Evaluación de la actividad antibacteriana del extracto etanólico by Medicina Veterinaria JDC

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE Cassia occidentalis (Brusca) y Cymbopogon citratus (Limoncillo) SOBRE DOS CEPAS BACTERIANAS (Aeromonas spp, Pseudomonas spp).

MÓNICA MOJICA CÁRDENAS

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL EXTRACTO ETANÓLICO DE Cassia occidentalis (Brusca) y Cymbopogon citratus (Limoncillo) SOBRE DOS CEPAS BACTERIANAS (Aeromonas spp, Pseudomonas spp).

MÓNICA MOJICA CÁRDENAS

TRABAJO DE GRADO PRESENTADO EN LA MODALIDAD DE INVESTIGACIÓN PARA OPTAR EL TÍTULO DE MÉDICO VETERINARIO

Director LUDY PAOLA VILLAMIL MVZ MSc Acuicultura

Co- Director CLAUDIA PEREZ Bióloga MSc Microbiología

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013

NOTA DE ACEPTACIÓN

____________________________________

DIRECTOR:

___________________________________________ MVZ, MSc LUDY PAOLA VILLAMIL

JURADO:

____________________________________________ ANASTASIA CRUZ CARRILLO

JURADO:

____________________________________________ CLAUDIA PATRICIA TORRES VALDERRAMA

DEDICATORIA

Este trabajo se lo dedico a Dios por su grandeza y haberme permitido abrir puertas que no podía abrir A mis Padres José Pascual Mojica T y Fanny Cárdenas de Mojica por su apoyo incondicional, brindándome optimismo y confianza para seguir adelante y por darme el mejor ejemplo de vida.

AGRADECIMIENTOS

A Dios por ayudarme a suplir las necesidades para terminar con este proyecto A mis padres que con su amor y paciencia fueron ayuda para seguir adelante

A la Doctora Ludy Paola Villamil y Claudia P茅rez por su asesoramiento, apoyo y paciencia en la culminaci贸n de este proyecto

A Yaneth Mart铆nez, coordinadora de laboratorio de la Universidad Juan de Castellanos y a la auxiliar, por su colaboraci贸n y amabilidad en el trabajo de campo

Contenido GLOSARIO ........................................................................................................................ 10 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 15 2

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................ 17

PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ................................................................................ 18

OBJETIVOS ............................................................................................................... 19 4.1 OBJETIVO GENERAL .............................................................................................. 19 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ....................................................................................... 19

JUSTIFICACIÓN .........................................................................................................20

HIPÓTESIS ................................................................................................................ 21

MARCO DE REFERENCIA ........................................................................................... 22 7.1 ESTADO DEL ARTE .................................................................................................22 7.2 MARCO TEÓRICO ..................................................................................................26 7.2.1 Fitoterapia ....................................................................................................26 7.2.2 Extractos naturales ....................................................................................... 27 7.2.3 Brusca...........................................................................................................28 7.2.4 Limoncillo .....................................................................................................29 7.2.5 Bacterias.......................................................................................................31 7.2.6 Resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos ............................ 35 7.2.7 Medios de cultivo .......................................................................................... 35 7.2.8 Métodos de evaluación de la capacidad antimicrobiana ............................... 36 7.3 MARCO LEGAL ......................................................................................................39 7.4 MARCO GEOGRÁFICO ........................................................................................... 40

DISEÑO METODOLÓGICO ......................................................................................... 41 8.1 DISEÑO EXPERIMENTAL ........................................................................................ 41 8.2 METODOLOGÍA ....................................................................................................41 8.2.1 Preparación de los extractos .........................................................................41 8.2.2 Pruebas microbiológicas ............................................................................... 43 8.2.3 Evaluación de la actividad antibacteriana ..................................................... 45 8.3 ANÁLISIS DE DATOS .............................................................................................. 48

RESULTADOS ............................................................................................................ 49 9.1 EVALUACIÓN DE LA ACTVIDAD ANTIBACTERIANA ................................................. 49 9.1.1 Método difusión en disco .............................................................................. 49 9.1.2 Método difusión en pozo .............................................................................. 52 9.1.3 Concentración mínima inhibitoria y bactericida ............................................ 52

10 DISCUSIÓN ............................................................................................................... 54 11 IMPACTO.................................................................................................................. 56 12 CONCLUSIONES ........................................................................................................57 13 RECOMENDACIONES ................................................................................................ 58 14 BIBLIOGRAFÍA...........................................................................................................59

Lista de figuras

Figura 1.

Planta Cassia occidentalis…………………………………………..

Figura 2.

Planta Cymbopogon citratus……………………………………..…

Figura 3.

Preparación de los extractos………………………………………..

Figura 4.

Pruebas microbiológicas……………..……………….…………….

Figura 5.

Preparación diluciones seriadas de los extractos…..…………….

Figura 6.

Método de difusión en disco……………………………………...…

Figura 7.

Diámetro halo de inhibición Cassia occidentalis ………………....

Figura 8.

Diámetro halo de inhibición Cymbopogon citratus ……………….

Figura 9.

Métodos empleados para la evaluación antibacteriana ..………..

Figura 10

Concentración mínima inhibitoria y concentración mínima bactericida………………………………………………………….....

Lista de tablas

Tabla 1.

Escala de Mc Farland……………………………………………..

Tabla 2.

Criterios de evaluación de antibióticos……………………..……

Tabla 3.

Halos de inhibición (mm) media y desviación estándar para el extracto Cassia occidentalis …………………………….....…..….

Tabla 4.

Tabla 5

Halos de inhibición (mm) media y desviación estándar para el extracto Cymbopogon citratus ………………………………………...

Resultados de la susceptibilidad bacteriana …………………….

GLOSARIO Alícuota: volumen determinado que se toma de un volumen inicial más grande. Acuicultura: cultivo de especies hidrobiológicas mediante técnicas apropiadas en ambientes naturales ó artificiales. Agente antimicrobiano: sustancia que actúa contra microorganismos como bacterias, virus, u hongos destruyéndolos ó inhibiendo su crecimiento. Antiespasmódico: es un fármaco que relaja el músculo liso. Carminativo: sustancia que favorece la expulsión de los gases del tubo digestivo y con ello disminuyen las flatulencias y cólicos. Célula: es la unidad morfológica y funcional de todo ser vivo que dispone de capacidad para actuar de manera autónoma. Deshidratación: perdida de agua en un cuerpo determinado. Dilución: es una preparación donde se toma de una solución de mayor concentración a una que quede a menor concentración. Diluciones seriadas: sucesión de diluciones con incrementos progresivos y regulares, en los cuales el factor de dilución siempre es igual. Dispepsia: dificultad gástrica debida a trastornos en la secreción o en la motilidad del estómago. Diurético: sustancia que aumenta la producción y eliminación de orina Emenagogo: sustancia con acción estrogénica. Epizootia: es el aumento de un número poco común de casos animales de una enfermedad determinada Etanol: es un compuesto químico obtenido a partir de la fermentación de los azúcares, empleado para farmacéutica y perfumerías

Estomaquico: medicamento que combate la dispepsia, favorece la secreción gástrica y el apetito. Extracción: es un procedimiento de separación de una sustancia que puede disolverse en dos solventes no miscibles Febrífuga: propiedad de una sustancia o planta medicinal que sirve para disminuir la fiebre. Fitofármaco: preparación que se emplea con fines terapéuticos cuya sustancia bioactiva procede de planta medicinal. Gram negativa: tipo de célula procariota cuya pared celular contiene relativamente pocos peptidoglicanos y presenta una membrana

externa

compuesta por lipopolisácarido y lipoproteína. Gram positiva: tipo de célula procariota cuya pared celular está compuesta por un alto número de peptidoglicanos y que carece de membrana externa. Kirby Bauer: Nombre coloquial con el que se denomina al “antibiograma” por difusión en disco en placa de agar para determinar la sensibilidad de un agente microbiano frente a un antibiótico. Maceración: extracción por disolvente donde el material permanece varios días sumergido MacFarland: es una escala que representa la concentración específica

bacteria que va de 0.5 a 10 UFC/ml Metabolitos primarios: son todas aquellas sustancias comunes a todas las plantas, producidas por ellas, e incluye carbohidratos, proteínas, grasas, ácidos nucléicos, aminoácidos. Metabolitos secundarios: son productos sintetizados por las plantas no comunes en todas las especies como: alcaloides, flavonoides, esteroides, cumarinas, taninos, aceites esenciales

