Determinación de la concentración de isoprostanos f2 en orina como marcador de estrés by Medicina Veterinaria JDC

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ISOPROSTANOS F2 EN ORINA COMO MARCADOR DE ESTRÉS OXIDATIVO EN PACIENTES CON DIFERENTES PATOLOGÍAS DE LA CLÍNICA VETERINARIA ZOOMEDICA – TUNJA.

YERIKSON ALFONSO VELANDIA LIZARAZO

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013 1

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE ISOPROSTANOS F2 EN ORINA COMO MARCADOR DE ESTRÉS OXIDATIVO EN PACIENTES CON DIFERENTES PATOLOGÍAS DE LA CLÍNICA VETERINARIA ZOOMEDICA – TUNJA.

YERIKSON ALFONSO VELANDIA LIZARAZO

Trabajo de grado presentado como requisito para optar al título de Médico Veterinario.

Directora: ANA CONSUELO GONZÁLEZ MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA, ESP. Codirector: GUILLERMO ENRIQUE GRANADOS MÉDICO VETERINARIO ZOOTECNISTA, ESP.

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS PROGRAMA DE MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2013

AGRADECIMIENTOS

A la Dr Ana Consuelo González Patiño por su orientación y apoyo en la culminación satisfactoria de este proyecto. Al Dr Guillermo Enrique Granados Ramírez quien con su paciencia y experiencia ayudaron al éxito de este proyecto. A la Dr Gloria Isabel González Patiño por su anegable ayuda y a sus valiosas colaboradoras al momento del procesamiento de las muestras. Al Dr Andrés Felipe Caycedo por su valiosa colaboración y orientación. Al Dr Javier Andrés Arias Hernández por su gran ayuda y apoyo A la Dr Viviana Gómez y a la Dr Ludy Villamil por estar presentes a lo largo del proyecto con orientación, apoyo y ayuda. A todos mis amigos y conocidos los cuales mostraron su interés y apoyo al momento de realizar y culminar con éxito el presente trabajo.

DEDICATORIA

A Dios y a la Virgen María por guiarme en todos los pasos de mi vida. A mis padres Isaura y Pedro por estar presentes en cada instante; les doy gracias porque con su amor y comprensión me enseñaron el sentido de responsabilidad y respeto, además aprendí de ellos que se debe tener confianza y optimismo en todas las cosas que se emprenden. A mis hermanos Oscar, Sandra y Paola por alentarme siempre con su amor y cariño a vencer todos los obstáculos y seguir adelante. A mi abuelo Timoleon especialmente a ti en tu memoria, que desde el cielo me está acompañando y nunca me ha abandonado, a mi abuelita Isaura que representa el amor y la ternura y jamás me negó nada; a mis tías y primos por estar pendientes siempre. A la doctora Consuelo González y al Doctor Guillermo Granados por permitirme hacer la tesis en la Clínica Veterinaria Zoomedica, por el agrado y el amor por los animales que me inculcaron desde el primer día y por instruirme a lo largo de todo el proyecto y brindarme su amistad. A todos mis amigos especialmente a Javier Arias por brindarme sus conocimientos desde el primer día, Gelen Raquel por su ternura y por inculcarme el amor y la pasión por los felinos y a Erika Soledad por brindarme una sonrisa y una carita siempre, a los tres gracias por estar ahí cuando más los necesite y por brindarme su cariño y amistad incondicional. Finalmente a todos los que de una u otra forma estuvieron a lo largo de la realización de este proyecto Andreita, Manolo y Jairo, Arleth, David, Yackeline, Arturo, Farith, Lizeth, Dianita y Clemencia a todos ellos les agradezco de corazón por haberme brindado su colaboración, apoyo y ánimo. 4

NOTA DE ACEPTACION

____________________________________ ____________________________________ ____________________________________ ____________________________________

____________________________________ FIRMA DIRECTOR

____________________________________ FIRMA JURADO

GLOSARIO

ANTIOXIDANTES: Son compuestos que detienen el ataque y la formación de radicales libres dentro de la célula. BIS: presencia de dos grupos complejos idénticos, pero separados, en una molécula. CIS: forma de isomerismo en la que grupos funcionales similares están unidos al mismo lado del plano que incluye dos átomos de carbono fijos adyacentes. DIASTEREOISÓMEROS: son isómeros con más de un centro quiral, hay dos potenciales diastereoisómeros por cada centro quiral. ESTRÉS OXIDATIVO: es causado por un desequilibrio entre la producción de especies reactivas del oxígeno y la capacidad de un sistema biológico de detoxificar rápidamente los reactivos intermedios o reparar el daño resultante. FOSFOLÍPIDOS: son un tipo de lípidos anfipáticos compuestos por una molécula de glicerol, a la que se unen dos ácidos grasos, un grupo fosfato y un grupo x, presentes en la membrana celular. ISÓMEROS: son compuestos con la misma fórmula molecular pero diferentes fórmulas estructurales. ISOPROSTANOS:

son compuestos similares

a las prostaglandinas producidas

principalmente a partir de ácido araquidónico, son considerados los mejores biomarcadores disponibles del estado de estrés oxidativo.

LÍPIDOS: son un conjunto de moléculas orgánicas.

LIPOPROTEÍNAS: son complejos macromoleculares compuestos por proteínas y lípidos que transportan masivamente las grasas por todo el organismo.

OXIDACIÓN: es un proceso bioquímico de pérdida de electrones siempre asociado a otro de captación que se denomina reducción. PATOGÉNESIS: describe el origen y evolución de una enfermedad con todos los factores que están involucrados en ella. PEROXIDACIÓN LIPÍDICA: hace referencia a la degradación oxidativa de los lípidos. Es el proceso a través del cual los radicales libres capturan electrones de los lípidos en las membranas celulares. Este proceso es iniciado por un mecanismo de reacción en cadena de un radical libre. REGIO ISÓMERO: uno de los tipos de isómeros constitucionales. TRANS: forma de isómero en la cual átomos fijados a dos átomos de carbono unidos mediante un doble enlace están en lados opuestos de la molécula.

ABREVIATURAS EO: Estrés oxidativo. ROS: Siglas en inglés, especies reactivas de oxígeno. ERO: Siglas en español, especies reactivas de oxígeno. IsoPs: Isoprostanos. SOD: Superoxido dismutasa. CAT: Catalasa. COX: Ciclooxigenasas. ECOP: Examen clínico orientado a problemas. PG o PGs: Prostaglandinas. CD: Dienos conjugados. PV: Índice de peróxidos. TBARS: Sustancias reactivas de ácido tiobarbiturico. GPx: Glutation peroxidasa. H2O: Agua. O2: Oxigeno. H: Hidrogeno. GSH: Glutation reducido. GTP: Glutation peroxidasa. DNA: Acido desoxirribonucleico. 8

RESUMEN

La sobrecarga oxidativa celular denominada estrés oxidativo (EO), se da por exceso de especies reactivas de oxígeno (ROS siglas por su nombre en inglés), la cual es causada por un desequilibrio entre los mecanismos generadores de ROS y los

sistemas

antioxidantes

fisiopatológicamente

con

defensivos, desarrollo

los

cuales

diferentes

están

implicados

enfermedades.

Los

isoprostanos son compuestos similares a las prostaglandinas que se producen de forma independiente de la ciclooxigenasa (COX), mediante un mecanismo no enzimático de peroxidación del ácido araquidónico inducido por radicales libres (Roberts y Morrow, 1997). Los ROS tienen la capacidad de sustraer un átomo de hidrógeno del ácido araquidónico dando lugar a la formación de cuatro isómeros de la prostaglandina H2; cada uno de estos diferente a la prostaglandina F2 (PGF2) o parcialmente reducido, dan lugar a isómeros de las prostaglandinas E2 (PGE2) y prostaglandina D2 (PGD2). Los isoprostanos son formados in vivo en animales y plantas y sus concentraciones pueden medirse en diferentes fluidos corporales (Flores 2005; Griffiths et al.,2002; Fam y Morrow, 2003) el objetivo general de esta investigación es la identificación de variaciones en la concentración de estos compuestos en orina en las diferentes patologías presentes en la población objeto de este estudio; las muestras de orina se obtuvieron por medio de cateterización vesical a 28 caninos consultantes a la Clínica Veterinaria Zoomedica con diferentes alteraciones en su estado de salud; dichas muestras se analizaron con el kit Snap ELISA (OxiSelect™ kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2α), los resultados obtenidos se compararon con el estado final del paciente, y adicionalmente se tuvieron en cuenta parámetros como el tipo de patología, sexo, edad y raza; de igual forma los resultados de este estudio se compararon con un estudio en el cual se valoró la concentración de isoprostanos en orina de pacientes sanos; evidenciando que 9

dichos individuos poseen niveles inferiores de EO en comparación con los pacientes con diferentes patologías que fueron objeto del presente estudio, en los que se observaron concentraciones elevadas de isoprostanos dependientes del tipo de patología; como fue el caso observado en animales con patologías cardiacas. Finalmente este estudio abre una nueva posibilidad en la valoración objetiva del EO; puesto que los isoprostanos tienen una gran actividad biológica, y la opción de ser medidos en diferentes fluidos corporales como suero y orina entre otros, permiten su aplicabilidad como herramienta complementaria en la evaluación cuantitativa de los estados de EO y la posibilidad de ser incluidos en aproximaciones multimodales en el monitoreo y pronóstico en diferentes enfermedades que dentro de su fisiopatología se ha descrito al EO como un componente importante o perpetuador de la enfermedad.

