Determinacion del porcentaje de la morfologia en la flora by Medicina Veterinaria JDC

DETERMINACION DEL PORCENTAJE DE LA MORFOLOGIA EN LA FLORA BACTERIANA EN HECES DE OVINOS ADULTOS CRIOLLOS CLINICAMENTE SANOS EN LA CIUDAD DE TUNJA BOYACÁ

LAURA VICTORIA LÓPEZ PÉREZ COD: 1101041026

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2011 8

DETERMINACION DEL PORCENTAJE DE LA MORFOLOGIA EN LA FLORA BACTERIANA EN HECES DE OVINOS ADULTOS CRIOLLOS CLINICAMENTE SANOS EN LA CIUDAD DE TUNJA BOYACÁ

LAURA VICTORIA LÓPEZ PÉREZ COD: 1101041026

Trabajo de grado para optar el título de médico veterinario

DIRECTOR YEFER MAURICIO BOYACA QUINTANA Médico Veterinario y Zootecnista Especialista En Laboratorio Clínico

FUNDACIÓN UNIVERSITARIA JUAN DE CASTELLANOS FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS MEDICINA VETERINARIA TUNJA 2011

CONTENIDO

Pág. GLOSARIO.

RESUMEN.

ABSTRACT.

INTRODUCCIÓN.

DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA.

OBJETIVOS.

GENERAL.

ESPECÍFICOS.

MARCO DE REFERENCIA.

1.1.

ESTADO DEL ARTE.

1.2.

MARCO TEORICO.

1.2.1. Taxonomía de ovinos.

1.2.2. Reproducción.

1.2.3. Bacterias.

1.2.4. Bacterias del rumen.

1.2.5. Morfología bacteriana.

1.2.6. Estructura de la célula bacteriana.

1.2.6.1.

Capsula.

1.2.6.2.

Flagelo bacteriano.

1.2.6.3.

Fimbrias.

1.2.6.4.

Pili.

1.2.7. Pared celular.

1.2.7.1.

Pared celular en bacterias Gran positivas.

1.2.7.2.

Pared celular en bacterias Gran negativas.

1.2.8. Membrana citoplasmática.

1.2.8.1.

Citoplasma. 10

1.2.8.2.

ADN Bacteriano.

1.2.8.3.

División celular bacteriana.

1.2.8.4.

Endospora bacteriana.

1.2.8.5.

Desarrollo bacteriano.

1.2.9. Tinción de Gram.

1.3.

MARCO GEOGRÁFICO.

1.3.1. Ubicación y localización geográfica.

1.3.2. Climatología.

METODOLOGIA

2.1.

TIPO DE ESTUDIO.

2.2.

DISEÑO EXPERIMENTAL.

2.2.1. Población.

2.2.2. Animales experimentales.

2.2.3. Lugar de Experimentación.

2.3.

MATETIALES Y METODOS.

2.3.1. Recolección de las muestras.

2.3.2. Procedimiento en el laboratorio

ANALISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.

3.1.

RESULTADOS.

3.2.

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN.

IMPACTO.

CONCLUSIONES.

RECOMENDACIONES.

Bibliografía.

LISTA DE FIGURAS

Pág. Figura 1. Morfología Bacteriana.

Figura 2 Estructura Bacteriana.

Figura 3 Disposición de los flagelos.

Figura 4. Pared celular de bacterias Gram positivas.

Figura 5. Pared celular de bacterias Gram negativas.

Figura 6 Porcentaje promedio de las morfologías encontradas en las heces de ovinos clínicamente sanos en Tunja.

LISTA DE TABLAS

Pág. Tabla.1: Características de algunas bacterias del rumen.

Tabla 2: Veredas de Tunja Boyacá y muestra.

Tabla 3: Prueba de chi2 de bondad de ajuste para morfologías bacterianas.

Tabla 4: Análisis de morfologías valores máximos y mínimos.

Tabla.5: Prueba de chi2 de bondad de ajuste para cada morfología bacteriana. 53 Tabla 6: Rangos normales de los porsentajes de las morfologias bacteriana en ovinos adultos criollos clinicamente sanos.

ANEXOS

Pag. ANEXO 1: Principales provincias. Inventario ovino-caprino 2009.

ANEXO 2: EVA 0vinos 2009.

ANEXO 3: Principales veredas de Tunja: inventario ovino 2009.

ANEXO 4: Programa estadístico Win Episcope 2.0.

ANEXO 5: Marcar las láminas para la tinción de Gram.

ANEXO 6: Esterilización del asa microbiológica.

ANEXO 7: Introducir el asa en la muestra.

ANEXO 8: Extendido de la muestra en la lamina portaobjetos.

ANEXO 9: Agrega violeta de Gram.

ANEXO 10: Se deja actuar el violeta de Gram.

ANEXO.11: Enjuagar con agua después de 1 minuto.

ANEXO 12: Se agrega lugol y se deja actuar 1 minuto.

ANEXO 13: Se agrega cetona se deja actuar 30 segundos.

ANEXO 14: Se agrega fucsina se deja actuar 30 segundos.

ANEXO 15: Se deja secar la lámina.

ANEXO 16: Observación de las morfologías.

GLOSARIO

ADN: Acido desoxirribonucleico, frecuentemente abreviado como ADN (y también DNA Del inglés deoxyribonucleic acid), es un tipo de ácido nucleico, una macromolécula que forma parte de todas las células. Contiene la información genética usada en el desarrollo y el funcionamiento de los organismos vivos conocidos y de algunos virus, y es responsable de su transmisión hereditaria.

Bacilo: Se usa para describir cualquier bacteria con forma de barra o vara, y pueden encontrarse en muchos grupos taxonómicos diferentes de bacterias.

Bacteria: La palabra bacteria proviene de un término griego que significa “bastón”. Se trata de un microorganismo unicelular procarionte que puede provocar enfermedades, fermentaciones o putrefacción en los seres vivos o materias orgánicas. Por tratarse de células procariotas, carece de núcleo u orgánulos internos. Las bacterias pueden vivir en cualquier hábitat; incluso algunas especies sobreviven en el espacio exterior.