Morbilidad: es la cantidad de individuos que son considerados enfermos en un espacio y tiempo determinados Patógeno: agente que causa enfermedad Polifenoles: grupo de sustancias químicas encontradas en las plantas caracterizadas por la presencia de más de un grupo fenol por molécula. Piscicultura: es el cultivo de peces bajo condiciones controladas por el hombre. Resistencia bacteriana: es la capacidad de un microorganismo de tolerar o resistir ciertas condiciones físico-químicas y biológicas adversas. Siembra: es la inoculación de microorganismos presentes en una muestra en un medio de cultivo Solvente: es un líquido o un gas que disuelven un sólido, líquido, o gaseoso dando por resultado una solución

RESUMEN

La emergencia de la resistencia bacteriana, ha generado nuevos intereses en la búsqueda de medicamentos con poder antibacteriano, los cuales proveen oportunidades ilimitadas para el hallazgo de nuevos fármacos. El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto antibacteriano del extracto de Cymbopogon citratus y Cassia occidentalis sobre las géneros Aeromonas spp y Pseudomonas spp, a diluciones

³ puro. Para la obtención de los extractos se usó el método

de maceración en frío, a partir de la mezcla y filtración de las hojas previamente trituradas en 4 litros de etanol durante tres días; la extracción del solvente se realizó a baño maría a 35 °C. Para la evaluación antibacteriana de los extractos se empleó los métodos de difusión en disco y difusión en pozo, teniendo en cuenta los diámetros de halos de inhibición. El extracto puro de Cassia occidentalis presentó el mayor diámetro que las demás diluciones con 8mm tanto para Aeromonas hydrophila como Pseudomonas aeruginosa, al igual que el extracto puro de Cymbopogon citratus con 9mm para Aeromonas hydrophila y 8.5 para Pseudomonas aeruginosa. En la evaluación de los extractos bajo los dos métodos, solamente se observó el efecto inhibitorio en el método de difusión en disco. Al enfrentar los extractos con los antibióticos de referencia, se considera que estos extractos no presentan la actividad antibacteriana frente a estas cepas bacterianas ya que no superaron los criterios mínimos establecidos de halos de inhibición.

Palabras

clave:

Aeromoniasis,

Pseudomoniasis,

concentración mínima inhibitoria.

extractos

vegetales,

ABSTRACT

Among the diseases most commonly reported are referenced bacterial origin; and to an overuse of antibiotics or chemical products to control or management, bacterial infections are less susceptible to treatment and instead become resistant to control. The emergence of bacterial resistance has generated new interest in the search for drugs with antibacterial power, which provide unlimited opportunities for drug discovery. The objective of this study was to evaluate the antibacterial effect of the extract of Cymbopogon citratus and Cassia occidentalis of Aeromonas spp and Pseudomonas spp, at dilutions of 1/10, 1/100, 1/1000 and pure. To obtain the extracts was used in cold soaking method, mixing the crushed leaves in 4 liters of ethanol for three days, and the solvent extraction was subjected to a water bath at 35 째 C. For antibacterial evaluation was used extracts the disk diffusion method, diffusion well, considering the diameters of inhibition zones. The pure extract of Cassia occidentalis showed the greatest diameter 8mm other dilutions with both Pseudomonas aeruginosa and Aeromonas hydrophila, as pure extract with 9mm Cymbopogon citratus for Aeromonas hydrophila and 8.5 for Pseudomonas aeruginosa. In the evaluation of the extracts under the two methods, but the inhibitory effect was observed in the disk diffusion method. Facing the extracts with reference antibiotics, it is considered that these extracts have no antibacterial activity against these bacterial strains as it did not exceed the minimum standards established by halos of inhibition. Key words: Aeromoniasis, Pseudomoniasis, plants extract, Minimal Inhibitory concentration

INTRODUCCIÓN

El uso de las plantas con fines curativos son de gran utilidad, ya que de ellas son obtenidas innumerables sustancias químicas, por estar relacionadas con el fenol y sus derivados (Domingo y López, 2003), dentro de estas se encuentran hierbas, especias y diversidad de plantas que también han demostrado actividad antibacteriana (Guiza y Rincón, 2007)

Al respecto Rodríguez y Nereyda, (2011) mencionan que cerca de 80 productos de origen vegetal como clavo, ajo, cebolla, salvia, romero, cilantro, perejil, orégano, mostaza y vainilla entre otros, contienen alto niveles de antimicrobianos. Además aproximadamente, el 60% de la población mundial utiliza plantas y productos derivados de ellas en su medicación y hoy en día estos productos naturales son considerados como una de las medicinas de gran importancia por su efectividad terapéutica (Araujo y Salas, 2008). La investigación, en este sentido, brinda la oportunidad de encontrar nuevos principios activos desde el punto de vista farmacológico, a partir de una materia prima más económica y natural (Alvarado y Moroni, 2010).

Una planta medicinal es aquella que contiene en uno o más de sus órganos (hoja, tallo, raíz, flor) principios químicos que pueden ser utilizados directamente como medicamento o bien servir para la elaboración de fármacos. Se ha demostrado la efectividad de diversas plantas sobre enfermedades bacterianas y en particular para el control de agentes bacterianos Gram negativos, muy comunes en el ambiente acuático, pertenecientes a los géneros Aeromonas y Vibrio (Prieto et al., 2005), los cuales emergen como consecuencia de la sobrepoblación, los cambios climáticos y el manejo que se dan en las explotaciones (Brown, 2000).

Considerando lo anteriormente expuesto, se plantea la búsqueda de nuevas alternativas naturales no solo para prevenir las infecciones bacterianas derivadas de la actividad piscícola, sino también, para disminuir el uso de antibióticos y la proliferación de plásmidos que son responsables de la resistencia a antibióticos en aguas abiertas (Negrete et al., 2006), es por ello que se propuso en este trabajo evaluar de la actividad antibacteriana del extracto etanólico de Cassia occidentalis (Brusca) y Cymbopogon citratus (Limoncillo) sobre dos cepas bacterianas (Aeromonas spp. y Pseudomonas spp.).

2 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA A nivel mundial en acuicultura se reportan como principales causas de enfermedad de trascendencia económica y epidemiológica a aquellas asociadas a las de origen bacteriano, para las cuales Iregui et al., (2004) en el caso de Colombia. reportan que cerca del 50%, de 406 casos investigados, de las enfermedades en peces, son procedentes de bacterias como Flexibacter spp, Edwarsiella spp, Aeromonas spp y Streptococcus spp., además de otras aisladas por Rodríguez, Montaño y Rodríguez (2005) en agua y de lesiones cutáneas de peces (53 peces) como Pseudomonas spp y Escherichia coli.

Dentro de los agentes etiológicos más comunes se reportan a Aeromonas spp y Pseudomonas spp son consideradas como fuente de diversas enfermedades sistémicas y digestivas en peces, anfibios y reptiles (Tequianes et al., 2005), que causan severas pérdidas económicas en granjas piscícolas tanto en las producciones por elevadas mortalidades que registran de hasta un 10% al 90%, además de los sobrecostos generados en los tratamientos (Blanco et al., 2004). A causa de los procedimientos químicos que se emplean para tratar de disminuir o inhibir estas bacterias, se ha presentado efectos colaterales, como lo es la bioacumulación en musculo de los peces, la resistencia bacteriana a estos productos y sobre todo la contaminación que se genera en los ecosistemas acuáticos (Penagos, Barato, y Iregui, 2009), convirtiéndose así en un problema biológico, médico, social, económico y etico ya que se involucra la flora, fauna acuática y los individuos externos que de alguna manera u otra interaccionan con estos poblaciones (Cabello, 2004).

Los frecuentes tratamientos y la baja asesoría técnica para contrarrestar estas bacterias o las enfermedades generadas por su presencia, ha producido una creciente alarma debido a la resistencia a los antibióticos convencionales más en

bacterias como Aeromonas spp y Pseudomonas spp, que por su compleja estructura

morfológica

y fácil

adaptación

diferentes condiciones han

desarrollado diferentes mecanismos de resistencia a los tratamientos con los que comúnmente se controla (Pérez, 1998)

Como alternativa se recurre a la obtención de fármacos a partir de plantas, constituyéndose como una fuente de agentes antimicrobianos (Ramirez y Díaz, 2007), respaldando que dichos compuestos extraídos de plantas podrían inhibir el crecimiento bacteriano por un mecanismo diferente al de los antibióticos convencionales (Eloff, 1998), como lo reporta Pandey et al., (2012),

Asalou,

Oyeyemi, y Olanlokun, (2009) demostrando que plantas como brusca y limoncillo presentan actividad antibacteriana debido a propiedades en la planta como taninos, flavonoides, saponinas, entre otros, las cuales se les atribuyen su efecto antibacteriano.

3 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ¿Los extractos obtenidos de las especies Cassia occidentalis y Cymbopogon citratus presentan actividad antimicrobiana frente a los microorganismos seleccionados Aeromonas spp. y Pseudomonas spp?

