agentes penetrantes y no penetrantes (Ávila, et al.2006).

Los agentes penetrantes se constituyen por ser de bajo peso molecular y permeable a través de la membrana celular, las cuales se encuentran el glicerol, el DMSO y el propaneidol. Su acción protectora se atribuye a prevenir la acumulación excesiva de electrolitos y de otras sustancias durante el proceso de congelamiento y la formación de cristales de hielo que rompen la estructura de la membrana (Ávila, et al.2006), así como evitar la excesiva deshidratación causada por la congelación lenta (Sandoval, 2007).

De estos los más el glicerol y la yema de huevo son los agentes más comúnmente utilizados en la congelación de semen ovino, alcanzando buenas tasas de supervivencia en esta especie con glicerol en concentraciones de 4 y 6% (Merino, 2003). Concentraciones mayores a esta disminuiría la supervivencia de los espermatozoides post-descongelación debido a una reacción toxica (Graham, 1978. En Merino, 2003 y Aisen, 2004).

Otro agente crioprotector frecuentemente utilizado es la yema de huevo, que protege al espermatozoide del shock frío y durante la congelación y la descongelación. La concentración de yema de huevo en el diluyente para semen ovino puede variar en un amplio rango, encontrándose el óptimo alrededor del 15%, aunque esta cifra también depende de la proporción de los demás compuestos presentes en el diluyente (Merino, 2003). Este efecto crioprotector se debe halas lipoproteínas y lectinas que contienen la yema de huevo (Palomino, 2001). La yema de huevo actúa también como amortiguador osmótico,

permitiendo una mayor tolerancia de los espermatozoides a las soluciones hipo e hiperosmóticas, la protección que ejerce durante la congelación se debe a su adhesión ala membrana plasmática (Aisen, 2004)

Los crioprotectores no permanentes son aquellos que al ser incorporados en el medio de dilución recubren la membrana plasmática de los espermatozoides protegiendo su estructura de la acción del frio, ninguno atraviesa la membrana plasmática por su alto peso molecular (Cortes Gallego, 2011). Estos suelen usarse en asociación con los agentes crioprotectores permeantes. (Aisen.2004).Los crioprotectores no permeantes más utilizados para la congelación de semen de diferentes especies son la sacarosa, rafinosa, trehalosa y lactosa (Sandoval.2007) y proteínas de la leche descremada y yema de huevo (Cortes Gallego, 2011).

1.2.7EFECTOS DE LA CRIOPRESERVACIÓN EN LA CÉLULA ESPERMÁTICA.

Las bajas temperaturas (asociadas al aumento de la rigidez de la membrana) y la rapidez (decimas de segundo) con la que suceden los cambios osmóticos en los procesos de congelación y descongelación hacen muy difícil el movimiento de las moléculas a través de la membrana mediante el proceso de transporte activo (dependientes de ATP), la disminución de la temperatura desde 25°C a 10°C reducen un 60% la actividad de las bombas dependientes de ATP (transporte comúnmente de dos moléculas a través de la membrana dependiente una de ellas de ATP y iones de H+), en consecuencia, los procesos de difusión son los que predominan en los momentos de estrés osmótico. La lesión celular crio inducida se explica en función de la formación de hielo intracelular y el estrés osmótico el que se ven sometidas las membranas celulares durante la congelación. (Avila, et al, 2006).

En el proceso de congelación los espermatozoides son sometidos a una disminución gradual de la temperatura, lo que produce una reducción reversible de

la actividad metabólica, en la especie ovina esta actividad se alcanza a temperatura cercanas a los-75°C (Maxwell, 1995. En Merino, 2003). Una congelación adecuada permite a los espermatozoides en el tiempo su integridad y su capacidad funcional (Merino, 2003).

Si la velocidad de congelación es alta o rápida, la célula espermática muere por la formación de cristales de hielo a nivel intracelular, pero si la velocidad de congelación es lenta, no se producirá la formación de cristales grandes de hielo intracelular, pero se comprometerá la vida celular por aumento de concentración de solutos en el citoplasma (Aisen, 2004).

Existe un rango de temperaturas críticas a la que los espermatozoides son especialmente sensibles (-10 y -40°C). Durante el proceso de criopreservación, los espermatozoides deben atravesar este rango crítico en dos oportunidades, una vez en la congelación y otra durante la descongelación (Wastson, 1981 En Merino, 2003).

Debido a la suma de estos factores se produce una disminución de la capacidad de sobrevivencia de los espermatozoides, una serie de cambios morfológicos y una disminución de la motilidad espermática y de los procesos metabólicos (Barbas, 2008)

1.2.8ALOE VERA (Aloe barbadensis)

La planta de Aloe vera es originaria de África, específicamente de la península de Arabia. La palabra Aloe deriva del árabe “alloeh” y significa “sustancia amarga brillante”, mientras que “vera” significa verdad. Se le denomina también con el nombre de sábila. Fue introducida por Cristóbal Colón en el continente americano, en los tiempos del descubrimiento de América, debido a que él la utilizaba como medicina para su tripulación (Ferraro, 2009).

Se ha propuesto que el gel aloe vera (Aloe barbadensis,) promueve los procesos de cicatrización externa e internas (gastritis) y regeneración celular (Arce et al, 2007), emoliente, antiinflamatorio, regenerador de tejidos, antibiótico, regulan las respuestas fisiológicas, laxante y hasta inhibe y estimula la función hormonal, (Sanabreaa, 2008 y Cosme, 2005), además de contar con propiedades antioxidantes, inmuno estimulantes, anti cancerígenas,

anti vejecimiento

antidiabético (Giosso, 2008).

1.2.8.1 Descripción de la planta.

El Aloe vera pertenece al reino Plantae; división: Magnoliophyta; clase: Liliopsida; orden: Liliales; familia: Liliaceas; género: Aloe; especie: Aloe Barbadensis (Miller); nombre común: Aloe vera (Syed et al, 1996 En Ferraro, 2009).

La planta Aloe vera o Aloe Barbadensis Milleres la variedad más utilizada en todo el mundo para la medicina curativa, de hojas elongadas, carnosas y ricas en agua, alcanza una altura de 50 a 70 cm; con tallos de 30 a 40cm de longitud, poseen el borde espinoso dentado; las flores son tubulares, colgantes, amarillas. Esta planta es xerófila, es decir, se adapta a vivir en áreas de poca disponibilidad de agua y se caracteriza por poseer tejidos para el almacenamiento de agua (Ferraro, 2009).

FIGURA No 3: Planta de Aloe Vera

Fuente:http://fichas.infojardin.com/

Lo más utilizado son las hojas, cada una está compuesta por tres capas: una interna que es un gel transparente que contiene 99%de agua y el resto está hecho 58

de glucomananos, aminoácidos, lípidos, esteroles y vitaminas; la capa intermedia o látex que es la savia amarillo amarga contiene antraquinonas y glucósidos y la capa externa gruesa llamada corteza, que tiene la función de protección y síntesis de carbohidratos y proteínas (Surjushe et al, 2008 En Ferraro, 2009).

1.2.8.2 Principios activos

Se le reconocen aproximadamente 75 principios activos potenciales (Arce et al, 2007), donde algunos de los cuales se le observa en la siguiente tabla:

TABLA No 7: PRINCIPIOS ACTIVOS DEL ALOE VERA Sacáridos

Vitaminas

Aminoácidos no esenciales Arginina

Componentes inorgánicos Calcio

Miscelánea

Cicloxigenasa

Aminoácidos esenciales Lisina

Celulosa

BI tiamina B2 Riboflavina B6 piridoxina Acido folico Vit C

Hidroxiprolina

Sodio

Oxidasa

Treonina

Trigliceridos

Acido aspártico Acido glutámico Prolina

Cloro

Amilasa

Valina

Esteroides

Magnesio

Catalasa

Leucina

Cromo

Lipasa

Isoleucina

Betacitosteroles Lignina

Vit A

Glicina

Zinc

Fenilalanina

Acido úrico

Vit E

Alanina

Cromo

Fosfatasa alcalina Carboxipeptidasa

Metionina

Giberelina

Colina

Tirosina

Cobre

Histidina

Manganeso

Antraquinonas Aloína Glucosa Barbaloína Ribosa Isobarbaloína L ramosa Antranol Aldopentos Acido aloético Ester de ácido Ciamínico Aleo emodina Emodina Acido crisofánico Resistanol Antraceno

Enzimas

Colesterol

Sustancia lecitina-like Acido salicilico Acido araquidónico Sorbato de potasio

(Ferraro, 2009).

Arce et al, 2007, señala que los carbohidratos son los más destacados en la composición del gel de Aloe Vera y son ellos los que ostentan las propiedades que se conoce.