Biosíntesis: Síntesis de compuestos orgánicos realizada por seres vivos o in vitro mediante enzimas.

Cápsula bacteriana: Es la capa rígida con borde definido formada por una serie de polímeros orgánicos que en las bacterias se deposita en el exterior de su pared celular. Generalmente contiene glicoproteínas y un gran número de polisacáridos diferentes, incluyendo polialcoholes y aminoazúcares.

Citoplasmá: Consiste en una estructura celular cuya apariencia es viscosa. Se encuentra localizada dentro de la membrana plasmática. Hasta el 85% del citoplasma está conformado por agua, proteínas, lípidos, carbohidratos, ARN, 15

sales minerales y otros productos del metabolismo. Además en su interior están localizados ciertos orgánulos como ribosomas, y el cromosoma bacteriano, cuerpos de inclusión.

Coco: Tipo morfológico de bacteria. Tiene forma más o menos esférica (ninguna de sus dimensiones predomina claramente sobre las otras).

Conjugación bacteriana: Es el proceso de transferencia de información genética desde una célula donadora a otra receptora. Este proceso fue descubierto por Joshua Lederberg y Edward Tatum en 1946. Este proceso es promovido por determinados tipos de plásmidos, que portan un conjunto de genes cuyos productos participan en el proceso, y que requiere contactos directos entre ambas células, con intervención de estructuras superficiales especializadas y de funciones específicas (pilis sexuales en los Gram negativos, y contacto íntimo en los Gram positivos).

Endosporas: Son células especializadas, no reproductivas, producidas por unas pocas bacterias de la división Firmicute. Su función primaria es asegurar la supervivencia en tiempos de tensión ambiental. Son extraordinariamente resistentes a la radiación (ultravioleta, X y gamma), a la desecación, a la lisozima, al calor, a los desinfectantes químicos y a trituración mecánica. Las endosporas se encuentran comúnmente en el suelo y el agua donde sobreviven durante largos periodos de tiempo.

Espacio periplasmático: Es el compartimento que rodea al citoplasma en algunas células procariotas, como por ejemplo en las bacterias Gram negativas. Aparece comprendido entre la membrana plasmática, por dentro, y la membrana externa de las gram negativas, por fuera. Tiene una gran importancia en el metabolismo energético, que se basa en la alimentación por procesos activos de

diferencias de composición química, concentración osmótica y carga eléctrica entre este compartimento y el citoplasma.

Diagnóstico: Es el procedimiento por el cual se identifica una enfermedad, entidad nosológica, síndrome, o cualquier condición de salud-enfermedad.

Espirilos: Son bacterias flageladas de forma helicoidal o de espiral. Se desplazan en medios viscosos avanzando en tornillo. Su diámetro es muy pequeño, lo que hace que puedan atravesar las mucosas; por ejemplo Treponema pallidum que produce la sífilis en el hombre. Son más sensibles a las condiciones ambientales que otras bacterias, por ello cuando son patógenas se transmiten por contacto directo (vía sexual) o mediante vectores, normalmente artrópodos hematófagos.

Eucariotas: Todas las células que tienen su material hereditario fundamental encerrado dentro de una doble membrana, la envoltura nuclear, que delimita un núcleo celular. Igualmente estas células vienen a ser microscópicas pero de tamaño grande y variado comparado con las otras células.

Fisión binaria: La fisión binaria o bipartición es una forma de reproducción asexual que se lleva a cabo las bacterias.

Flagelo: Es una estructura filamentosa que sirve para impulsar la célula. Tiene una estructura única, completamente diferente de los demás sistemas presentes en otros organismos, como los cilios, pili y fimbrias.

Flora intestinal: Se denomina flora intestinal al conjunto de bacterias que viven en el intestino, en una relación que a veces es de comensalismo y otras de simbiosis. La gran mayoría de estas bacterias no son dañinas para la salud, y muchas son beneficiosas. Se calcula que el ser humano tiene en su interior unas 2.000 especies bacterianas diferentes, de las cuales solamente 100 pueden llegar 17

a ser perjudiciales. Muchas especies animales dependen muy estrechamente de su flora intestinal.

Fosfolípidos: Son un tipo de lípidos anfipáticos compuestos por una molécula de glicerol, a la que se unen dos ácidos grasos (1,2-diacilglicerol) y un grupo fosfato. El fosfato se une mediante un enlace fosfodiéster a otro grupo de átomos, que frecuentemente contienen nitrógeno, como colina, serina o etanolamina y muchas veces posee una carga eléctrica. Todas las membranas activas de las células poseen una bicapa de fosfolípidos.

Fucsina: Materia colorante de color rojo oscuro de contraste, que resulta de la acción del ácido arsénico y otras sustancias sobre la anilina; se emplea para teñir bacterias Gram negativas.

Glicoproteínas: Son moléculas compuestas por una proteína unida a uno o varios hidratos de carbono, simples o compuestos. Tienen entre otras funciones el reconocimiento celular cuando están presentes en la superficie de las membranas plasmáticas (glucocálix).

Laboratorio clínico: Es el lugar donde los técnicos y profesionales en bacteriología, realizan análisis clínicos que contribuyen al estudio, prevención, diagnóstico y tratamiento de problemas de salud.

Lipopolisacarido: Son polímeros complejos con restos de ácidos grasos como parte lipófila y cadenas características de oligosacáridos y polisacáridos, que forman la parte mayoritaria de la capa externa de la membrana externa de bacterias Gram negativas. En su conjunto, forman una capa protectora hidrófila en torno a la célula bacteriana que no puede ser atravesada por moléculas lipófilas.

Lugol: Es una disolución de yodo molecular I2 y yoduro potásico KI en agua destilada. Fue preparada por primera vez en 1829 y nombrada en honor al médico francés J.G.A. lugol. Este producto se emplea frecuentemente como reactivo en análisis médicos y de laboratorio.

Microbiología: Ciencia encargada del estudio de los microorganismos, seres vivos pequeños (de mikros "pequeño", bios, "vida" y logos, "estudio"), también conocidos como microbios. Es la rama de la biología dedicada a estudiar los organismos que son sólo visibles a través del microscopio: organismos procariontes y eucariontes simples.