4 OBJETIVOS

4.1 OBJETIVO GENERAL Evaluar la actividad antibacteriana del extracto etanólico de Cassia occidentalis (Brusca) y Cymbopogon citratus (Limoncillo) sobre dos cepas bacterianas (Aeromonas spp. y Pseudomonas spp.).

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 

Determinar la concentración mínima inhibitoria del extracto etanólico Cassia occidentalis y Cymbopogon citratus sobre Aeromonas spp. y Pseudomonas spp.



Determinar la concentración mínima bactericida del extracto etanólico Cassia occidentalis y Cymbopogon citratus sobre Aeromonas spp. y Pseudomonas spp.



Establecer comparativamente la respuesta de los extractos mediante el método difusión en disco y difusión en pozo.

5 JUSTIFICACIÓN

Las plantas, por su biodiversidad y riqueza en metabolitos secundarios, han sido utilizadas durante milenios por su capacidad medicinal, proporcionando una fuente de posibles sustancias activas contra agentes bacterianos (Álvarez, Izasa, y Echeverry, 2005). Esta riqueza en recursos biológicos son una fuente inmensa para adquirir conocimiento y convertirlo en una herramienta útil para un mayor beneficio en la medicina animal y humana (Lizcano y Vergara, 2008).

La búsqueda de productos naturales con actividad antimicrobiana, proveen oportunidades ilimitadas para hallar nuevos fármacos (Ramírez y Castaño, 2009) debido a su acción biodegradable, no agresivos al medio acuático, y por su inmensa ventaja de eficiencia y efectividad frente a la farmacéutica convencional (Guerra, 2005), que los convertiría en una opción natural de control de enfermedades frecuentemente reportadas en las producciones acuícolas, con mínimos efectos secundarios al ecosistema (Silveira, 2006).

Es así como actualmente se propone el estudio de alternativas naturales derivadas del procesamiento de las plantas, de las cuales se obtienen metabolitos activos de acción antibacteriana, como lo son la Brusca y el limoncillo que hacen parte de las plantas nativas del altiplano Cundiboyacense sobre los cuales se reporta que el extracto de la planta Brusca tiene actividad antibacteriana y antifúngica (Vaijayanthimala et al., 2000) y la planta Limoncillo es utilizada ampliamente

aplicaciones

para

acuicultura

como

antimicrobianos

antifúngicos (Prieto et al., 2005). Con esto se podría tratar o llegar a tener un valor clínico en el tratamiento de cepas microbianas resistentes, ya que estos principios activos derivados de plantas pueden desarrollar un mecanismo diferente a los antibióticos convencionales (Eloff, 1998).

6 HIPÓTESIS

Hipótesis nula: Ninguno de los extractos obtenidos de las especies Cassia occidentalis y Cymbopogon citratus presenta actividad antimicrobiana frente a los microorganismos seleccionados Aeromonas spp. y Pseudomonas spp.

Hipótesis alterna: Todos los extractos obtenidos de las especies Cassia occidentalis y Cymbopogon citratus presenta actividad antimicrobiana frente a los microorganismos seleccionados Aeromonas spp. y Pseudomonas spp.

7 MARCO DE REFERENCIA

7.1 ESTADO DEL ARTE Iregui et al., (2004), reportan que las lesiones presumiblemente asociadas con procesos infecciosos bacterianos que tuvieron mayor relevancia en este estudio fueron aquellas relacionadas con bacterias Gram negativas (-) como Aeromonas sp, Flexibacter sp, Edwarsiella sp, mientras que las alteraciones sugestivas de infección por bacterias Gram (+) fueron los Streptococcus spp. Por consiguiente el mismo estudio revela que de los 406 casos investigados de las explotaciones piscícolas de los departamentos de Colombia, el 50% corresponden a infecciones bacterianas, con un 15% correspondientes a Aeromonas sp.

Pérez, Isaza, y Acosta (2007) en Caldas Colombia evaluaron la actividad antibacteriana de extractos metanólicos, clorofórmicos y de éter de petróleo de las hojas de Phenax rugosus y Tabebuia chrysantha, frente a Stphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Proteus vulgaris, y Pseudomona aeruginosa con la técnica de cultivo en pocillos con concentraciones de 500, 250, 125, 62.5 y 31.25 mg/ml, demostrando que el extracto metanólico fue el único que tuvo inhibición frente a las especies bacterianas, como lo tuvo la Pseudomona aeruginosa

con

un halo de inhibición de 15mm a una

concentración de 500 mg/ml de Phenax rugosus.

Negrete, Romero, y Arredondo (2004) realizaron un estudio en Morales (México), donde estudiaron diferentes granjas donde se presentaron lesiones de infección en cultivos de peces de Ornato, los cuales fueron sometidos a estudios y a cultivos para identificación de diferentes bacterias como Aeromonas hydrophila, Vibrio fluvialis y Vibrio furnissi y fueron sometidos mediante el método de difusión en placa a tratamientos con diferentes antibióticos demostrando que las bacterias

anteriormente dichas presentaron resistencia a cefalotina, ampicilina, tetraciclina, clorafenicol.

Ramírez y Díaz (2007) evaluaron la actividad antibacteriana del extracto etanólico, fracción etérea y fracción diclorometano de hojas, raíces, espigas del Ruibarbo (Rumex conglomeratus) utilizando la

técnica de cultivo en pocillos a

concentraciones de 500, 250, 150 µg/mL, frente a Staphylococcus aureus, Echerichia coli y Pseudomonas aeruginosa, demostrando acción inhibitoria solo para Staphylococcus aureus en los diferentes extractos y concentraciones.

Hernández y Rodríguez (2001) estudiaron los extractos etanólicos de Ocinum basilicum L, Ocinum tenuiflorum L y Cymbopogon citratus (limoncillo) empleando el método de diluciones seriadas dobles en medio líquido, mediante concentración mínima inhibitoria (CMI) frente a 12 organismos bacterianos, demostrando que el Ocinum tenuiflorum inhibió a la mayoría de bacterias, entre estas la Pseudomona aeruginosa con um MIC de 22.15 mg/mL, y para Ocinum basilicum un MIC de 8.39 mg/mL.

Cruz, Rodríguez, y Rodríguez (2010) comprobaron propiedades antibacterianas de cuatro especies vegetales (Bidens pilosa, Shinus molle, Silybum marianum, Lantana camara) frente a Echerichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomona aeruginosa, empleando el método de difusión en disco y difusión en pozo, a concentraciones 0,1; 0,3; 0,5; 0,8; 1 mg/mL demostrando que tuvieron actividad inhibitoria contra Staphylococcus aureus, pero que no tuvieron acción con E. coli, y P. aeruginosa.

Chukwujekwu et al., (2006) reporta que el extracto de las raíces de la Cassia occidentalis (Brusca) presenta actividad antibacteriana frente a Bacillus subtilis y Staphylococcus aureus presentando una concentración mínima inhibitoria de 7.8 × 10− 3 y 3.9 × 10− 3 mg ml− 1

Daniyan, Oloruntimeiehin, y Ifeadi (2011) realizaron un estudio con extracto cloroformico de las flores de la planta Brusca, en la cual el análisis fitoquímico revela

presencia

taninos,

flavonoides,

antraquinonas,

saponinas,

carbohidratos; y en la cual presenta actividad antibacteriana contra Klebsiella pneumoniae con una concentración de 30-90 mg/ml.

Sadiq et al., (2012) en Sokoto, Nigeria demostraron que el extracto etanólico de las hojas de Cassia occidentalis presenta actividad antibacteriana contra Staphylococcus aureus, E. coli, Shigella, Pseudomonas aeruginosa; refiriendo que Staphylococcus aureus, presentando mayor halo de inhibición (18mm) en comparación con las demás especies; la de menor halo fue Shigella (7mm), y la compararon con los antibióticos que comúnmente se usan, amoxilina, septrin, ampidox, demostrando que las especies anteriormente dichas, presentaron resistencia al antibiótico amoxilin excepto Salmonella typhi.

Arya et al., (2010) sustentan que el extracto metanólico de las hojas de Cassia occidentalis

presentan

actividad

antibacteriana

contra

aeruginosa,

pneumoniae, P. mirabilis y E. coli, demostrando que P. mirabilis presentó un mayor halo de inhibición (15mm) que las demás; también reportan que el extracto acuoso de las hojas inhiben a las bacterias P. vulgaris, K. pneumoniae, P, aeruginosa, permitiendo ver, que la especie más susceptible fue Pseudomonas aeruginosa que tuvo un mayor halo de inhibición (18mm) que las demás especies.

