Determinación de la concentración de isoprostanos f2 en orina como marcador de estrés oxidativo by Medicina Veterinaria JDC

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ISOPROSTANOS F2 EN ORINA COMO MARCADOR DE ESTRÉS OXIDATIVO EN PERROS GERONTES DE LA CLÍNICA VETERINARIA ZOOMEDICA DE LA CIUDAD DE TUNJA

GELEN RAQUEL AVILA DAZA

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013 1

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ISOPROSTANOS F2 EN ORINA COMO MARCADOR DE ESTRÉS OXIDATIVO EN PERROS GERONTES DE LA CLÍNICA VETERINARIA ZOOMEDICA DE LA CIUDAD DE TUNJA

GELEN RAQUEL AVILA DAZA

Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de Médico Veterinario.

Directora: ANA CONSUELO GONZÁLEZ MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA, ESP.

Codirector: GUILLERMO ENRIQUE GRANADOS MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA, ESP.

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013 2

NOTA DE ACEPTACIÓN

______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________ ______________________________________

_____________________________________ FIRMA DIRECTOR

_____________________________________ FIRMA JURADO

A Dios y a la Virgen María por ser la luz y la guía en mi camino A mi mamita por siempre ser fuerte en las adversidades por ser más que una madre, por ser padre, amiga y confidente, por apoyarme en cada etapa de mi vida , porque gracias a ella he logrado cumplir mis metas, y sobre todo por darme ese amor incondicional que ha hecho de mi una mejor persona. A mis mascotas, por enseñarme a ver la vida de una forma diferente y maravillosa comprendiendo así que hay un amor distinto, un amor puro y verdadero. .

AGRADECIMIENTOS

Gracias madre, por estar en cada momento de mi vida, porque gracias a ti no me ha faltado nada, por el contrario me ha sobrado amor y felicidad. A mi novio Diego, quien durante 5 años ha compartido su vida conmigo, brindándome su amor y apoyo, haciendo de mí una mujer aun más feliz. A mi querida Doctora Consuelo, por su perseverancia, por inculcarme el amor y el compromiso hacia la profesión, por compartir conmigo la gran pasión por los gatos y por brindarme su valiosa amistad. Al Doctor Guillermo, por compartir conmigo sus conocimientos, por enseñarme a soñar y a creer en la posibilidad de hacer de esos sueños una realidad, por tenerme paciencia y por ser más que mi maestro mi amigo. A Yerikson, por ser un amigo incondicional, por ayudarme en la realización de este proyecto y por compartir conmigo esa convicción y pasión por los animales. A mis amigos, Javier Arias por su cariño, ayuda y todos los conocimientos que tuve la oportunidad de aprender de él, a mi amiguis Erika, porque cada dia de nuestra amistad ha sido una gran aventura, llena de risas, afecto y felicidad. A mis profesores, que a lo largo de mi vida estudiantil, me han acompañado en mi proceso de formación, aportando no solo enseñanzas, también experiencias de vida y en algunas oportunidades amistad. A la Doctora Viviana y la Doctora Ludy, por su acompañamiento constante, por dejarme conocer a tan maravillosas personas, amigas y maestras. A mis amigos de la clínica veterinaria Zoomedica, Andreita, Dr Manolo, Jairo, Farith, Nano, Sra. Rosita y Lina por su gran amistad y colaboración en este proceso de formación.

TABLA DE CONTENIDO

INTRODUCCIÓN ................................................................................... 15 JUSTIFICACIÓN .................................................................................... 16 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................... 17 OBJETIVOS ........................................................................................... 19 OBJETIVO GENERAL............................................................................ 20 OBJETIVOS ESPEIFICOS ..................................................................... 20 1.

MARCO DE REFERENCIA ........................................................... 20

1.1

ESTADO DEL ARTE............................................................................ 21

1.2

MARCO TEÓRICO .............................................................................. 23

1.2.1

Radicales libres de oxígeno.............................................................. 23

1.2.2

Daño y toxicidad causada por los RLO ............................................ 25

1.2.3

Defensas antioxidantes .................................................................... 25

1.2.4

Estrés oxidativo ................................................................................ 27

1.2.5

Estrés oxidativo y envejecimiento..................................................... 28

1.2.6

Daño oxidativo celular ...................................................................... 29

1.2.7

Isoprostanos ..................................................................................... 29

1.2.8

Diferencias entre IsoPs y PGs derivados de la COX ........................ 30

1.2.9

Mecanismo de formación de los F2 IsoPs ........................................ 30

1.2.10 F2 IsoPs como marcadores de estrés oxidativo in vivo .................... 31 1.3

MARCO GEOGRÁFICO ...................................................................... 32

1.4

MARCO LEGAL ................................................................................... 32 2.

DISEÑO METODOLÓGICO .......................................................... 35

2.1

TIPO DE ESTUDIO.............................................................................. 35

2.2

DISEÑO EXPERIMENTAL .................................................................. 35

2.3 MATERIALES Y METODOS DE INVESTIGACIÓN. PROCRESO Y PROCEDIMIENTOS APLICADOS. ............................................................... 36 2.4 UNIVERSO, POBLACION, MUESTRA Y UNIDADADES EXPERIMENTALES. ..................................................................................... 39

2.5

TRATAMIENTO - PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN. .......... 40

2.6

FORMULACIÓN DE HIPOTESIS. ....................................................... 43 3.

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS ............................... 44

3.1

RESULTADOS .................................................................................... 44

3.2

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN .................................................................... 49 4.

IMPACTO ...................................................................................... 51

CONCLUSIONES.......................................................................... 52

RECOMENDACIONES ................................................................. 53

BIBLIOGRAFÍA ............................................................................. 54

TABLA DE TABLAS

Tabla 1. Radicales de oxígeno y su mecanismo natural de defensa antioxidante....................................................................................................... 26 Tabla 2. Consignación de datos........................................................................ 39 Tabla 3. Preparación de la curva 8-iso-PGF2α Standard. ................................ 40 Tabla 4. Numeración de muestras de todo el estudio (Sano, geriátrico y enfermos) .......................................................................................................... 44 Tabla 5. Curva estándar. .................................................................................. 45 Tabla 6. Curva estándar y fórmula. ................................................................... 45 Tabla 7. Resultados obtenidos sin la fórmula (Blanco) y resultados obtenidos tras la aplicación del a fórmula (Lila). ................................................................ 46 Tabla 8. Valor mínimo y máximo de Isoprostanos en caninos gerontes. .......... 47 Tabla 9. Comparación de resultados de pacientes sanos menores a 7 años, caninos mayores a 7 años (gerontes) y con diferentes patologías. ................. 47 Tabla 10. Valor determinado por edades. ......................................................... 48 Tabla 11.Valor determinado según género. ...................................................... 49

TABLA DE FIGURAS

Figura 1. Vía de formación de los Isoprostanos. ............................................... 29 Figura 2. Formación de isoprostanos. ............................................................... 31 Figura 3 a y b. Realización del ECOP............................................................... 35 Figura 4 a y b. Toma de muestras por medio de cateterización vesical en hembras y machos............................................................................................ 36 Figura 5. Muestras refrigeradas. ....................................................................... 36 Figura 6. Concentrado buffer. ........................................................................... 37 Figura 7a y b. Anticuerpo y diluyente muestra. ................................................. 37 Figura 8 a y b. Solución substrato y descongelamiento de muestras a temperatura ambiente. ...................................................................................... 38 Figura 9. Acidificación de muestras. ................................................................. 38 Figura 10. Lavado con solución Buffer para lavado. ......................................... 41 Figura 11. Incubación en mezclador orbital. ..................................................... 41 Figura 12. Adición de solución para detener. .................................................... 42 Figura 13. Ubicación de las placas sobre el lector de microplaca..................... 42 Figura 14. Resultados obtenidos en el lector de microplaca. ............................ 43

GLOSARIO

ÁCIDO ARAQUIDÓNICO: es un ácido graso esencial, formado por una cadena de 20 carbonos con cuatro dobles enlaces. ANTIOXIDANTES: son sustancias que pueden proteger sus células de los efectos de los radicales libres. CICLOOXIGENASAS:

enzima que

permite

organismo

producir

prostaglandinas a partir del ácido araquidónico. CIS: forma de isomerismo en la que grupos funcionales similares están unidos al mismo lado del plano que incluye dos átomos de carbono fijos adyacentes. EICOSANOIDES: son un grupo de moléculas de carácter lipídico originadas de la oxigenación de los ácidos grasos esenciales de 20 carbonos tipo omega3 y omega-6. ENZIMAS: son proteínas que catalizan todas las reacciones bioquímicas ESTRÉS OXIDATIVO: es un desbalance entre la producción de radicales libres de oxígeno y los sistemas de defensa antioxidante, enzimáticos o no, debido a carencia de vitaminas y minerales. FOSFOLÍPIDOS: Es un tipo especial de lípido, son los componentes primarios de las membranas celulares GERONTE: Animal de edad avanzada en el cual es evidente la suma de los efectos del envejecimiento sobre los procesos físicos y neurológicos. ISÓMEROS: son moléculas que tienen la misma fórmula química pero sus átomos se

encuentran

ordenados

forma

distinta,

produciendo propiedades físicas y químicas diferentes ISOPROSTANOS: son compuestos similares a las prostaglandinas producidas principalmente a partir de ácido araquidónico, son considerados los mejores biomarcadores disponibles del estado de estrés oxidativo.