Morfología: Estudio de la forma de un sistema u organismo.

Ósmosis: Es un fenómeno físico relacionado con el comportamiento de un sólido como soluto de una solución ante una membrana semipermeable para el solvente pero no para los solutos. Tal comportamiento entraña una difusión compleja a través de la membrana, sin "gasto de energía". La ósmosis del agua es un fenómeno biológico importante para la fisiología celular de los seres vivos.

Pared celular: Es una estructura compleja y fundamental para la bacteria formada por peptidoglicano (mureína o glucopeptido), por su rigidez le da su forma peculiar a la bacteria y la protege de los cambios de la presión osmótica y del medio que la rodea, es el lugar donde se localizan numerosos determinantes antigénicos que permiten diferenciar a las bacterias entre sí.

Patología: Es la parte de la medicina encargada del estudio de las enfermedades en su más amplio sentido, es decir, como procesos o estados anormales de causas conocidas o desconocidas.

Peptidoglicano: Cadenas de aminoazúcares unidas entre sí por péptidos de bajo número de aminoácidos, para formar una trama que rodea a la membrana plasmática y da forma y resistencia osmótica a la bacteria.

Pleomorfo: Son aquellos organismos bacterianos que varían en cuanto a forma durante su ciclo vital y, por tanto, no adquieren una única forma característica. Un buen ejemplo lo constituyen las proteobacterías gram negativas del género Rhizobium.

Procariotas: Se llama procariotas (del griego πρό, pro = antes de y κάρυον, karion = núcleo) a las células sin núcleo celular diferenciado, es decir, cuyo material genético se encuentra disperso en el citoplasma, reunido en una zona denominada nucleoide.

Ribosomas: Son orgánulos encargados de sintetizar proteínas a partir de la información genética que les llega del ADN transcrita en forma de ARN mensajero (ARNm). Sólo son visibles al microscopio electrónico, debido a su reducido tamaño (29 nm en células procariotas y 32 nm en eucariotas).

Vibrio: Es un género de bacterias, incluidas en el grupo gamma de las proteobacterias. Varias de las especies de Vibrio son patógenas, provocando enfermedades del tracto digestivo.

RESUMEN

En las últimas décadas se han hecho importantes avances en el estudio de la morfología de las bacterias, estos avances han permitido ubicar definitivamente a las bacterias en el reino procariota. El conocimiento a profundidad de las diferentes estructuras y su composición han permitido mejorar el diagnóstico de enfermedades que afectan a los seres vivos.

Este trabajo busca determinar el porcentaje de la morfología de la flora bacteriana en heces de ovinos adultos criollos clínicamente sanos en la ciudad de Tunja Boyacá y de esta forma implementar un punto de referencia para el diagnóstico de enfermedades bacterianas que afectan esta especie doméstica.

Para llevar a cabo este proyecto se utilizaron 106 ovinos clínicamente sanos, que fueron tomados como muestra, los cuales son sometidos a un exámen clínico demostrando que se encuentran en un excelente estado físico, las muestras de materia fecal fueron tomadas directamente del recto las cuales son procesadas en el laboratorio Clínico Microzoo mediante la técnica de la tinción de Gram.

Los resultados obtenidos nos muestran que hay más presencia de bacterias gram positivas que bacterias gram negativas. Además se evidencia que las morfologías con los porcentajes más altos están entre cocos 31,321%, cocobacilos 9,085%, diplococos 4,123%, de bacterianas Gram positivas y cocos 25,613%, cocobacilos 9,632%, diplococos 3,915% de bacterias Gram negativas encontradas en la flora bacteriana de ovinos adultos criollos clínicamente sanos excretadas en las heces, en la ciudad de Tunja Boyacá.

Palabras Claves: Bacterias, Tinción de Gram, Enfermedades bactrianas, Flora bacteriana. 21

ABSTRACT

In recent decades there has been significant advances in the study of the morphology of the bacteria, these advances have allowed the bacteria to permanently locate the Kingdom prokaryote. The depth understanding of the different structures and composition have improved the diagnosis of diseases that affect living things.

This work seeks to determine the percentage of the morphology of the bacteria in feces of clinically healthy adult sheep Creole in the city of Tunja Boyacรก and thus implement a benchmark for the diagnosis of bacterial diseases that affect the domestic species.

To carry out this project were used clinically healthy sheep 106, which were sampled, which undergo a clinical examination showing that they are in excellent physical condition, fecal samples were taken directly from the rectum which are Clinical processed in the laboratory technique Microzoo by Gram stain.

The results show that there is more presence of gram positive gram negative bacteria. Furthermore it is evident that the morphologies with the highest rates are among cocos 31.321%, cocobacilos 9.085%, diplococos 4.123% in Gram-positive bacteria and cocos, 25.613%, cocobacilos 9.632%, diplococos 3.915%, of Gram negative bacterial flora found in the Creoles of clinically healthy adult sheep excreted in feces, in the city of Tunja Boyacรก.

Keywords: Bacteria, Gram stain, Bactrian Diseases, Bacterial Flora.

INTRODUCCIÓN

La microbiología es la ciencia que estudia los microorganismos incluidos aquellos que encontramos en la flora bacteriana intestinal; la cual está constituida por todas las bacterias que pueden establecerse en un individuo sano sin cambiar su condición normal, pero cuando ocurre alguna alteración, ya sea por causas exógenas o endógenas, aquellos microorganismos varían su comportamiento pasivo tornándose agresores activos y desarrollando procesos infecciosos en cualquier sitio del organismo que los hospeda, presentándose signos y síntomas clínicos que puedan evolucionar rápidamente poniendo en peligro la vida del individuo y ocasionando cuantiosas pérdidas económicas (Sánchez, 1988).

La flora normal está compuesta por muchas bacterias, las cuales tienen diferentes estructuras bacterianas como la pared celular, el citoplasma, los ribosomas entre otras. Es fundamental el poder demostrar que tales estructuras bacterianas bien identificadas son importantes para un diagnóstico, un tratamiento rápido, eficaz y adecuado en las patologías digestivas infecciosas (Torres, 2008).