Pandey et al., en el (2012) reporta que el extracto etanólico de las hojas de Cassia occidentalis a concentraciones de 25, 50, 75 mg/ml mostró mejor actividad antibacteriana,

que

los

extractos

preparados

con

éter

petróleo

contra

Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans y Aspergillus niger.

Asalou, Oyeyemi, y Olanlokun (2009) realizaron un estudio donde utilizaron 300g de la hojas de Cymbopogon citratus que fueron lavadas en 500 ml de etanol al 95% por varios días, después los extractos fueron filtrados y concentrados por el rota evaporador. La actividad antibacteriana presenta inhibición contra Salmonella typhi empleándolo a 50 mg/ml.

Cuellar y Hussein, (2009) y Osanaiye, Agbaji, y Dakare, (2007) reportan que el aceite esencial del Cymbopogon citratus presenta actividad antibacteriana contra Salmonella typhi, Staphylococcus aureus y Escherichia coli, con un efecto del 87% con respecto a la gentamicina estándar, y fueron más activas por encima del 1/16 de las diluciones que emplearon.

Otros estudios revelan que los extractos etanólicos de Cymbopogon citratus, Adiatum capillus-veneris, inhiben a las bacterias Staphylococcus aureus, Proteus mirabilis, Klebsiella pneuomonia, y el hongo Candida albicans demostrando una concentración mínima inhibitoria de 12.5mg/ml, y un MIC de 0.78mg/ml para el hongo (Nyarko, Barku, y Batama, 2012)

7.2 MARCO TEÓRICO

7.2.1 Fitoterapia La fitoterapia es la ciencia que estudia el conocimiento y uso medicinal de las plantas, que fueron utilizadas por milenios por sus beneficios curativos, y que en el actual siglo el empleo de la tecnología ha permitido la obtención de sus principios activos (familias metabolitos) (Guerra, 2005), revelando el potencial de la plantas como fuente de agentes anti-infectivos, y permitiendo el avance en la ciencia moderna en el campo de la fitoquímica (López et al., 1997).

Cada especie en particular presenta una edad óptima para la obtención de sus principios activos, por lo general en las plantas muy jóvenes no existen sustancias con las propiedades biológicas y químicas bien definidas y si son viejas suelen presentar disminuido el metabolismo y por ende el contenido de sus compuestos activos (Rodriguez, 1998). Estos principios que pueden ser primarios son los de mayor abundancia en la naturaleza y desempeña un papel esencial en el metabolismo básico de la planta, como lo son las proteínas, los ácidos nucleicos, hidratos de carbono y lípidos; los principios secundarios son aquellos responsables del olor, del sabor, color y de las propiedades medicinales, como terpenos y esteroides, flavonoides, cromenos y benzofuranos, cumarinas, quinonas, alcaloides entre otras (Mesa y Pinel, 2007).

Los flavonoides exhiben actividad antiviral, antimicrobiana y antifúngica junto con el ácido caféico y el cinámico que son representantes de los fenoles, su acción contra los microorganismos se debe a la inhibición enzimática posiblemente por acción sobre los grupos sulfihidrilos de sus aminoácidos de cisteína o por medio de reacciones más inespecíficas con proteínas bacterianas (Araujo y Salas, 2008). Los extractos de poli fenoles afectan a la porción lipídica de la membrana

citoplasmática de los microorganismos patogénicos, provocando una disminución del consumo de oxígeno y la alteración de la cadena respiratoria (Prosdócimo et al., 2010).

7.2.2 Extractos naturales Los extractos se obtienen mediante la separación de porciones biológicamente activas presentes en los tejidos de plantas, con el uso de un solvente (alcohol, agua, mezcla de estos u otro solvente selectivo) y un proceso de extracción adecuado, que permiten obtener productos farmacéuticos con menores efectos secundarios y satisfacer las necesidades crecientes del uso de productos naturales (Pérez, 2011). La selección del solvente depende de parámetros técnicos

económicos

como

selectividad,

estabilidad,

inercia

química,

temperatura de ebullición no demasiado elevada para permitir su eliminación total, y no demasiada baja para evitar pérdidas (González, 2004). Para la determinación de la consistencia de los extractos se clasifica como blandos que tiene la consistencia de miel espesa; firmes que no se adhieren a los dedos; secos el disolvente ha sido casi completamente eliminado y fluidos que corresponde exactamente al peso de la sustancia empleada como medicamento; su conservación es indispensable la cual debe estar protegida de la luz, y en envases bien tapados (Barreto, 1997).

Las extracciones pueden hacerse por extracción continua en soxhlet, en la cual el material seco se sitúa en una cámara central y el solvente se hace evaporar en caliente, el vapor del solvente asciende al condensador y gotea sobre el material vegetal; por reflujo, el material vegetal y el solvente se colocan en un balón el cual tiene acoplado un refrigerante, se calienta, el solvente evaporado se condensa y vuelve a mezclarse con el material vegetal; y por maceración en frío, el material se mezcla con el solvente triturado continuamente en frio (Arévalo y Enciso, 1996)

Los métodos utilizados para evaluar actividad de extractos de plantas sobre bacterias y hongos suelen ser similares, variando la preparación del inóculo, medio de cultivo, temperatura y tiempo de incubación; por ejemplo la técnica de difusión por discos en agar es utilizada para generar datos cualitativos, involucrando la aplicación de una cantidad determinada antibacterial y otra sustancia en un sustrato, (usualmente discos de papel) en la superficie del agar (Mueller Hinton) sobre el cual se ha distribuido un inóculo del microorganismo en estudio; se formará así, por difusión un gradiente de concentración del producto alrededor del disco y la sensibilidad del microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento bacteriano (Shiva, 2007).

7.2.3 Brusca

Clasificación taxonómica según el Plant Name Botany ( 2012): Reino:

Planta

División

Magnoliophyta

Clase:

Magnoliopsida

Subclase:

Rosidae

Orden:

Fabales

Familia:

Fabaceae

Subfamilia: Cesalpinoideae Género:

Cassia

Especie:

Cassia occidentalis

Es una planta ramificada arbustiva, mide de 0,8 a 1,5 metros de altura; las hojas son pinnadas y miden aproximadamente 20 cm (Figura 1); las flores son amarillas 2 cm de largo, los nombres comunes son Bicho de café, brusca, busca, café de brusca, cafecillo, café senna; su parte útil son las semillas, flores y hojas; las semillas se tuestan y utilizan como sustituto del café, además poseen actividad

febrífuga, emenagoga y estomaquica, se emplea también como diurético y tratamiento de indigestión, dispepsia y enfermedades prostáticas (Vademécum, 2008). Las hojas son usadas para la cicatrización de heridas, llagas, picazón, enfermedades cutáneas, fracturas de huesos, fiebre, infección de la garganta (Arya et al., 2010) Presentan actividad antimicrobianas (antibacterianas y anti fúngicas) (Vaijayanthimal et al., 2000). Los metabolitos secundarios que se encuentran

las

semillas

son

los

lípidos,

carotenoides,

tocoferoles,

aminoácidos, carbohidratos, alcaloides, saponinas, taninos, mucílago y aceites fijos (Vademécum, 2008).

Figura 1. Cassia occidentalis. Fuente: Autor

7.2.4 Limoncillo

Clasificación Taxonómica según el Plant Name Botany ( 2012): Reino:

Plantae

División:

Magnoliophyta

Clase:

Liliopsida 29

Subclase:

Commelinidae

Orden:

Poales

Familia:

Poaceae

Género:

Cymbopogon

Especie:

Cymbopogon citratus

Los nombres comunes son caña santa, hierba de limón, limoncillo, limonaria, limonera, caña limonaria, lemongrass; es una gramínea que alcanza hasta 2 m de altura crece en macollos compactos, formados por muchos tallos cortos que salen de rizomas pequeños, sus hojas tienen entre 30 y 100 cm de largo y 1 a 1.5 cm de ancho, con bordes duros y el nervio central fuerte; la parte utilizable por la industria está constituida por las hojas y los tallos tiernos (Figura 2). Se ha empleado como estomáquico, carminativo, antiulceroso y antiespasmódico (Vademécum, 2008). Sus hojas son utilizadas para preparar bebida aromática y té, para aliviar dolores estomacales e intestinales; es un constituyente principal en la cocina por su sabor a limón (Hindumathy, 2011). Es una planta considerada de importancia económica en la agricultura de Estados Unidos de América y parte de Asia donde son cultivadas para propósitos comerciales como en la industria de cosméticos, insecticidas, jabones, perfumes; se usa en la medicina herbal como tratamientos del nerviosismo y de inflamaciones (Asaolu et al., 2009). El aceite esencial es usado como cura para acné, sarna, flatulencia, dolores de cabeza y problemas de circulación sanguínea (Singh et al., 2011). De las partes aéreas se han aislado flavonoides, ácido caféico, fructosa, sacarosa y compuestos volátiles: terpenos como geraniol, citronelol y citral. Las hojas contienen alcoloides, taninos y flavonoides (Vademécum, 2008)