1.3MARCO GEOGRÁFICO Y CLIMÁTICO

El presente trabajo fue desarrollado en las instalaciones de la clínica veterinaria de pequeños animales de la “Fundación Universitaria Juan de Castellanos” en el municipio de Soracá, vereda Otro Lado, departamento de Boyacá, ubica 7da en la cordillera central de los Andes en la mesita cundiboyacense, al norte limita con Chivata, al oeste con Siachoque y Viracachá, al sur con Ramiriquí y Boyacá (Boyacá) y aleste con la ciudad de Tunja.

El municipio de Soracá cuenta con una temperatura media de 12 °C, apta para labores de campo, donde sus principales fuentes de economía son el cultivo de papa, trigo, frutales trigo y pastos para la ganadería.

En cuanto a la localización departamental, está ubicado en la zona del centro del departamento de Boyacá a 5° 30´de latitud Norte y 73´de longitud Oeste de Grenwich.

1.4MARCO LEGAL

Del Código Sanitario Para Animales Terrestres (Oie), 2010 

DEL ARTÍCULO 4.6.6

Condiciones aplicables a la toma de semen

1. El suelo de la zona de monta deberá estar limpio y presentar una superficie saneada.

2. Los cuartos traseros del animal excitador, ya sea maniquí o animal vivo, deberán mantenerse limpios. El maniquí se limpiará a fondo después de cada sesión de toma de semen. Los cuartos traseros de los animales excitadores se lavarán cuidadosamente antes de cada sesión de toma. Después de la toma de cada eyaculado se limpiará el maniquí o los cuartos traseros del animal excitador. Se podrán utilizar protecciones plásticas desechables.

3. La mano de la persona encargada de tomar el semen no deberá entrar en contacto con el pene del animal. Se utilizarán guantes desechables que se cambiarán para cada toma.

4. Después de cada toma se limpiará a fondo la vagina artificial: se desmontará y cada una de sus piezas se lavarán, enjuagarán, secarán y mantendrán protegidas del polvo. Antes de volver a montar la vagina se desinfectará el interior del cuerpo del aparato y del cono con métodos de desinfección autorizados, como los que utilizan alcohol, óxido de etileno o también vapor. Una vez montada, la vagina artificial se conservará en un armario que se limpiará y desinfectará periódicamente.

5. El lubrificante que se utilice deberá ser aséptico. 6. Se recomienda no sacudir la vagina artificial después de la eyaculación, para evitar que el lubrificante y las impurezas pasen a través del cono y se mezclen con el contenido del tubo recolector.

7. En caso de toma de eyaculados sucesivos, se cambiará de vagina artificial para cada monta. La vagina también se cambiará si el animal ha insertado el pene y no ha eyaculado.

8. Los tubos de toma deberán estar esterilizados y ser desechables o esterilizados en autoclave o por calentamiento en horno a 180°C durante, por lo menos, 30 minutos. Los tubos se taparán para evitar el contacto con el medio ambiente hasta que vuelvan a utilizarse.

9. Después de la toma de semen, el tubo permanecerá acoplado al cono e insertado en su manga hasta ser sacado del local de monta y trasladado al laboratorio. 

DEL ARTÍCULO 4.6.7

Condiciones aplicables a la manipulación del semen y a la preparación de dosis de semen en el laboratorio.

1. Diluyentes

a) Todos los recipientes deberán estar esterilizados. b) Si se utilizan constituyentes de diluyente suministrados en polvo, el agua que se añada deberá ser destilada o desmineralizada, esterilizada (121 °C durante 30 minutos o equivalente), recogida correctamente y enfriada antes de ser utilizada. c) Cuando se utilice leche, yema de huevo o cualquier otra proteína animal para preparar el diluyente del semen, el producto deberá estar exento de gérmenes patógenos o ser esterilizado. Cuando se utilice yema de huevo, se emplearán técnicas asépticas para separarla del huevo. La utilización de yema de huevo comercializada para el consumo humano o de yema de huevo sometida a procedimientos de pasteurización o irradiación para reducir la contaminación bacteriana será una alternativa posible. Cualquier otro aditivo que se utilice también deberá esterilizarse.

d) El diluyente no deberá conservarse más de 72 horas a +5 °C antes de ser utilizado. Si se conserva a -20 °C, el período de conservación podrá ser más largo. El diluyente se conservará en un recipiente cerrado.

2. Condiciones aplicables a la conservación del semen

El semen destinado a la exportación deberá conservarse separado de cualquier otro material genético no conforme con los requisitos del presente capítulo, con nitrógeno líquido fresco, dentro de frascos esterilizados o asépticos.

3. Selección de semen

El equipo de selección de semen debe ser limpiado y desinfectado tras su utilización con cada animal según las recomendaciones del otorgante de la licencia del sistema.

Si se añade plasma seminal, o sus componentes, el semen seleccionado antes de la crioconservación y almacenamiento, debe derivar de animales de igual o mejor situación sanitaria.

2. METODOLOGIA

2.1 TIPO DE ESTUDIO

El estudio para el presente trabajo de investigación es de tipo experimental descriptivo, ya que están orientado hacia la comprobación de sus resultados obtenidos a partir de los tres grupos de estudio (como testigo: Triladyl ® al 100%; y como grupo experimental: Triladyl® al 70% más 30 % Aloe Vera; Triladyl® 90% más Aloe Vera al 10%). La evaluación de los diluyentes se realizó en cuatro periodos de tiempo (al diluir el semen a 35°C, finalizado el enfriamiento a 5°C, vapores de nitrógeno, concluido el proceso de congelamiento a -196°C, y finalmente a las 48 horas congelamiento). En cada periodo las variables a medir fueron: porcentaje de motilidad progresiva y porcentaje de células vivas.

2.2 DISEÑO EXPERIMENTAL

El presente trabajo cuenta con un diseño por bloques completos al azar, donde se tuvieron en cuenta los siguientes criterios de inclusión: 

Dos colectas, con un intervalo de cuatro días entre ellos, con tres eyaculados por colecta, formando así un Pool, para luego dividirse en los tres grupos experimentales.



Evaluación

las

características

macroscópicas

(color,

volumen,

consistencia) y microscópicas (motilidad masal, motilidad individual, concentración, espermatozoides vivos y morfología) del los eyaculados de un ovino macho raza Katahdin.



Evaluar el efecto de porcentaje de Aloe Vera en el diluyente comercial o variable independiente, en los siguientes grupos: Triladyl® al 70% más Aloe vera al 30%; Triladyl® al 90% más 10% de Aloe Vera y como grupo control Triladyl® al 100%.



Dos variables de dependientes: porcentaje de motilidad progresiva y porcentaje de espermatozoides vivos durante cinco faces (Al diluir el semen a 35 °C. finalizado el enfriamiento a 5 °C, vapores de nitrógeno, concluido el proceso de congelamiento a -196 °C, 48 horas congelamiento).

Esta información se resume en la siguiente tabla:

TABLANo 8: DESCRIPCIÓN DE LOS TRATAMIENTOS A PARTIR DEL DILUYENTE TRILADYL® MÁS EL COADYUVANTE ALOE VERA EN DOS CONCENTRACIONES 10%-30%. Número de colecta 1.0

2.0

Tratamiento Triladyl® 100% Triladyl® 90% más Aloe Vera 10% Triladyl® 70% más Aloe Vera 30% Triladyl® 100% Triladyl® 90% más Aloe Vera 10% Triladyl® 70% más Aloe Vera 30%

Evaluación de la calidad seminal % motilidad progresiva % espermatozoides vivos 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III III

Abreviaturas: III. Número de pajillas 1. Al diluir el semen a 35 °C. 2. Finalizado el enfriamiento a 5 °C 3. Vapores de nitrógeno. 4. Concluido el proceso de congelamiento a -196 °C 5. 48 horas congelamiento.

2.3 MATERIALES Y METODOS 

1 agua destilada



1 balanza



1 caja de caza



1 caja de cubreobjetos-portaobjetos



1 calentador de agua (baño maría)



1 catéter



1 Cava



1 Cronometro



1 Kit test iris



1 micropipeta



1 nevera



1 paquete de bolsas nazco



1 paquete palillos de tinto



1 paquete servilletas absorbibles



1 platina térmica



1 potenciómetro ó tiras para medir pH



1 probeta



1 rack de congelación



1 selladora de pajillas



1 solución salina



1 Termómetro d 0 a 60°C



1 Vagina artificial



1 venoclisis de macrogoteo



100 pajillas



3 tubos colectores graduados o 1 paquete bolsas de colecta



3 vasos precipitados



50 Puntas amarillas para micropiptas



Aloe Vera (Ya preparado)



Diluyente Triladyl®



Microscopio



Nitrógeno liquido

2.3.1

METODOS

2.3.1.1

Obtención del semen.