Este trabajo busca identificar el porcentaje de la morfología de las bacterias encontradas en las heces de ovinos criollos clínicamente sanos de Tunja, debido a que esta especie es sobresaliente en Boyacá. El propósito de este estudio es implementar un punto de referencia para poder diagnosticar de una forma más precisa, los desbalances en la flora bacteriana que puedan ser desencadenadas por enfermedades de tipo metabólico o de desórdenes alimenticios que afectan a esta especie doméstica.

DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA

Actualmente no se encuentra información sobre la morfología de la flora bacteriana en heces de ovinos en esta zona geográfica, por lo tanto importante efectuar hallazgos que ayuden al médico veterinario a realizar un diagnóstico mucho más eficiente, rápido y de menor costo en cualquier patología digestiva ocasionada por bacterias patógenas.

Es importante tener en cuenta que el laboratorio clínico veterinario es una herramienta fundamental para el diagnóstico de la o las posibles causas de los procesos patológicos, en consecuencia la evaluación y cuantificación de la morfología normal de las heces de los ovinos se constituirá en un punto de referencia, para el análisis comparativo de exámenes coproscópicos.

Por lo tanto es esencial, tener un punto de referencia en cuanto a la proporción de la morfología de los microorganismos que se encuentran en la flora intestinal de los ovinos clínicamente sanos, ya que es un requisito para asegurar el éxito de futuros avances tecnológicos y el bienestar de esta especie, con el fin de disminuir el costo de tratamientos.

OBJETIVOS

GENERAL

Determinar el porcentaje de la morfología de la flora bacteriana en heces de ovinos adultos criollos clínicamente sanos en la ciudad de Tunja Boyacá.

ESPECIFICOS

Establecer el porcentaje de diferentes morfologías bacterianas Gram positivas y Gram negativas, presentes en las heces de ovinos adultos criollos clínicamente sanos en la ciudad de Tunja Boyacá. Determinar el porcentaje de bacterias Gram positivas y Gram negativas en la flora bacteriana en heces de ovinos adultos criollos clínicamente sanos en la ciudad de Tunja Boyacá. Implementar un punto de referencia de las morfologías bacterianas normales en ovinos criollos, para diagnosticar patologías digestivas ocasionadas por bacterias patógenas.

1.1.

MARCO DE REFERENCIA

ESTADO DEL ARTE

En la actualidad, no se conocen estudios científicos sobre la determinación del porcentaje de la morfología de la flora bacteriana normal por medio de las heces y la tinción de Gram en ovinos clínicamente sanos.

El clínico veterinario tiene la oportunidad de utilizar las ayudas paraclínicas, entre las cuales encontramos el laboratorio clínico el cual orienta al veterinario para mejorar el diagnostico y así asegurar el bienestar de esta especie, además reducir los costos de los tratamientos y evitar la resistencia ante algunos antibióticos. Sin embargo se conocen artículos donde se resalta la morfología de las bacterias y la reacción ante distintas coloraciones.

Las bacterias se presentan con una morfología definida, que está determinada por su pared rígida.La forma de las bacterias es muy variada y, a menudo, una misma especie adopta distintos tipos morfológicos, lo que se conoce como pleomorfismo. De todas formas, podemos distinguir tres tipos fundamentales de bacterias cocos, bacilos y espirilos (Fritzi, 2004).

Según (Carmona, 1999) entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas existen importantes diferencias como, las bacterias Gram positivas contienen menos aminoácidos que las Gram negativas; el contenido graso es mucho más elevado en las Gram negativas que en las Gram positivas. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacción a la tinción de Gram.

Por otra parte, (Stanchi, 2007) la coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram que desarrollo la técnica en 1884. La tinción de Gram es una técnica muy útil para la diferenciación de las bacterias Gram positivas y las Gram negativas. Además permite al clínico clasificar las bacterias según su morfología.

Madigan (2004) reporta que las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta después de la decoloración y aparecen de color azul intenso. Las bacterias Gram negativas no son capaces de retener el cristal violeta después de la decoloración, y son teñidas de rojo con el colorante de contraste safranina.

1.2.

MARCO TEORICO

1.2.1. Taxonomía de ovinos.

Clase: Mammalia (vertebrados de sangre caliente que amamantan a sus crías) Orden: Artiodactyla (número par de dedos terminados en pezuñas y andar digitigrado) Sub-orden: Pecora (rumiantes verdaderos con estómago dividido en 4 cavidades) Familia: Bovoidae (cuernos huecos no caducos sobre prolongaciones óseas del hueso frontal) Género: Ovis (dos glándulas mamarias, etc.) Especie Ovis (todas las razas de ovinos domesticados) (Rodríguez, 1999).

La economía de Boyacá se basa principalmente en la producción agrícola y ganadera, la explotación de minerales, la industria siderúrgica, el comercio y el turismo. La agricultura se ha desarrollado y tecnificado en los últimos años; los principales cultivos son papa, maíz, cebolla, trigo, cebada, caña panelera, yuca. La 27

ganadería constituye otro de los renglones importantes de su economía: ganados vacunos, porcinos, equinos, asnales, mulares, caprinos y ovinos. La producción artesanal es muy laboriosa especialmente en cerámica, tejidos de lana de oveja y fique, tagua, tapices, instrumentos musicales y cestería, entre otros (Alcaldía mayor de Tunja 2010).

La oveja doméstica (Ovis orientalis aries) es un mamífero cuadrúpedo ungulado rumiante doméstico, usado como ganado. Se originó a partir de la domesticación del muflón en Oriente Próximo hacia el IX milenio con el objetivo de aprovechar su piel, lana, carne y leche. Tiene una longevidad de 18-20 años (Pumarola, 1995).