Figura 2. Cymbopogon citratus. Fuente: Autor 7.2.5 Bacterias Las bacterias son microorganismos procariotas, constan de citoplasma, membrana plasmática, ARN y ribosomas, pared celular y algunas pueden presentar flagelos, fimbrias o pili; es así como el éxito evolutivo de las bacterias se debe en parte a su versatilidad metabólica, en donde todos los mecanismos posibles de obtención de materia y energía se pueden encontrar en las bacterias (Bailon, Cruz, y Cervantes, 2003). La célula bacteriana es una máquina sintética capaz de duplicarse a sí misma y los procesos bioquímicos del crecimiento celular bacteriano suponen no menos de 2000 reacciones de una gran variedad de tipos por lo tanto algunas de estas reacciones son transformaciones de la energía (Madigan, Martinko, y Parker, 2004). Las bacterias se han clasificado como Gram negativas (-) y Gram positivas (+) en función de su comportamiento frente a la tinción de Gram, para las Gram positiva (+) se tiñen de color violeta oscuro, y las Gram negativa (-) de color rosa debido a su pared celular (Granados y Villaverde, 2003).

La morfología nos puede dar información primara del tipo de bacteria, pero no de forma concluyente y es dada por la rigidez de su pared, estas pueden ser esférica (coco), bastoncillo o cilíndrica (bacilo), helicoidal (espirilo), en forma de coma (Vibrio), espiral (espiroqueta), estrella y cuadrangular (Granados y Villaverde, 2003).

 Aeromonas spp Clasificación taxonómica según: Stanier, (1943) Reino:

Bacteria

Filo:

Proteobacteria

Clase:

Gammaproteobacteria

Orden:

Aeromonadales

Familia:

Aeromonadaceae

Género:

Aeromonas

Aeromonas es propio de ecosistemas acuáticos dulceacuícola, salobres y es un patógeno oportunista causando infecciones intestinales e extraintestinales en animales de sangre fría, caliente, y en humanos, además es un comensal del intestino de peces, reptiles y anfibios (Gonzalez et al., 2004). Evidencias clínicas y epidemiológicas

indicarían

que

ciertas

especies

Aeromonas

son

enteropatógenas (Stanchi, 2007). En humanos son agentes etiológicos de diversas enfermedades, que en ocasiones pueden presentar hemorragia, osteomilitis, neumonía, septicemia y enfermedades ulcerativas (Tequianes et al., 2005). Los brotes de enfermedad por Aeromonas spp., por lo general están asociados a serios desordenes en el ambiente de los peces, como la alta densidad de los animales, la manipulación, las altas temperaturas, bajo oxígeno disuelto, altos nitritos, alto amonio, susceptibilidad del hospedero y la virulencia del patógeno (Iregui et al., 2004).

Los miembros de este género miden 1,1 a 4,4 µm de largo por 0,4 a 1,0 µm de ancho. La mayoría de las cepas son móviles por medio de flagelos monótricos, algunas poseen flagelos lofótricos y otras presentan pequeños flagelos laterales. A. salmonicida y A. media son excepciones de cepas inmóviles; Las diferentes especies de Aeromonas pueden crecer en los medios diferenciales y selectivos empleados para el aislamiento de bacterias Gram-negativas. (Valdés y Vivanco, 2001).

 Aeromonas hydrophila

Aeromonas hydrophila es un cocobacilo Gram negativo (-) que pertenece a un grupo de bacterias móviles, anaerobias facultativas implicadas en una gran variedad de infecciones que afectan a los peces y al ser humano. En los peces ocasiona un cuadro típico de septicemia hemorrágica y puede producir enfermedad como patógeno primario dándose en ocasiones como oportunista, ocasionando grandes pérdidas económicas en el ámbito mundial (Jiménez, Iregui, y Figueroa, 2008). Los productos extracelulares de A. hydrophila causan muerte en peces al ser inoculados intraperitonealmente y cursan lesiones extensas en músculo al ser inyectado por esta vía (Rodríguez et al., 2005). Según un estudio en México en una explotación de trucha Arco iris se presentó un brote de septicemia hemorrágica en donde los animales presentaban oscurecimiento de la piel, exoftalmia unilateral y el patrón de comportamiento alterado; clínicamente la enfermedad se presenta con características de epizootia, resultando en un alto índice de morbilidad y mortalidad (Fuentes y Pérez, 1998).

Las infecciones por Aeromonas hydrophila se clasifican en tres grupos de acuerdo al tipo de lesión y de signos; septicemia por Aeromonas motiles; cutánea, infección limitada a la piel y al músculo; latente, infección sistémica pero sin signos de enfermedad (Iregui et al., 2004).

 Pseudomonas spp. Clasificación taxonómica según Migula & Campbell, (1983) Reino:

Bacteria

Filo:

Proteobacteria

Clase:

Gammaproteobacteria

Orden:

Pseudomonadales

Familia:

Pseudomonadaceae

Género:

Pseudomonas

El género Pseudomonas está integrado por bacilos gramnegativos, móviles por flagelos polares, aerobios estrictos, no fermentativos, oxidasa positiva con un diámetro de 0,6 a 2 µm, crecen con facilidad en medios nutritivos simples; están ampliamente distribuidas en la naturaleza: el suelo, el agua y en todo lugar donde exista materia orgánica en descomposición (Stanchi, 2007). Esta bacteria produce septicemia con lesiones hemorrágicas sobre la piel, apareciendo una hiperemia en los vasos de la dermis y termina con grandes ulceraciones que penetran en el músculo, que a la vez alteran los órganos internos, en algunos casos se presenta ascitis, generando una muerte rápida en los peces. De todas las especies que integran este género la Pseudomonas aeruginosa es el patógeno más importante, teniendo en cuenta la cantidad y tipos de infecciones (invasivas y toxígenas) que produce, así como la morbilidad y mortalidad que ocasiona, se reviste de una enorme importancia clínica en el hombre y en los animales (Martínez, Pérez, y Pérez, 2001).

 Pseudomonas aeruginosa No forma esporas y es aerobio estricto, utiliza el oxígeno aceptor final de electrones, aunque puede crecer en un ambiente anaeróbico empleando nitratos

como aceptor terminal de electrones. Es una bacteria resistente a antibióticos y puede mutar a cepas multirresistentes, durante el tratamiento (Stanchi, 2007).

7.2.6 Resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos Las bacterias son capaces de desarrollar mecanismos de resistencias, en la cuales se presentan tres fundamentales: la primera es la inactivación del antibiótico por enzimas como lo es las betalactamasas, en los gram positivos suelen ser plasmídicas, inducibles y extracelulares, y en las gram negativas de origen plasmídico o por transposones, constitutivas y periplámicas; la segunda se presenta las modificaciones bacterianas que impiden la llegada del antibiótico al punto diana, alterando los sistemas de transporte (aminoglucosidos en los anaerobios), y también pueden provocar la salida del antibiótico, por un mecanismo de expulsión activa, impidiendo que se acumule en cantidad suficiente para que actúe eficazmente; la tercera es la alteración por parte de la bacteria de su punto diana, impidiendo o dificultando la acción del antibiótico, como las alteraciones del ADN girasa (resistencia de quinolonas ) (Pérez, 1998) 7.2.7 Medios de cultivo Un medio de cultivo es un conjunto de nutrientes, factores de crecimiento y otros componentes que

crean

condiciones necesarias para

desarrollo

microorganismos; pueden ser según por su consistencia, sólidos y líquidos y por su composición, medios generales, enriquecimiento, selectivos y medios diferenciales etc. (Gamazo, López y Díaz, 2005). En este estudio se emplearon los siguientes medios:

 Agar Mueller Hinton Es un medio excelente para efectuar pruebas de susceptibilidad a antimicrobianos (antibiograma); se utiliza para la realización del ensayo difusión en placas. (García, Fernández y Paredes, 1994).

 Agar nutritivo Es un medio enriquecido de nutrientes para el aislamiento de microorganismos gram-positivos y gram-negativos, hongos y levaduras que no requieren elementos especiales para su crecimiento, se usa principalmente para el mantenimiento de cepas, realización de subcultivos para confirmar la pureza de los aislamientos (Shiva, 2007). Este medio se empleó para el aislamiento de las cepas Aeromonas spp y Pseudomonas spp.