Palabras Clave: Peroxidación, ROS, prostaglandinas, ciclooxigenasa, isómero.

ABSTRACT

The oxidative overloaded called oxidative stress (OS) stands out because of the reactive oxygen species exceed (ROS) which is causes by an imbalance between the ROS generators and the defensive antirust systems, which are pathologically involved to the development in different pathologies, the isoprostanes are similar compounds like prostaglandin s that are produced independently from the ciclooxigenase (COX) through a non-enzymatic mechanism: peroxidation of arachidonic acid, as a result, the four isomers formation from the prostaglandin F2 (PGF2) or reduced partially, it stand for the prostaglandin s isomers E2 (PGE2) and prostaglandin D2 (PGD2). The isoprostanes are formed live in animals and plants and their funnels can be measured in different body fluids; the general goal in this research is to analyze, identify the centralization that this components have in the target`s urine in various remaining pathologies. The urine samples were got through the vessical catheterization to 28 canines which got into the “Zoomedica” vet clinic, those presented several disturbances in their health status; those samples were checked using the kid snap Elisa (OxiSelect™ kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2α). The gathered outcomes were compared to the final patient`s status; moreover, pathologies like: sex, age and breed were taken into account to be compared. Likewise the studies outcomes were compared to another which purpose was compare the urine`s isoprostanes centralization in healthy patients; evidencing the inferior OS possession levels in these patients. Instead of the different pathologies presented in the studied target, it was seen the higher isoprostanes centralization depending on the pathology kind, as a sample the pathology in cardiac animals. In this research a wide possibility is opened in the OS objective assessment; as the great biology isoprostanes activity the best option is to measure them in different fluids like: urine, serum among others. 11

The OS status and the possibility of being included in multimodal approximations in the monitoring and diagnosing of different illness within the pathophysiology is described OS as important component or sickness perpetuator. Thus, the applicability as complementary tool allows the quantitative assessment form the OS status. Key words: Peroxidation, ROS, prostaglandins, isomer, ciclooxigenase.

TABLA DE CONTENIDO INTRODUCCIÓN ............................................................................................................. 17 1.

OBJETIVOS ............................................................................................................. 19 1.1

OBJETIVO GENERAL ....................................................................................... 19

1.2

OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................. 19

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................... 20 2.1

CARACTERIZACIÓN DEL PROBLEMA ............................................................ 20

Pregunta de investigación. ........................................................................................... 21 3.

JUSTIFICACIÓN ...................................................................................................... 22

MARCO DE REFERENCIA ...................................................................................... 24 4.1

ESTADO DEL ARTE ......................................................................................... 24

4.2

MARCO TEÓRICO ............................................................................................ 26

4.2.1

Radicales libres de oxígeno ........................................................................ 26

4.2.2

Daño celular ocasionado por los RLO ........................................................ 27

4.2.3

Defensas antioxidantes .............................................................................. 28

4.2.4

Estrés oxidativo .......................................................................................... 30

4.2.5

Daño oxidativo celular ................................................................................ 30

4.2.6

Caracterización del estrés oxidative ........................................................... 30

4.2.7

Isoprostanos ............................................................................................... 31

4.2.8

Diferencias entre IsoPs y PGs derivados de la COX .................................. 32

4.2.9

Mecanismo de formación de los F2 IsoPs .................................................. 32

4.2.10

F2 IsoPs como marcadores de estrés oxidativo in vivo............................... 33

4.2.11

Fisiología .................................................................................................... 34

4.2.12

Efectos vasculares de los IsoPs ................................................................. 37

4.2.13

Vasos sistémicos ........................................................................................ 37

Marco geográfico ...................................................................................................... 40

DISEÑO METODOLÓGICO ..................................................................................... 42 6.1 7.

DISEÑO ESTADÍSTICO .................................................................................... 54 RESULTADOS. ..................................................................................................... 56

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS........................................................... 64

CONCLUSIONES ..................................................................................................... 65 13

10.

IMPACTO.............................................................................................................. 67

11.

RECOMENDACIONES ......................................................................................... 68

12.

BIBLIOGRAFÍA. .................................................................................................... 69

TABLA DE TABLAS Tabla 1. Radicales de oxígeno y su mecanismo natural de defensa antioxidante. .......... 29 Tabla 2. Estados fisiopatológicos en los que se ha tomado a los F2 isoprostanos como marcadores en humanos. ................................................................................................ 35 Tabla 3. Isoprostanos más frecuentes estudiados in vivo en humanos y animales. ......... 37 Tabla 4. Preparación de la curva 8-iso-PGF2α Standard. ................................................ 48 Tabla 5. Consignación de datos....................................................................................... 54 Tabla 6. Numeración de muestras de todo el estudio (Geriátrico, sano y enfermos). ....... 56 Tabla 7. Curva estándar. ................................................................................................. 57 Tabla 8. Curva estándar y formula. .................................................................................. 58 Tabla 9. Resultados obtenidos sin la formula (Blanco) y resultados obtenidos tras la aplicación del a formula (Azul). ........................................................................................ 58 Tabla 10. Valores determinados según patologías. ......................................................... 59 Tabla 11. Estado final del paciente. ................................................................................. 60 Tabla 12. Valores evaluados por raza.............................................................................. 61 Tabla 13. Valores de EO por género................................................................................ 61 Tabla 14. Valores de EO según la edad. ......................................................................... 62 Tabla 15. Comparación de resultados de pacientes sanos geriátricos y críticos. ............. 63

TABLA DE FIGURAS Figura 1. Vía de formación de los Isoprostanos ............................................................... 31 Figura 2. Formación del Ácido araquidónico. ................................................................... 33 Figura 3. Mapa de Tunja. ................................................................................................. 40 Figura 4. Realización del ECOP. ..................................................................................... 42 Figura 5. Toma de muestras por medio de cateterización vesical en hembras y machos. 43 Figura 6. Muestras refrigeradas. ...................................................................................... 44 Figura 7. Concentrado buffer……………………………………………………………………45 Figura 8. Agua desionizada. ............................................................................................ 45 Figura 9. Anticuerpo………………………………………………………………………………45 Figura 10. Diluyente muestra. .......................................................................................... 45 Figura 11. Conjugado. ..................................................................................................... 46 Figura 12. Solución substrato. ......................................................................................... 46 Figura 13. Descongelamiento de muestras. ..................................................................... 47 Figura 14. Acidificación de muestras. .............................................................................. 47 Figura 15. Preparación de series del 8-iso-PGF2α Standard, para la elaboración de la curva................................................................................................................................ 48 Figura 16. Adición de 100 μL del anticuerpo Anti-8-iso-PGF2α diluido a las pocetas. ...... 49 Figura 17. Lavado con solución Buffer para lavado. ........................................................ 49 Figura 18. Golpeado y lavado de placa para micropipeta. ............................................... 50 Figura 19. Mezcla de soluciones y trasferencia de la mezcla. .......................................... 50 Figura 20. Incubación en mezclador orbital...................................................................... 51 Figura 21. Adición de 100 μL de solución substrato a cada placa. ................................... 51 Figura 22. Solución para detener. .................................................................................... 52 Figura 23. Adición de solución para detener. ................................................................... 52 Figura 24. Ubicación de las placas sobre el lector de micriplaca. .................................... 53 Figura 25. Resultados obtenidos en el lector de microplaca. ........................................... 53

INTRODUCCIÓN El estrés oxidativo es el desequilibrio entre la producción de radicales libres de oxigeno (RLO) altamente reactivos y el mecanismo de limpieza o de bloqueo natural de estas sustancias (Flores 2005), un incremento en los RLO se relaciona con efectos perjudiciales en la salud de los seres vivos tales como procesos cancerígenos y en diferentes enfermedades (Ames, 1998, 2000; Córdova y Nava, 2000; De la cruz et al., 2006), así como también están implicados en la proliferación y crecimiento de células, apoptosis, inmunidad y defensa contra microorganismos patógenos (Glosh y Myers, 1998; Bae et al., 1997; Lee et al., 1998; De la cruz et al., 2006). Los isoprostanos (IsoPs) F2 son compuestos similares a las prostaglandinas que se producen en vivo mediante un mecanismo no enzimático de peroxidación del ácido araquidónico inducido por radicales libres (Morrow et al., 1994), se descubrieron por primera vez por Morrow et al., (1990) y se han considerado desde hace tiempo como marcadores de estrés oxidativo en enfermedades inflamatorias y degenerativas (Roberts y Morrow, 1997), estos permiten su medición en orina y sangre (Flores 2005; Griffiths et al., 2002; Fam y Morrow, 2003); actualmente se han detectado en todos los tejidos humanos y fluidos evaluados permitiendo la valoración de los efectos de diferentes enfermedades (Fam y Morrow, 2003; Flores 2005). En el presente estudio se determinó el comportamiento de las concentraciones de isoprostanos F2 en orina de pacientes caninos con diferentes enfermedades que ingresaron a la clínica veterinaria Zoomedica de Tunja sin tener en cuenta edad, sexo, ni raza, se tomaron muestras de orina por medio de sonda urinaria, estas fueron procesadas por medio del test de ELISA (OxiSelect™ kit ELISA 8-isoProstaglandina F2α); el estudio se comparó con la evolución del paciente, su estado final y valores obtenidos en un estudio realizado en forma paralela en pacientes sanos.

Asimismo, actualmente en Medicina Veterinaria se cuenta con diferentes ayudas paraclínicas de las cuales ninguna nos permite medir isoprostanos F2 y realizar un monitoreo del estrés oxidativo; por lo cual este estudio permite un primer acercamiento en la valoración objetiva de esta condición y su relación con diferentes patologías de frecuente presentación.