LEUCOTRIENOS: eicosanoides derivados de lípidos de membrana. Son

producidos por leucocitos y su principal función es la de participar como mediadores de la inflamación. LÍPIDOS: son un conjunto de moléculas orgánicas compuestas principalmente por carbono e hidrógeno y en menor medida oxígeno, aunque también pueden contener fósforo, azufre y nitrógeno. LIPOOXIGENASAS: enzima que intervine en la ruta metabólica de síntesis de

leucotrienos a partir del ácido araquidónico. LIPOPROTEÍNAS: son macromoléculas que estructuralmente están formadas por una parte lipídica y una proteica. OXIDACIÓN: reacción química en la que uno o más electronesse transfieren entre los reactivos, provocando un cambio en sus estados de oxidación. PEROXIDACIÓN LIPÍDICA: hace referencia a la degradación oxidativa de los lípidos. Es el proceso a través del cual los radicales libres capturan electrones de los lípidos en las membranas celulares. PROSTACICLINAS: Hormona del grupo de las prostaglandinas que deriva del

ácido araquidónico. Es sintetizada por el endotelio cardiovascular, y su función es inhibir la agregación de plaquetas. PROSTAGLANDINAS: conjunto de sustancias de carácter lipídico derivadas de

los ácidos grasos de 20 carbonos (eicosanoides), que contienen un anillo ciclopentano y constituyen una familias de mediadores celulares, con efectos diversos, a menudo contrapuestos. RADICAL LIBRE: átomo o molécula que contiene un electrón desapareado en su orbital exterior. TRANS: forma de isómero en la cual átomos fijados a dos átomos de carbono unidos mediante un doble enlace están en lados opuestos de la molécula.

ABREVIATURAS AA: Ácido araquidónico ADN: Ácido desoxirribonucleico. ADO: Adenosina AMPc: Adenosin Monofosfato Cíclico CAT: Catalasa. COX: Ciclooxigenasas. ERO: Siglas en español, especies reactivas de oxígeno. EO: Estrés oxidativo. GPx: Glutatión peroxidasa. GRd: Glutatión reductasa. GSH: Glutatión reducido. GST: Glutatión-S-transferasa H: Hidrogeno. H₂ O: Agua. IsoPs: Isoprostanos. RLO: Radicales libres de oxígeno. RNS: Especies reactivas derivadas del oxígeno nítrico. ROS: Siglas en inglés, especies reactivas de oxígeno. O₂ : Oxigeno PG o PGs: Prostaglandinas. SOD: Superoxido dismutasa.

RESUMEN

Una de las causas del envejecimiento prematuro y del desarrollo de diferentes patologías de común presentación en caninos gerontes es el EO. Esta condición es originada por un desequilibrio entre la formación de radicales libres y la producción de antioxidantes creados de forma endógena.

Los IsoPs son compuestos similares a las prostaglandinas que se producen de forma independiente de la ciclooxigenasa, mediante un mecanismo no enzimático de peroxidación del AA inducido por radicales libres. Los IsoPs han sido ampliamente descritos como marcadores pronósticos

en condiciones

mediadas por EO, también son productos, cuantificables y de gran estabilidad química, haciendo posible su medición en orina, tejidos y otros fluidos biológicos.

El objetivo de este trabajo consistió en determinar los valores de isoprostanos F₂ en orina presentes en caninos gerontes; las muestras se obtuvieron por medio de cateterización vesical a 28 caninos con edades superiores a 7 años de edad asistentes a la Clínica Veterinaria Zoomedica; estas muestras se analizaron con el kit Snap ELISA teniendo en cuenta variables como edad y género; adicionalmente se compararon con un estudio donde se valoró la concentración de IsoPs en orina de pacientes sanos menores a 7 años, evidenciando que dichos individuos poseen niveles inferiores de IsoPs en comparación con los pacientes gerontes, por tanto menor cantidad de EO.

Por último, este estudio no solo brinda la oportunidad de implementar nuevas técnicas en medicina veterinaria, también crea la posibilidad de ver al EO como un parámetro importante y determinante en el estado de salud del paciente canino geronte dando al clínico la posibilidad de dar un manejo adecuado y un monitoreo constante al paciente geriátrico.

Palabras claves: envejecimiento, radicales libres, ciclooxigenasa, isoprotanos.

ABSTRACT One of the main causes of the premature aging and the common pathology presented on geront canine is the OE. This condition is generated by an imbalance between the radical formation and the antioxidants production

The Isoprostanes (IsoPs) are similar compounds to the prostaglandins which are produced independently from the cyclooxygenase through a non-enzymatic mechanism arachidonic acid (AA) peroxidation induced by free radicals, the IsoPs have been widely described as dialed prognostic in mediated conditions by OE they are as well, quantifiable products and possess great chemical stability, making its possible urine, tissues and other biological fluids measurement This paper goal consisted in determining the Fâ&#x201A;&#x201A; isoprostanes values in a current geront canineâ&#x20AC;&#x2122;s urine. The samples were got by bladder catheterization to 28 canines over the 7 years old that attended the Zoomedica veterinarian clinic. Those samples were analized using the kid snap ELISA bearing in mind variables like age and gender, furthermore, were compared with a previous wic the IsoPs urine concentration from the 7 years old healthy patients were assessed. It is shown in those patients low IsoPs levels in relation to the geront ones, hence lower OE amount.

Finally, this study not only provides an opportunity in the new veterinarian medicine techniques implementation but it creates the possibility to perceive OE as an important and determinant parameter in the geront canineâ&#x20AC;&#x2122;s health status giving the clinician the possibility to give an appropriate and constant monitoring and handling on the geriatric patients.

Key Words: aging, free radicals, cyclooxygenase, isoprostanes.

INTRODUCCIÓN

El envejecimiento es un proceso fisiológico que afecta a las células de los seres vivos, las cuales con el paso del tiempo sufren deterioro morfofuncional que favorece el desarrollo de patologías e incluso puede conducir a la muerte (Peinado, 2000). Dentro de las causas del envejecimiento prematuro y del desarrollo de diferentes patologías de común presentación en caninos gerontes se encuentra que el estrés oxidativo (EO) es un factor predominante en dichos casos (Rodríguez y Céspedes, 1999). El estrés oxidativo se origina a causa de un desequilibrio entre la formación de radicales libres y la producción de antioxidantes creados de forma endógena (Murillo, 2011). “Los radicales libres son especies químicas que tienen uno o más electrones desapareados, aptos de existir en forma autónoma, que se producen en todas las células” (Insua, 2003). La vida media del radical libre es de microsegundos. Un radical de vida extremadamente corta y de gran importancia biológica es el radical hidroxilo (•OH); siendo este el más perjudicial, ocasionando efectos sobre los ácidos nucleicos, produciendo una peroxidación y por tanto una modificación química de sus bases nitrogenadas, también “ataca a los ácidos grasos insaturados de los fosfolípidos y otros componentes de las membranas celulares formando hidroperóxidos que terminan alterando la permeabilidad selectiva de la membrana celular” (Núñez y Ortega, 2007).

Dentro de los fosfolípidos de las membranas celulares se encuentra el ácido araquidónico (AA) el cual en respuesta a procesos inflamatorios puede degradarse por una vía enzimática mediada principalmente por ciclooxigenasas y lipooxigenasas siendo productos de este metabolismo los tromboxanos, prostaglandinas, prostaciclinas y leucotrienos; de otra parte

la vía no

enzimática del metabolismo del AA, principalmente catalizada por radicales libres produce isoprostanos los cuales son compuestos similares a las prostaglandinas (Mandelker, 2011; Morrow y Roberts, 1997; Morrow et al., 1999). Los isoprostanos (IsoPs) aparecen en muestras de tejido y plasma que 15

se han sometido a la degradación oxidativa durante el almacenamiento prolongado o inadecuado. Estos también aparecen en el plasma y en la orina en condiciones normales y son elevados por el estrés oxidativo (Arbor, 2011).

Los isoprostanos F₂ han demostrado su utilidad en la valoración del estrés oxidativo in vivo (Anonimo, 2011) y se consideran como biomarcadores confiables de esta condición. Al ser el EO una condición inherente al proceso de envejecimiento y a diferentes estados patológicos y teniendo en cuenta que la longevidad de los caninos ha aumentado es necesario contar con una herramienta que de forma objetiva permita valorar el impacto del EO y el rol que este desempeña en el envejecimiento y en el desarrollo y perpetuación de diferentes entidades que aquejan al paciente geronte. Los valores de IsoPs no han sido determinados aun para caninos de edad avanzada por eso, el presente estudio pretende ser el punto de partida en el cual se establezca las concentraciones de dichas moléculas y de esta forma buscar determinar el comportamiento de las concentraciones de isoprostanos F₂

en orina de

pacientes caninos gerontes que ingresan a la Clínica Veterinaria Zoomedica de Tunja.

JUSTIFICACIÓN

El EO es un proceso asociado a niveles elevados de radicales libres y se ha relacionado con diversos procesos patológicos, de igual forma el proceso de envejecimiento lleva implícito el desarrollo de EO y disminución de las funciones cognitivas; el daño oxidativo a nivel cerebral en perros gerontes es acumulativo y deteriora la función de proteínas, lípidos y mitocondrias, provocando una alteración en la función neuronal (Head y Zicker, 2011). La longevidad de los caninos y su expectativa de vida ha sido superada a lo largo del tiempo razón por lo cual en la actualidad se han descrito condiciones como la disfunción cognoscitiva senil, que implican deterioro en los procesos de aprendizaje, memoria y comportamiento en caninos gerontes mediado por diferentes eventos siendo el principal el EO. “El envejecimiento está asociado con alteraciones en el grado de estrés oxidativo que está influenciado por la genética molecular” (Césped et al, 2000; Vijg y Suh, 2005). Se piensa que los radicales libres constituyen moléculas muy reactivas que reaccionan con formas biológicas, generando así daño oxidativo imposible de reparar que se va acumulando con el paso del tiempo ocasionando una pérdida paulatina de la capacidad funcional (Céspedes y Reyes, 2007) A pesar de conocer el impacto que genera el EO en el organismo en medicina de pequeños animales se carece de herramientas que permitan valorar de forma objetiva su impacto y evolución; y de esta forma generar estrategias terapéuticas que permitan reducir dicho impacto. Los isoprostanos F₂ han demostrado su utilidad en la valoración del estrés oxidativo in vivo y se consideran como biomarcadores confiables del nivel de EO su aplicación ha sido mayor en medicina humana y los reportes en medicina veterinaria son escasos, por lo cual este estudio pretende evidenciar la utilidad de la valoración del grado de estrés oxidativo en pacientes caninos de edad avanzada a través de la medición de IsoPs.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

CARACTERIZACIÓN DEL PROBLEMA

El envejecimiento es debido en parte a la acción de los radicales libres encargados de diversas reacciones de oxidación enzimática (Zorrilla, 2002); están involucrados en múltiples modificaciones como las presentadas en los ácidos nucleícos que forman el ADN de las células produciendo su fragmentación; en las proteínas celulares induciendo daño oxidativo; en la oxidación de los lípidos celulares causando peroxidación lipídica (Halliwell y Chirico, 1993; Morrisey y O'Brien, 1998; Pérez y Pérez, 2000). “Cuando se producen estos procesos en el organismo aparece el estrés oxidativo que puede afectar a cualquier estructura celular y aparecer en cualquier especie animal” (Murillo, 2011). Diferentes estudios realizados en cerebros humanos patológicos y normales en individuos de edad avanzada, proveen amplia evidencia del rol del daño oxidativo asociado a la edad, así mismo se ha demostrado que la actividad oxidante endógena se encuentra reducida en geriatras (Mandelker, 2011).