 Caldo Infusión cerebro corazón (BHI) Es un medio de cultivo líquido para microorganismos de difícil crecimiento y microorganismos de crecimiento rápido (Shiva, 2007). Este medio se empleó para conservar las cepas agregándole glicerol al 10 % y refrigerándolas a -20°c

7.2.8 Métodos de evaluación de la capacidad antimicrobiana El método más común es el de Kirby-Bauer mediante difusión en agar (disco de papel o pozo) y dilución (agar o caldo líquido)

7.2.8.1 Método de difusión en agar Este método se le conoce como antibiograma de discos, que determinan la susceptibilidad

los

microorganismos

una

variedad

agentes

antimicrobianos(Arrieta y Mattar, 2007; se emplean discos de papel absorbente,

impregnados con una concentración conocida del antibiótico colocándose sobre la superficie de una placa de agar de Mueller Hinton, en la que se acaba de inocular una suspensión de la cepa bacteriana con una turbidez equivalente al tubo 0.5 de McFarland incubándose por 18-24 horas a 35-37°C; de esta manera se forma radialmente un gradiente de concentración alrededor del disco, permitiendo establecer si la cepa bacteriana es resistente, medianamente resistente o sensible al antibiótico (Rodríguez et al., 2005). Con este mismo procedimiento se emplea difusión en pozo que consiste en perforar el agar formando unos pocillos donde se adiciona el producto a evaluar. (Shiva, 2007).

7.2.8.2 Método por dilución Este método se utiliza para bacterias y hongos permitiendo cuantificar la sensibilidad del microorganismo, determinando la concentración mínima que inhibe el crecimiento bacteriano (CMI), por dilución en agar y dilución en medio líquido (Sánchez y Guzman, 1998);  Dilución en agar Consiste en diluciones seriadas del antibiótico con agar Mueller Hinton, luego se solidifica y se evalúa con las diferentes diluciones del antibiótico (Sánchez y Guzman, 1998).  Dilución en medio líquido Se preparan las diluciones seriadas del antibiótico o extracto adicionándolas en una serie de tubos con medio de cultivo líquido como caldo de Mueller Hinton o caldo de tripticasa de soya con el inóculo bacteriano a evaluar.

Concentración mínima inhibitoria (CMI) Es la mínima concentración del antibiótico o del extracto que inhibe el crecimiento bacteriano, evaluando en los tubos la formación de velo ascendente que al

agitarlo se puede mantener en la superficie o caer al fono del tubo; también se puede formar un anillo adherido o no a la pared del tubo; se puede presentar enturbiamiento del medio en los tubos (Stanchi, 2007).

Concentración mínima bactericida La actividad bactericida es el valor de la actividad antimicrobiana que mata un microorganismo determinado esta se determina in vitro enfrentando una concentración de bacterias frente a una aserie de diluciones del antibiótico. La concentración más baja que mata el 99% de la población bacteriana se denomina concentración mínima bactericida (Stanchi, 2007).

7.3 MARCO LEGAL

A continuación se describirá brevemente la normatividad vigente, de la bioética y comportamiento del profesional Médico Veterinario en los diferentes procesos de investigación, además la normatividad que rige al trabajar con laboratorios

Ley 576 de 2000 (Febrero 15): se expide el código de ética que rige el ejercicio profesional de Medicina Veterinaria, donde los artículos 3, 49, 90 decretan la responsabilidad que tiene el médico veterinario a nivel profesional y su compromiso ético para investigar, desarrollar, y producir de manera correcta los recursos del medio ambiente junto con la biodiversidad del país, sin generar riesgos para la salud pública, y contribuyendo al desarrollo del sector agropecuario.

Decreto 77 de 1997:

Se reglamenta los requisitos y condiciones técnico

sanitarias para el funcionamiento de los laboratorios clínicos, donde el artículo 4 menciona la importancia que tiene el apoyar la vigilancia epidemiológica al trabajar en

laboratorios, y se ajustarán a las estipulaciones del Manual de

Normas Técnicas, Científicas y administrativas adoptado por el Ministerio de Salud.

Ley 86 de 1993 (Junio 3): por el cual se reglamenta el uso e industrialización de la Flora Medicinal. Decreta Artículo 1: denominase planta medicinal toda especie vegetal que, sin originar perturbaciones tóxicas, haya manifestado, en el uso tradicional, propiedades favorables a la restauración de la salud.

7.4 MARCO GEOGRÁFICO

El presente trabajo se desarrolló en ambientes de campo que consiste en la recolecta de las plantas es especial de las hojas y de laboratorio donde se desarrolló todos los procesos evaluativos de los extractos frente a las cepas bacterianas del estudio.

LOCALIZACIÓN RECOLECTA VEGETAL

La planta Brusca y Limoncillo se recolectó en etapa florativa provenientes del Municipio de San Mateo, vereda Monterredondo situada a 6 grados, 24 minutos y 29 segundos de latitud norte, 72 grados, 33 minutos y 37 segundos de longitud oeste, con una altitud de 2.300 metros. (interactiva, 2004).

PROCESOS DE LABORATORIO

Para la extracción de las plantas y la evaluación microbiológica se desarrolló en la Fundación Universitaria Juan de Castellanos; ubicada en la Ciudad de Tunja que está ubicada en el altiplano Cundiboyacense en la cordillera Oriental de los Andes. Aproximadamente a los 5º32´7" de longitud al Oeste de Greenwich, con una altitud de 2700 msnm y una temperatura 13 grados centígrados

8 DISEÑO METODOLÓGICO

8.1 DISEÑO EXPERIMENTAL

Tipo de estudio: Experimental: permite establecer causación o relación de causa y efecto de un fenómeno a través de procedimientos controlados donde de manipulan y controlan las variables que ejercen incidencia sobre el fenómeno (Suárez, 2001).

Correlacional: describe relaciones entre dos o más variables en un momento determinado (Suárez, 2001)

8.2 METODOLOGÍA 8.2.1 Preparación de los extractos

Las hojas de cada una de las plantas se recolectaron antes de la etapa florativa en tiempo seco, sin rocío en el Municipio de San Mateo (Boyacá), vereda Monterredondo. Las hojas fueron puestas a la sombra en un lugar seco por un período de ocho días para su deshidratación, finalizado este periodo se procedió a la maceración en frío, que consiste en triturar las hojas con un mortero hasta conseguir 300 g de cada planta, empacándolas en una tela con maya y dejándolas en un frasco de vidrio de cuatro litros de capacidad con etanol desnaturalizado al 96% tapando el total de la muestra por 72 horas (3 días) agitando regularmente los frascos y protegidos de la luz directa (Pandey et al., 2012) (Figura 3).

 Extracción del solvente Pasados las 72 horas se filtró y se evaporó el etanol a baño maría

a una

temperatura de 35°C utilizando cuatro recipientes de vidrio (100 ml) para cada planta, agregando 20 ml de extracto cada 24 durante un mes. Una vez extraído el solvente, se obtuvo el extracto bruto de cada planta con un promedio de 18.4 gr para brusca y 23 gr para Limoncillo, con una consistencia pastosa, y de color verde, las cuales se almacenaron a 4ºC hasta el momento de su utilización (Figura 3).

Figura 3.Preparación de los extractos. A. Hojas secas de Cassia occidentalis. B. Hojas secas de Cymbopogon citratus. C. Maceración en frio de ambas plantas (izquierda brusca y derecha limoncillo). D. Evaporación a baño maría, cuatro recipientes de vidrio para cada planta.

8.2.2 Pruebas microbiológicas  Conservación de las cepas El trabajo se desarrolló en el laboratorio de microbiología de la Fundación Universitaria Juan de Castellanos, las bacterias Aeromonas spp. y Pseudomonas spp ATCC 15442 fueron adquiridas del cepario de la Facultad de Ciencias de la Pontificia Universidad Javeriana. Posteriormente para su conservación, las cepas se cultivaron en caldo infusión cerebro corazón (BHI), incubándose por 24 horas a 37 ºC. El cultivo se mezcló con igual volumen de glicerol al 10% (v/v), la mezcla homogénea se dispensó en tubos eppendorf a razón de 1ml/tubo conservándose a -200C.  Estandarización del inóculo bacteriano Para la estandarización de los inóculos bacterianos según la técnica de kirby Bauer, se tomaron de los tubos eppendorf las bacterias y se sembraron por aislamiento en estría en agar nutritivo de manera independiente, incubándose por 24 horas a 37°C; una vez obtenido el crecimiento bacteriano, se tomaron 4 o 5 colonias y se sembraron en cada tubo con 3ml de solución salina al 0,85% hasta obtener una turbidez equivalente a escala 0,5 de McFarland, que representa aproximadamente 1.5x108 ufc/ml (figura 4). En la tabla 1 se muestra la forma de elaborar la escala de Mc Farland. Tabla 1. Escala de Mc Farland TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