1. OBJETIVOS

1.1

OBJETIVO GENERAL

 Determinar los valores de isoprostanos F2 en orina de pacientes caninos

con diferentes patologías de la Clínica Veterinaria Zoomedica mediante la prueba de Snap ELISA.

1.2

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

 Comparar los resultados obtenidos con el estado final de cada paciente y a su vez con los resultados obtenidos en pacientes caninos sanos  Determinar la variación de los resultados obtenidos teniendo en cuenta las diferentes patologías que se presenten.  Determinar la variación de resultados por raza sexo y edades.

2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

2.1

CARACTERIZACIÓN DEL PROBLEMA

El EO es la sobrecarga oxidativa celular por exceso de ROS que es causada por un desequilibrio entre los mecanismos generadores de ROS y los sistemas antioxidantes defensivos. El metabolismo aerobio implica la reducción de ROS incluso en condiciones básales; las ROS atacan todo tipo de moléculas biológicas dando como consecuencia el origen de radicales libres (Flores, 2005). La utilización de los isoprostanos en la medicina tiene importantes implicaciones como marcador pronostico; encontrándose en la mayoría de los fluidos biológicos como el plasma, orina y tejidos, observándose niveles basales variados entre las especies y entre individuos dependiendo del grado de estrés oxidativo (Flores 2005; Griffiths et al., 2002; Fam y Morrow, 2003) Se necesitan pruebas objetivas, asequibles, poco invasivas, de resultados rápidos y fácilmente repetibles que permitan mejorar el proceso de toma de decisiones, la implementación de estrategias terapéuticas, el monitoreo y evolución de los estados de enfermedad y por ende el pronóstico. El EO es una condición que se ha descrito como perpetuadora y como factor agravante en la fisiopatología de diversas enfermedades, por tal motivo es necesario identificar y desarrollar herramientas que permitan al médico veterinario valorar y cuantificar de forma objetiva la magnitud del estrés oxidativo y de esta forma estimar las consecuencias que esta condición puede conllevar en la progresión de una determinada enfermedad. La valoración de las concentraciones de isoprostanos F2 alfa como indicadores del grado de estrés oxidativo ha sido ampliamente descrita en medicina humana (Fam y Morrow, 2003; Flores, 2005; González, 2005; Griffiths et al., 2002); sin

embargo esta determinación no se ha realizado en medicina veterinaria y por lo tanto no se ha probado su utilidad en la práctica clínica.

Pregunta de investigación.

¿Las concentraciones de F2 isoprostanos en orina se verán influenciadas por la presencia de enfermedades en los pacientes objeto de estudio?

3. JUSTIFICACIÓN

Los radicales libres de oxígeno causan daño oxidativo y este se ha visto implicado en el desarrollo y perpetuación de más de cien enfermedades diferentes, entre las que se encuentran distintos tipos de cáncer, enfermedades cardíacas y vasculares, diabetes y desórdenes neurovegetativos. Un radical libre es cualquier molécula que contiene uno o más electrones no apareados. En las células aeróbicas existen diversas vías que conducen a la producción de radicales libres derivados del oxígeno. Las fuentes principales son las enzimas asociadas al metabolismo del ácido araquidónico, como la cicloxigenasa, la lipoxigenasa y la citocromo P-450 (Céspedes y Sánchez, 2000). Un aumento de la peroxidación lipídica se ha involucrado en la patofisiología en humanos de enfermedades tan diversas como: arteriosclerosis, la diabetes o el Alzheimer (González, 2005), El estrés oxidativo desempeña un papel importante en la patofisiología del asma (Henricks et al., 2001) y se han cuantificado niveles elevados de isoprostanos en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (Practico et al.,, 1998a), enfermedad pulmonar intersticial (Montuschi et al., 1998), fibrosis quística (Collins et al., 1999;Montuschi et al., 2000), infarto de miocardio (Mallat et al., 1998), coronariopatías (Mehrabi et al., 1999; Van Kooten et al., 1997), hipercolesterolemia (Davi et al., 1997), preeclampsia (Barden et al., 1996; Staff et al., 1999) y la aterosclerosis (Practico et al., 1997; Practico et al., 1998a); Existe evidencia sobre la participación de los procesos de oxidación lipídica en la inflamación (Tsimihodimos et al.,, 2002). En diversas enfermedades inflamatorias como en la esclerosis sistémica (Montuschiet al., 1999a; Wood et al., 2000; Pratico et al., 1998a; Cracowski et al., 2001) los niveles de F2 isoprostanos se encuentran elevados al igual que en la esclerosis múltiple (Greco et al., 1999), y en las lesiones medulares, y alteraciones metabólicas como la diabetes tipo 1 y 2, o nefrológicas como la insuficiencia renal crónica (Cracowski et al., 2002). 22

En la medicina veterinaria la medición de isoprostanos como marcadores de estrés oxidativo en orina y otros fluidos no ha sido divulgada, ya que los estudios sobre este tema son muy escasos. Teniendo en cuenta que los numerosos reportes descritos en medicina humana demuestran la utilidad de estas pruebas dentro del panel de exámenes paraclínicos realizados a pacientes en diferentes condiciones de enfermedad; su evaluación e inclusión dentro del campo de la medicina de pequeños animales permitirá mejorar el proceso de diagnóstico y así mismo será un parámetro útil en la toma de decisiones desde el punto de vista terapéutico. El presente estudio, se desarrolló en la Clínica Veterinaria Zoomedica de la ciudad de Tunja, se llevó a cabo en pacientes caninos con diferentes patologías, de los cuales se obtuvieron muestras de orina tomadas por medio de cateterización vesical y se valoraron los niveles de F2 isoprostanos por medio del kit ELISA (OxiSelect™ kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2α); posteriormente se compararon los resultados obtenidos con la evolución y resultado final de cada paciente. El presente proyecto es de gran importancia en investigación por cuanto fomenta la implementación de nuevos estudios sobre el estrés oxidativo y resalta la importancia de la evaluación, monitoreo y control de esta condición en diferentes estados patológicos en pequeños animales.

4. MARCO DE REFERENCIA

4.1

ESTADO DEL ARTE

Recientemente se ha descrito una nueva familia de prostaglandinas F2 denominada F2 isoprostanos, producidos in vivo por la peroxidación de radicales libres del ácido araquidónico; estos compuestos pueden producir efectos patológicos o fisiopatológicos ya que tienen la capacidad de alterar el músculo liso y las funciones de las plaquetas; se han observado F2 isoprostanos elevados en cardiopatías, isquemia y diabetes (Cracowski et al., 2001). Desde su descripción inicial en 1990, el rápido desarrollo de métodos analíticos para la medición de isoprostanos ha permitido superar algunos de los riesgos de los métodos anteriores y más ampliamente utilizados en la evaluación del daño mediado por radicales libres (Greco, et al., 1999). Recientemente se ha establecido que las ciclooxigenasas (COXs) son los únicos responsables de la síntesis de prostaglandinas (PGs) in vivo; una característica estructural importante de las prostaglandinas H2 (PGH 2), formada por COX es la trans-configuración de las cadenas laterales con relación al anillo prostane. Los IsoPs se forman in vivo de los radicales libres, catalizada por la peroxidación del ácido araquidónico independiente de la COX; una diferencia importante entre estos compuestos y las PGs es que los IsoPs se forman a partir de endoperóxidos intermedios, la gran mayoría de los cuales contienen cadenas laterales que son cis con respecto al anillo prostane. Además, a diferencia de la formación de eicosanoides de la COX, los IsoPs se forman como mezclas racémicas, ya que se generan de forma no enzimática (Gao, et al., 2003). Los isoprostanos, se han convertido en "gold Standard" de los biomarcadores de estrés oxidativo in vivo en los últimos años; los IsoPs son los marcadores más 24

fiables de la peroxidación lipídica in vivo, la complejidad de la vía de los IsoPs se ha ampliado, proporcionando nuevos conocimientos sobre los mecanismos de la peroxidación lipídica in vivo y permiten a los investigadores explorar el papel del estrés oxidativo en la enfermedad humana (Musiek, et al., 2007). El estrés oxidativo se caracteriza por un desequilibrio entre el aumento de la exposición a los radicales libres y las defensas antioxidantes; es una característica primordial de muchas enfermedades agudas y crónicas; los F (2)-IsoPs son un grupo de 64 compuestos isómeros en la estructura de la ciclooxigenasa, derivada de la PGF (2alfa). La medición de F (2)-IsoPs es el método más fiable para evaluar el estado de estrés oxidativo in vivo, proporcionando una herramienta importante para explorar el papel del estrés oxidativo en diferentes patogénesis (Montuschi, et al., 1998; Montuschi, et al., 2000). La generación de productos reactivos de la peroxidación lipídica se cree que contribuyen a las especies reactivas del oxígeno (ROS) mediante neurotoxicidad. Los IsoPs, como las moléculas de prostaglandinas formadas in vivo a través de la oxidación mediada por ROS de ácido araquidónico, se ha demostrado su formación en mayores cantidades en los cerebros de pacientes con diversas enfermedades neurodegenerativas. Recientemente, se han identificado nuevas clases de IsoPs, conocido como A2-y J2-IsoPs o IsoPsciclopentenona, que son altamente reactivos, electrófilos y formas de aductos con tiol que contienen moléculas, incluyendo residuos de cisteína en las proteínas y glutatión (Musiek, et al., 2007). En la actualidad se encuentran marcadores no específicos utilizados para la evaluación de estrés oxidativo como el índice de peróxidos (PV), dienos conjugados (CD), sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS), que miden los productos finales de la degradación de biomoleculas oxidadas (oxiesteroles, ceto-proteínas, 8-oxodeoxyguanosina), cuya acumulación no está necesariamente relacionada con el aumento del estrés oxidativo (Vaya, 2008).