Su carne y leche se aprovechan como alimento. Con la leche pueden elaborarse derivados lácteos, entre los que destaca el queso. Con su lana se elaboran distintos

productos,

especialmente ropa.

cuero

otro

subproducto

ampliamente utilizado. A la hembra se la llama oveja y al macho, carnero (que generalmente presenta grandes cuernos, normalmente largos y en espiral). Las crías de la oveja son los corderos y los ejemplares jóvenes son conocidos como moruecos. Un grupo de ovejas conforman un rebaño, piara o majada, y al cercado donde se meten se le denomina aprisco, brete, corral o redil. La cría y utilización de estos animales por parte del hombre se conoce como ganadería ovina (Rodríguez, 1999).

1.2.2. Reproducción.

La oveja posee un periodo reproductivo que varía entre 7 y 10 años. Después de cinco meses de gestación la oveja pare una o dos crías, a las que se les llaman corderos. Para conseguir que los apareamientos tengan lugar en el momento deseado se puede separar a los machos de las hembras y no juntarlos hasta que llegue el momento adecuado, o tratar a las ovejas con sustancias hormonales para sincronizar y provocar el celo en el momento deseado (Guo et al; 2005). 28

Los corderos recién nacidos están con sus madres aproximadamente hasta un mes y medio, hasta que son destetados y se meten en los cebaderos, separándose machos y hembras ya que han de comer piensos diferentes. Las ovejas llegan a la pubertad entre los 5 y los 10 meses de edad y los carneros entre los 3 y los 6 meses de edad. Aunque lo más recomendado es esperar hasta que tengan un año para introducirlos en el programa reproductivo (Pedrosa, et, al. 2005).

1.2.3. Bacterias.

Son seres generalmente unicelulares con un tamaño variable; sus medias oscilan entre 0,5 y 1 µm.Las bacterias tienen una estructura menos compleja que la de las células de los organismos superiores; son células procariotas no tienen el núcleo definido y presentan orgánulos internos de locomoción, contienen información genética, sistemas de producción de energía y sistemas biosintéticos necesarios para el crecimiento y reproducción. Generalmente poseen una pared celular compuesta de peptidoglicano. Muchas bacterias disponen de flagelos o de otros sistemas de desplazamiento. Del estudio de las bacterias se encarga la bacteriología, una rama de la microbiología (Pirez, 2002).

Las bacterias juegan un papel fundamental en la naturaleza y en el hombre: la presencia de una flora bacteriana normal es indispensable, una célula bacteriana típica tiene las siguientes estructuras: acido desoxirribonucleico (ADN). Además presentan pared celular, membrana citoplasmática, citoplasma, Ribosomas, capsula, flagelo, esporas, fimbrias, plásmidos, nucleoide y cuerpos de inclusión (Jawetz, 1995).

1.2.4. Bacterias del rúmen.

El rúmen provee un ambiente apropiado, con un suministro generoso de alimentos, para el crecimiento y reproducción de los microorganismos. La ausencia de aire (oxigeno) en el rúmen se favorece el crecimiento de bacterias. Los microorganismos fermentan glucosa para obtener la energía para crecer y producen ácidos grasas volátiles (AGV) como productos finales de fermentación. Los AGV cruzan las paredes del rúmen y sirven como fuentes de energía para el rumiante (Donlan, 2002).

Mientras que crecen los microorganismos del rúmen, producen aminoácidos, fundamentales para proteínas. Las bacterias pueden utilizar amoniaco o urea como fuentes de nitrógeno para producir aminoácidos. Sin la conversión bacteriana, el amoníaco y la urea serian inútiles para los rumiantes. Sin embargo, las proteínas bacterianas producidas en el rúmen son digeridas en el intestino delgado y constituyen la fuente principal de aminoácidos para el animal (Donlan, 2002).

El rúmen contiene una gran variedad de bacterias, casi todas son anaerobias no esporuladoras, unas pocas especies son anaerobias facultativas y ocasionalmente se detectan bacterias anaerobias que forman espora (Branda, 2005).

Las bacterias del rúmen son predominantemente anaerobias estrictas, pero también coexisten con anaerobias facultativas, adheridas a las paredes del rúmen, estas usan el O2 que proviene del torrente circulatorio y son muy importantes en las funciones del rúmen siendo las más importantes las que fermentan la celulosa. Muchas de las bacterias del rúmen son altamente especializadas, poseen numerosos requerimientos nutricionales que le deben ser aportados por el sistema. Otras, por el contrario, emplean pocas fuentes de energía y otro grupo son más inconstantes en el requerimiento de energía (Donlan, 2002). 30

Cuando dos o más microorganismos combinan sus capacidades metabólicas para degradar una sustancia que no puede ser catabolizada en forma individual por ninguno de los dos se llega al concepto de sintrofia, en el rúmen existen grupos sintróficos relacionados a la degradación de fibras, incluyendo, por ejemplo a los celulolíticos, hemicelulolíticos y los microorganismos que los suceden, como las bacterias metanogénicas. Los más competitivos presentan adhesión al sustrato y almacenamiento de energía dentro de la célula. Las bacterias del rúmen se caracterizan en base a su morfología, (ver tabla 1) productos de fermentación, sustrato que utilizan, relación molar (G+C) % de su DNA y por su movilidad (Donlan, 2002). Organismo

Morfología

Movilidad

Productos De Fermentación

DNA (Mol %C+G)

Sustrato

Fibrobacter succinogenes *

Bacilo

Succinato, acetato, formiato

45-51

Celulosa

Butyrivibrio fibrisolvens *

Bacilo curvado

Acetato, formiato, lactato, butirato, H2 y CO2

Celulosa

Ruminococcus albus *

Coco

Acetato, formiato, H2 y CO2

43-46

Celulosa

Clostridium lochheadii

Bacilo (espora)

Acetato, formiato, butirato H2 y CO2

Celulosa

Ruminococcus Flavefaciens

Coco

Acetato, succinato y H2

39-44

Celulosa

Clostridium polysaccharolyticum

Bacilo (espora)