CL2Ba 1% 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

SO4H2 1% 9,9 9,8 9,7 9,6 9,5 9,4 9,3 9,2 9,1 9,0 43

Ufc/ml 3,0x108 6,0x108 9,0x108 1,2x109 1,5x109 1,8x109 2,1x109 2,4x109 2,7x109 3,0x109

Figura 4. Pruebas microbiológicas. A. Siembra por estría múltiple de Aeromonas en Agar nutritivo. B. Siembra por estría múltiple de Pseudomonas en Agar nutritivo. C. Preparación de Mac Farland (tubo izquierdo 0,5 de Mc Farland y tubo derecho 1 de Mc Farland). D. Tubo 0.5 de Mc farland (tubo izquierdo) y solución salina al 0.85%+colonias de Aeromonas spp (tubo derecho).E. Tubo 0.5 de Mc farland (tubo izquierdo) y solución salina al 0.85%+colonias de Pseudomonas spp (tubo derecho)

8.2.3 Evaluación de la actividad antibacteriana Para realizar las diluciones de cada uno de los extractos se agregó 1 gramo del extracto puro, más 9 ml de agua peptonada al tubo anterior se tomó peptonada al

para tener la dilución

ml para adicionarlo en un tubo que conten a

se obtuvo la dilución

del

ml de agua

², y de este se tomó 1 ml y se pasó a

un tubo que contenía 9 ml de agua peptonada al 0,1

dilución

³). (Figura 5)

Figura 5. Preparación de las diluciones seriadas de los extractos

Una vez preparado y ajustado el inóculo y las diluciones de los extractos se evaluó la actividad antibacteriana de cada extracto mediante dos métodos: difusión en disco y difusión en pozo.

8.2.3.1

Difusión en disco

El inóculo bacteriano (ajustada al patrón 0,5 de Mc Farland) se impregnó un hisopo de algodón estéril y se esparció en todas las direcciones sobre el agar con Mueller Hinton, hasta que se logró una difusión homogénea. Después de 3 a 5 minutos se colocaron los sensidiscos con antibióticos en µcg y los sensidiscos con las diferentes diluciones de los extractos (1

³) sobre la superficie del

agar con pinzas estériles aplicando una ligera presión a una distancia no menor a 24 mm desde un centro al otro.(Figura 6). -

Antibióticos: Para Pseudomonas se usaron sensidiscos de: Norfloxacina (10), Gentamicina (10), y para Aeromonas se pusieron sensidiscos de Ceftriaxona (30), Oxitetraciclina (30). Se incubaron por 24 horas a 37°C para observar los halos de inhibición.

Figura 6. Método difusión en disco. A. Impregnando los discos de papel con las diluciones de los extractos. B. Ubicación de los sensidiscos en la caja con agar Mueller Hinton.

8.2.3.2

Difusión en pozo (perforación en gel de agar).

Se mezcló 1ml de la suspensión bacteriana (ajustada al patrón 0,5 de Mc Farland) con 20 ml de agar Mueller Hinton fundido a 45 0C, luego se perforaron pozos con 0,5 cm de diámetro y 0,4 mm de profundidad con un pitillo estéril, y se agregaron

20 µl de cada uno de los extractos a diferentes diluciones

³ y puro) y

se incubaron a 37 C por 24 horas.

La elección de los antibióticos se escogió de acuerdo para cada cepa bacteriana según Sánchez y Guzman, (1998) y observando que estos antibióticos han sido los más usados en otros tipos de investigaciones.

Para la evaluación bacteriana por medio de los dos métodos se interpretó según criterios de halos de inhibición de Sánchez y Guzman, (1998). Tabla 2.

TABLA 2. Criterio de interpretación del antibiograma de discos ZONA DE INHIBICIÓN (mm) ANTIMICROBIANO RESISTENTE MEDIANAMENTE SENSIBLE Mcg RESISTENTE R M S Ceftriaxona 30 14 15-19 20 Oxitetraciclina 30 14 15-18 19 Norfloxacina 10 12 13-16 17 Gentamicina 10 12 13-14 15 Tomado de (Sánchez y Guzman, 1998)

8.2.3.3

Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) por el método de dilución en tubo

Se tomaron ocho tubos (cuatro para cada planta) con 5 ml de caldo nutritivo estéril) y se les adicionó 0,5 ml del inóculo bacteriano ajustado a escala 0,5 de Mc farland. Posteriormente se adicionó 1 ml de las diluciones de los extractos a evaluar de brusca y limoncillo. El volumen final para todos los tubos se ajustó con agua destilada estéril (3.5 ml) para completar un volumen final de 10 ml. Todos los tubos se incubaron a 370C por 24. La concentración mínima inhibitoria se tomó

como: la más baja concentración de los extractos que inhibe el crecimiento bacteriano. 8.2.3.4

Determinación de la concentración mínima bactericida (CMB).

A partir de la concentración mínima inhibitoria (CMI) después de las 24 horas, se impregnaron hisopos estériles de los tubos donde se observó inhibición de crecimiento y se sembraron en cajas con agar nutritivo. Se incubaron por 24 h a 37° C y la concentración mínima bactericida es la menor concentración del extracto capaz de inhibir el crecimiento microbiano.

8.3 ANÁLISIS DE DATOS

Los datos se consolidaron en Microsoft Excel 2010 realizando un análisis descriptivo, teniendo en cuenta las dos replicas para cada dilución con cada una de las bacterias utilizadas.

9 RESULTADOS

9.1 EVALUACIÓN DE LA ACTVIDAD ANTIBACTERIANA

9.1.1 Método difusión en disco

Como se observa en la tabla 3, al comparar la media de las dos réplicas que se emplearon el extracto puro de Cassia occidentalis presentó un equivalente en sus diámetros de inhibición de 8mm para ambas bacterias. La dilución de 1/1000 (10¯³) para el caso de Pseudomonas aeruginosa, no presentó halo de inhibición; al análisis de los datos las diluciones 10ˉ

10¯³ presentaron una alta desviación

de (4.9) con respecto a la media, considerándose demasiada alta la dispersión de los datos. Al comparar los extractos frente a los antibióticos se observa que no hubo sensibilidad evidente; frente a los tratamientos control de Pseudomonas aeruginosa la gentamicina registró un diámetro de 16 mm y Aeromonas hydrophila con oxitetraciclina presentó un diámetro de 25 mm (figura 7). Tabla 5

Tabla 3. Halos de inhibición (mm) media y desviación estándar para el extracto Cassia occidentalis en Aeromonas hydrophila y Pseudomonas aeruginosa

EXTRACTO

Cassia occidentalis

CONCEN TRACIÓN mg/ml

DIAMETRO HALO DE INHIBICIÓN (mm) Aeromonas hydrophila 1 2 X S

Pseudomonas aeruginosa 1 2 X S

Puro

1/10

1/100

3.5

4.94974747

1/1000

3.5

4.94974747

(-) ausencia halo de inhibición 1-2: número de repeticiones S: desviación estándar

X: media

Promedio de halos de inhibición en mm con Cassia occidentalis frente al control positivo 30 25 20 15 10 5 0

Aeromonas

16 8

3,5

Pseudomonas Control positivo para A. hydrophila Control positivo para P. aeruginosa

Tratamiento

Figura 7. Diámetro del halo de inhibición con Cassia occidentalis en Aeromonas hydrophila y Pseudomonas aeruginosa por el método de difusión en disco

Como se aprecia en la tabla 4 al comparar las medias del extracto puro de Cymbopogon citratus este presentó un diámetro de 9 mm para Aeromonas hydrophila y 8.5 mm para Pseudomonas aeruginosa. Las diluciones de 1/100 (10ˉ²) y 1/1000 (10ˉ³) tuvieron un halo de 7 mm y 3.5 mm para P. aeruginosa, y ausencia de halo para Aeromonas hydrophila. En el caso de la dilución 10ˉ³ esta presentó una alta variabilidad con respecto a la media (SD 4.9). Con referencia a los antibióticos empleados estos presentaron mayor diámetro de inhibición que los extractos, con un diámetro de 27mm para Norfloxacina y de 26 mm con ceftriaxona (Figura 8) (Tabla 5).

Tabla 4. Halos de inhibición (mm) media y desviación estándar para el extracto Cymbopogon citratus en Aeromonas hydrophila y Pseudomonas aeruginosa

EXTRACTO

Cymbopogon citratus

DIAMETRO HALO DE INHIBICIÓN (mm)

CONCEN TRACIÓN mg/ml

Puro

8.5

0.70710678

1/10

7.5

0.70710678

7.5

0.70710678

1/100

1/1000

3.5

(-) ausencia halo de inhibición S: desviación estándar

Aeromonas hydrophila 2 X S

Pseudomonas aeruginosa 1 2 X S

1-2: número de repeticiones

4.94974747

X: media

Promedios halos de inhibición en mm con Cymbopogon citratus frente al control positivo 26

30 25 20 15 10 5 0

Aeromonas 16 9

7,5

8,5

3,5

Pseudomonas Control positivo para A. hydrophila Control positivo para P. aeruginosa

Tratamiento

Figura 8. Diámetro de inhibición de Cymbopon citratus en Aeromonas hydrophila y

Pseudomonas aeruginosa por el método de difusión en disco .