El EO es un factor predisponente y perpetuador asociado a diferentes patologías (hepáticas, cardiacas, renales, neurodegenerativas, etc.) y al proceso normal de envejecimiento; es por esta razón que es necesario contar con herramientas paraclinicas que permitan realizar una valoración objetiva de esta condición y de su impacto en la salud animal.

Actualmente en la práctica veterinaria, los médicos de pequeños animales no cuentan con dichas herramientas, las cuales están disponibles y ampliamente difundidas en medicina humana; este tipo de pruebas permite mejorar el diagnóstico, monitoreo y terapéutica de las diferentes entidades en las cuales se encuentra involucrado el EO. Los IsoPs han sido ampliamente descritos como marcadores pronósticos en condiciones mediadas por EO (Mallat et al., 1998, Cracowski et al.(a), 2000; Cracowski et al.(b), 2001); la cuantificación del EO resulta de gran relevancia para la comprensión de numerosos mecanismos fisiológicos y fisiopatológicos (González, 2005). Los isoprostanos son productos secundarios de la peroxidación lipídica, cuantificables y de gran estabilidad 18

química, lo que hace posible que se lleve a cabo su medición en orina, tejidos y otros fluidos biológicos (Reilly et al., 1996); y de esta forma ser incluidos dentro del panel de ayudas paraclinicas en el control y monitoreo de pacientes gerontes.

Los isoprostanos como marcadores

de estrés oxidativo han sido poco

explorados en medicina veterinaria, encontrándose la mayoría de los estudios en medicina humana,

por tanto se crea la necesidad de observar las

variaciones de estos en diferentes de tipos pacientes; en Colombia también son escasos los proyectos de investigación encontrados en dicha rama, exceptuando un estudio reportado por Velandia en el 2013 acerca de la concentración de isoprostanos F₂

en orina como marcadores de estrés

oxidativo en pacientes caninos con diferentes patologías, reiterando así la necesidad de profundizar y ampliar la información que sobre el tema se encuentra.

Pregunta de investigación

¿Las concentraciones de F₂ isoprostanos en orina se verán influenciadas en relación con la etapa senil de los pacientes objeto de estudio?

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL 

Determinar los valores de isoprostanos F₂

en orina de pacientes

gerontes asistentes a la Clínica Veterinaria Zoomedica mediante la prueba de kit Snap ELISA (OxiSelect™ kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2α).

OBJETIVOS ESPEIFICOS 

Comparar los valores obtenidos con los resultados reportados en pacientes caninos menores a 7 años.



Determinar la relación de los valores de isoprostanos F₂

comparación con la edad del paciente. 

Correlacionar los valores obtenidos de isoprostanos F₂ en orina de caninos gerontes frente al género de estos.

1. MARCO DE REFERENCIA

1.1

ESTADO DEL ARTE

Originalmente Gerschman y Harman propusieron el papel de los radicales libres en el proceso natural de envejecimiento. Se reporta incrementos de EO durante la vejez y las enfermedades que este acarrea, sin tener ideas claras acerca de los mecanismos moleculares que condicionan el fenómeno de envejecimiento. El desarrollo o crecimiento no son distintas etapas si no el envejecimiento es la última etapa del desarrollo viéndose influenciada por los niveles de estrés oxidativo (Rodríguez y Céspedes, 1999). Los procesos fisiologicos que acarrea el estado de envejecimiento podrian ser una causa de enfermedades cronicas; viendose disminuidos los niveles tisulares de antioxidantes favoreciendo a los radicales libres que actuan sobre moleculas biologicamente importantes; al incrementarse el estado de vejez los RLO se tornan más perjudiciales por disminucion de los sistemas antioxidantes favoreciendo el EO (Zorrilla, 2002). La diferenciación de procesos patologicos con procesos de vejez frente al EO es dificil; pudiendo ser el envejecimiento y la muerte el resultado de la activacion de genes especificos en un momento determinado del ciclo celular. Los RLO al generar lesiones durante la vida se van acumulando lo que explicaria la teoria de los RLO frente al envejecimiento, tambien observandose una concentracion disminuida de antioxidantes al igual que inactivacion de las enzimas detoxificadoras de RLO y una acumulacion de proteinas oxidadas sin haber sufrido el proceso de gradacion (Elejalde, 2001) Los F₂ isoprostanos son una mezcla de isomeros que forman cuatro tipos o familias de regioisómeros creados por la oxidacion del ácido araquidonico presente en los fosfolípidos de membrana; los niveles de F₂ isoprostanos se encontraron altos en hígados aislados de ratas tratadas con tetracloruro de carbono siendo este un potente pro-oxidante (Waugh et al., 1997). Para comprender la fisiología y la biología de los F₂ isoprostanos, el hígado es parte esencial, ya que los primeros estudios para el descubrimiento de los F₂ IsoPs y para la comprensión de la importancia que tenian frente al EO se 21

observaron en ratas experimentales con lesiones hepáticas oxidativas y en humanos con estudios en pacientes con insuficiencia hepática y sindrome hepatorrenal. Se demostro que la medición de F₂ IsoPs tomandos como marcadores de peroxidación lipidica in vivo, es posible en la enfermedad renal (Moore, 2004). En ratas normales y diabéticas a nivel glomerular las ROS, marcadores de estrés oxidativo se ven disminuidas al incrementarse la concentración extracelular de adenosina (ADO) y del adenosin monofosfato cíclico (AMPc); siendo estas dos sustancias un mecanismo de protección para el glomerulo. Mediante la la técnica de microtamizado se ailaron los glomerulos de ratas diabéticas y sanas, exponiendolos a un reto oxidativo determinando asi la conecentracion de F8 isoprostanos como marcador indirecto de daño por RLO, determinando el efecto protector de ADO y AMPc extracelular (Mena et al., 2002). El ácido araquidonico sufre un ataque de radicales iniciadores somentiendo a la estructura de doble enlace del ácido araquidonico a un reordenamiento de radicales produciendo así metabolitos llamados F₂ isoprostanos que poseen tres grupos OH que son menos reactivos que los demas productos de la peroxidacion lipídica y se acaracterizan por ser marcadores útiles al momento de evaluar el estrés oxidativo in vivo (Handelman et al., 2001). Al momento de evaluar el estrés oxidativo, los F₂ isoprostanos son de gran importancia in vivo; se ha descrito la formación de gamma cetoaldehidos altamente reactivos también llamados isoketals producto de los isoprostanos; de igual manera por la vía central de formación de isoprostanos estan las prostaglandinas H2 que se someten a reordenamiento in vivo formando así el anillo E y D y los compuestos de anillo tromboxano; los isoprostanos D2 y E2 se someten a deshidratacion in vivo formando ciclopentanona A2 y J2 isoprostanos con gran suseptibilidad a reaccionar frente a la adición de Michael con tioles (Roberts y Morrow 2002).

Los isoprostanos son formados in vivo en animales y sus concentraciones pueden medirse en orina; una clara evidencia de esto fue probado en un estudio realizado en caninos con diferentes patologías, donde se midieron las concentraciones de IsoPs mediante el kit Snap ELISA , esto para determinar los niveles de EO que en ellos se encuentran, los resultados obtenidos se compararon con un estudio en el cual se valoró la concentración de IsoPs en orina de pacientes sanos; evidenciando que dichos individuos poseen niveles inferiores de IsoPs en comparación con los pacientes con diferentes patologías en los que se observaron concentraciones elevadas de IsoPs (Velandia, 2013). 1.2

MARCO TEÓRICO

1.2.1 Radicales libres de oxígeno Los radicales libres de oxígeno (RLO) son átomos o moléculas que tienen uno o varios electrones no apareados en su última capa y alteran la reactividad del átomo o molécula, lo que facilita que reaccionen con un elevado número de moléculas,

oxidándolas

luego

atacando

estructura;

las

formas

parcialmente reducidas del oxígeno se denominan especies reactivas de oxígeno (ERO) ya que por lo general son más reactivas que la molécula de oxígeno en su estado natural (De la Cruz, 2006; Abilés, 2007 y Flores, 2005). El radical más simple se denomina hidrógeno (H•) ya que posee un protón y un electrón no apareados (Halliwell, 1994 y Flores, 2005) “la reacción en cadena de los radicales libres se inicia por la sustracción de un H• desde otras moléculas” (Flores, 2005). El oxígeno es necesario al momento de la obtención de energía en procesos celulares, al aceptar 4 protones y dos protones por acción del complejo citocromo-oxidasa

reduce

agua;

oxígeno

que

reduce

incompletamente genera compuestos intermedios inestables llamados especies reactivas de oxigeno (Abilés, 2007). El aumento en la producción de RLO impacta la salud y a los seres vivos en general, asociándose a procesos cancerígenos; y también juegan un papel 23