En el macho katahdin antes de su colecta, fue preparado y acostumbrado semanas anteriores para la obtención del eyaculado por medio de vagina artificial, así mismo de realizarse un examen físico y andrológico (ver anexos). El animal se desparasitó con doramectina, se hizo una aplicación intramuscular de complejo vitamínico y mineral. Además previo a la colecta fue separado por 5 días de la manada, manteniéndolo estabulado y con una dieta uniforme a partir de ensilaje de maralfalfa, concentrado y agua a voluntad. Para la obtención de los eyaculados, el ovino fue puesto en un lugar tranquilo cerca a las instalaciones de la clínica de pequeños animales de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos junto con la hembra estrogenizadaen horas de la tarde para las perspectivas colectas, por poseer un área adecuado, abierto, tranquilo. Antes de realizar las colectas perspectivas, el macho se le recortaron los pelos prepuciales, posteriormente se lavo el prepucio con agua corriente y se seco con servilletas absorbibles, luego, se enjuago dos veces la cavidad prepucial con solución salina fisiológica con la ayuda de un catéter sin producir lesión del mismo.

A continuación el macho se acerco a la oveja haciendo varios intentos de monta, finalmente cuando el macho logra montar a la hembra, se introdujo la vagina con el pene desviado, por lo cual se logró sujetando el pene del prepucio con la mano izquierda y finalmente observando el empuje de cadera o golpe de riñón, obteniendo así el eyaculado para su posterior evaluación (Ver foto No 9).

a) Vagina artificial La vagina artificial fue llenada con agua a una temperatura de 55°C (±) 5 °C (para alcanzar una temperatura interna de 45°) e insuflando con aire. El tubo colector fue atemperado a una temperatura de 30-35°C para evitar el shock térmico de las células espermáticas (Palma, 2008,) (Ver foto No 7) Posteriormente a la obtención del eyaculado en el tubo colector este fue protegido del frio directo, siendo llevada la muestra a baño María a 35°C para su evaluación y posterior utilización (Palma, 2008,).

2.3.1.2

Evaluación del semen

Evaluación macroscópica 

Color, volumen y consistencia: Esta característica se evaluó de forma directa en el tubo colector graduado.

Evaluación microscópica 

Motilidad masal: Para su medición, se colocó una gota de semen puro (sin diluir) a un portaobjetos limpio y templado a 37°C. Se observan las ondas características sin cubreobjetos (40 0 100x), en el borde de la gota (Aisen, 2004). 68



Motilidad Individual progresiva: Para su determinación se colocó una gota de diluyente isotónico y una pequeña gota de semen fresco en un portaobjetos a 37°C. se homogenizan ambas gotas y se observan con cubreobjetos a 100-400x (Aisen, 2004).



Concentración: La concentración se determinó a partir de una dilución de citrato de sodio al 2,9%, 1:100 (0,05 ml de semen en 5 ml de citrato de sodio al 2,9%. Para su lectura se uso un espectrofotómetro, donde se calibro a una longitud de onda de 550 nm para la especie ovina (Jiménez ,2011) Es así como al medir el semen en el espectrofotómetro, este tomo los valores de referencia tal como lo reporta Jimenez, 2011 en la siguiente tabla:

TABLANo 9: EQUIVALENCIAS (TRANSMITANCIA/CONCENTRACIÓN) PARA OVINOS (0,05 ML DE SEMEN EN 5 ML DE CITRATO DE SODIO AL 2,9% A UNA LONGITUD DE ONDA DE 550 NM)

Tras m Conc D. Opt Tras m Conc D. Opt

4099 0,95 9 21

4010 0,92 1 22

3920 0,88 6 23

3831 0,85 4 24

3742 0,82 4 25

3652 3563 3473 0,79 0,77 0,74 6 5 26 27 28

3384 0,72 1 29

3295 0,69 9 30

3205 3116 3026 2937 2848 2758 2669 2579 2490 2401 0,76 0,65 0,63 0,62 0,60 0,58 0,56 0,55 0,53 0,52 8 8 8 2 5 9 3 8 3 (Jiménez, 2011)



Porcentaje de espermatozoides vivos: Para su determinación se colocó en el extremo de un portaobjetos templado a 37 °C1 gota de colorante (moviesperma) y 1 gota de semen, para luego mezclarlas. Posteriormente se observó de 100 a 200 espermatozoides en distintos campos, expresando el resultado en porcentaje de espermatozoides vivos (Aisen, 2004 y Roldan,, 2003).



Morfología espermática: para este examen se tomaron 5 gotas de semen y 5 gotas de colorante “Cuenta esperma Irys”, posteriormente se homogenizo, tomando una gota de la mezcla para colocarla en un portaobjeto, luego, se procedió hacer el frotis, dejándola secar al aire libre. De inmediato que la lamina estuvo seca, se agrego el fijador “morfoesperma iris” dejándolo actuar por 5 minutos, por ultimo se desecho el fijador y se lavo la placa con agua suave, se cubrió la placa con un colorante “Morfoesperma II Irys”, dejándolo actuar por 5 minutos, se realizo un segundo lavado y se dejo secar, realizando la lectura a un objetivo 100x.

2.3.2 DESCRIPCIÓN DE LOS TRATAMIENTOS

Para cada colecta se obtuvieron tres eyaculados, con intervalos de 15 minutos entre ellos. Posteriormente se evaluaron las características macroscópicas de cada eyaculado, luego, se mezclaron para formar un Pool de colecta dentro de un tubo atemperado a 36 ± 1°C, evaluando sus características microscópicas. Para cada grupo, se obtuvo

un número significativo de pajillas, dependiendo a su

volumen y concentración. El volumen de cada pajilla fue de 0.5 ml, las cuales fueron puestas al azar en las dos variables de medición (porcentaje de motilidad progresiva y porcentaje de espermatozoides vivos), durante cinco etapas de evaluación (1. Al diluir el semen a 35°C; 2. Finalizado el enfriamiento a 5 °C; 3. Vapores de nitrógeno; 4. Concluido el proceso de congelamiento a -196 °C; 5. Y a 70

las 48 horas congelamiento).Para cada pajilla de 0.5 ml se utilizó una concentración de 100x106 espermatozoides totales por dosis (Aisen, 2004).

a.Extracción de los cristales de Aloe Vera.

Las pencas de Aloe vera se compraron en un mercado tradicional, posteriormente se lavaron con agua estéril eliminando los residuos de la superficie. Se dejaron escurrir y se retiraron los bordes de las hojas, donde se ubican los chuzos o espinas. El corte se realizó 2 cm hacia dentro, para facilitar el retiro de las demás partes de la corteza. Después de obtener el gel, se licuó y se filtró a través de papel filtro depositándose en un recipiente hermético estéril hasta completar un volumen de 100 ml (Cosme, 2005). Con un potenciómetro se evaluó el pH de los extractos de Aloe Vera, los cuales estaban con un valor promedio de 6.3, siendo el pH tolerado por los espermatozoides de 6.5 (Cosme, 2005).

b. Preparación del diluyente. El Triladyl® es un compuesto buffer que contiene TRIS, Ácido cítrico, azúcar (glucosa), Glicerina y antibióticos que por cada 100 ml contiene5 mg tilosina, 25 mg gentamicina, 30 mg espectinomicina y15 mg lincomicina (Aguirre Reyes, 2006).

El diluyente listo para su uso se compone de una parte de concentrado de Triladyl®, tres partes de agua de alta pureza y una parte de yema de huevo, de modo que el diluyente contiene 20% de yema de huevo. Se comienza la preparación vaciando un frasco completo de concentrado de Triladyl® en una probeta graduada, agregándole 750 ml de agua de alta pureza. A

continuación se separó completamente la yema de huevo fresca de la clara de huevo y de sus membranas y se pesaron 250 g en una balanza.

La solución madre es luego agregada en varios pasos a la yema de huevo, mezclándola cuidadosamente. Para el desarrollo completo de las cualidades de conservación del Triladyl®, se cuidó de que la solución madre sea adicionada a la yema de huevo y no en sentido contrario. El diluyente es filtrado a continuación por papel filtro estéril.

Terminado el preparado del producto comercial, se utilizó 70% del contenido, agregándole a éste mismo un 30% del extracto de Aloe Vera como diluyente no convencional; de igual forma, se determinó para el 10% de Aloe Vera junto con un 90% del contenido del diluyente comercial. Como diluyente testigo para el estudio se utilizo el 100%del producto comercial.

c. Cálculos para determinar Número de pajillas

Luego de la obtención de cada eyaculado, se colocó en baño maría a 35°C mientras se lleva a cabo los exámenes ya descritos. Después de establecida la concentración, se calculó el número total de espermatozoides en el eyaculado. Ese número fue dividido por la cantidad de células espermáticas que llevará cada dosis, obteniéndose el total de dosis que se podrán lograr en cada eyaculado. Finalmente el número obtenido se multiplicó por el volumen correspondiente a cada dosis (o.5 ml pajilla) dando el resultado del volumen total, esto es diluyente más semen (Palma, 2008).

d. Predilución y dilución del semen

El eyaculado fue prediluido dentro de bolsas nazco en proporción 1:1, vertiendo lentamente el diluyente a lo largo de la pared del vaso. Una vez calculado el

volumen total del diluyente, el semen prediluido fue vertido a lo largo de la pared interna a un envase temperado de mayor tamaño, previamente enjuagado con diluyente. A continuación se adicionó el volumen de diluyente faltante al semen prediluido, agitando suavemente el envase para favorecer la dispersión homogénea del semen en el diluyente (Triladyl®, 2011).