Acetato, formiato, butirato y H2

Celulosa y almidón

Bacteroides ruminicola

Bacilo

Formiato, acetato y succinato

40-42

Almidón

Ruminobacter amylopHilus

Bacilo

Formiato, acetato y succinato

Almidón

Selenomonas ruminantium

Bacilo curvado

Acetato, propionato y lactato

Almidón

Succinomas amylolytica

Ovalado

Acetato, propionato y succinato

Almidón

Streptococcus bovis

Coco

Lactato

37-39

Almidón

Selenomonas lactilytica

Bacilo curvado

Acetato y succinato

Lactato

MegaspHaera elsdenii

Coco

Acetato, propionato, butirato, valerato, coproato, H2 y CO2

Lactato

Viellonella párvula

Coco

Acetato, propionato y H2

38-41

Lactato

Lachnospira multiparus

Bacilo curvado

Acetato, formiato, lactato, H2 y CO2

Pectina

Anaerovibrio lipolytica

Bacilo

Acetato, propionato y succinato

Lipolitico

Eubacterium ruminantium

Bacilo

Formiato, butirato, lactosa y CO2

Xilano

Lactobacillus ruminis

Bacilo

Lactosa

44-47

Azucares

Lactobacillus vitulinus

Bacilo

Lactosa

34-37

Azucares

Methanobrevi- bacter ruminantium

Bacilo

CH4 (de H2 + CO2 o formiato)

Metanóge nos

Methanomicro-bium mobile

Bacilo

CH4 (de H2 + CO2 o formiato)

Metanóge nos

Eubacterium oxidoreducens

Bacilo

Lactosa y H2

Aromático s

Tabla 1 Características de algunas bacterias del rúmen1

1.2.5. Morfología bacteriana.

La forma de las bacterias es muy variada y, a menudo, una misma especie adopta distintos tipos morfológicos, lo que se conoce como pleomorfismo. De todas formas, podemos distinguir tres tipos fundamentales de bacterias (Figura 1) (Díaz, 2010). •

Coco (del griego kókkos, grano): de forma esférica.

•

Diplococo: cocos en grupos de dos.

•

Tetracoco: cocos en grupos de cuatro.

•

Estreptococo: cocos en cadenas.

•

Estafilococo: cocos en agrupaciones irregulares o en racimo.

•

Bacilo (del latín baculus, varilla): en forma de bastoncillo.

•

Formas helicoidales:

Vibrio: ligeramente curvados y en forma de coma.

Espirilo: en forma helicoidal rígida.

Espiroqueta: en forma de tirabuzón (helicoidal flexible) (Donlan, 2002).

http://www.monografias.com/trabajos7/rumen/rumen.shtml. 32

Algunas especies presentan incluso formas tetraédricas o cúbicas. Esta amplia variedad de formas es determinada en última instancia por la composición de la pared celular y el citoesqueleto, siendo de vital importancia, ya que puede influir en la capacidad de la bacteria para adquirir nutrientes, unirse a superficies o moverse en presencia de estímulos. A continuación se muestran diferentes especies con diversos patrones de asociación: (Díaz, 2010). •

Neisseria gonorrhoeae en forma diploide (por pares).

•

Streptococcus en forma de cadenas.

•

Staphylococcus en forma de racimos.

•

Actinobacteria en forma de filamentos. Dichos filamentos suelen rodearse

de una vaina que contiene multitud de células individuales, pudiendo llegar a ramificarse, como el género Nocardia, adquiriendo así el aspecto del micelio de un hongo (Young, 2006).

Figura 1. Morfología Bacteriana 33

Fuente: Álvarez, 2010

1.2.6. Estructura de la célula bacteriana.

Las células bacterianas están provistas de pared celular, membrana plasmática, citoplasma, cromosoma o genóforo e inclusiones citoplasmáticas, como los ribosomas. Además, algunas poseen estructuras superficiales como cápsulas, flagelos y fimbrias (figura 2.) (Pedroza, et, al 2005).

Figura 2 Estructura Bacteriana 1.2.6.1.

Fuente: Álvarez, 2010

Cápsula.

Algunas células bacterianas están rodeadas de una sustancia viscosa que forma una capa que cubre o envuelve la célula y está normalmente compuesta de polisacárido, polipéptido, o ambos. Esta formación se denomina Glicocálix, cápsula o cubierta mucilaginosa, siendo, al parecer, la cápsula una estructura más definida que la cubierta. No todas las especies de bacterias producen cápsulas fácilmente observables, y el grosor de la cápsula está notablemente influido por Ia composición del medio en que crece la bacteria. La habilidad de producir una cápsula es una propiedad heredada del organismo, pero la cápsula no es un componente celular completamente esencial (Bergey, 1994).

Las cápsulas tienen importancia, por muchos motivos, para las bacterias y para el hombre. A las bacterias las provee de una cubierta protectora, que puede servir, además, como depósito de alimentos de repuesto, o como lugar de eliminación de sustancias de desecho. Por otra parte, la presencia de la cápsula aumenta Ia capacidad infecciosa en algunas bacterias patógenas; y al contrario, de la pérdida de la cápsula puede derivarse la pérdida de virulencia (Bergey, 1994).

1.2.6.2.

Flagelo bacteriano.

Consiste en una estructura delgada que se prolonga hacia fuera desde la superficie celular. Es muy diferente del flagelo eucariota. No está rodeado de membrana plasmática. Los flagelos rotan, con lo que impulsan a las bacterias por el medio acuoso. Esto sucede por su estructura, constituída por 3 partes diferentes. La parte más externa del flagelo es una hélice delgada y se denomina filamento, por rotación hace que la célula se mueva. El filamento está compuesto por flagelina, una proteína (Macnab, 2003).

El filamento se ancla a la bacteria por una base formada por distintos componentes. Unido a él existe una parte más gruesa llamada codo o gancho, que actúa como articulación o visagra que permite que el flagelo se gire en distintas direcciones. El codo se une a una estructura compleja llamada cuerpo basal, que no tiene nada que ver con el del flagelo eucariota, que tiene 2 funciones. El cuerpo basal está metido en la cubierta celular, ancla el flagelo a la célula y es además, el motor que hace que el filamento rote. Está constituido por anillos. En las bacterias Gram positivas existen dos anillos internos y dos externos. En ambos casos, el más interno se llama M por estar embebido en la membrana plasmática. El anillo M es el que rota. En el flagelo bacteriano no tiene ATP-asa debido a que la propia membrana bacteriana tiene energía por el resultado de gradiente (Young, 2006).