Los isoprostanos son compuestos similares a las prostaglandinas formados por peroxidación de radicales libres del ácido araquidónico esterificado en los fosfolípidos de membrana; son una clase nueva de marcadores específicos sensibles a la peroxidación de lípidos in vivo, sugiriendo que los niveles de isoprostanos se podrían utilizar como marcadores no invasivos para la determinación de estrés oxidativo (Miller et al., 2011).

4.2

MARCO TEÓRICO

4.2.1 Radicales libres de oxígeno Los RLO son moléculas que tienen uno o varios electrones no apareados en su última capa y alteran la reactividad del átomo o molécula haciéndolos más reactivos, lo que facilita que reaccionen con un elevado número de moléculas, oxidándolas y luego atacando su estructura; las formas parcialmente reducidas del oxígeno se denominan especies reactivas de oxigeno (ERO) ya que por lo general son más reactivas que la molécula de oxígeno en su estado natural (De la Cruz et al., 2006; Abelís, 2007; Flores, 2005). El hidrogeno (H) es el radical libre más simple ya que posee un protón y un electrón no apareados; la reacción en cadena de los radicales libres es iniciada al restar un H desde otra molécula (Flores, 2005). En los organismos aeróbicos el oxígeno (O2) es reducido a agua (H2O) al terminar la cadena respiratoria mitocondrial; permaneciendo unida la molécula de O 2 al complejo IV de la cadena respiratoria mitocondrial hasta haber aceptado 4 electrones y dos protones por acción de la citocromo oxidasa (ferrocitocromo c: oxigenoreductasa) (Abelís, 2007; Flores, 2005). Durante el avance por las diferentes fases de la cadena mitocondrial (complejos I II y/o III) hay perdida de electrones, especialmente en proteínas no hemo (hierrosulfuro), que genera reducción parcial del O2 al anión superóxido O2˙- que es un RLO (Flores, 2005) producido por macrófagos, neutrófilos, leucocitos, fibroblastos 26

y células del endotelio vascular; poco reactivo apto para oxidar grupos tioles y ácido ascórbico, participa en procesos de reperfusión tras procesos de isquemia (Abelís, 2007); este anión superoxido puede ser convertido a peróxido de oxigeno (H2O2) que no es un radical gracias a la suma de un segundo electrón; y la suma de un tercer electrón a el H2O2, produce la creación del radical hidroxilo (HO-); el cual es un RLO y una molécula que tiene gran reactividad química, siendo capaz de reaccionar con gran cantidad de sustancias orgánicas (Flores,2005; González, 2005). 4.2.2 Daño celular ocasionado por los RLO Uno de los mayores efectos del estrés oxidativo es la peroxidación lipídica que genera daño celular por el cambio de propiedades físico-químicas de membrana, alterando la permeabilidad y el control de la homeostasis iónica celular; en ocasiones causa la oxidación del grupo sulfidrilo de proteínas presentes en el trasporte iónico e inhibición de la síntesis de adenosintrifosfato (ATP); se ocasionaría necrosis o apoptosis celular ya que el estrés oxidativo amentaría la [Ca2+]i y activaría fosfolipasas y proteasas (Halliwell, et al., 1992; González, 2005; Li et al., 2000; Peiro et al., 2000; Thannickal y Fanburg, 2000). Los radicales de oxigeno actúan a nivel vascular de modo directo y a través de la liberación de mediadores vasoactivos (González, 2005). El O2- y el H2O2 tienen la capacidad de modular respuestas contráctiles y vasodilatadoras, estimulando la contracción por medio de movilización de depósitos de Ca++ (González, 2005; Touyz, 2000). Gran parte de los pasos del metabolismo del ácido araquidónico son acompañados por radicales libres lo que supone una retroalimentación positiva (González, 2005; Holtzman, 1991).

4.2.3 Defensas antioxidantes El metabolismo de aerobiosis es un proceso primordial para la formación de energía que está asociado a un proceso paradójico de generación de RLO que puede llegar a alterar la integridad celular si no son neutralizados con antioxidantes endógenos (Flores, 2005). Las células están provistas de una gran gama de enzimas antioxidantes al igual que de pequeñas moléculas antioxidantes derivadas principalmente de la ingesta de frutas y verduras (González, 2005); las defensas antioxidantes se dividen según su mecanismo de acción en enzimáticas y no enzimáticas (Tabla 1): 

Enzimáticas: son el mecanismo primario de defensa primordial frente a los radicales libres (González, 2005), tienen importancia y variación en situaciones de hipoxia (Pedraz, 1999); en la etapa final de gestación se genera un aumento en las enzimas antioxidantes fetales, como preparación al nacimiento (Radi, 1993); permanecen estables en el periodo de crecimiento, y con la edad se incrementa la actividad de estos sistemas enzimáticos, en condiciones de hipoxia aumenta la capacidad de activación lo que contribuye a desarrollar cierta tolerancia ante situaciones de estrés oxidativo alto (González, 2005); los barredores o scavengers enzimáticos como la superoxidodismutasa (SOD) (Flores, 2005) que se localiza en la mitocondria y el citosol, favorece la dismutación de radicales superoxido a hidroperóxido; la catalasa (CAT) (González, 2005) que elimina el peróxido de hidrógeno y se encuentra en los peroxisomas de varios tejidos (Flores, 2005); la glutatión peroxidasa (GPx), que transforma el hidroperoxido en agua y O2 (González, 2005); las enzimas GSH (glutatión reducido) reductasa,

dehidroascorbatoreductasa

tioreduxínreductasa

son

participes en la reducción de las formas de antioxidantes endógenos (González, 2005; Flores, 2005). 

No enzimáticas: las vitaminas liposoluble alfa tocoferol (E) y hidrosoluble ácido ascórbico (C) no presentan actividad enzimática pero cuentan con actividad antioxidante citosólica y extracelular y protegen contra la 28

peroxidación (Frei, 1994; González, 2005; Halliwell, 1994; Flores, 2005); al igual que los uratos y el glutatión, barredores de radicales lipofílicos como los carotenoides, flavonoides, tocoferoles y ubiquinol; la ceruloplasmina y los carotenos, barredores de radicales hidrofilitos como el ascorbato y el urato (González, 2005). Tabla 1. Radicales de oxígeno y su mecanismo natural de defensa antioxidante. Radicales libres de oxigeno O2˙-

Anión superóxido

OH˙

Radical hidroxil

ROO˙

Peróxido lipídico

NO˙

Óxido nítrico

NO2˙

Dióxido nítrico

ONOO-

Peroxinitrito

Mecanismo de defensa antioxidante Antioxidante enzimáticos SOD

Superóxido de dismutasa 2O2˙- + 2H+

CAT

Catalasa 2H2O2

GTP

No – Radicales

H2O2 + O2

O2 + H2O2

Glutatión peroxidasa 2GSH + H2O2

GSSG+ 2H2O

2GSH+ROOH

GSSG + ROH+ 2H2O

Antioxidantes no- Enzimáticos H2O2

Peróxido de hidrogeno

Vit A

HOCL

Ácido hipocloroso

Vit C

Ácido ascórbico

ONOO-

Peroxinitrito

Vit E

α – tocoferol

Oxigeno libre

β Caroteno Áciso Úrico Flavonoides Sulfidrílos

Fuente: Dhalla, et al., 2000; Flores, 2005. El punto negro en superíndice indica un electrón no apareado; la carga negativa indica el electrón ganado; GSH: glutatión reducido; GSSG: glutatión oxidado; el oxígeno libre es una molécula inestable debido a los dos electrones presentes en 29

su órbita externa que giran en dirección opuesta (Dhalla, et al., 2000; Flores, 2005). 4.2.4 Estrés oxidativo El estrés oxidativo es la inestabilidad entre el mecanismo de limpieza o de bloqueo natural de radicales libres y la producción de radicales libres de oxigeno (RLO) altamente reactivos, ya que los RLO tienen la capacidad de oxidar directamente el ácido desoxiribonucleico (DNA), proteínas y lípidos; se han asociado con la patogénesis de algunas patogénesis en enfermedades humanas como en la aterosclerosis, cáncer, Alzheimer o diabetes (Sies, 1991). 4.2.5 Daño oxidativo celular El metabolismo aerobio genera la obtención de especies reactivas de oxígeno, que atacan moléculas biológicas como sustratos lipídicos, carbohidratos, proteínas y ADN, induciendo su oxidación, generando nuevos radicales libres que tiene la capacidad de reaccionar con otras moléculas por lo que en las células hay un constante requerimiento de antioxidantes para la inactivación de estas especies (Abilés, 2007; Papas, 1996). 4.2.6 Caracterización del estrés oxidative El aumento en la generación de RLO, puede evidenciar simplemente mecanismos homeostáticos o cambios que no son tóxicos en las células y la capacidad para revelar un elevado EO previo a, o concomitante con, lesión celular que es consistente con el papel de estas sustancias en el daño. La producción de los RLO podría generar cambios en macromoléculas como lípidos, proteínas o el DNA (Flores, 2005; Meagher y Fitzgerald, 2000). La oxidación de lipoproteínas en especial el colesterol-LDL, ejerce un papel patogénico en la aterosclerosis; la medición de productos de la oxidación en tejidos, plasma y orina, ha sido utilizada en estudios clínicos para reflejar la peroxidación lipídica in vivo. Los peróxidos lipídicos son compuestos inestables que se degradan en una variedad de productos como alcanos de cadena corta y aldehídos, que se han utilizado en estudios clínicos como en la medición de 30

aldehídos citotóxicos, de dienos conjugados, sustancias que reaccionan con el ácido tiobarbitúrico (TBARS) e isoprostanos (Flores, 2005). 4.2.7 Isoprostanos Los isoprostanos fueron descubiertos por primera vez en la fisiología y patofisiología humana por Morrow et al., en 1990, circulan en el plasma y se excretan en orina (Practico et al., 1995) y se han considerado desde entonces como marcadores de estrés oxidativo; se forman de forma abundante in vivo por medio de un mecanismo no enzimático de peroxidación (Figura 1) del ácido araquidónico (Roberts y Morrow, 1997; Morrow et al., 1999) que es un ácido graso poli-insaturado ampliamente distribuido en el organismo (Flores, 2005), inducido por radicales libres independientemente de la enzima ciclooxigenasa (COX) (Roberts y Morrow, 1997; Morrow et al., 1999). Figura 1. Vía de formación de los Isoprostanos