importante al momento de la diferenciación, proliferación o detención del crecimiento celular, apoptosis, y diversos procesos inmunológicos (De la Cruz, 2006). La formación de los RLO en la célula se da por procesos como, perdida de electrones en la cadena respiratoria, activación leucocitaria, reacciones enzimáticas como en el caso de la xantina oxidasa, y en el metabolismo de fármacos y otros xenobioticos; los RLO formados en condiciones normales no generan daño oxidativo en la célula por lo que la célula activa mecanismos antioxidantes; si la capacidad de los mecanismos se ve afectada por el daño oxidativo se genera estrés oxidativo (Viña y Pallardó, 1999) En el sistema inmune especialmente los fagocitos son una fuente de RLO; los polimorfonucleares y macrófagos al entrar en contacto con un agente infeccioso aumentan el consumo de oxigeno esto tiene lugar en la membrana plasmática y los radicales libres formados colaboran en la destrucción de la infección (González, 2005) Las ROS presentan alta reactividad molecular, pudiendo ser en ocasiones RLO, es decir, “Moléculas o fragmentos moleculares que contienen uno o más electrones desapareados en orbitales atómicos o moleculares. Este electrón desapareado confiere un grado considerable de reactividad al radical libre logrando además que pueda existir de forma independiente por cortos períodos de tiempo” (Londoño, 2011). Los RLO se ven implicados en la etiologia de más de cien enfermedades gracias al daño oxidativo que producen, como el cancer, cardiopatias, diabetes, desordenes neurovegetativos y el envejecimiento. (Viña y Pallardó, 1999 y Céspedes y Sánchez, 2000) Los neutrófilos generan gran cantidad de oxidantes que según su origen se clasifican en especies reactivas derivadas del oxigeno (ROS) y especies reactivas derivadas del oxigeno nítrico (RNS); el EO conduce a que la membrana celular sufra una peroxidación lipídica y se genere una nueva serie

de prostanoides, derivados del acido araquidónico por un proceso de oxidación denominados, isoprostanos (Crúz et.al., 2004 y Romero et.al., 2006). 1.2.2 Daño y toxicidad causada por los RLO Los RLO reactivos (in vitro) producen modificaciones químicas y daño sobre las proteínas, lípidos, hidratos de carbono y nucleótidos; por ende, si los mecanismos protectores fallan por exceso de RLO se producirían alteraciones metabólicas y celulares (Slater, 1984). Los RLO actúan directamente a nivel vascular por medio de la liberación de mediadores vaso activos (González, 2005). El metabolismo del acido araquidónico en su mayoría está acompañado por RLO lo que supone una retroalimentación positiva (González, 2005 y Holtzman, 1991) Se ha asociado daño al ADN por causa de los RLO ya que grupos moleculares son susceptibles, además, el ADN se asocia a metales pesados que pueden catalizar la síntesis de radicales libres hidroxilo por medio de formas moleculares del O2; los RLO se asocian a diferentes enfermedades como el enfisema pulmonar, glomerulonefritis, artritis reumatoidea, síndrome de isquemia-reperfusión,

Parkinson,

intoxicación

por

fármacos

como

paracetamol y en procesos normales como el deporte (Viña y Pallardó, 1999 y De la Cruz, 2006) y en el envejecimiento (Rodríguez y Céspedes,1999). 1.2.3 Defensas antioxidantes El sistema de defensa antioxidante tiene la función de proteger en diferentes sitios, y contra diferentes tipos de RLO; se comporta de forma diferente intracelular y extracelularmente y tiene una naturaleza enzimatica y no enzimatica (Flores, 2005): 

Mecanismos enzimáticos intracelulares: Es el mecanismo de defensa primario y más significativo frente a los RLO, y dentro de estos mecanismos encontramos a: la superoxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT),

Glutation

peroxidasa

(GPx),

Glutation

reductasa

(GRd),

concentración de glutation reducido (GSH), vitaminas y ácido urico; las 25

cocentraciones de GSH en varios tejidos de origen murino disminuyen significativamente con la edad (Benzi y Moretti, 1995; Sohal et al., 1990; Mo et al., 1995; Villa y Gorini, 1986) y en insectos (Shull y Heints, 1991 y Sohal et al., 1990) se presenta disminución de la CAT en Drosophila y mosca domestica durante el envejecimiento (Sohal et al., 1990 y Sohal et al., 1981), en mamiferos, el comportamiento de esta enzima es diferente según el tejido, disminuyendo en riñon e hígado y tiende a aumentar en corazón y cerebro donde disminuyen marcadamente en las ultimas etapas de la vida; la actividad y expresión de GPx y glutatión-Stransferasa (GST) declinan durante el envejecimiento en todos los tejidos estudiados a diferencia de la GRd, que en mamíferos aumenta en cerebro y corazón pero disminuye en hígado y riñón y en insectos disminuye; la actividad o expresión de SOD no presenta una conclusión definitva,

pudiendose

ver

afectada

por

especie,

habitat

procedimientos tecnicos empleados (Rodríguez y Céspedes, 1999). 

Mecanismos no enzimáticos: existen sustancias sin actividad enzimatica pero con gran poder antioxidante como los antioxidantes hidrofilicos en lo que se encuentran la vitamina C, ascorbato, ácido úrico, bilirrubina y albúmina; y antioxidantes lipofílicos como la vitamina E, alfatocoferol, carotenoides y ubiquinonas, además, los carotenos, ceruloplasmina, urato, glutatión, flavonoides (Halliwell, 1994; Céspedes y Sánchez, 2000 y González, 2005).

Tabla 1. Radicales de oxígeno y su mecanismo natural de defensa antioxidante. 26

Radicales libres de oxigeno Radicales libres O2•OH• ROO• •

NO NO2• ONOO

Anión superoxido Radical hidroxil Peróxido lipidico Óxido nítrico Dióxido nitrico

Peroxinitrito

Mecanismo de defensa antioxidante Antioxidantes Enzimáticos Superóxido de dismutasa SOD

CAT

2O2•- + 2H Catalasa

GTP

2H2O O2 + H2O Glutatión peroxidasa 2GSH+H2O2

GSSG+2H2O

2GSH+ROOH GSSG + ROH + 2H2O

No Radicales

H2O2 HOCL ONNO1 O2

H2O2 + O2

Antioxidantes no Enzimáticos Peróxido de hidrógeno Vitamina A Ácido hipocloroso Vitamina C (ácido ascórbico) Peroxinitrito Vitamina E (α-tocoferol) Oxigeno libre Β-caroteno Acido Urico Flavonoides Sulfidrílos Fuente: Dhalla et al., 2000; Flores, 2005.

“El punto negro en superíndice indica un electrón no apareado; la carga negativa indica el electrón ganado; GSH: glutatión reducido; GSSG: glutatión oxidado; el oxígeno libre es una molécula inestable debido a los dos electrones presentes en su órbita externa que giran en dirección opuesta” (Dhalla et al., 2000 ; Flores, 2005). 1.2.4 Estrés oxidativo El EO es el desequilibrio que se produce entre el mecanismo de limpieza o bloqueo natural de RLO y la producción de RLO altamente reactivos; los RLO al tener la capacidad de oxidar al DNA, proteinas y lípidos causan procesos degenerativos; se han asociado a patogénesis como, arteriosclerosis, alzheimer, diabetes, cáncer y procesos naturales como la vejez (Sies, 1991; Kohen y Nyska, 2002 y Barceló y Barbé, 2005). 27

1.2.5 Estrés oxidativo y envejecimiento La teoría original acerca de los RLO sobre el envejecimiento fue propuesta por primera vez en la década del 50 por Gerschman y Harman; proceso que se da de la siguiente forma: “durante el metabolismo aerobio se producen incidental e incontrolablemente especies radicálicas derivadas del oxígeno que, una vez generadas, promueven reacciones que dañan macromoléculas. Este daño irreversible se acumula con el tiempo resultando en una pérdida gradual de la capacidad funcional de la célula” (Rodríguez y Céspedes,1999). La diferenciación que hay entre el proceso de envejecimiento y procesos patológicos en ese estado es difícil; “el envejecimiento y la muerte pueden ser el resultado de la activación de genes específicos en un momento determinado del ciclo celular (apoptosis). La teoría de los RLO del envejecimiento supone que este resulta de la acumulación de lesiones orgánicas debidas a RLO. También se ha detectado una menor actividad proteolítica que en las células jóvenes, una disminución de las concentraciones de antioxidantes e inactivación de las enzimas detoxificadoras de RLO y una acumulación de proteínas oxidadas no degradadas” (Elejalde, 2001). Durante el desarrollo se produce la expansión de la capacidad metabólica que genera mayor cantidad de prooxidantes, generando asi una mayor demanda de respuestas al EO; el DNA mitocondrial es susceptible a lesiones oxidativas por lo que a medida que pasa la edad sufre oxidaciones y lesiones (Cascales et al., 2003). Los RLO al ser muy reactivos pueden generar lesiones en cualquier célula, por medio de mecanismos como alteraciones oxidativas que se acumulan en el colágeno, DNA y elastina; ruptura de mucopolisacaridos gracias a la degradación oxidativa y por medio de acumulaciones de sustancias metabólicamente inertes como fibrosis de arteriolas y capilares, pigmentos y ceras (Zorrilla, 2002).

1.2.6 Daño oxidativo celular El metabolismo aerobio implica la producción de ERO que atacan todo tipo de moléculas biológicas y asi inducen su oxidación, que generan a futuro nuevos radicales libres que tienen la capacidad de reaccionar con otras moléculas, por lo que en las células hay un requerimento constante de antioxidantes para la inactivacion de estas especies (Abilés, 2007). 1.2.7 Isoprostanos Los isoprostanos se descubrieron por primera vez en la fisiología y patofisiología humana por Morrow et al., en 1990; circulan a nivel del plasma y se excretan en orina (Praticó, Lawson y Fitzgerald, 1995) y se han considerado como marcadores de estrés oxidativo; se forman en vivo por un mecanismo de peroxidación no enzimatica del ácido araquidónico que es inducida por los RLO, que es un ácido graso poli-insaturado distribuido en el organismo independiente de la ciclooxigenasa (COX) (Roberts y Morrow, 1997; Morrow et al., 1999 y Flores, 2005).

Figura 1. Vía de formación de los Isoprostanos. Fuente: González, 2005. Los isoprostanos se generan tanto a partir de moléculas libres de ácido araquidónico (Morrow et al., 1990a;1990b), como a partir de la esterificación de los lípidos de membrana (Morrow et al., 1994 y González, 2005).