El semen, el diluyente y las bolsas nazco estuvieron siempre a igual temperatura que el semen, para evitar un shock térmico de las células espermáticas. El semen prediluido puede retirarse del baño maría para continuar su procesamiento a temperatura ambiente. El envasado se efectúa a temperatura ambiente (Ver foto No 12).

e. Enfriamiento Del Semen o Tiempo De Equilibrio

El enfriamiento se realizó de forma progresiva en una cámara de refrigeración “nevera” donde la temperatura descendió paulatinamente hasta llegar a una temperatura de 5 °C, durante dos horas (López, 2008; García. et al, 1998; Jones y Martin, 1993 En Brito, 2004; Palma, 2008). Aisen (2004) recomienda una refrigeración moderada, oscilando entre -0.1°C/min a -0.5 °C/min.

En este periodo el espermatozoide se adapta para reducir su metabolismo (Merino, 2003). Una refrigeración de mayor velocidad podría causar una serie de cambios en el metabolismo y bioquímica del semen que reduce la motilidad y actividad metabólica de los espermatozoides (White, 1993 En Merino, 2003). (ver foto No 13).

Envasado

Cada pajilla fue envasada a un volumen de 0.5 ml con la ayuda de una sonda y por aspiración, sellándose posteriormente con selladora manual.

g. Vapores de nitrógeno-congelamiento.

Finalizado el proceso de equilibrio a 5°C, las pajillas se expusieron a vapores de nitrógeno durante 15 minutos de forma horizontal con ayuda del rack de congelación dentro de la cava (4 cm por enzima del nivel de nitrógeno -120°130°C) (Palma, 2008)e inmediatamente se introdujeron en el termo con nitrógeno liquido para ser criopreservadas a -196 °C (López, 2008).

h. Descongelamiento

Por cada tratamiento empleado (Dilución, enfriamiento, vapores de nitrógeno, concluido a los -196 °C y a las 48 horas congelación)

se descongelaron las

pajillas en agua a 37 °C durante 30 segundos (Aisen, 2004). A continuación se colocó una gota de semen entre porta y cubreobjeto atemperados, en esta observación se estimaron los porcentajes de espermatozoides vivos como la motilidad progresiva.

2.4DESCRIPCIÓN DE LA POBLACIÓN

En el presente estudio se utilizo un ovino macho de raza Katahdin, como fuente de células espermáticas, edad aproximada 3 años, peso 65 kg y circunferencia escrotal de 31 cm, al cual se realizó un examen físico y capacidad reproductiva. El animal se desparasitó con doramectina, se hizo una aplicación intramuscular de complejo vitamínico (Fosfoland®). Igualmente previo a la colecta fue separado por 5 días de la manada, manteniéndolo estabulado y con una dieta uniforme a partir de ensilaje de maralfalfa, concentrado y agua a voluntad.

Este ejemplar fue seleccionado debido a que es el único ejemplar de la raza presente el sector, además de su capacidad reproductiva debido a que es el progenitor de las crías presentes en la manada, su destreza y actitud de dominancia, su rusticidad y gran mansedumbre.

Estudios recientes demuestran que el uso de

un solo ejemplar para

investigaciones de congelación de semen, constituyen una muestra representativa en cuanto a la población a estudiar. De esta manera Cosme (2005),empleo un macho ovino raza Blackbelly como unidad representativa, así como Gutiérrez et al. (2006)manipularon un ovino de la misma raza y utilizaron agua de coco, Opuntiasp., leche y sus combinaciones para criopreservar semen, y por ultimo Benítezet al (2009) usaron una clasificación simple para examinar cambios de la motilidad de espermatozoides durante la prueba de termoresistencia enun porcino de raza Pietrain x Yorkshire.

2.5 PROCESAMIENTO RECOLECCIÓN DE LA INFORMACIÓN

2.5.1 Diagrama de flujo.

☺ En estas etapas, fueron evaluados las dos variables de estudio que son: porcentaje espermatozoides vivos y porcentaje de motilidad progresiva.

2.6 TRATAMIENTO Y PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN.

Los eyaculados una vez fueron tomados por vagina artificial, inmediatamente se llevaron al laboratorio de microbiología de la Fundación universitaria Juan de Castellanos para su respectiva evaluación y congelación. Sus resultados se determinaron a partir de una evaluación cuantitativa y cualitativa, mediante su examen macroscópico y microscópico de los eyaculados. Los datos obtenidos en cada

una de las colectas fueron recopilados en los

formatos de trabajo, que se describen en las tablas No 19-20 (ver anexos)

3. ANALISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

3.1 RESULTADOS

Para cumplir con los objetivos del estudio, los cuales fueron analizar las características propias de los eyaculados del macho katahdin, y analizar los porcentajes de espermatozoides vivos y porcentajes de motilidad progresiva, se empleó un análisis descriptivo a partir de los promedios obtenidos durante los tres grupos de evaluación.

TABLANo 10: Resultados Obtenidos Para La Colecta 1 Y 2 Evaluando Los Porcentajes De Espermatozoides Vivos Y Porcentajes De Motilidad Progresiva En los tres grupos experimentales.

Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%

Triladyl® 70%, Aloe vera 30%

Triladyl® 100%

Combinación Repeticion COLECTA 1 COLECTA 2 COLECTA 1 COLECTA 2 COLECTA 1 COLECTA 2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

% ESPERMATOZOIDES VIVOS T0 TE TVN TC 48h 71 47 36 25 23 68 45 34 24 21 68 43 33 21 19 65 43 32 24 23 63 40 29 23 20 60 39 25 20 17 74 53 40 30 26 74 51 38 28 25 72 50 35 26 23 70 48 35 29 28 68 45 35 29 26 65 43 33 27 25 72 50 31 28 24 70 47 29 24 23 68 44 29 22 20 68 45 33 26 24 63 44 33 24 21 61 41 30 20 18

% MOTILIDAD PROGRESIVA T0 70 68 65 70 65 65 76 76 75 74 72 72 74 70 68 70 68 66

TE 55 52 50 48 46 45 60 59 55 56 52 52 58 55 53 50 48 46

TVN 35 33 30 32 31 28 40 38 35 42 39 37 38 35 33 35 33 32

TC 30 28 28 28 25 23 32 28 28 27 27 25 27 25 22 24 23 20

48h 22 20 19 20 17 17 28 26 25 27 25 25 23 21 19 22 18 18

Mesa, 2011

T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120-130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento -196°C; 48H= 48 horas congelamiento

3.1.1 Para porcentajes de motilidad progresiva

GRAFICA No 1.Comportamiento de los porcentajes de motilidad progresiva en el grupo control (Triladyl® al 100%)para cada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento -196°C y 48H= 48 horas congelamiento) 80

Y= PORCENTAJES DE MOTILIDAD

68 65

55 50

52 46

50 45

35 32

33 31

30 28

28 25

28 23

22 20

20 19 17 17

10 0

TVN

Triladyl® 100% COLECTA 1 Triladyl® 100% COLECTA 2

48h X= TEMPERATURA

Se pueden observar los cambios porcentuales para cada una de las fases durante las dos colectas en el tratamiento control, presentando mayores porcentajes de motilidad para la colecta 1, además se observa cambios significativos en las fases comprendidas entre TE y TVN.

GRAFICA No 2.Comportamiento de los porcentajes de motilidad progresiva para el grupo experimental (Triladyl® 70%, Aloe vera 30 %). En cada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120-130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento -196°C y 48H= 48 horas congelamiento) 80 76 74

Y= PORCENTAJES DE MOTILIDAD

76 72

75 72

60 56

59 52

55 52 42 40

39 38

37 35 32

28 27

28 25

28 27

26 25

20 10 0

TVN

Triladyl® 70%, Aloe vera 30% COLECTA 1 Triladyl® 70%, Aloe vera 30% COLECTA 2

48h X= TEMPERATURA

En esta grafica se pueden observar resultados muy similares en las dos colectas para el tratamiento Triladyl® 70%, Aloe vera 30 %en cada una de las fases. Señalando de igual forma una disminución de motilidad durante las fases TE y TVN. Donde finalmente los resultados se encuentran arrojando un solo porcentaje a las 48h.

GRAFICA No 3.Comportamiento de los porcentajes de motilidad progresiva para el grupo experimental (Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%). En cada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120-130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento -196°C y 48H= 48 horas congelamiento). 80 74 70

70 68

68 66

Y= PORCENTAJES DE MOTILIDAD

58 55

53 46 38 35

35 33

33 32 27 24

25 23

22 20

23 22

21 18

TVN

Triladyl® 90%, Aloe Vera 10% COLECTA 1 Triladyl® 90%, Aloe Vera 10% COLECTA 2

48h X= TEMPERATURA

19 18

En esta gráfica se puede observar una disminución gradual de la motilidad progresiva para las dos colectas en cada una de las fases, donde obtuvo una diferencia significativa a partir de las fases TE, TVN y TC.