Fuente: González, 2005 31

Los isoprostanos son originados a partir de moléculas libres de ácido araquidónico (Morrow et al., 1990a, 1990b; Gonzalez, 2005) al igual que a partir de la esterificación de lípidos de membrana (Morrow et al., 1994; González, 2005). La prostaglandina F2α formada por ciclooxigenasas (COX) genera como compuestos resultantes isómeros por lo que se les denomino F2 isoprostanos; son clasificados en el sistema de nomenclatura IsoPs aprobada por el comité de nomenclatura eicosanoide y ratificada por la Joint

Comission on Biochemical

Nomenclature (JCBN) of the International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Flores, 2005; Taber et al., 1997). 4.2.8 Diferencias entre IsoPs y PGs derivados de la COX Los IsoPs contienen cadenas laterales que son predominantemente orientadas Cis2 al anillo de propano; están formados in situ esterificados a los fosfolípidos y son subsecuentemente liberados por fosfolipasas (Flores, 2005; Liu et al.,, 1999; Pratico 1999). Las PGs tienen únicamente cadenas laterales con orientación Trans 1; se generan solamente a partir del ácido araquidónico libre (Flores, 2005; Liu et al.,, 1999; Pratico 1999). 4.2.9 Mecanismo de formación de los F2 IsoPs Se basa en los principios químicos propuestos por Pyor y Porter de la generación de intermediarios biciclico-endoperóxidos producidos por la peroxidación de otros ácidos grasos poli-insaturados (Flores, 2005); el ácido araquidónico (Figura 2) inicial sufre una abstracción de un átomo de hidrógeno bis-alílico para producir un radical araquidonil, la adición posterior de una molécula de oxígeno a este radical produce un radical peroxil; dependiendo del sitio de la abstracción y la inserción de la molécula de oxígeno, se forman 4 diferentes isómeros de radical peroxil.

Figura 2. Formación del Ácido araquidónico.

Fuente: Roberts y Morrow 2000. Luego estos radicales sufren endociclización y otra molecula de oxigeno se añade para formar compuestos similares a las PGG2 (regio-isómeros-endoperóxidos); estos intermediarios son entonces reducidos a IsoPs-F2, formándose cuatroregioisómeros que se denominan como serie 5, 12, 8 o 15 dependiendo del átomo de carbono al cual la cadena hidroxil está unida. Cada uno de los 4 regio-isómeros puede teóricamente estar formado de 8 diastereo-isómeros racémicos; finalmente llegando a un total de 64 diferentes compuestos que pueden ser originados por este proceso (Flores 2005; Porter y Funk, 1975; Pryor et al., 1976). 4.2.10 F2 IsoPs como marcadores de estrés oxidativo in vivo En el estudio “Biomarkers of Oxidative Stress Study” (BOSS) financiado por el National Institute of Health, demostró en ratas que los lsoPs son un buen índice de 33

injuria oxidativa, permitiendo la cuantificación exacta de injuria oxidativa in vivo (Kadiiska et al., 2005a; 2005b; Flores 2005). La cuantificación del estrés oxidativo es de gran importancia para facilitar la comprensión de numerosas enfermedades y sus mecanismos fisiológicos y fisiopatológicos (Flores, 2005; González 2005); ya que los isoprosanos son el resultado de la peroxidación lipídica con una gran estabilidad química. Se han llevado a cabo mediciones en orina (Reilly et al., 1996), plasma (Morrow et al., 1995), líquido céfalo-raquídeo (Montine et al., 1999), condensación espiratoria (Montuschi et al., 1999a; 1999b), lavado broncoalveolar (Montuschi et al., 1998) o de forma esterificada en membranas tisulares o en partículas lipídicas circulantes (Morrow et al., 1995) y se ha utilizado favorablemente como herramienta para la evaluación de la terapia antioxidante (Davi et al., 1997), tomando en cuenta que otras técnicas son costosas y dificultosas (González, 2005). 4.2.11 Fisiología Los descubrimientos de IsoPs en tejidos y fluidos biológicos en humanos (Tabla 2; Tabla 3) y en animales sanos demuestran que se genera una peroxidación lipídica que es eliminada por las defensas antioxidantes incompletamente (González, 2005); las concentraciones de IsoPs varían con la edad y el sexo en humanos (Ide et al., 2002; Helmersson et al., 2002); en ratas varia con la edad en concentraciones plasmáticas de F2 IsoPs y los niveles de F2 IsoPs esterificados en lípidos (Roberts et al., 2001); estos descubrimientos evidencian la posibilidad de que el aumento del daño oxidativo en moléculas biológicas sería una causa natural de envejecimiento (Feillet-Coudray et al., 1999; Rokach et al., 1997). Aumentos en la peroxidación lipídica se ven implicados en enfermedades como la arteriosclerosis, diabetes o Alzheimer; teniendo en cuenta a los isoprostanos como marcadores químicos estables y fácilmente mensurables de la peroxidación lipídica (González, 2005). En el sistema respiratorio los rangos de isoprostanos se ven reflejados en aumento en sus niveles en patologías como enfermedad pulmonar obstructiva 34

crónica (González, 2005; Practico et al., 1998a), fibrosis quística (Collins et al., 1999; González, 2005; Montuschi et al., 2000), fallo respiratorio grave (Goil et al., 1998; González, 2005), alergenos (Dworski et al., 2000; González, 2005; Montuschi et al., 1999b). A nivel cardiovascular las concentraciones de isoprostanos se ven aumentadas en algunas patologías como infarto al miocardio (González, 2005; Mallat et al., 1998), coronariopatías (Gonzáles 2005; Mehrabi et al., 1999; Van Kooten et al., 1997); los 8-iso PGF2α son potentes vasoconstrictores e inducen la mitogénesis en las células musculares lisas vasculares (González, 2005; Roberts y Morrow, 1997). En la inflamación se ve reflejada la participación de procesos de oxidación lipídica (González, 2005; Tsimihodimos et al., 2002) al igual que niveles altos de F2 isoprostanos (González, 2005). En patologías neurológicas los niveles de isoprostanos son elevados como en la esclerosis múltiple (González, 2005; Greco et al., 1999) o en lesiones medulares, nefrológicas como la insuficiencia renal crónica o metabólicas como la diabetes tipo 1 y 2 (Cracowsky et al., 2002; González, 2005). Tabla 2. Estados fisiopatológicos en los que se ha tomado a los F2 isoprostanos como marcadores en humanos. Niveles de isoprostanos F2 Área de studio

Aumentados

Invariables

Metabolismo lipídica

Hipercolesterolemia familiar homocigota y heterocigota.

Hipercolesterolemia tipo IIa (niños)

Diabetes

Diabetes tipo 1 y 2

Diabetes tipo 1 con excreción de albúmina urinaria normal

Hiperhomocistinemia

Homocistinuriahomocigota e hiperhomocistinemia moderada

Niveles de isoprostanos F2 Área de studio

Aumentados

Invariables

Enfermedad cardiovascular

Fallocardiaco, aterosclerosis, ruptura de aneurisma abdominal aórtico, infarto miocárdico, angioplastia coronaria, angina inestable, bypasscardiopulmonar

Enfermedad coronaria estable, test de esfuerzo positivo, pacientes sintomáticos vs asintomáticos con estenosis carotídea

Enfermedad sistémica e inflamatoria

Esclerosis sistémica (escleroderma), lupus eritematoso sistémico, síndrome anticuerpo antifosfolípido, enfermedad inflamatoria reumática, rabdomiolisis.

Síndrome de Raynaud

Patología intestinal y hepática

Cálculos biliares, pancreatitis, cirrosis hepática, Enf. De Cronh

Patología pulmonar

Fibrosis quística, asma, Enf. Pulmonar Obstructiva Crónica, SDRA, fallo respiratorio (aspirados traqueales en niños), enfermedad pulmonar intersticial, HAP.

Patología neurológica

Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad de Huntington, Enfermedad de CreutzfeldtJakob, Síndrome Down, daño de médula espinal.

Enfermedad de Alzheimer, Enfermedad De Huntington, infarto agudo isquémico, migraña.

Enfermedad nefrológica

Hemodiálisis

Síndrome nefrótico, trasplante renal.