La prostaglandina F2α formada por la COX genera como compuestos resultantes isómeros, por lo que se les denomino F₂

isoprostanos; son

clasificados en el sistema de nomenclatura IsoPs aprobada por el comité de nomenclatura eicosanoide y ratificada por la Joint Comission on Biochemical Nomenclature (JCBN) of the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Flores, 2005 y Taber et al., 1997). 1.2.8 Diferencias entre IsoPs y PGs derivados de la COX Estructuralmente los IsoPs poseen cadenas laterales orientadas cis en el anillo prostano, y se forman a partir de la oxidación del ácido araquidónico esterificado en los fosfolípidos de membrana, están formados in situ y son subsecuentemente

liberados

por

fosfolipasas;

mientras

que

las

prostaglandinas su cadena lateral es exclusiva trans y se forma a partir del ácido araquidónico libre (Milne et al., 2011) 1.2.9 Mecanismo de formación de los F2 IsoPs Se basa en los principios químicos propuestos por Pyor y Porter de la generación de intermediarios biciclico-endoperóxidos producidos por la peroxidación de otros ácidos grasos poli-insaturados; el ácido araquidónico (Figura 2) inicial sufre una abstracción de un átomo de hidrógeno bis-alílico para producir un radical araquidonil, la adición posterior de una molécula de oxígeno a este radical produce un radical peroxil; dependiendo del sitio de la abstracción y la inserción de la molécula de oxígeno, se forman 4 diferentes isómeros de radical peroxil (Flores, 2005). Luego estos radicales sufren endociclización y otra molécula de oxígeno se añade para formar compuestos similares a las PG F2 (regio-isómerosendoperóxidos); estos intermediarios son reducidos a IsoPs-F2, formándose cuatro regio-isómeros que se denominan como serie 5, 12, 8 o 15 dependiendo del átomo de carbono al cual la cadena hidroxil está unida. Cada uno de los 4 regio-isómeros puede teóricamente estar formado de 8 diastereo-isómeros racémicos; finalmente llegando a un total de 64 diferentes compuestos que

pueden ser originados por este proceso (Flores 2005; Porter y Funk, 1975; Pryor et al., 1976).

Figura 2. Formación de isoprostanos. Fuente: Roberts y Morrow 2000. 1.2.10 F2 IsoPs como marcadores de estrés oxidativo in vivo En el estudio “Biomarkers of Oxidative Stress Study” (BOSS) financiado por el National Institute of Health, realizado en ratas demostró que los lsoPs son un buen índice de injuria oxidativa, permitiendo la cuantificación exacta de lesión oxidativa in vivo (Kadiiska et al., 2005a; 2005b y Flores 2005). Los IsoPs son el resultado de la peroxidación lipídica con una gran estabilidad química. Se han llevado a cabo mediciones en orina (Reilly et al., 1996), plasma (Morrow et al., 1995), líquido céfalo-raquídeo (Montine et al., 1999), condensación

espiratoria

(Montuschi

al.,

1999a;

1999b),

lavado

broncoalveolar (Montuschi et al., 1998) o de forma esterificada en membranas tisulares o en partículas lipídicas circulantes (Morrow et al., 1995) y se ha utilizado favorablemente como herramienta para la evaluación de la terapia 31

antioxidante (Davi et al., 1997), tomando en cuenta que otras técnicas son costosas y difíciles de realizar (González, 2005). 1.3

MARCO GEOGRÁFICO

Tunja es la capital del departamento de Boyacá con una temperatura de 14° C, se encuentra aproximadamente a 5 grados, 32 minutos y 7 segundos de longitud al oeste de Greenwich es de 73 grados, 22 y 04 segundos, las alturas oscilan entre 2700 y 3150 msnm, con una extensión de 121.4 Km2, pertenece a la unidad morfológica del Altiplano Cundiboyacense en la Cordillera Oriental de los Andes.

El estudio se realizo en la Clínica Veterinaria Zoomedica ubicada en el centro histórico de la ciudad de Tunja; con una latitud y longitud de + 5º 32´ 11.32” y 37º 21´ 40.68” respectivamente, la cual cuenta con servicios de urgencias 24 horas, consultas, cirugía, hospitalización, asistencia reproductiva en caninos y felinos, consulta especializada: neurología, dermatología, fauna silvestre, laboratorio clínico,

rayos X, ecografía, vacunas, pet shop, guardería,

peluquería; el horario de atención es de lunes a sábado de 8 am a 7 pm jornada continua, domingos y festivos de 8 am a 1 pm.

1.4

MARCO LEGAL

LEY 576 DE 2000 (febrero 15) Por la cual se expide el Código de Ética para el ejercicio profesional de la medicina veterinaria, la medicina zootecnia y la zootecnia. CAPITULO 6.

Del uso de animales para

investigación, docencia y recreación. Artículo 83. Médico

Veterinario Zootecnista

y el

veterinaria y

El Médico Veterinario, el

Zootecnista, están obligados al

cumplimiento de las prescripciones legales que sobre el uso de animales para la investigación, la docencia y la recreación que se encuentren contenidas en la Ley 84 de 1989 y demás disposiciones aplicables sobre protección

animales, su incumplimiento se constituye en falta a la ética

Artículo 23 Los experimentos que se lleven a cabo con animales vivos, se realizarán únicamente con autorización del Ministerio de Salud Pública y sólo cuando tales actos sean imprescindibles para el estudio y avance de la ciencia y siempre y cuando esté demostrado: •

Que los resultados experimentales no pueden obtenerse por otros

procedimientos o alternativas; •

Que las experiencias son necesarias para el control, prevención, el

diagnóstico o el tratamiento de enfermedades que afecten al hombre o al animal; • Que los experimentos no puedan ser sustituidos por cultivo de tejidos, modos computarizados, dibujos, películas, fotografías, video u otros procedimientos análogos Artículo 24: El animal usado en cualquier experimento deberá ser puesto bajo los efectos de anestesia lo suficientemente fuerte para evitar que sufra dolor. Si sus heridas son de consideración o implican mutilación grave, serán sacrificados inmediatamente al término del experimento. LEY 84 DE 1989 Diciembre 27 Por la cual se adopta el Estatuto Nacional de Protección de los Animales y se crean unas contravenciones y se regula lo referente a su procedimiento y competencia. CAPITULO I. Artículo 1. A partir de la promulgación de la presente Ley, los animales tendrán en todo el territorio nacional especial protección contra el sufrimiento y el dolor, causados directa o indirectamente por el hombre. Parágrafo: La expresión "animal" utilizada genéricamente en este Estatuto, comprende los silvestres, bravíos o salvajes y los domésticos o domesticados, cualquiera sea el medio físico en que se encuentren o vivan, en libertad o en cautividad. Artículo 2. Las disposiciones de la presente Ley, tienen por objeto: a) Prevenir y tratar el dolor y el sufrimiento de los animales; 33

b) Promover la salud y el bienestar de los animales, asegurándoles higiene, sanidad y condiciones apropiadas de existencia; c) Erradicar y sancionar el maltrato y los actos de crueldad para con los animales; d) Desarrollar programas educativos a través de medios de comunicación del Estado y de los establecimientos de educación oficiales y privados, que promuevan el respeto y el cuidado de los animales; e) Desarrollar medidas efectivas para la preservación de la fauna silvestre

2. DISEÑO METODOLÓGICO

2.1

TIPO DE ESTUDIO

Este estudio es de tipo transversal exploratorio por cuanto la información reportada en medicina veterinaria acerca de los IsoPs es escasa. Este proyecto se ejecutó en la Clínica Veterinaria Zoomedica de la ciudad de Tunja, se utilizaron caninos domésticos con edades superiores a los 7 años, con el fin de determinar y medir los valores de isoprostanos F₂ en orina como marcador de EO. 2.2

DISEÑO EXPERIMENTAL

A la Clínica Veterinaria Zoomedica ingresan un promedio de 32 pacientes gerontes al mes de los cuales se escogieron 28 al azar en el transcurso del estudio, a estos se les realizó un examen físico completo (Figura 3 a y b).

Figura 3 a y b. Realización del ECOP.

Con previo consentimiento informado de los propietarios se procedió a realizar la toma de la muestra de orina (Figura 4 a y b); se inicio con la desinfección de la zona perineal con alcohol y yodo; la muestra se obtuvo por cateterización vesical con sonda urinaria estéril lubricada con lidocaína en gel para neutralizar el dolor al momento en el que la sonda se introdujera por la uretra.

Figura 4 a y b. Toma de muestras por medio de cateterización vesical en hembras y machos. Se descartó la primera orina proveniente de la sonda, tomando así una muestra mayor a un mililitro siendo recolectadas en recipientes aptos para orina debidamente identificados y sellados y posteriormente conservados a una temperatura menor a 4 ºC hasta el momento de ser procesadas (Figura 5).

Figura 5. Muestras refrigeradas. El almacenamiento de muestras fue realizado en el Laboratorio de la Clínica Veterinaria Zoomedica y la implementación, capacitación, utilización, montaje y lectura de resultados se realizó en el laboratorio de microbiología de la Secretaria de Salud de Boyacá.

2.3

MATERIALES Y METODOS DE INVESTIGACIÓN. PROCRESO Y PROCEDIMIENTOS APLICADOS.

El OxiSelect™ kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2α de Cell Biolabs, Inc provee cierta cantidad de reagentes permitiendo la realización de 28 pruebas. 36

Para la ejecución del kit se inicia con la preparación de los reagentes; empezando con la preparación del 1X buffer para lavado (Figura 6), diluyendo el concentrado buffer para lavado 10X hasta 1X con agua desionizada, esto se agita hasta lograr la homogenización.

Figura 6. Concentrado buffer. El anticuerpo Anti-8-iso-PGF2α se diluye antes de su utilización en una proporción de 1:1000 mas el diluyente muestra (Figura 7 a y b).

Figura 7a y b. Anticuerpo y diluyente muestra.

El conjugado 8-iso-PGF2α-HRP se prepara antes de usarlo, diluyendo el conjugado 1:80 con el diluyente muestra preparando suficiente conjugado para las pocetas establecidas por el kit.

La solución substrato se debe dejar a temperatura ambiente antes de su preparación, al igual que a las muestras recolectadas antes de procesarlas (Figura 8 a y b).

Figura 8 a y b. Solución substrato y descongelamiento de muestras a temperatura ambiente.