Las bacterias flageladas presentan un patrón específico, tanto por el lugar de fijación como por el número de dichos apéndices. Este carácter se aplica a la clasificación de las bacterias en los órdenes Pseudomonadales y Eubacteriales; el primero incluye todas las bacterias con flagelos polares, y el segundo las que llevan flagelos peritricos (Carmona, 1999).

1.2.6.2.1.

Disposición de los flagelos.

Distintas especies de bacterias tienen diferente número y localización de los flagelos. Las bacterias monotricas presentan un solo flagelo (por ejemplo, Vibrio cholerae). Las bacterias lofotricas tienen múltiples flagelos situados en el mismo punto (o en dos puntos opuestos) que actúan en concierto para conducir a las bacteria en una sola dirección. En muchos casos, las bases de los múltiples flagelos están rodeadas de una región especializada de la membrana plasmática, denominada membrana polar. Las bacterias anfitricas tienen un solo flagelo en cada uno de los dos extremos opuestos (un solo flagelo opera a la vez, permitiendo a la bacteria revertir rápidamente el movimiento cambiando el flagelo que está activo). Las bacterias peritricas tienen flagelos que se proyectan en todas las direcciones (por ejemplo, Escherichia coli). (Figura 3) (Guo, et, al 2005). Monotricas Lofotricas Anfitricas Peritricas

Figura 3 Disposición de los flagelos

Fuente: Álvarez, 2010

En algunas bacterias, tales como las especies más grandes de Selenomonas, los flagelos se organizan fuera de la célula enroscándose helicoidalmente unos con otros para formar una gruesa estructura denominada fascículo. Otras bacterias como las espiroquetas tienen un tipo especializado de flagelo conocido como filamento axial situado intracelularmente en el espacio periplásmico, que produce la rotación de toda la bacteria para avanzar con un movimiento similar al de un sacacorchos (Belas, R. 1986).

La rotación de los flagelos monotricos polares empuja la célula hacia delante con los flagelos atrás. Periódicamente, la dirección de rotación se invierte brevemente, produciendo un viraje en la célula. Esto se traduce en la reorientación de la célula. Cuando la bacteria se desplaza en una dirección favorable el viraje es poco probable. Sin embargo, cuando la dirección del movimiento es desfavorable (por ejemplo, lejos de un producto químico atrayente), es más probable la realización de un viraje, con la posibilidad de que la célula se reoriente así en una dirección favorable (Atsumi, T. 1996).

En algunos Vibrio (en particular, Vibrio parahemolyticus) y en las formas relacionadas de proteobacterias como Aeromonas, coexisten dos sistemas flagelares codificados por diferentes conjuntos de genes e impulsados por diferentes gradientes de iones. Los flagelos polares se suelen utilizar cuando nadan en líquidos, mientras que los flagelos laterales entran en funcionamiento cuando los primeros experimentan gran resistencia al giro y proporcionan movilidad en fluidos viscosos o sobre superficies( Canals, R. 2006).

1.2.6.3.

Fimbrias.

Es un apéndice proteínico presente en muchas bacterias, más delgado y corto que un flagelo. Estos apéndices oscilan entre 4-7 mm de diámetro y hasta varios µm de largo y corresponden a evaginaciones de la membrana citoplasmática que 37

asoman al exterior a través de los poros de la pared celular y la cápsula. Las fimbrias son utilizadas por las bacterias para adherirse a las superficies, unas a otras, o a las células animales. Las fimbrias pueden estar repartidas uniformemente por toda la superficie de la célula o estár situada sólo en los polos. En muchas bacterias, las fimbrias son necesarias para la colonización durante el proceso de infección o para iniciar la formación de una biopelícula. Algunas fimbrias pueden contener lectinas, las cuales son necesarias para adherirse a las células destino puesto que pueden reconocer las unidades de oligosacáridos presentes en la superficie de estas células. Otras fimbrias se unen a los componentes de la matriz extracelular (Atsumi, T. 1996).

1.2.6.4.

Pili.

Los pilis comunes cumplen funciones de adherencia a receptores específicos y superficiales, esto es importante en las especies de relevancia clínica porque media la adherencia de muchas bacterias a determinados epitelios, jugando un papel fundamental en la colonización. Intervienen en el intercambio genético entre bacterias, de allí su nombre. El apareamiento de dos bacterias y la transferencia de ADN a través del pili sexual se conocen como conjugación. Se transfiere material genético de una célula donadora (que posee un plásmido F que codifica el pili sexual, entre otras cosas) a una receptora. En general el material transferido es un plásmido o una porción de cromosoma movilizada por un plásmido (Pírez, 2002).

Una vez unidas las bacterias los pilis sexuales se retraen, permitiendo que las células se unan y pase el ADN de la donadora a la receptora, formándose una verdadera unión (puente) entre las membranas de las células para el pasaje del ADN. La célula receptora está estrechamente emparentada con la donadora y posee un receptor específico para los pilis sexuales (Pírez, 2002).

1.2.7. Pared Celular.

Debajo de las sustancias extracelulares, como son las cápsulas y cubiertas mucilaginosas, y en la periferia de una delicada membrana que está en inmediato contacto con el citoplasma, se encuentra la pared celular, que es una estructura rígida que da forma a la célula. Las paredes celulares pueden destruirse o romperse en condiciones especiales (Jawetz, E. 1995).

Constituyentes

importantes

pared

celular

son

los

amínoácidos,

aminoazúcares, azúcares y grasas. Estas sustancias (proteinas, hidratos de carbono, grasas) están enlazadas formando el polímero complejo que forma la pared celular (Carmona, 1999).

Entre los constituyentes de la pared celular de las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas existen importantes diferencias. Por ejemplo, las paredes de las bacterias gram-positivas contienen menos aminoácidos que la gram-negativa; el contenido graso es mucho más elevado en la gram-negativa que en las grampositivas. Este hecho se ha propuesto como explicación del mecanismo de la reacción al gram (Bergey, 1994).

1.2.7.1.

Pared celular en bacterias Gram positivas.