3.1.2 Para porcentajes de espermatozoides vivos.

GRAFICA No 4Comportamiento de los porcentajes de espermatozoides vivos para el grupo control (Triladyl® al 100%),en cada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno 120-130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento -196°C y 48H= 48 horas congelamiento) 80 71

Y= PORCENTAJES DE ESPERMATOZOIDES VIVOS vivosVIVOS

65 60

68 63

68 60

47 43

45 40

43 39

36 32

34 29

33 25

25 24

24 23

21 20

19 17

10 0

Triladyl® 100% COLECTA 1

TVN

48h

Triladyl® 100% COLECTA 2

x = TEMPERATURA

En la presente grafica se observa una notable disminución de espermatozoides vivos a partir de la fase TO hasta fase TC, siendo de mayor porcentaje la colecta 1, pero en seguida de la fase TC hasta las 48 h los resultados muestran una significativa similitud porcentual.

GRAFICA No 5. Comportamiento de los porcentajes de espermatozoides vivos para el grupo experimental (Triladyl® 70%, Aloe vera 30%), en cada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120-130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento 196°C y 48H= 48 horas congelamiento).

Y= PORCENTAJES DE ESPERMATOZOIDES VIVOS

80 74 70

74 68

72 65

60 53 48

50 40

51 45

50 43

40 35

38 35

35 33

30 29

29 28

27 26

28 26

26 25

25 23

10 0

TVN

Triladyl® 70%, Aloe vera 30% COLECTA 1 Triladyl® 70%, Aloe vera 30% COLECTA 2

48h X = TEMPERATURA

Se pueden observar los cambios a partir de las fases TO hasta la fase TC, siendo de mayores porcentajes de espermatozoides vivos para la colecta 1, pero a partir de la fase TC hasta la fase de 48h se observa un pequeño aumento de porcentaje de espermatozoides vivos para la colecta 2.

GRAFICA No 6. Comportamiento de los porcentajes de espermatozoides vivos para el grupo experimental (Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%), encada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120-130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento 196°C y 48H= 48 horas congelamiento) 80 72 68

Y= PORCENTAJES DE ESPERMATOZOIDES VIVOS

70 63

68 61

50 45

47 44

44 41 33 31

33 29

30 29

28 26

22 20

23 21

20 18

10 0

TVN

Triladyl® 90%, Aloe Vera 10% COLECTA 1

48h X = TEMPERATURA

Triladyl® 90%, Aloe Vera 10% COLECTA 2

En la anterior grafica se observa que desde la fase TO hasta la fase TVN la colecta 1 obtuvo los mayores porcentajes de espermatozoides vivos, pero a partir de la fase TVN hasta la fase TC la colecta 2 obtuvo un pequeño aumento con respecto a la colecta 1, y finalmente, desde la fase TC hasta las 48 horas las dos colectas no obtuvieron diferencias significativas para los porcentajes de espermatozoides vivos.

3.1.3 Comportamiento promedio de la motilidad progresiva

GRAFICA No 7. Porcentaje promedio de la motilidad progresiva en cada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120-130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento 196°C y 48H= 48 horas congelamiento) empleando Triladyl® al 100%, Triladyl® al 70% más Aloe vera 30%, Triladyl® al 90% más Aloe vera 10% 80,0

PORCENTAJES DE MOTILIDAD

70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0

TVN

48h

Triladyl® 100%

67,2

49,3

31,5

27,0

19,2

Triladyl® 70%, Aloe vera 30%

74,2

55,7

38,5

27,8

26,0

Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%

69,3

51,7

34,3

23,5

20,2

En la anterior grafica se observa que el grupo Triladyl® al 70% más Aloe vera 30% obtuvo el mayor porcentaje durante la motilidad progresiva, para cada una de las fases con respecto al grupo control Triladyl® al 100% y el grupo experimental Triladyl® al 90% más Aloe vera 10%. Sin embargo este ultimo tratamiento obtuvo un pequeño aumento con respecto al grupo control, por lo tanto se puede concluir que a mayor Aloe Vera en dilución con el Trilalyl® promueve una mayor motilidad progresiva.

3.1.4 Comportamiento promedio de espermatozoides vivos.

GRAFICO No 8 Porcentaje promedio de espermatozoides vivos en cada una de las fases (T0= Dilución semen 35 °C; TE= Finalizado el enfriamiento 5°C; TVN= Vapores de nitrógeno -120-130°C; TC= concluido el proceso de congelamiento 196°C y 48H= 48 horas congelamiento) empleando Triladyl® al 100%, Triladyl® al 70% más Aloe vera 30%, Triladyl® al 90% más Aloe vera 10%

80,0 PORCENTAJES DE VITALIDAD

70,0 60,0 50,0 40,0 30,0 20,0 10,0 0,0

TVN

48h

Triladyl® 100%

65,8

42,8

31,5

22,8

20,5

Triladyl® 70%, Aloe vera 30%

70,5

48,3

36,0

28,2

25,5

Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%

67,0

45,2

30,8

24,0

21,7

En la anterior grafica se observa de igual manera que el grupo Triladyl® al 70% más Aloe vera 30% obtuvo el mayor porcentaje de espermatozoides vivos, para cada una de las fases con respecto al grupo control Triladyl® al 100% y el grupo experimental Triladyl® al 90% más Aloe vera 10%. Sin embargo este ultimo tratamiento obtuvo un pequeño aumento con respecto al grupo control, por lo tanto se puede concluir que a mayor Aloe Vera en dilución con el Trilalyl® promueve una mayor vitalidad espermática.

3.1.5 Análisis de las colectas seminales.

En cada colecta se obtuvo tres eyaculados, donde se evaluó de forma visual sus características macroscópicas (volumen, color, aspecto), luego, se mezclaron para formar así

un pool de colecta evaluando sus características microscópicas

(concentración, motilidad masal, motilidad progresiva, espermatozoides vivos, espermatozoides anormales) usando un reactivo espermático “Kit Test Iris”, en donde, los eyaculados cumpliesen con los criterios mínimos de referencia para la especie ovina. (Ver anexos, tabla No 18).

3.2 ANÁLISIS Y DISCUSIÓN

En totalidad se utilizaron seis eyaculados, de dos colectas de un ovino las cuales fueron divididas en tres fracciones para cada grupo de estudio, obteniendo un promedio de volumen 1.85 ml, color blanco, aspecto lechoso, concentración espermática 3607 x 106/ 1 ml, motilidad masal 82.5%, motilidad progresiva 80%, espermatozoides vivos 76.5% y espermatozoides anormales 15.5%, cumpliendo con las características propias de eyaculado para la especie ovina descritas por Angulo, 2003 y Aguirre Reyes, 2006, siendo aptas para criopreservarse.

Con respecto al pH del Aloe Vera usado como coadyuvante del producto comercial Triladyl®, Cosme en el 2005, señala que al manipular el extracto de Aloe Vera, fue utilizado un pH de 6.5. A partir de este dato, en el presente trabajo se obtuvo un pH de 6.3, lo cual se midió con un potenciómetro durante su extracto (foto No, 3). El valor que constituye el extracto de Aloe Vera en este estudio, no representaría ningún efecto secundario en las células espermáticas, ya que y como lo menciona Salamon y Maxwell, 2000 En Cosme, 2005 el pH optimo de los diluyentes es lo más cercano a 7, aunque valores de pH 6 a 7.4 son bien tolerados por los espermatozoides.

3.2.1 T0= Dilución semen 35 °C

En la mayoría de los tratamientos para la fase de dilución a 35°C se pudo observar una disminución en el porcentaje de motilidad progresiva y espermatozoides vivos

al momento de agregar el diluyente, obteniendo los siguientes resultados:

TABLA No 11: PROMEDIOS DURANTE LA FASE DE DILUCIÓN A 35 °C (TO) Tratamientos

Motilidad progresiva

Espermatozoides vivos

Triladyl® 100%

67.2 %

65.8 %

Triladyl® 70%, Aloe vera 30%

74.2 %

70.5 %

Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%

69.3 %

67.0 %

(Mesa, 2011)

Por lo tanto esta disminución se atribuye a un efecto de dilución, donde Maxwell y Johnson, 1999 en Cosme 2005 mencionan que los espermatozoides responden a la dilución, con un aumento inicial de la actividad metabólica seguido por una perdida de motilidad y aumento en el daño de la membrana. Por otra parte, Wastson y Merlin 1976, en Cortés Gallego, atribuyen que este efecto se debe a una reducción de los componentes del plasma seminal, disturbios en los componentes osmóticos y electrolíticos del diluyente.