A continuación se efectúa el proceso de hidrólisis acida de las muestras rompiendo así las uniones que mantienen unidos los lípidos y los no lípidos, acidificando la orina a un ph 3, adicionando 100 μL de HCl 1N a 1 mL de muestra de orina, diluyéndola posteriormente en pbs o en diluyente muestra a razón de 1:4 a 1:8 (Figura 9).

Figura 9. Acidificación de muestras.

2.4

UNIVERSO, POBLACION, MUESTRA Y UNIDADADES EXPERIMENTALES.

El estudio tuvo una duración de 4 meses, en los cuales se identificó la población la cual cumplía con los siguientes criterios de inclusión: caninos mayores de 7 años, sin tener en cuenta raza, género o enfermedades asociadas, a los cuales se les realizo un examen físico completo, se tomaron las muestras (teniendo en cuenta el previo consentimiento informado de los propietarios) y se realizó su posterior procesamiento, lectura, interpretación y análisis de resultados.

Los datos obtenidos se consignaron en una tabla donde se depositaron los datos referentes al número en los resultados, nombre del paciente, edad, raza y género (Tabla 2) para su posterior selección y valoración.

Tabla 2. Consignación de datos. Nº en los resultados

Nombre del paciente

Edad

Raza

Género

29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49

León Killer Bob Negro Kike Horacio Negro Dipsy Camilo Viruta Toby Tasha Lisa Mini Lassy Glenda Miny Rex Dalas Tintin Shaguy

7 años 8 años 7 años 8 años 8 años 7 años 8 años 7 años 7 años 7 años 7 años 7 años 7 años 8 años 7 años 8 años 10 años 12 años 11 años 10 años 11 años

Mestizo Labrador Mestizo Labrador Mestizo Mestizo Mestizo F. Poodle Mestizo Mestizo Schnauzer Beagle F.Poodle Beagle P Aleman Mestizo Pinscher Cocker Schnauzer Pinscher Labrador

M M M M M M M H M H M H H H H H H M M M M 39

50 51 52 53 54 55 56

Panda Mily Maito Mimo Toshy Teo Titi

7 años 8 años 7 años 11 años 12 años 7 años 10 años

Beagle Pit bull Mestizo Pinscher Mestizo Schnauzer Mestizo

M H M M M M M

Para la tabulación y el análisis de los resultados obtenidos de cada uno de los pacientes motivo de estudio se creó una base de datos utilizando el programa Microsoft Excel 2007. Al haber concluido la recopilación de muestras e información en la base de datos se realizó el respectivo análisis estadístico.

2.5

TRATAMIENTO - PROCESAMIENTO DE LA INFORMACIÓN.

La preparación del estándar fresco se realiza diluyendo el estándar 8-isoPGF2α desde 200μg/mL hasta 0.2 μg/mL en el diluyente muestra para una dilución final 1:1000; se preparan series del 8-iso-PGF2α Standard restante de acuerdo a la siguiente tabla (Tabla 3). Tabla 3. Preparación de la curva 8-iso-PGF2α Standard. Tubos estándar

8-iso-PGF2α Standard (μL)

Diluyente muestra (μL)

8-iso-PGF2α Standard (pg/mL)

5 μL of Standard Stock 250 μL of Tube #1 250 μL of Tube #2 250 μL of Tube #3 250 μL of Tube #4 250 μL of Tube #5 250 μL of Tube #6 0 Μl

4995 μL

200,000

750 μL 750 μL 750 μL 750 μL 750 μL 750 μL 200 μL

50,000 12,500 3,125 781 195 49 0

2 3 4 5 6 7 8

Posterior a la realización de la curva se procede a la adición de 100 μL del anticuerpo Anti-8-iso-PGF2α diluido a la placa cubierta de anticuerpo cabra anti-conejo y se deja incubar 1 hora a 25 °C en un mezclador orbital. De ahí se procede a remover la solución anticuerpo de las pocetas y se lavan 5 veces 40

con 300 μL de solución buffer para lavado 1X por poceta (Figura 10); en el último lavado se vacían las pocetas y se golpea suavemente la placa de micropipeta sobre trozos de papel absorbente removiendo así el exceso de solución para lavado.

Figura 10. Lavado con solución Buffer para lavado. A continuación se procede a combinar 55 μL del 8-iso-PGF2α de la muestra y 55 μL del 8-iso-PGF2α-HRP conjugado en un microtubo y se mezcla muy bien, de allí se transfieren 100 μL de la solución combinada para cada poceta; seguidamente se incuba a 25ºC sobre un mezclador orbital (Figura 11).

Figura 11. Incubación en mezclador orbital. La solución combinada se remueve de las pocetas y son lavadas 5 veces con 300 μL de buffer para lavado 1X por poceta , en el último lavado se vacían las pocetas y se golpea la placa de micropipeta sobre papel absorbente eliminando así el exceso de solución de lavado.

De ahí se continúa a la adición de 100 μL de solución substrato a cada placa y es incubado a temperatura ambiente durante 30 minutos en un mezclador orbital (Figura 11).

La reacción enzimática que se produce es detenida adicionando a cada poceta 100 μL de solución; la lectura se hace de inmediato ya que el color se desvanece con el tiempo (Figura 12)

Figura 12. Adición de solución para detener.

La absorbancia de cada placa es leida sobre un lector de microplaca utilizando 450nm como longitud de onda primaria (Figura 13).

Figura 13. Ubicación de las placas sobre el lector de microplaca.

El lector de microplaca, arrojó los siguientes resultados (Figura 14):

Figura 14. Resultados obtenidos en el lector de microplaca.

2.6

FORMULACIÓN DE HIPOTESIS.

Hi: Las concentraciones de F₂ isoprostanos en orina se verán influenciadas en la etapa senil de los pacientes objeto de estudio Ho: Las concentraciones de F₂

isoprostanos en orina no se verán

influenciadas en la etapa senil de los pacientes objeto de estudio

3. ANร LISIS Y DISCUSIร N DE RESULTADOS

3.1

RESULTADOS

Tabla 4. Numeraciรณn de muestras de todo el estudio (Sano [], geriรกtrico [] y enfermos)

Estรกndar

Diluyente

0,604

0,45

0,55

0,59

0,52

0,50

0,51

0,35

0,41

0,47

0.087

muestras

0.643 B

Estรกndar

Diluyente

0,527

0,55

0,47

0,48

0,40

0,46

0,51

0,41

0,46

0.063

muestras

0.605 C

Estรกndar

0.584

0,552

0,54

0,49

0,50

0,52

0,46

0,44

0,29

0,19

0,46 5

0.096 D

Estรกndar

0.535

0,538

0,51

0,49

0,42

0,34

0,39

0,28

0,12

0,33

0,23

0.177 E

Estรกndar

0.452

0,412

0,47

0,37

0,30

0,34

0,30

0,24

0,15

0,13

0,39

0.366 F

Estรกndar

0.557

0,415

0,50

0,49

0,44

0,21

0,34

0,29

0,31

0,23

0,26

0.546 G

Estรกndar

0.534

0,355

0,51

0,43

0,39

0,45

0,44

0,36

0,35

0,13

0.58 H

Estรกndar

0.545

0,553

0,49

0,43

0,46

0,38

0,23

0,20

0,42

0,23

0,62

0.605

Las 86 muestras numeradas se dividieron en 4 grupos siendo los primeros 28 pacientes sanos, del 29 al 56 pacientes geriรกtricos los cuales fueron utilizados 44

para el presente estudio, del 57 al 84 pacientes con diferentes patologías y los dos finales 85-86 se descartaron.

Los resultados arrojados por el lector de microplaca no se pueden graficar ya que son inversos, paro lo cual el fabricante del kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2α provee dos curvas estándar y una fórmula para la interpretación exacta de los resultados (Tabla 5; Tabla 6)

Tabla 5. Curva estándar.

Curva estándar 450nm 0,7 0,6 IsoPs

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1

100

1.000

10.000

100.000 1.000.000

pg/ml

Tabla 6. Curva estándar y fórmula.

Curva estándar 450nm 0,6 y = -0,111ln(x) + 1,1123 R² = 0,9743

0,5 IsoPs

0,4 0,3 0,2 0,1 0 1

100

1.000

10.000

100.000

pg/ml

La parte izquierda (sin color) de la tabla corresponden a los datos medidos por absorbancia en el lector de microplaca y los graficados en la parte derecha (color lila) son los arrojados por Microsoft Excel 2010 al implementar la fórmula (Tabla 7)

Tabla 7. Resultados obtenidos sin la fórmula (Blanco) y resultados obtenidos tras la aplicación del a fórmula (Lila). Sin Fórmula 0,438 0,433 0,59 0,486 0,504 0,423 0,308 0,441 0,394 0,46 0,525 0,488 0,525 0,346 0,345 0,219 0,454 0,387 0,504 0,407 0,467 0,398 0,303 0,346 0,449 0,239 0,516 0,465

Con Fórmula 434,75 454,78 110,54 282,12 239,89 497,66 1402,41 423,16 646,24 356,59 198,54 277,09 198,54 995,86 1004,87 3126,74 376,39 688,31 239,89 574,82 334,79 623,37 1467,02 995,86 393,73 2611,21 215,31 340,88

Tabla 8. Valor mínimo y máximo de Isoprostanos en caninos gerontes.

Intervalo de IsoPs pg/ml en los pacientes gerontes 3126,74

3500,00 3000,00 2500,00 2000,00 1500,00 1000,00 500,00 0,00

110,54

198,5400794

Valor minimo de intervalo

Moda

380,9878332

428,96

Media

Mediana

696,83

Promedio

Valor mayor de intervalo

Los niveles de isoprostanos en los caninos gerontes del estudio, tienen un valor mínimo de 110,54, un valor máximo de 3126,74 IsoPs pg/ml de esta manera el valor promedio es de 696,83 IsoPs pg/ml.

Tabla 9. Comparación de resultados de pacientes sanos menores a 7 años, caninos mayores a 7 años (gerontes) y con diferentes patologías. Comparación de resultados de IsoPs pg/ml de caninos sanos < a 7 años, caninos mayores >7 años y con diferentes patologías 9000,00 Cantidad de IsoPs pg/ml

8000,00 7000,00 6000,00 5000,00

Geriátricos

4000,00

Sanos < de 7 años

3000,00

Patológicos

2000,00 1000,00 0,00 1

9 11 13 15 17 19 21 23 25 27

Caninos sanos, Gèriatricos y diferentes patologìas

La tabla 9 muestra que los pacientes gerontes tienen niveles más altos de IsoPs comparado estadísticamente con pacientes sanos menores de 7 años de edad, y a su vez los pacientes con diferentes patologías, muestran valores más altos de las tres poblaciones, se demuestra que a mayor edad y con un estado patológico los niveles de isoprostanos y de EO aumentan.