Patología obstétrica

Pre-eclampsia, distrés fetal y vuelta de cordón prieta.

Pre-eclampsia.

Fuente: González, 2005.

4.2.12 Efectos vasculares de los IsoPs Los isoprostanos generan un efecto de vasoconstricción al igual que una relajación del músculo liso vascular y estos cambian de acuerdo al compuesto, el tipo de vaso y la especie (González, 2005). 4.2.13 Vasos sistémicos En vasos como la arteria aorta, carótida, cerebrales, piales, coronarias, retinianas, renales y pulmonares se observan efectos constrictores por parte de la 8-iso PGF2α (Tabla 3); observándose también en vasos linfáticos, útero y tracto gastrointestinal (Cracowskiet al., 2002; González, 2005). Tabla 3. Isoprostanos más frecuentes estudiados in vivo en humanos y animales. Autor

Año

Vaso, órgano y especie

Efectos vasculares

Isoprostanos estudiados

Morrow

1990

Vasos renales rata

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Banerjee

1992

Vasos pulmonares conejo

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Takahashi

1992

Arterias Glomerulares rata

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Fukunaga

1993

Vasos renales rata

Vasoconstricción

8-iso PGE

Kang

1993

Vasos renales rata

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Crankshaw

1995

Miometrio humano

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Mohler

1996

Carótida cerdo

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Kawikova

1996

Vía aérea, Cobayo

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Jourdan

1997

Arteria pulmonar rata

Vasoconstricción Vasorelajación

8-iso PGF2α

Wagner

1997

Anillos aórticos pulmonares de rata

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

1997

Corazón aislado cobayo

Vasoconstricción

8-iso PGF2α, 8iso PGE2

John

1997

Arteria pulmonar rata

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Hoffman

1997

Arteriolas piales rata

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Möbert

Autor

Año

Vaso, órgano y especie

Efectos vasculares

Isoprostanos estudiados

Truog

1997

Vasos pulmonares cerdo

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Marley

1997

Vena porta rata

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Lahaie

1998

Vasos retininianos lechones

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Mobert

1998

Coronarias cobayo

Vasoconstricción

8-iso PGF2a

1998

Aorta rata

Kromer

1996, 1999

Coronaria vaca,cerdo,oveja adultos

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Wilson

1999

Arteria coronaria cerdo

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Sametz

1999, 2000

Arteriolas oreja conejo

Vasoconstricción

8-iso PGE2, 8iso PGF2α

Audoly

2000

Ratas enteras

Vasoconstricción

8-iso PGE2, 8iso PGF2α

Hou

2000

Microvasos inmaduros periventriculares cerdo

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Oliveira

2000

Art. Umbilical humana

Vasoconstricción

8-iso PGF2α, 8iso PGE2

Gardan

2000

Vena safena humana

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

Cracowski

2000

Articulación mamaria interna humana

Vasoconstricción

8-iso PGF2α

2000

Vasos pulmonares humanos y caninos

Vasorelajación

8-iso PGE1, 8iso PGE2, 8-iso PGF1α , 8-iso PGF2α, 8-iso PGF2β

2001

Vasos pulmonares humanos y caninos

Vasoconstricción

8-iso PGE1, 8iso PGE2, 8-iso PGF1α, 8-iso PGF3β, 8-iso PGF1β, 8-iso PGF2α, 8-iso PGF2β

2002

Vasos pulmonares cerdo adulto

Vasoconstricción

8-iso PGE1, 8iso PGE2, 8-iso

Janssen

PGF1α, 8-iso PGF2α, 8-iso PGF2β. Zhang

Belik

2003

Coronaria cerdo adulto

Vasorelajación

8-iso PGF2α, 8iso PGE1, 8-iso PGF2β.

2003, 2004

Arteria pulmonar ratas reciénnacidas

Vasorelajación

8-iso PGF2α

Fuente: González, 2005.

5. Marco geográfico Figura 3. Mapa de Tunja.

Fuente: Plan de ordenamiento territorial 2012. Tunja (Figura 3) es la capital del departamento de Boyacá con una temperatura de 14° C, se encuentra aproximadamente a 5 grados, 32 minutos y 7 segundos de longitud al oeste de Greenwich es de 73 grados, 22 y 04 segundos, las alturas oscilan entre 2700 y 3150 msnm, con una extensión de 121.4 Km2, pertenece a la unidad morfológica del Altiplano Cundiboyacense en la Cordillera Oriental de los Andes. El estudio se realizó en la Clínica Veterinaria Zoomedica ubicada en el centro histórico de la ciudad de Tunja Transversal 11 número 23 – 54 parque Santander la cual cuenta con servicios de urgencias 24 horas, consultas, cirugía, hospitalización,

asistencia

reproductiva

caninos

felinos,

consulta

especializada: neurología, dermatología, fauna silvestre, laboratorio clínico, patología, rayos X, ecografía, vacunas, pet shop, guardería, peluquería teniendo

horarios de atenci贸n de lunes a s谩bado de 8 am a 7 pm jornada continua, domingos y festivos de 8 am a 1 pm.

6. DISEÑO METODOLÓGICO Este estudio es exploratorio transversal, ya que sirve para familiarizarse con fenómenos desconocidos, por lo que el estudio es sobre la investigación de un derivado del ácido araquidonico de las cuales no se conoce el valor en pacientes veterinarios con diferentes patologías. El desarrollo del trabajo de investigación tuvo una duración de 6 meses comprendido del 18 de noviembre del 2012 al 30 de abril del 2013 y se dividió en 3 etapas; la primera identificación de la población y toma de muestras previo consentimiento informado de los propietarios; segunda etapa procesamiento de muestras y tercera etapa lectura, interpretación y análisis de resultados A los 28 pacientes objeto de estudio se les realizo un examen físico completo (Figura 4) y se tuvo en cuenta su historial clínico previo; y el diagnostico de diferentes patologías en cada uno de ellos determinando así su inclusión en el estudio, la muestra se obtuvo por cateterización vesical con sonda urinaria esteril y se descartó la primera orina proveniente de la sonda y se tomó una muestra mayor a un mililitro. Figura 4. Realización del ECOP.

A la Clínica Veterinaria Zoomedica ingresan 35 consultantes al mes de los cuales se escogieron 28 pacientes en el transcurso del estudio, cuyas historias clínicas reportaban diferentes enfermedades; sin tener en cuenta edad raza o sexo; con previo consentimiento informado de los propietarios se procedió a realizar la toma de la muestra por medio de sonda uretral estéril (Figura 5) con previa desinfección de la zona perineal con alcohol y yodo, donde fueron tomadas 28 muestras de orina, y almacenadas en frascos aptos para orina. Figura 5. Toma de muestras por medio de cateterización vesical en hembras y machos.

Las muestras fueron recolectadas en recipientes debidamente identificados, sellados

embalados,

procediendo

inmediatamente

almacenarlas

refrigeración a una temperatura no mayor a 4 ºC hasta el momento de ser procesadas (Figura 6).

Figura 6. Muestras refrigeradas.

El almacenamiento de muestras a temperatura acorde fue realizado en el Laboratorio Veterinario Microzoo y la implementación, capacitación, utilización, montaje y lectura de resultados se realizó en el laboratorio de microbiología de la Secretaria de Salud de Boyacá. Al momento de la toma de muestras se tomaron 36 muestras, eligiendo únicamente 28, las que tenían mayor contenido, ya que el kit obliga una determinada cantidad de muestras y de orina por muestra. La preparación de los reagentes se efectuó en base al inserto adjunto al kit; iniciando con la preparación del 1X Buffer para lavado, diluyendo el concentrado buffer (Figura 7) para lavado 10X hasta 1X con agua desionizada (Figura 8), agitando hasta la homogenización.

Figura 7. Concentrado buffer.

Figura 8. Agua desionizada.

La dilución del anticuerpo Anti-8-iso-PGF2α se realiza inmediatamente antes de usarlo diluyendo el Anticuerpo Anti-8-iso-PGF2α 1:1000 con el diluyente muestra (Figura 9 y 10).

Figura 9. Anticuerpo.

Figura 10. Diluyente muestra.

El conjugado 8-iso-PGF2α-HRP se prepara inmediatamente antes de usarlo diluyendo el conjugado (Figura 11) 1:80 con el diluyente muestra (Figura 10) preparando suficiente conjugado para todas las pocetas del kit.

Figura 11. Conjugado.

Al momento de la preparaci贸n de la soluci贸n substrato (Figura 12) se debe atemperar a temperatura ambiente.

Figura 12. Soluci贸n substrato.

A todas las muestras recolectadas se les somete a descongelamiento antes de procesarlas hasta alcanzar la temperatura ambiente (Figura 13).

Figura 13. Descongelamiento de muestras.

Antes de realizar el ELISA se efectúa el proceso de hidrólisis acida de las muestras rompiendo así las uniones que mantienen unidos los lípidos y los no lípidos, acidificando la orina a un ph 3, adicionando 100 μL de HCl 1N a 1 mL de muestra de orina, diluyéndola posteriormente en pbs o en diluyente muestra a razón de 1:4 a 1:8 (Figura 14). Figura 14. Acidificación de muestras.