Aunque en la mayoría de las combinaciones se conservo un porcentaje de motilidad progresiva y espermatozoides vivos por enzima del 65% durante esta primera fase, se puede resaltar que en el grupo Triladyl® sin agregar Aloe vera

(grupo control) la motilidad progresiva y el porcentaje de espermatozoides vivos se mantienen por debajo de los grupos a los cuales se les adicionó aloe vera en un 10 y 30%. Esto permite especular que el extracto de Aloe Vera, más el diluyente Triladyl®, proporcionan a los espermatozoides un medio más resistente a este efecto de dilución, en donde a mayor concentración del Aloe, mayor porcentaje de obtenido de vitalidad y motilidad.

Comparando dichos resultados, de los dos grupos con Aloe Vera, se puede afirmar que el grupo con el 30% fue el que mayor porcentaje obtuvo de motilidad y vitalidad, frente al 10% de Aloe Vera, de tal manera que se disminuyo el efecto de dilución situándolo desde un principio aceptable para este proceso.

Los datos descritos respecto a la motilidad progresiva en la fase de dilución concuerdan con los obtenidos por Brito, 2004 donde utilizo un diluyente a base de Tris-glucosa-yema de huevo obteniendo un resultado promedio de 74.5% de motilidad, siendo similar al obtenido con Triladyl® 70% más Aloe Vera 30% con 70.5%.

Ahora, respecto a los resultados obtenidos por Cosme, en el 2005,donde se evaluó el agua de coco en combinación con Aloe Vera (AV),en dos tratamientos “porcentaje de espermatozoides vivos (EV) y motilidad progresiva (MP)”, se obtuvo para esta etapa de dilución un resultado promedio del 80% para EV y MP con AV al 10%, de igual manera, un promedio de 85% para EV y MP con AV al 30%.De lo anterior resalta que la mezcla entre estos dos componentes, agua de coco más aloe vera, fueron combinaciones apropiadas para garantizar un buen porcentaje de EV y MP durante esta fase de dilución, además, estuvo por enzima de los resultados obtenidos por el presente trabajo, al mezclar el diluyente comercial Triladyl en combinación con el AV en concentraciones del 10 y 30%, posiblemente debido a la composición de cada una de las proporciones que contiene el agua de coco.

3.2.2 TE= Finalizado el enfriamiento 5°C

Para esta segunda fase de congelación, y dentro de cada grupo experimental, cabe señalar que el Triladyl® por ser un diluyente de un solo paso, no se le adicionó Glicerol como crioprotector, ya que este componente viene incluido en el mismo. De tal forma que para cada grupo, su enfriamiento se realizo de forma progresiva donde su temperatura descendió paulatinamente (por dos horas)hasta llegar a 5°C, tal cual como lo reportan López, 2008; García. et al, 1998; Jones y Martin, 1993 En Brito, 2004; Palma, 2008 y Cosme, 2005.

Dentro de los tres tratamientos de estudio para motilidad progresiva, y vitalidad se obtuvieron los siguientes resultados:

TABLA No 12: PROMEDIOS DURANTE LA FASE DE EQUILIBRIO O ENFRIMIENTO A 5° C (TE). Tratamientos

Motilidad progresiva

Espermatozoides vivos

Triladyl® 100%

49.3 %

42.8 %

Triladyl® 70%, Aloe vera 30%

55.7 %

48.3 %

Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%

51.7 %

45.2 %

(Mesa, 2011)

Estos valores promédiales para las dos variables de estudio no concuerdan con resultados obtenidos por Cosme, 2005 donde obtuvo con el 10% de Aloe Vera más agua de coco una motilidad del 60% y una viabilidad del 80%, mientras que con el 30% de Aloe Vera más agua de coco, obtuvo una motilidad y vitalidad de

60%. Sin embargo los tres grupos mantuvieron valores aceptables al finalizar la fase de equilibrio que es un mínimo de motilidad progresiva del 50% (Giles, 1993 En Ruiz, 2007).

En esta fase Ávila Acosta, 2006 señala que el descenso de temperatura a los 5°C en la célula espermática desencadena una disminución en la actividad metabólica y por consiguiente su motilidad, por lo cual se puede restituir si se eleva la temperatura a los niveles normales, siempre y cuando

estos no

presenten daños de tipo estructural causados por el shock térmico (Salomón y Maxwell, 2000 En Ávila Acosta, 2006). Así mismo Paulenz et a, 2002 En Aguirre, Reyes 2006, señala que no se observo diferencia estadística en cuanto a MP al monitorear semen diluido con glicerol a 5°C conservado durante 0, 8, 16 y 24 horas. A partir de lo anterior, se presume que la disminución en cuanto al porcentaje de espermatozoides vivos y motilidad en el presente trabajo, es causado por un daño directo sobre la membrana espermática, como consecuencia al shock térmico, provocando así una alteración a la membrana, donde Vishwanath y Shannon, 2000 en Avila Acosta, 2006, mencionan que el daño se debe a un incremento en la actividad metabólica de Na/K intracelular, lo cual causa una notable disfunción en el cruzamiento intramembranal de algunos iones, ocasionando por ende una disminución de sobrevivencia y motilidad.

3.2.3 TVN= Vapores de nitrógeno

En esta tercera fase, se puede afirmar que a medida que desciende la temperatura por el cual se exponen las pajillas (vapores de nitrógeno de -120 a 130°C) paulatinamente disminuye el porcentaje de motilidad y vitalidad espermática. Palma, 2008 afirma que el periodo de congelación en la célula espermática está comprendida entre los 0°C y – 10°C, donde la congelación del citoplasma se encuentra de los -10°C después de la congelación del medio

extracelular -5°C, de manera que los cambios ocurridos en este periodo pueden deberse a que algunos espermatozoides sufren daños irreversibles, concordado en investigaciones de Holt, 2000. En Cosme 2005 quien menciona que existen efectos dañinos durante este proceso.

Los resultados obtenidos en esta fase de vapores de nitrógeno fueron:

TABLA No 13: PROMEDIOS DURANTE LA FASE VAPORES DE NITRÓGENO (TWN). Tratamientos

Motilidad progresiva

Espermatozoides vivos

Triladyl® 100%

31.5 %

Triladyl® 70%, Aloe vera 30%

38.5 %

36.0 %

Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%

34.3 %

30.8 %

(Mesa, 2011)

Por lo tanto se puede afirmar que a medida que desciende la temperatura menores posibilidades de motilidad y supervivencia espermática. Donde Avila, et al, 2006 afirma que al bajar la temperatura se reduce un 60% la actividad de las bombas de ATP, como consecuencia de una difusión de la membrana a causa de un estrés osmótico, ocasionando a la vez la formación de hielo intracelular o desestabilización de la membrana.

Por otra parte y de acuerdo a los resultados obtenidos en esta fase, se puede afirmar que el Aloe Vera tiene un efecto favorable en la membrana a la hora de medir los promedios de motilidad y vitalidad, donde la concentración que mayor

índices positivos presentó fue la del tratamiento en el que se adicionó 30% de Aloe Vera, en comparación con los otros tratamientos.

3.2.4 TC= concluido el proceso de congelamiento -196°C

En esta fase se analizaron los cambios luego de sumergir las pajillas dentro del nitrógeno líquido, obteniendo los siguientes resultados:

TABLA No 14: PROMEDIOS DURANTE LA FASE FINAL DE CONGELAMIENTO -196° C (TC) Tratamientos

Motilidad progresiva

Espermatozoides vivos

Triladyl® 100%

27.0%

22.8%

Triladyl® 70%, Aloe vera 30%

27.8%

28.2%

Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%

23.5%

24.0%

(Mesa, 2011)

Por lo tanto los tratamientos que más daño le ocasionaron a los espermatozoides durante el congelamiento fueron los tratamientos del grupo control (triladyl® sin adición de aloe vera y Triladyl® 90% más Aloe Vera 10%) ya que presentó una disminución de motilidad respecto al grupo que se le adiciono aloe vera al 30%. Giles, 1993 en Cosme, 2005, señalan que el valor mínimo requerido para el semen durante la fase de congelación es de un 35% para motilidad progresiva, valor que no es cumplido por ningún grupo al ser expuesto a bajas temperaturas de -196 °C.

Por otra parte, los porcentajes de motilidad que se presentan en el trabajo, no concuerdan con los presentados por Brito, 2004 donde experimento un diluyente a base de Tris, glucosa, y yema de huevo, obteniendo una motilidad del 40,2%, siendo que los componentes del Triladyl son a partir de Tris, glucosa y yema de huevo. Cosme en el 2005, obtuvo porcentajes utilizando Aloe Vera al 10% una motilidad progresiva del 40% y una vitalidad del 50%, y con un porcentaje de Aloe Vera al 30% con una motilidad del 60% y una vitalidad del 70%. En consecuencia, autores como, Bailey y Buhr, 1994, en Ávila Acosta, 2006 mencionan que la congelación parece ser una de las etapas que más afecta a los espermatozoides, ya que causa daños directos en el mecanismo espermático, como cambios dentro de la estructura de membrana, niveles altos de Ca+2 intracelular y cambios de permeabilidad. A la vez, Salamon y Maxwell 1995, en Merino, 2003 hacen mención que el congelamiento de semen ovino conduce a cambios severos en su estructura y función,mientras que Valcértel, 1994 en Cosme, 2005 menciona que entre estos cambios se encuentran: alteraciones de la motilidad progresiva y la integridad de la membrana.