Tabla 10. Valor determinado por edades.

IsoPs pg/ml

Valor determinado por edades 4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

3126,74

1004,87

2611,21

110,54

239,89

574,82 340,88

239,89

7 años

8 años

10 años

11 años

688,31

688,31 12 años

Edad

Para el estudio las variaciones de edad en los caninos están entre los 7 y los 12 años, evidenciando un aumento considerable de IsoPs en los pacientes de 8 y 12 años, un valor medio en pacientes de 7 años y los valores más bajos en pacientes de 10 y 11 años.

Tabla 11.Valor determinado según género.

IsoPs pg/ml

Valor determinado según género 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500 0

3126,74 2611,21

198,54

110,54

Hembras

Machos

Género

En la tabla 11 se observa que las hembras presentan niveles más altos de IsoPs en relación con los machos, sin embargo hay que tener en cuenta que el número de muestras no es uniforme lo cual genera un sesgo en la interpretación de los datos.

3.2

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN

De acuerdo con los reportes en medicina humana, el proceso natural de envejecimiento se relaciona directamente con el aumento de los niveles de EO (Rodríguez y Céspedes, 1999); este estudio mediante la utilización de IsoPs F2 como biomarcador de EO en orina de caninos gerontes, corrobora este hecho, ya que los caninos mayores a 7 años tienen un significativo aumento de IsoPs F2 por tanto un mayor nivel de EO en relación con los caninos sanos menores a 7 años. Según Murillo (2011), la vejez afecta los procesos fisiológicos del organismo y está ligada a la edad de los animales de compañía. El envejecimiento suscita un incremento en la producción de radicales libres en distintas estructuras, como en el cerebro, produciendo un incremento del EO, lo cual genera una disminución de las funciones vitales de los perros y por tanto una baja en la calidad de vida del paciente, siendo esta condición una característica 49

observada en la mayoría de caninos gerontes, esta misma tendencia se presento en los pacientes objeto de estudio, como en el caso de los caninos de 8 años de edad.

No todos los individuos dentro de la misma especie envejecen por igual, la existencia de condicionamientos de carácter genético, y un fuerte componente ambiental, hacen que el proceso de envejecimiento no sea homogéneo en todos los seres vivos, según lo dicho por Peinado et al (2000), este hecho también se pudo evidenciar en el presente estudio debido a que los caninos de 8 y 12 años de edad presentan niveles más altos de IsoPs F2, que los de 7, 10 y 11 años, sin embargo no se puede tener certeza en este caso, ya que la cantidad de muestras no son proporcionales con respecto a la edad de cada uno de los pacientes.

Las hormonas sexuales pueden influir en el EO. El estrés oxidativo mitocondrial es mayor en los hombres que en las mujeres; debido a que las mujeres presentan valores más altos de estrógenos que los hombres, esto las protege contra el envejecimiento por una sobre regulación de la expresión de genes relacionados con los antioxidantes y la longevidad según lo reportado en humanos por Vitale, Salvioli y France (2013), lo anterior no concuerda con los resultados obtenidos en el estudio ya que las hembras presentaron niveles más altos de IsoPs en relación con los machos por tanto un EO mayor, posiblemente por lagunas de las siguientes características: la población objeto de estudio, no presentaba la suficiente homogeneidad respecto al género, presentándose un mayor número de machos que de hembras y según lo reportado

también

por

Vitale,

Salvioli

France

(2013)

ratas

ovariohisterectomizadas los niveles de EO tienden a ser similares a los de los machos, probablemente por una influencia menor derivado de los estrógenos.

4. IMPACTO

Los reportes en medicina de pequeños animales acerca de la valoración objetiva del impacto que genera el EO en el organismo son escasos, a pesar de ser aceptada la presencia de este proceso en el estado normal de envejecimiento y en diferentes estados patológicos; este estudio se presenta como uno de los pioneros en medicina veterinaria en la cuantificación de este parámetro mediante la medición de IsoPs F₂ en orina; y su importancia se refleja en la comparación realizada en tres tipos poblacionales diferentes, sanos menores de 7 años, gerontes mayores de 7 años y pacientes con diferentes patologías, en donde se evidencio diferencias significativas relacionadas con la edad y el estado de salud del paciente.

Este proyecto es el punto de partida, para darle continuidad al estudio del EO, sus causas, consecuencias, valoración y monitoreo; y de esta forma se contempla la posibilidad de desarrollar pruebas fácilmente repetibles, que permitan evaluar la tendencia de esta condición, en estados fisiológicos y patológicos.

5. CONCLUSIONES La concentración elevada de F2 isoprostanos en orina fue evidente en los pacientes caninos mayores a 7 años, lo cual comprueba que el EO es una condición presente en el proceso normal del envejecimiento, como se ha demostrado en estudios realizados en medicina humana.

Los pacientes gerontes tienen valores de F2 isoprostanos en orina aumentados comparados con los presentados por pacientes sanos menores a 7 años, como se esperaba de manera inicial, sin embargo los niveles tienen mayor relación con estudios previos a este como el realizado por Velandia en el 2013 sobre la concentración de isoprostanos F2 en orina como marcadores de estrés oxidativo en pacientes caninos con diferentes patologías, con esto se evidencia la estrecha relación que tiene el proceso de envejecimiento y las enfermedades, esto debido al daño tisular y la mínima regeneración que hay en esta etapa.

Las variaciones de F2 isoprostanos en orina con relación a la edad y al género; se adjudican a una desigualdad en la cantidad de muestras con respecto a estas variables dentro de la población objeto de estudio, no a una condición propia de dichos planteamientos.

El EO es parte de un proceso inherente e inevitable como lo es la etapa senil en cualquier especie animal, lo cual se pudo evidenciar en este estudio, dando así la posibilidad de implementar una nueva herramienta paraclínica que permita la valoración del grado de estrés oxidativo en el cual se encuentra el paciente, dando al clínico de pequeños animales un mayor entendimiento de la situación y estado del canino geronte independientemente de la razón por la cual ingresa a consulta, de esta forma plantear nuevas o diferentes alternativas terapéuticas que permitan mitigar las consecuencias del EO.

6. RECOMENDACIONES En próximas investigaciones se pueden valorar grupos más homogéneos en cuanto a la edad, al género y al estado reproductivo, para determinar con mejor precisión si hay diferencias entre dichas variables y el nivel de IsoPs que en ellas se encuentra.

Se debe identificar una prueba de medición rápida y fácilmente repetible que permita determinar las distintas alteraciones que puedan presentarse de EO en caninos y otras especies animales, esto debido a que el kit (OxiSelect™ kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2α) utilizado en este estudio fue desarrollado para ámbitos investigativos.

7. BIBLIOGRAFÍA

Abilés, J. S. (2007). Estrés oxidativo y su relación con el aporte de antioxidantes nutricionales en el paciente crítico. Universidad de Granada, Fisiologia. Universidad de Granada. Recuperado el 2013 de Agosto de 02, de Estrés oxidativo y su relación con el aporte de antioxidantes nutricionales en el paciente crítico.: http://digibug.ugr.es/bitstream/10481/1526/1/16710794.pdf Anonimo. (2011). OxiSelect™ kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2α. Cell Biolabs, Inc. Arbor, A. (2011). 8 - Isoprostane EIA kit . Cayman Chemical Company , 5-40. Barceló, A., & Barbé, F. (2005). Estrés oxidativo y síndrome de apneashipopneas. Arch Bronconeumol, 41:393-9. Benzi, G., & Moretti, A. (1995). Age-and peroxidative stress-related modifications of the cerebral enzymatic activities. Free Rad Biol Med, 19(1):77101. Cascales, M., Cabezas, J. A., & Garcia, P. (2003). Bioquímica y fisiopatología del envejecimiento. Céspedes, E., & Reyes, A. (2007). Marcadores de estrés oxidativo en ratas senescentes. Revista Cubana de Investigaciones Biomédicas, 26(2). Céspedes, E., Rodríguez, K., Llópiz, N., & Cruz, N. (2000). Un acercamiento a la teoría de los radicales libres y el estrés oxidativo en el envejecimient. Rev Cub Invest Biomed, 19:186-90. Céspedes, T., & Sánchez, D. (2000). Algunos aspectos sobre el estrés oxidativo, algunos aspectos sobre el estrés oxidativo, de suplementación. Cubana Cardiol, 14:55-60. Cracowski JL, Cracowski C, Bessard G, Pepin JL, Bessard J, Schwebel C, Stankelabesque F, Pison C. al. (2001 b). Increased formation of F2isoprostanes in patients with severe heart failure. En T. F.-L. Cracowski JL, Heart (págs. 84:439-440). Cracowski JL, Durand T, Bessard G. (2002 a). Isoprostanes as a biomarker of lipid perodixidationin humans: physiology, pharmacology and clinical implications. Ttrends in pharmacological sciensces; 23:360-366