La preparación del estándar fresco se efectúa diluyendo el estándar 8-iso-PGF2α desde 200μg/mL hasta 0.2 μg/mL en el diluyente muestra para una dilución final 1:1000; adicionando del tubo reserva 5 μL de 8-iso-PGF2α Standard a 4.995 mL de diluyente muestra; se preparan series del 8-iso-PGF2α Standard restante de acuerdo a la siguiente tabla (Tabla 4): Tabla 4. Preparación de la curva 8-iso-PGF2α Standard. Tubos estándar 1 2 3 4 5 6 7 8

8-iso-PGF2α Standard (μL) 5 μL of Standard Stock 250 μL of Tube #1 250 μL of Tube #2 250 μL of Tube #3 250 μL of Tube #4 250 μL of Tube #5 250 μL of Tube #6 0 μL

Diluyente muestra (μL) 4995 μL 750 μL 750 μL 750 μL 750 μL 750 μL 750 μL 200 μL

8-iso-PGF2α Standard (pg/mL) 200,000 50,000 12,500 3,125 781 195 49 0

Figura 15. Preparación de series del 8-iso-PGF2α Standard, para la elaboración de la curva.

Posteriormente a la realización de la curva se procede a la adición de 100 μL del anticuerpo Anti-8-iso-PGF2α diluido (Figura 16) a la placa cubierta de anticuerpo cabra anti-conejo y se incuba 1 hora a 25 °C en un mezclador orbital (Figura 17). 48

Figura 16. Adición de 100 μL del anticuerpo Anti-8-iso-PGF2α diluido a las pocetas.

Se remueve la solución anticuerpo de las pocetas y se lavan 5 veces con 300 μL de solución buffer para lavado 1X en cada una de las posetas (Figura 17); en el último lavado se golpea suavemente la placa de micropipeta sobre trozos de papel absorbente removiendo de esta manera el exceso de solución para lavado (Figura 18). Figura 17. Lavado con solución Buffer para lavado.

Figura 18. Golpeado y lavado de placa para micropipeta.

Luego del lavado riguroso esencial para remover el ácido presente en el anticuerpo, se combinan 55 μL del 8-iso-PGF2α de la muestra y 55 μL del 8-isoPGF2α-HRP conjugado en un microtubo y se mezcla de forma adecuada manualmente, tras la mezcla se transfieren 100 μL de la solución combinada para cada poseta(Figura 19); inmediatamente después se incuba a 25ºC sobre un mezclador orbital (Figura 20). Figura 19. Mezcla de soluciones y trasferencia de la mezcla.

Figura 20. Incubación en mezclador orbital.

Tras la incubación es removida la solución combinada de las posetas y son lavadas 5 veces con 300 μL de buffer para lavado 1X por poceta (Figura 17), tras el último lavado se vacían las posetas y se golpea la placa de micropipeta sobre papel absorbente removiendo así el exceso de solución de lavado (Figura 18). Se procede a la adición de 100 μL de solución substrato a cada placa (Figura 21) y es incubado a temperatura ambiente durante 30 minutos en un mezclador orbital (Figura 20). Figura 21. Adición de 100 μL de solución substrato a cada placa.

La reacción enzimática que se produce es detenida adicionando a cada poceta 100 μL de solución para detener; la lectura se hace inmediatamente ya que el color se desvanece con el tiempo (Figura 22, 23). Figura 22. Solución para detener.

Figura 23. Adición de solución para detener.

Sobre un lector de microplaca se lee la absorbancia de cada placa utilizando 450nm como longitud de onda primaria. Figura 24. Ubicaci贸n de las placas sobre el lector de micriplaca.

Luego del procesamiento en el lector de microplaca, se arrojaron los siguientes resultados: Figura 25. Resultados obtenidos en el lector de microplaca.

6.1

DISEÑO ESTADÍSTICO

Para la selección y valoración de los datos se elaboró una tabla para consignación de datos (Tabla 5) referentes al número en los resultados, nombre del paciente, patología de cada paciente, edad, raza, sexo y estado final que a su vez se divide en favorable, desfavorable y estable. Tabla 5. Consignación de datos. Numero en los resultados

Nombre del paciente

Patología

Estado final Favorable

Desfavorable

Edad

Raza

Sexo

Estable

1-28

N.N

Pacientes sanos

29-56

N.N

Pacientes geriátricos

Merlín

Hipotiroidismo

4 años

Mestizo

Mao

Cardiópata

9 años

Mestizo

14 años

F. Poodle

12 años

Mestizo

7 años

Labrador

1 año

Mestizo

3 años

Mestizo

Fila Brasilero

Mestizo

Espondiloartrosis 59

Conito

TVT

Copito

Cardiópata 4

Nacho

Dificultad respiratoria

Ruptura ligamento cruzado MPs 62

Scoby

Politraumatismo

Chalo

Claudicacion MPI

X X

Fractura de cadera 64

Simón

Rinti

Enfermedad viral

meses

Arritmia cardiaca

5 años

Numero en los resultados 66

Nombre del paciente

Niño

Patología

Estado final Favorable

Desfavorable

Cardiópata

Edad

Raza

Sexo

5 años

Mestizo

13 años

Pinscher

4 años

Akita

8 años

Cruza

Estable X

Masa a nivel de xifoides 67

Beethove n

Renal

Hachi

Politraumatismo

Ramón

Enfermedad respiratoria (Rinitis)

Cico

Dermatitis alérgica por pulga

5 años

Mestizo

Chagui

Dermatitis alérgica por pulga

6 años

Mestizo

Yaro

Urolitiasis

1 año

Cruza

Tabata

TVT

3 años

F. Poodle

Piero

Hernia discal

3 años

Terranova

Katy

Hipotiroidismo

7 años

Golden R.

Dulce

Sindrome vestibular

2 años

Mestizo

Fito

Brucella

6 años

Pit Bull

Nacho

Hipotiroidismo

8 años

Beagle

María Camila

Carcinoma mamario

7 años

Mestizo

Infección del tracto urinario 80

Spencer

Hernia discal

8 años

Boxer

Niña

Brucella

10 años

Mestizo

Hernia discal

Numero en los resultados

Nombre del paciente

Patología

Estado final Favorable

Líder

Edad

Raza

Sexo

8 años

Rottweiler

11 años

Labrador

5 años

F. Poodle

Desfavorable

Disco espondilitis

Estable

Erlichia 83

Chagui

Disco espondilitis

Sisi

TVT

Para el análisis y tabulación de la información obtenida de cada uno de los pacientes motivo de estudio se creó una base de datos utilizando el programa Microsoft Excel 2010. Luego de haber terminado la recopilación de muestras e información en la base de datos se realizó el análisis estadístico. 7. RESULTADOS. Tabla 6. Numeración de muestras de todo el estudio (Geriátrico, sano y enfermos). A

Estándar

Diluyente de muestras

0,604 8

0,459 0,553 16 24

0,643 Diluyente de muestras

0,063

0,605

0,527

0,559 0,479 0,486 0,488 0,407 0,465 0,519 0,414 0,461

0,087 B

Estándar

3 0,096 D

Estándar

4 0,177

0,584

0,552

0,535

0,538

5 15

6 31

7 39

8 47

9 55

10 63

11 71

12 79

0,59 0,525 0,504 0,516 0,353 0,414 0,476 32 40 48 56 64 72 80

0,541 0,491 0,504 0,525 0,467 0,447 0,435 0,299 0,192 18

0,511 0,312 0,423 0,346 0,398 0,287

0,12 0,336 0,235

Estándar

0,452

0,412

0,557

0,415

0,534

0,355

0,545

0,553

0,473 0,377 0,308 0,345 0,303 0,245 0,155 0,139

0,39

5 0,366 F

Estándar

6 0,546 G

Estándar

7 0,58 H

Estándar

8 0,605

0,508 0,499 0,441 0,219 0,346 0,291 0,317 0,237 0,269 21

0,511 0,438 0,394 0,454 0,449 0,365 0,363 0,359

0,13

0,495 0,433

0,46 0,387 0,239 0,205 0,421 0,236 0,622

De las 86 muestras numeradas se dividieron en 4 grupos siendo los primeros 28 pacientes sanos, del 29 al 56 pacientes con diferentes patologías, del 57 al 84 geriátricos y los dos finales 85-86 se descartaron. Los resultados que arroja el lector de microplaca no se pueden graficar ya que son inversos, paro lo cual el fabricante del kit de Elisa utilizado en el estudio provee dos curvas estándar y una fórmula para la interpretación exacta de los resultados (Tabla 7; Tabla 8). Tabla 7. Curva estándar.

Standard Curve 0,7 OD 450nm

0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1

100

1.000 pg/ml

10.000 100.000 1.000.000

Tabla 8. Curva estĂĄndar y formula.

Standard Curve 0,6 y = -0,111ln(x) + 1,1123 RÂ˛ = 0,9743

OD 450nm

0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1

100

1.000 pg/ml

10.000

100.000

Los datos en color naranja corresponden a los datos medidos por absorbancia en el lector de microplaca y los graficados de color rojo son los arrojados por Microsoft Excel al implementar la formula (Tabla 9): Tabla 9. Resultados obtenidos sin la formula (Blanco) y resultados obtenidos tras la aplicaciĂłn del a formula (Azul). 0,447 0,287

400,89 1694,49

0,245

2473,81

0,291

1634,51

0,365

839,19

0,205

3547,06

0,353

934,99

0,519

209,57

0,435

446,66

0,12

7628,45

0,155

5565,40

0,317

1293,19

0,363

854,44

0,421

506,70

0,414

539,69

0,414

539,69

0,299

1520,85

0,336

1089,74

0,139

6428,32

0,237

2658,68

0,359

885,80

0,236

2682,74

0,476

308,72

0,461

353,39

0,192

3987,78

0,235

2707,02

0,39

669,95

0,269

1992,80

Tabla 10. Valores determinados según patologías.