En la tabla 5 se presentan los resultados de los antibióticos usados en este estudio, que evidencian la sensibilidad de las cepas con los halos de inhibición en mm Tabla 5. Resultados de la actividad

de los antibióticos contra Aeromonas

hydrophila y Pseudomonas aeruginosa ESPECIE

ANTIBIOTICO

DIAMETRO HALO DE INHIBICIÓN (mm)

Mcg

TÉCNICA DIFUSIÓN EN DISCO

Aeromonas hydrophila

Ceftriaxona 30

Oxitetracilina 30

Pseudomonas aeruginosa

Norfloxacina 10

Gentamicina 10

R= Resistente

M= Medianamente resistente

S= sensible

En este estudio se considera que no hubo sensibilidad en la actividad antibacteriana de los extractos ya que los halos de inhibición estuvieron entre un rango de 7-9 mm por el método de difusión en disco. (Figura 9).

A B Figura 9. Métodos empleados para la evaluación antibacteriana. A, método de difusión en disco. B, método de difusión en pozo

9.1.2 Método difusión en pozo Al evaluar la actividad antibacteriana del extracto etanólico de Cassia occidentalis (brusca) sobre Aeromonas spp. con este método, no se encontraron halos de inhibición. Con respecto al efecto de este mismo extracto sobre Pseudomonas spp, no se presentaron halos de inhibición.

En cuanto a Cymbopogon citratus (limoncillo) sobre las dos cepas mencionadas anteriormente se presentó el mismo efecto, que el extracto etanólico de Cassia occidentalis

9.1.3 Concentración mínima inhibitoria y bactericida A la valoración del estudio no hubo concentración mínima inhibitoria ni bactericida de los extractos, debido a que se observó en cada tubo de ambas cepas bacterianas la presencia de turbidez, (figura 10), confirmando esta presencia de crecimiento bacteriano por inoculación de una alícuota de cada tubo en agar nutritivo.

C Figura 10. Concentraci贸n m铆nima inhibitoria y bactericida. A. CMI Cymbopogon citratus (izquierda Aeromonas, Derecha Pseudomonas) B. CMI DE Cassia occidentalis (izquierda Aeromonas, Derecha Pseudomonas). C. Concentraci贸n m铆nima bactericida, siembra en agar nutritivo

10 DISCUSIÓN Los metabolitos secundarios de las plantas ofrecen múltiples posibilidades farmacológicas en relación los efectos que se atribuyen a las moléculas activas que incluyen actividad antibacteriana, antifúngica, entre otras (Alvarez, Izasa, y Echeverry, 2005); en el que de su estudio depende en gran medida el avance en el control de enfermedades frecuentes en animales y humanos que han generado resistencia a las medidas terapeúticas convencionales.

Al comparar el resultado de los extractos con los antibióticos empleados, se evidencia que no hubo actividad antibacteriana que promoviera halos de inhibición mayores a los de referencia para cada antibiótico, esto puede ser atribuido a que las cepas evaluadas corresponden al grupo de bacterias gram negativas, consideradas como un gran desafío para los antibacterianos por las barreras estructurales que estas poseen (Avello et al., 2012).

El extracto de Cassia occidentalis tuvo un diámetro de inhibición de 8mm en este estudio tanto para Aeromonas hydrophila como para Pseudomonas aeruginosa, demostrando que no hubo sensibilidad a su evaluación, similar a lo reportado por Sadiq et al., (2012), que obtuvo halos de inhibición de 7 mm para Pseudomonas aeruginosa. No obstante, Pandey, et al., (2012) registró en sus estudios sobre Pseudomonas aeruginosa que el extracto etanólico de las hojas Cassia. occidentalis evaluada a 75 mg/ml, produjo diámetros de inhibición de 15.3 mm.

En relación a otros solventes Arya et al., (2010) demostraron para Pseudomonas aeruginosa sensibilidad al extracto acuoso de esta planta con un mayor halo de inhibición de (18 mm) y Ranjithkumar, Sivasankari y Sekar, 2011 en la planta con acetato de etilo, registraron sensibilidad para Aeromonas con un diámetro de 20

mm. Considerando lo anterior se podría asumir que el efecto de los extractos depende de los solventes en los que se encuentre diluido, al respecto Arya, Saini y Singh, 2013 observó sensibilidad en extractos metanólicos y acuosos de las hojas de Cassia occidentalis contra Pseudomonas aeruginosa, evaluados a 200 mg/ml con diámetros promedio de 18 mm y 22 mm respectivamente, siendo más efectivo en extractos acuosos.

El extracto Cymbopogon citratus en este estudio no presentó actividad antibacteriana contra Aeromonas hydrophila y Pseudomonas aeruginosa, presentando halos de inhibición de 9 mm, inferiores a los referenciados en los criterios de interpretación con respecto a la clasificación de sensibles medianamente sensibles y resistentes para las cepas, tal y como lo reporta Nyarko, Barku, y Batama, 2012 y Hernández y Rodriguez, 2001 que afirman no encontrar halos de inhibición en sus estudios con el extracto de la planta evaluada. En contraste Singh, et al., 2011 reporta que el aceite de esta planta evaluada a 50 µl posee actividad antibacteriana contra Aeromonas hydrophila, pero no para Pseudomonas aeruginosa.

Al comparar los dos métodos de evaluación (difusión en disco y difusión en pozo) con los datos del estudio se muestra que el último método no presentó halo de inhibición para ningún extracto a diferencia del primer método que presentó halos de inhibición con ambas plantas. En contraparte en otros estudios han demostrado que el método de difusión en pozo es efectivo por sus características de absorción al evaluar la sensibilidad de la cepa Pseudomonas aeruginosa frente a la planta Persea lingue (Avello et al., 2012)

11 IMPACTO

Aunque en este estudio no se hayan superado las expectativas con los extractos etan贸licos evaluados a diferentes diluciones sobre las cepas bacterianas, el conocimiento generado es un avance para seguir estudiando las propiedades de los metabolitos secundarios que son los responsables de la actividad antibacteriana frente a microorganismos causantes de muchas

enfermedades

reportadas en piscicultura, con el prop贸sito de generar nuevos y mejores medios de control terap茅utico a partir de extractos vegetales.

Es importante recalcar que alternativas de este tipo disminuyen el impacto de los ecosistemas acu谩ticos por las terapias convencionales y por tanto a la salud humana.

12 CONCLUSIONES

Ninguno de los extractos obtenidos de las especies Cassia occidentalis y Cymbopogon citratus

presentó sensibilidad

antimicrobiana frente a los

microorganismos seleccionados Aeromonas spp. y Pseudomonas spp.

En la concentración mínima inhibitoria ninguno de las diluciones empleadas de cada extracto demostró efecto bacteriostático frente a las cepas bacterianas, de esta manera se consideraría que estas bacterias hacen parte del grupo de resistentes frente a muchos antimicrobianos, lo cual se hace difícil su control o inhibición

Ninguna de las diluciones empleadas de cada extracto etanólico, evidenció tener efecto bactericida frente a las cepas bacterianas

Aeromonas spp. y

Pseudomonas spp. Considerándose que estos extractos no presentan suficiente acción antibacteriana

En este estudio el método difusión en disco tuvo una mayor eficiencia que el método de difusión en pozo, al igual no se descarta que este método en pozo sea más

efectivo

con otros tipos de microorganismos, evaluadas con diferentes

extractos de plantas.

13 RECOMENDACIONES

Se recomienda seguir investigando las plantas utilizadas en este estudio, identificando

los

principios

activos

responsables

sus

propiedades

antibacterianas, además de realizar diferentes métodos de extracciones y utilizando otros solventes adecuados para este tipo de trabajo

Es necesario seguir investigando otras plantas que sean más efectivas como agentes

antibacterianos

contra

las

cepas

bacterianas

Aeromonas

spp,

Pseudomonas spp

Durante el transcurso del trabajo de laboratorio se presentaron inconvenientes con respecto a la disponibilidad de materiales aptos para este tipo de proyectos, lo cual sería apto dotar con herramientas e instrumental necesarios y suficientes a los laboratorios para realizar con más eficacia los trabajos que sean requeridos por las investigaciones

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