Cruz, E., Sanfiel, L., & Palacio, O. (2004). Estrés oxidativo e hipertensión esencial: una realidad clínica. Revista Cubana de Investigaciones Biomédicas, 23. Davi G, Alessandri P, Mezzetti A, Minotti G, Bucciarelli T, Costantini F, Cipollone F, Bittolo G, Ciabattoni G, Patrono C. (1997). In vivo formation of 8epi-prostaglandin F2 isincreased in hypercholesterolemia. Arterioscler Thromb VascBiol. 17:3230-3235 De la Cruz, E. S. (2006). Estrés oxidativo en los deportes de resistencia: implicaciones para el nadador de larga distancia. Archivos demedicina del Deporte, 23 (112): 255-263. Dhalla, N., Temsah, R., & Netticadan, T. (2000). Role of oxidative stress in cardiovascular diseases. J Hypertens, 655-73. Elejalde Guerra, J. I. (2001). Estrés oxidativo, enfermedades y tratamientos antioxidantes. ANALES DE MEDICINA INTERNA, 18(6), 326-335. Flores, L. (2005). Etrés oxidativo y fibrogenesis en la diabetes mellitus tipo 1: influencia del control glucémico del consumo de tabaco. Memoria para optar al grado de doctor en medicina y cirugía . Barcelona , España : . González, G. (2005). Efecto de los Isoprostanos en la reactividad vascular pulmonar y sistémica durante el período neonatal. Tesis doctoral. Barcelona, España. Halliwell, B., & Chirico, S. (1993). Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance. Am J Clin Nutr, 57:715S-724S. Handelman, G. J., Walter, M. F., Adhikarla, R., Gross, J., Dallal, G. E., & Levin, N. W. (2001). Elevated plasma F2-isoprostanes in patients on long-term hemodialysisl. Kidney Internationa., 59, 1960-1966. Head, E., & Zicker, S. (2011). Oxidative Stress, Cognitive Dysfunction, and Brain Aging. En L. Mandelker, P. Vajdovihc, & D. Armstrong (Ed.), Studies on Veterinary Medicine: Oxidative Stress in Applied Basic Research and Clinical Practice. New York : Humana Press. Holtzman, M. (1991). Arachidonic acid metabolism. Implications of biological chemistry for lung function and disease. . Am Rev Respir Dis, 143:188-203. Insua, M. F. (Noviembre de 2003). Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blanca. Obtenido de http://www.efdeportes.com Kadiiska MB, Glanden BC, Baird DD, Germolec D, Graham LB, Parker CE, Nyska A, Wachsman JT, Ames BN, Baus S, Brot N, Fitzgerald GA, Floyd RA, 55

George M, Heinecke JW, Hatch GE, Hensley K, Lawson JA, Marnett LJ, Morrow JD, Murray DM, PLastaras J, Roberts LJ, Walter PB, Tomer KB, Mason RP, Barrett JC. (2005). Biomarkers of oxidative stress study II: are oxidation products of lipids, proteins, and DNA markers of CCI4 poisoning? Free Radic. Biol. Med; 698-710 Kohen, R., y Nyska, A. (2002). Oxidation of Biological SystemsOxidative Stress Phenomena, Antioxidants, Redox Reactions, and Methods for Their Quantification. Toxicologic Pathology, 620–650. Londoño, J. (2011). Antioxidantes: importancia biológica y métodos para medir su actividad. En Desarrollo y transversalidad serie lasallista investigación y ciencia (págs. 129-162). Mallat et al. (1998). Elevated levels of 8-isoprostaglandin F2 in pericardial fluid of patients with heart failure: A potential role forin vivo oxidant stress in ventricular dilatation and progression to heart failure. En Z. Mallat, I. Philip, M. Lebret, D. Chatel, J. Maclouf, & A. Tedgui. Mandelker, L. (2011). Studies on Veterinary Medicine: Oxidative Stress, Free Radicals, and Cellular Damage. En L. Mandelker, P. Vajdovich, & D. Armstrong (Ed.), Oxidative Stress in Applied Basic Research and Clinical Practice. New York: Humana Press. Mena, E. M., Sáenz, Á., Galicia, O. G., Quintana, A., & Martínez, F. (2002). La diabetes experimental reduce la producción de f8-isoprostanos en glomérulos aislados de rata en presencia de AMPc y ADO. Investigación y ciencia. Milne, G., Yin, H., Hardy, K., Davies, S., & Rober, L. (2001). Isoprostane generation and function. Chem Rev, 111:5973-96. Mo, J., Hom, D., & Andersen, J. (1995). Decreases in protective enzymes correlates with increased oxidative. Mech Ag Dev, 81:73-82. Montine TJ, Beal MF, Cudkowicz ME, O’Donnell H, Margolin RA, McFarland L, Bachrach AF, Zackert WE, Roberts LJ, Morrow JD (1999). Increased CSF F2isoprostane concentration in probable AD. Neurology: 52: 562-565 Montuschi P, Corradi M, Ciabattoni G, Nightingale J, Kharitonov SA, Barnes PJ. (1999a). Increased 8-isoprostane, a marker of oxidative stress, in exhaled condensate of asthmapatiens. Am J RespirCrit Care Med. 160: 216-220. Montuschi P, Corradi M, Ciabattoni G, Nightingale J, Kharitonov SA, Barnes PJ. (1999b). 8-isoprostane, a new biomarker of oxidative stress in asthma (Abstract). Am JRespirCrit Care Med. 159: A97.

Montuschi P, Ciabattoni G, Paredi P, Pantelidis P, Bois RM, Kharitonov SA, Barnes PJ. (1998). 8-isoprostane, a new biomarker of oxidative stress in interstitial lung diseases. Am JRespirCrit Care Med. 158: 1524-1527 Moore, K. (2004). Los isoprostanos y el hígado. Chem Phys lípidos, 125-33. Morrisey, P., & O'Brien, N. (1998). Dietary antioxidant in health and disease. Int Dairy J, 8:463-472. Morrow, J., Frei, B., Longmire, A., Gaziano, J., Lynch, S., Shyr, Y., y otros. (1995). Increase in circulating products of lipid peroxidation (F2 – isoprostanes) in smokers. N Engl J Med, 332:1198-1203. Morrow, J., Harris, T., & Roberts, L. I. (1990 b). Noncyclooxygenase oxidative formation of aseries of novel prostaglandins: Analytical ramifications for measurement of eicosanoids. AnalBiochem, 184:1-10. Morrow, J., Hill, K., Burk, R., Nammour, T., Badr, K., & Roberts, L. 2. (1990 a). A series ofprostaglandin F2-like compounds are produced in vivo in humans by a noncyclooxygenase,freeradicalcatalyzed mechanism. Proc Natl Acad Sci, 87:9383–9387. Morrow et al. (1999). The isoprostanes: unique prostaglandin-like products of free-radical-initiated. En J. Morrow, Y. Chen, C. Brame, J. Yang, S. Sanchez, J. Xu, . . . L. Roberts. Drug Metab Rev. Morrow, J., & Roberts, L. (1997). The isoprostanos: unique bioactive products of lipid peroxidation. En J. Morrow, & L. Roberts. Prog Lipid Res. Murillo, M. D. (2011). Patologías Relacionadas con el Estrés Oxidativo en Perro y Gato. Gaceta de Ciencias Veterinarias, 13. Núñez, R., & Ortega, F. (2007). Estructura quimica de los radicales libres. Tesis doctoral , Universidad de San Martín de Porres , Lima . Peinado M.A, M. d. (2000). Envejecimiento y neurodegeneración:bases moleculares y celulares. REVISTA DE NEUROLOGÍA, 31: 1054-1065. Pérez, P., & Pérez, J. (2000). Métodos para medir el daño oxidativo. Rev Cubana Med Milit, 29:192-198. Porter, N., & Funk, M. (1975). Letter: peroxy radical cyclization as a model for prostaglandin biosynthesis. J Org.Chem, 3617-. Praticó, D., Lawson, J., & Fitzgerald, G. (1995). Cyclooxygenase-dependent formation of the isoprostane, 8-epi prostaglandin F2 alpha. J BiolChem., 270:9800-9808. 57

Pryor, W., Stanley, J., & Blair, E. (1976). Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides. Lipids. 370. Reilly et al. (1996). Modulation of oxidant stress in vivo in chronic cigarette smokers. En M. Reilly, N. Delanty, J. Lawson, & G. Fitzgerald. Circulation. Roberts, L., & Morrow, J. (1997). The generation and actions of isoprostanes. Biochim Biophys Acta, 1345:121-135. Roberts, L., & Morrow, J. (2002). Products of the isoprostane pathway: unique bioactive compounds and markers of lipid peroxidation. Cell Mol Life Sci, 80820. Rodríguez, C., & Céspedes, M. (1999). Estrés oxidativo y envejecimiento. Rev Cubana Invest Biomed, 18:67-76. Romero, P., Rodrìguez, B., Martínez, S., Cañizares, R., Sepúlveda, D., & Manresa, F. (2006). Estrés oxidativo en el condensado exhalado de pacientes con infección pulmonar grave. Arch Bronconeumol, 42:113-9. Shull, S., & Heints, N. (1991). Differential regulation of antioxidant enzymes in response to oxidants. J Biol Chem, 266:24398-403. Sies, H. (1991). Oxidative stress: from basic research to clinical application. Am. J Med, 391-6. Slater, T. F. (1984). Free-radical mechanisms in tissue injury. Biochem. J., 222, 1-15. Sohal, R., Arnold, L., & Sohal, B. (1990). Aged-related changes in antioxidants enzymes and pro-oxidant generation. Free Rad Biol Med, 10:495-500. Sohal, R., Donato, H., & Biehl, E. (1981). Effect of age and metabolic rate on lipid peroxidation in the housefly. Mech Ag Dev, 16:159-67. Taber, D., Morrow, J., & Roberts, L. (1997). A nomenclature system for the isoprostanes. Prostaglandins, 63-7. Velandia, Y. (2013). Determinación de la concentración de isoprostanos F2 en orina como marcador de estrés oxidativo en pacientes con diferentes patologías de la clínica veterinaria zoomedica. Tesis pregrado, Fundacion Universitaria Juan de Castellanos , Tunja. Vijg, J., & Suh, Y. (2005). Genetics of longevity and aging. Annu Rev Med, 56;193-212.

Viña, J., & Pallardó, F. V. (1999). Nutrición y ejercicio físico. En D. Hernadez Rodriguez, & A. Sastre Gallego, Tratado de Nutrición (págs. 715-719). Madrid: Ediciones Díaz de Santos. Vitale, G., Salvioli, S., & France, C. (2013). Oxidative stress and the ageing endocrine system. Nature Reviews Endocrinology, 228-240. Waugh, R. J., Morrow, J. D., Roberts II, L., & Mur. (1997). Identification and Relative Quantitation of F2-Isoprostane Regioisomers Formed in vivo in the Rat. . Free Radical Biology and Medicine., 23, 943–954. Zorrilla, A. (2002). El envejecimiento y el estrés oxidativo . Revista Cubana Invest Biomed, 21:178-85.