Valores determinados según patologías 9000

Estrés oxidativo

8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000

Enfermedad viral

Infección urinaria

Carcinoma mamario

Urolitiasis

Dificultad respiratoria

Dermatitis alérgica por pulga

Patología

Fractura de cadera

Cojera MPi

Neurológico (posteriores)

TVT

Disco espondilitis

Erlichia

Enfermedad vestibular

Politraumatismo

Brucella

Hernia discal

Renal

Hipotiroidismo

Masa a nivel de xifoides

Cardiópata

Ruptura ligamento cruzado…

1000

En la tabla 10 se observa que las cardiopatías presentan un alto nivel de estrés oxidativo; se identifica que las patologías virales, infecciosas pulmonares y 59

urinarias presentan un bajo nivel de estrés oxidativo a excepción de la Brucella que marca un nivel medio-alto de EO; las patologías asociadas a hueso y musculo varían en niveles al igual que las masas tumorales que van desde niveles altos a muy bajos; las patologías hormonales toman un nivel alto de EO al igual que las que comprometen a riñón. Tabla 11. Estado final del paciente.

Estado final de pacientes con diferentes patologias 9000,00 7628,45

8000,00

EO pg/ml

7000,00

6428,32 5565,40

6000,00 5000,00 4000,00 3000,00 2000,00 1000,00

308,72

209,57

400,89

0,00 Favorable

Desfaviorable Estados

Estable

Para la recolección de estos datos fue necesaria la visita por segunda vez de cada uno de los pacientes, permitiendo la realización de un ECOP y con él la determinación de su estado final; estableciendo que en pacientes estables los niveles de EO se encuentran aumentados, en los favorables el EO se encuentra ligeramente aumentado y los desfavorables muestran un EO disminuido (Tabla 11).

Tabla 12. Valores evaluados por raza.

Fila Brasilero

Boxer

Labrador

Pit Bull

Terranova

Akita

F. Poodle

Beagle

Rottweiler

Pinscher

Golden R.

9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Mestizo

EO pg/ml

Valores determinados por Raza

Razas

Los niveles de isoprostanos se observan muy elevados en razas como Mestizos, Golden Retriever y Pinscher; el Rottweiler, Beagle y French Poodle denotan una concentración de EO media y los Akita, Terranova, Pitbull y Labrador presentan una relación media baja de EO muy similar comparada con el Bóxer y Fila Brasilero que presentan un nivel de EO poco marcado (Tabla 12). Tabla 13. Valores de EO por género.

E O pg/ml

Valor determinado segun sexo 9000,00 8000,00 7000,00 6000,00 5000,00 4000,00 3000,00 2000,00 1000,00 0,00

7628.45 6428.32

308,72

209,57

Hembra

Macho Género

En la figura 13 se observa que las hembras presentan niveles más bajos de EO que los machos, sin embargo debe tenerse en cuenta que el número de machos sobrepasaba al de hembras, lo cual genera un sesgo en la interpretación del EO respecto al género. Tabla 14. Valores de EO según la edad.

14 años

13 años

12 años

11 años

10 años

9 años

8 años

7 años

6 años

5 años

4 años

3 años

2 años

1 año

9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 5 meses

EO pg/ml

Valor determinado por edades

Edades: Meses y años

Al realizar la valoración de datos por edad varió desde los 5 meses hasta los 14 años arrojando resultados como los marcados niveles de EO en pacientes de 5, 7, 10 y 13 años; niveles medios de EO en pacientes de 1,2,3,4,8,9,12,14 años y valores disminuidos en pacientes de 5 meses, 6 y 11 años de edad.

Tabla 15. Comparación de resultados de pacientes sanos geriátricos y críticos.

100000 Curva estandar

10000 Sanos (1 - 7 años)

1000

Geriartricos (> 7 años)

100

Patológicos Critico

10 1

100

1000

10000

100000

1000000

[8-isoprostane] (pg/mL)

La tabla15 muestra que los pacientes sanos se encuentran en los niveles más bajos de EO, los geriátricos en un punto medio y los pacientes enfermos en la parte más alta, lo que demuestra que a mayor injuria sobre el organismo los niveles de isoprostanos y de EO se incrementan.

8. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

En el presente estudio se encontraron concentraciones elevadas de f2 isoprostanos en orina de pacientes con cardiopatías; lo cual se relaciona con un EO aumentado; concordando con los reportes en Medicina humana en los que se evidencian niveles elevados de los F2 isoprostanos en pacientes cardiópatas y en estados isquémicos y así mismo en diabetes (Cracowski et al., 2000). Los isoprostanos son la “gold estándar” dentro de los biomarcadores en la valoración del estrés oxidativo in vivo de acuerdo a lo afirmado por Musiek, et al., 2005; y esta condición juega un papel importante en la génesis y perpetuación de diferentes patologías; este aspecto se corroboro con los resultados obtenidos en este estudio en los cuales se evidencia que las concentraciones de F2 isoprostanos en orina se alteran de forma significativa en pacientes enfermos. . Según Montuschi, et al., 2007 el estrés oxidativo se caracteriza por un desequilibrio entre el aumento de la exposición a los radicales libres y las defensas antioxidantes, siendo esta condición una característica primordial de muchas enfermedades agudas y crónicas; observándose esta misma tendencia en los pacientes de este estudio; en enfermedades crónicas como cardiopatías, hipotiroidismo e insuficiencia renal los índices de EO son elevados y en patologías agudas como infecciones. El EO desempeña un papel importante en la patofisiología del asma como lo muestra Henricks et al., 2001 y se han cuantificado niveles elevados de isoprostanos en pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica demostrado por Practico et al., 1998a, y en la enfermedad pulmonar intersticial evaluada por Montuschi et al., 1998, sin embargo, en los resultados de este estudio los niveles fueron disminuidos, dependiendo posiblemente de las pocas muestras tomadas en pacientes con procesos pulmonares. 64

9. CONCLUSIONES Los resultados del estudio demostraron que los niveles de F2 isoprostanos varían según el tipo de patología, al igual que los niveles de EO, aprobando así la hipótesis alternativa. Los niveles de F2 isoprostanos relacionados con el estado final del paciente no son concluyentes ya que el objetivo del estudio no era el pronóstico de los pacientes sino la relación con otro estudio relazado de forma paralela. Fueron evidentes las variaciones en la concentración de F2 isoprostanos en orina en pacientes con diferentes patologías al compararlos con los valores obtenidos en caninos sanos; lo cual demuestra que el EO es una condición presente en el desarrollo de los estados de enfermedad y específicamente para la población objeto de estudio, las cardiopatías fueron las alteraciones que presentaron una mayor variación y los procesos virales una menor. Las menores concentraciones de F2 isoprostanos en orina respecto al género en este estudio; se atribuyen a una menor cantidad de hembras dentro de la población, no a una condición propia del género. En pacientes de raza mestiza los valores de EO se observaron aumentados y en el Fila Brasilero disminuidos; pudiéndose ver afectados y modificados por la cantidad de muestras tomadas de cada una de las razas estudiadas. El desarrollo de esta investigación abre la puerta al estudio e inclusión de una nueva herramienta paraclinica que permitirá la valoración objetiva del grado de estrés oxidativo en diferentes condiciones patológicas; situación que en la actualidad únicamente se presume y asume pero no se corrobora de forma objetiva. El presente estudio permitió corroborar que el EO es una condición presente y determinante en diferentes estados patológicos; lo cual en medicina humana 65

desde hace varios años se ha confirmado y se continúa evaluando. Por tal motivo esta investigación puede ser tomada como punto de partida para el desarrollo de futuros estudios en el ámbito del estrés oxidativo en su valoración, monitoreo y terapéutica.

10. IMPACTO Las pruebas mínimamente invasivas son de gran utilidad en la práctica clínica diaria, porque permiten una valoración eficaz y segura de diferentes alteraciones; lo que a su vez repercute en un mejor proceso de abordaje al paciente en diferentes situaciones patológicas. El EO es una condición ampliamente descrita en la literatura médica; con un impacto significativo en la génesis, desarrollo y perpetuación de estados patológicos; sin embargo hasta el momento en Medicina Veterinaria el conocimiento de dicha condición y sus consecuencias han sido escasamente valoradas y su evidente existencia e impacto se presumen y asumen por la extrapolación de reportes en medicina humana; la presente investigación abre las puertas a la evaluación objetiva y cuantitativa del EO en Medicina Veterinaria mediante la cuantificación de los niveles de F2 isoprostanos; los cuales podrán hacer parte de aproximaciones multimodales en el diagnóstico, monitoreo y pronóstico de pacientes con diferentes patologías.

11. RECOMENDACIONES En futuras investigaciones pueden valorarse los niveles de F2 isoprostanos para monitorear el grado de estrés oxidativo en grupos de pacientes con una patología específica y de esta forma determinar el impacto del EO en una patología determinada. El kit (OxiSelect™ kit ELISA 8-iso-Prostaglandina F2α) empleado en este estudio es un instrumento desarrollado para ámbitos investigativos, por tal motivo su utilización en la valoración de F2 isoprostanos en

pacientes individuales y la

repetición de la prueba para la evaluación de la tendencia del EO en el tiempo es limitada; debe identificarse una prueba de medición rápida y fácilmente repetible para ampliar a nuevas investigaciones que permitan determinar las diferentes variaciones que puedan presentarse en el grado de estrés oxidativo en diferentes escenarios como diagnóstico, monitoreo, evolución, terapéutica y pronostico.

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