3.2.5 48H= 48 horas congelamiento

Dentro de la fase de conclusión de congelamiento a -196°C y las 48 horas de congelamiento resultaron cambios pocos significativos con respecto a la motilidad y vitalidad en los diferentes tratamientos, posiblemente por que son pocos los días, según lo reportado por Cosme, 2005. Obteniendo los siguientes resultados:

TABLA No 15: PROMEDIOS DURANTE LAS 48 HORAS DE CONGELAMINETO (48H) Tratamientos

Motilidad progresiva

Espermatozoides vivos

Triladyl® 100%

19.2 %

20.5 %

Triladyl® 70%, Aloe vera 30%

26.0 %

25.5 %

Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%

20.2 %

21.7 %

(Mesa, 2011)

Con respecto a los resultados obtenidos por Aguirre Reyes, 2006, el cual empleo dos diluyentes comerciales “Triladyl®” y “Andromed®” para la congelación de semen en ovinos, obtuvo que la motilidad para el primer diluyente fue de 16.2% y con Andromed® de 15.5%, siendo estos dos resultados muy significativos al compararlos con la presente investigación ya que se obtuvo un porcentaje de 19,2% con Traladyl® al 100%.

Por otra parte Lopez, 2008 empleo en uno de sus tratamientos el diluyente comercial “Continental®”para determinar el porcentaje de motilidad progresiva y el porcentaje de espermatozoides vivos, donde se obtuvo para el primero, una concentración de 19,3% y un porcentaje de espermatozoides vivos de 18,6%, siendo por lo tanto resultados muy similares a los obtenidos con Triladyl® al 100% en este estudio.

Por ultimo, Cosme, 2005 obtuvo al utilizar Aloe Vera al 10% una motilidad de 40% y vitalidad del 50%. Al mismo tiempo que el Aloe Vera al 30% se desempeño con motilidad del 50% y una vitalidad del 50%, no siendo compatible con los resultados

de trabajo donde obtuvimos con Aloe vera al 30% un promedio de motilidad del 26% y una vitalidad del 25.5%.

3.2.6 Discusión general. Dentro de la evaluación espermática “macro-micro” para cada uno de los eyaculados obtenidos por método de vagina artificial, en el macho Katahdin, se puede considerar que cumplen con los requerimientos mínimos para ser criopreservado, descrito por los diferentes autores anteriormente mencionados.

Al diluir la muestra de semen en el diluyente Triladyl® sin adicionar Aloe vera, la motilidad progresiva y el porcentaje de espermatozoides vivos se manifiesta con porcentajes menores en cada una de las etapas evaluadas con respecto a los grupos a los cuales se les adiciono aloe vera en un 10 y 30%. Esto presume que el diluyente comercial por si solo, no favorece del todo la calidad espermática, debido posiblemente a la proporción de sus componentes. Los intentos de aplicar el método y los diluyentes usados para la congelación de semen bovino a la especie ovina ofrecen unos resultados muy pobres. Las serias dificultades que presenta la congelación del semen ovino están relacionadas fundamentalmente con la composición lipídica de su membrana y se intentan subsanar desarrollando protocolos específicos con nuevos diluyentes, agentes crioprotectores, y sistemas de congelación y descongelación (Abecia y Forcada, 2010), En cualquier caso, esto hace pensar que al diluir Aloe Vera con el diluyente Triladyl®, este ayuda a disminuir los daños causados por la peroxidación lipídica cuando se aumenta el número de especies reactivas de oxigeno en el proceso de congelación (Lopez, 2008), además Ruiz en el 2007 demostró que la peroxidación daña la membrana plasmática,

presentando

bajos

porcentajes

motilidad

fertilidad.

Consecuentemente, lo anterior hace pensar que el gel de Aloe Vera dentro 75 compuestos ya descritos, presenta además antioxidantes como: vitamina C,

vitamina E, acido úrico y catalasa que permiten prevenir el daño oxidativo de los espermatozoides durante el proceso de congelación.

La membrana espermática contiene baja concentración de enzimas protectoras de las formas toxicas de O2 especialmente Catalasa, por ende se cree que esta enzima la cual aporta el Aloe Vera promueve un poder reductor hacia los radicales libres protegiendo las membranas y componentes naturales del estrés oxidativo Villa en el 2009..

Cabe señalar que el efecto protector se relaciona al colesterol que le proporciona el Aloe Vera, ya que éste se relaciona con el colesterol que le brinda la yema de huevo, aportando tal vez a la célula espermática una doble protección durante el proceso decriopreservación, ya que Villa en el 2009 menciona que el colesterol actúa como un núcleo esteroide que se inserta como un naipe en la bicapa de la membrana espermática donde la estabiliza y la flexibiliza efectuando un efecto protector.

También se determina que el efecto proporcionado del Aloe vera a la célula espermática durante el proceso de criopreservación, se debe posiblemente a sus propiedades energéticas: glucosa, celulosa y ribosa. Donde Arce et al, 2007 señala que los carbohidratos son los más destacados dentro la composición del Aloe Vera. A la vez que proporcionaría la energía necesaria para mantener su metabolismo celular y generar el movimiento del flagelo. Por otra parte hay que señalar el efecto que proporciona la lecitina presente en el aloe vera, pero también en la yema de huevo donde Villa, 2009 menciona que este compuesto provee estabilidad de la membrana espermática.

Por ultimo el Aloe Vera como coadyuvante de un crio protector al presentar diversos componentes entre aminoácidos esenciales y no esenciales, vitaminas, minerales y enzimas, tal vez pueden producir un efecto protector en la célula

espermática durante el shock térmico, sin embargo no se tiene un panorama claro y conciso de cada uno de estos efectos sobre la célula espermática.

Con lo anterior se reitera que a mayor concentración de Aloe Vera se mejora tanto el porcentaje de supervivencia como el de motilidad progresiva individual en cada una de las fases de estudio, con respecto al diluyente Trilayl® al 100% como grupo control.

En este orden de ideas, y al poner en práctica lo descrito por Gibbson y Cueto, 2010, que afirman que para aceptar una pajuela o pajilla para su uso comercial debe poseer una motilidad individual progresiva igual o superior a 2.5%, y un porcentaje de espermatozoides vivos igual o superior al 30%, vale la pena el uso del diluyente Triladyl adicionando Aloe Vera al 30% obteniendo valores aproximados para su comercialización.

4. CONCLUSIONES



Se determina que el diluyente trilayl® al 70% en combinación con Aloe Vera al 30%, efectivamente incrementa los porcentajes de supervivencia y motilidad individual espermática, con respecto a los otros dos grupos de estudio (triladyl® al 100% como grupo control y triladyl® al 90% más Aloe Vera10%), siendo una combinación optima para el procesamiento de semen en la especie ovina.



En general se puede decir que la combinación del diluyente comercial Triladyl® con Aloe Vera, incrementa las posibilidades de supervivencia espermática y motilidad, durante el proceso de criopreservación.



Respecto a la calidad obtenida en cada uno de los eyaculados que se tomaron del macho Katahdin, se concluye que éstas cumplen con las características propias de calidad seminal dentro de esta especie, además, cabe resaltar que este macho posee una alta capacidad reproductiva al ser el progenitor de las crías que se encuentran en las instalaciones de la Clínica Veterinaria San Francisco de Asís, por su destreza, actitud de dominancia, rusticidad y gran mansedumbre.



Cabe señalar que a pesar de que se han implementado diluyentes comerciales para el procesamiento de semen en la especie ovina (Triladyl®, Andromed®, Continental®), que originalmente fueron hechos para bovinos, estos aún no representan resultados óptimos de calidad, respecto a los obtenidos para la especie bovina donde proporcionan porcentajes del 50% de motilidad (Medina, et al. 2007).



A pesar de que se han ejecutado múltiples protocolos para el procesamiento de semen en

ovinos con diferentes diluyentes de

congelación “comerciales y no comerciales”, aún sigue siendo un gran desafío para los investigadores, el poder determinar que diluyente, y el método de congelación, es el más apropiado para criopreservar semen en ovinos. 

Son múltiples las propiedades que posee el Aloe Vera, que pueden cumplir funciones benéficas en la célula espermática durante el proceso de criopreservación, tales como: aminoácidos esenciales y no esenciales, vitaminas, minerales y enzimas. Pero no se conoce con exactitud cual de ellos proporciona mayor efecto en la célula para que esta se mantenga motil y viva.

5. IMPACTO SOCIAL

Al conseguir mejores condiciones durante el congelamiento de semen ovino, se emplearán nuevas oportunidades para el pequeño y mediano ovinocultor, de tal forma que, tendrán la oportunidad de acceder a nuevo material genético, esto implica que el avance en esta especie deberá tener un gran desarrollo en los últimos años, mejorando así

los caracteres hereditarios y por ende su

productividad.

EL empleo de semen congelado puede producir un gran impacto científico en cuento al mejoramiento genético ovino a nivel regional, al aumentar el flujo de material seminal, así como al facilitar el transporte de semen a otros municipios del departamento de Boyacá como a nivel nacional. De esta manera evitando el costoso traslado de los reproductores y disminuyendo el riesgo sanitario.

Es importante destacar el papel fundamental que proporciona el Aloe Vera en cuanto a sus propiedades y beneficios sobre la célula espermática, siendo que este no ha tenido una profunda investigación en este departamento como agente crioprotector, en este caso dela célula espermática del ovino. Además, por ser de fácil adquisición y preparación, y por sus bajos costos que representa en comparación con otros diluyentes comerciales o al disminuir la cantidad del mismo.

100

6. RECOMENDACIONES



De acuerdo a los resultados obtenidos con esta investigación se recomienda implementar otras variables de evaluación, como lo son, alteraciones en cuanto a la morfología durante

la congelación-

descongelacion y evaluación del daño acrosomal en dicho proceso. 

Se propone ampliar más esta investigación, utilizado distintos tipos de inseminación (transcervical- inseminación intrauterina), para así determinar los porcentajes de preñez obtenida a partir del protocolo utilizado “Triladyl® más Aloe Vera”



Se recomienda implementar nuevos protocolos utilizando

Aloe Vera en

otros diluyentes comerciales, tales como: Andromed, Continental, Skimmilk extender, Universal de IMV, Biladyl, para determinar cual de todos ellos proporciona

mejor

calidad

espermática

durante

proceso

criopreservación. 

preciso

realizar

otros

estudios

donde

utilicen

otras

concentraciones de Aloe Vera sin exceder el 50%, empleando Triladyl® como diluyente comercial. 

Se recomienda evaluar la motilidad progresiva y vitalidad espermática en diferentes tiempos, es decir, observando cada pajilla 0, 15, 30, 45, 60 y 90 minutos posteriores a la descongelación, método empleado por Aguirre, Reyes 2006.



Se propone evaluar este mismo procedimiento a partir de un sistema de análisis espermático computarizado (CASA).

101

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109

ANEXOS

Foto 1: Esterilizaci贸n de materiales

Foto 2: Corte de la s谩bila.

Fuente: Mesa, 2011

Foto 3: Extracci贸n Aloe Vera

Fuente: Mesa, 2011

Foto 4: Preparaci贸n del diluyente

Fuente: Mesa, 2011

110

Foto 5: Lavado prepucial.

Foto 6: Medici贸n circunferencia escrotal

Fuente: Mesa, 2011

Foto 7: Vagina artificial.

Fuente: Mesa, 2011

111

Foto 8: Flemen, intento de monta

Foto 9: Golpe riñón, toma eyaculado

Fuente: Mesa, 2011

Foto 10: Colecta en el baño maría

Fuente: Mesa, 2011

112

Foto 11: Evaluaci贸n microsc贸pica diluyente

Foto 12: Diluci贸n semen m谩s

Fuente: Mesa, 2011

Foto 13: Fase de equilibrio

Fuente: Mesa, 2011

Foto 14: Empacado de pajillas

Fuente: Mesa, 2011

113

Foto 15: Sellado de pajillas

Fuente: Mesa, 2011

Foto 16: Fase de vapores de nitr贸geno Foto 17: Evaluaci贸n descongelamiento

Fuente: Mesa, 2011

114

TABLA No 17. EVALUACIÓN DE LA ACTITUD REPRODUCTIVA DEL MACHO OVINO

EXAMEN DE ACTITUD REPRODUCTIVA POTENCIAL DEL OVINO

Fecha: 01/06/11

Propietario: JDC

Nombre: Pancho

Nacimiento: 27 agosto 2008

Establecimiento: Otro lado

Identificación:

Peso: 65 kg

Departamento: Boyacá Municipio: Soracá

Raza: Katahdin

Uso: Carne

Condición corporal: 3 (1-5)

EXAMEN GENERAL Estado de carnes: 3

Ap. Locomotor: N

Aplomos: N

Desplazamiento: N

Articulaciones: N

Piel: N °C

Frecuencia cardiaca: 75 (70-80) Temperatura: 38.7

Frecuencia respiratoria: 15 (12-20)

EXAMEN PARTICULAR Est. Dientes: N

Boca: N

Pecho: N

Manos: N

Pezuñas manos: N

Encías: N Patas: N

Lengua: N

Ojo Derecho: N

Escá. Hum: N

Carpo: N

Espac. Interd. Manos: N

Ojo izquierdo: N Cox. Fémur: N

Pezuñas Patas: N

Rodilla: N

Tarso: N

Espac. Interd. Patas: N

GENITALES Prepucio: N

Deslizamiento: N

Pene: Escroto: N N Testículo Derecho Tamaño: 15 cm

Tono testicular: N

Testículo Izquierdo

Dolor: ninguno

Temperat ura: N

Deslizamiento: N

Epidídimo Derecho Cabeza: N Observaciones: Ninguna

Cuerpo: N

Cola: N

Circunferencia escrotal: 31 cm

Tono: N

Cabeza: N

Tamaño:15 cm

dolor: ningun o Epidídimo Izquierdo Cuerpo: N

Cola: N

Temperatura: N

Tono: N

Examen Funcional Excitación: N

Erección: N

Monta: N

Abrazo: N

golpe de Riñon: N

N: Normal

Eyaculación: N

libido: N

Fuente: Mesa 2011 115

TABLA No 18 INFORMACION DE LAS COLECTAS POR VAGINA ARTIFICAL

Fecha/Hora

04/jun/20114:30 pm 04/jun/20114: 45 pm 04/jun/20115: 00 pm TOTAL

10/jun/201110:00 am 10/jun/201110:15 am

Colecta No 1

Volumen

Color

Aspecto

Concentraci贸n

Motilidad Masal

Motilidad individual

Espermatozoides vivos Espermatozoides anormales (%) (%)

Eyaculado 1

0.8 ml

Blanco

Lechoso

--------

------

--------

------------

Eyaculado 2

0.7 ml

Blanco

Lechoso

---------

------

-----

---------

------------

Eyaculado 3 ----------

0.5 ml

Blanco

Lechoso

--------

-----

------

---------

------------

2 ml

Blanco

Lechoso

3742 x10 / 1ml.

Volumen

Color

Aspecto

Concentraci贸n

85% Motilidad Masal

80% Motilidad individual

78% 15% Espermatozoides vivos Espermatozoides anormales (%) (%)

0.6 ml

Blanco

Lechoso

--------

------

--------

------------

Colecta No 2 Eyaculado 1

Eyaculado 2

0.6 ml

Blanco

Lechoso

---------

------

-----

---------

------------

10/jun/2011 10:30 am

Eyaculado 3

0.5 ml

Blanco

Lechoso

--------

-----

------

---------

------------

TOTAL

-----------

1.7 ml

Blanco

Lechoso

3473 x 10 / 1ml.

80%

75%

16%

Fuente: Mesa, 2011

116

TABLA No 19: Formato empleado para los resultados obtenidos durante los porcentajes de motilidad progresiva. % MOTILIDAD PROGRESIVA. COLECTA 1

TRATAMIENTO

Triladyl® 100%, Triladyl® 70%, CONTROL Aloe vera 30%

Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%

Dilución semen 35 °C Finalizado el enfriamiento 5°C Vapores de nitrógeno -120-130°C concluido el proceso de congelamiento -196°C

48 horas congelamiento % MOTILIDAD PROGRESIVA. COLECTA 2

TRATAMIENTO

Triladyl® 100%, Triladyl® 70%, CONTROL Aloe vera 30%

Dilución semen 35 °C Finalizado el enfriamiento 5°C Vapores de nitrógeno -120-130°C concluido el proceso de congelamiento -196°C

48 horas congelamiento

117

Triladyl® 90%, Aloe Vera 10%

TABLA No 20: Formato empleado para los resultados obtenidos durante los porcentajes de espermatozoides vivos. % ESPERMATOZOIDES VIVOS. COLECTA 1

TRATAMIENTO

Triladyl® 100% CONTROL

Triladyl® 70%, Triladyl® 90%, Aloe vera 30% Aloe Vera 10%

Dilución semen 35 °C Finalizado el enfriamiento 5°C Vapores de nitrógeno -120-130°C

concluido el proceso de congelamiento -196°C

48 horas congelamiento % ESPERMATOZOIDES VIVOS. COLECTA 2

TRATAMIENTO

Triladyl® 100% CONTROL

Dilución semen 35 °C Finalizado el enfriamiento 5°C Vapores de nitrógeno -120-130°C concluido el proceso de congelamiento -196°C

48 horas congelamiento 118

Triladyl® 70%, Triladyl® 90%, Aloe vera 30% Aloe Vera 10%

119