El péptidoglicano se dispone en varias capas, lo que le otorga grosor a la pared. Atraviesan el peptidoglicano polisacáridos ácidos, denominados ácidos teicoicos. Los ácidos teicoicos son de dos clases: poliglicerol fosfato y poliribitol fosfato. Los poliglicerol fosfatos están unidos a la membrana celular y se les denomina ácidos lipoteicoicos, mientras que los poliribitol fosfato o ácidos teicoicos están unidos al peptidoglicano. Las funciones primarias de estos polímeros son la estabilización del peptidoglicano y la captura de Mg++. Sin embargo, se ha demostrado en algunas bacterias patógenas, como Staphylococcus y algunos Streptococcus, 39

cumplen funciones tipo adhesinas. En S. pneumoniae contribuyen a la respuesta inflamatoria. Otros componentes, presentes en algunos microorganismos, tienen importancia antigénica o clínica. Por ejemplo, los polisacáridos neutros se encuentran presentes en todos los Streptococcus, así como la proteína M en el S. pyogenes. (Figura 4) (Madigan, 2004).

Figura 4. Pared celular de bacterias Gram positivas.

1.2.7.2.

Fuente: Álvarez, 2010

Pared celular en bacterias Gram negativas.

Su pared celular es más delgada, pero más compleja que la de los Gram negativas (Figura 5). El péptidoglicano se dispone en una sola capa, pero por fuera de ella se encuentra una segunda membrana denominada membrana externa (Pírez, 2002).

La membrana externa es una membrana asimétrica, porque si bien la monocapa interna está formada por fosfolípidos, la monocapa exterior está formada por un tipo especial de lípido, denominado lipopolisacárido (LPS). El LPS es una molécula anfipática que contiene tres regiones diferentes: el lípido A, el core y el antígeno O. El lípido A, es un complejo de azúcares, fosfatos, ácidos grasos y forma una bicapa con los fosfolípidos de la membrana. Además, es el responsable de la toxicidad del LPS (Carmona, 1999).

El core, es un oligosacárido de 4 a 5 azúcares, algunos infrecuentes como las heptosas y un azúcar de 8 carbones, denominado ceto-deoxioctanoico (KDO). Sirve de enlace entre el lípido A y el Antígeno O. El antígeno O, está formado por cadenas de 25 o más unidades de azúcares repetidas. El LPS constituye una endotoxina, que se libera cuando la bacteria se divide o muere. Es un potente estimulador de los macrófagos, lo que causa la activa liberación de citoquinas, responsables de las manifestaciones clínicas de las infecciones por bacterias Gram negativas y que varían desde una fiebre hasta el shock séptico (Martínez, 2010).

Entre la membrana externa y la membrana celular se crea un compartimento virtual, llamado espacio periplásmico. El espacio periplásmico es una matriz que incluye al péptidoglicano, enzimas, proteínas captadoras de nutrientes y sustancias de secreción (Carmona, 1999).

La membrana externa contiene numerosas proteínas, siendo las porinas las más abundantes. Se denominan así, porque forman poros que comunican el exterior con el espacio periplásmico. Las porinas constituyen poros de difusión inespecíficos que permiten el paso de sustancias hidrofílicas y no mayores de 700 daltons (aminoácidos o disacáridos) (Martínez, 2010).

Figura 5. Pared celular de bacterias Gram negativas

Fuente: Álvarez, 2010

1.2.8. Membrana citoplasmática

Inmediatamente debajo de la pared celular, existe una membrana fina, o envoltura, que se denomina membrana citoplásmica o protoplásmica y está formada por una bicapa de fosfolípido integral y proteínas. La membrana citoplásmica tiene una significación funcional de suma importancia. Se trata de una membrana semipermeable, selectiva, que controla el paso de los elementos nutritivos dentro de la célula y la salida de los productos de desecho; tiene enzimas respiratorias y durante la división celular el cromosoma se une a la membrana de la célula en el sitio llamado mesosoma (Presscott, 1999).

1.2.8.1.

Citoplasma

El citoplasma bacteriano es un gel de alta presión osmótica. Al microscopio muestra un aspecto finamente granular, debido a su alto contenido en ribosomas e inclusiones de diversos materiales nutritivos que las bacterias almacenan en forma insoluble. Aproximadamente en el centro del citoplasma localizamos el material genético de la bacteria, organizado en un nucleoide, el cual se destaca en

microfotografías por su aspecto hipolúcido. Este material genético consiste de un cromosoide único formado por ADN de doble hebra circular. Esta gran molécula se encuentra compactada por sobreenrrollamiento, proceso en el que intervienen enzimas del tipo topoisomerasa y proteínas estructurales “tipo-histonas” (Aguado, 2007).

El núcleo lleva el material genético de la bacteria; está formado por un único filamento de ácido desoxirribonucleico (ADN) apelotonado y que mide cerca de 1 mm de longitud (1000 veces el tamaño de la bacteria) (Madigan, 2004).

Los ribosomas son elementos granulosos, que se hallan contenidos en el citoplasma bacteriano; esencialmente compuestos por ácido ribonucleico, desempeñan un papel principal en la síntesis proteica. El citoplasma, por último, contiene inclusiones de reserva (Font, Quer, 1982).

1.2.8.2.

ADN bacteriano

Como se señaló, la célula procariota a diferencia de la eucariota carece de una membrana nuclear, tampoco posee nucléolo, ni aparato mitótico, y nunca configura una masa cromosómica definida. El material genético está compuesto de una estructura fibrilar, constituida por un ADN circular de doble cadena, enrollado sobre sí mismo. Si bien se asocia a proteínas básicas, estas no son verdaderas histonas. Los mesosomas son, al parecer, invaginaciones de la membrana citoplasmática y participan en la división celular y en la replicación de ADN. Si bien hay autores que opinan que son artefactos de técnica que se observan en las microfotografías electrónicas, hay otros que han observado que claramente el ADN se fija al mesosoma en la etapa previa de la división celular (Berg, 2002).

En las últimas décadas se han desarrollado muchas técnicas que permiten estudiar el ADN bacteriano, todas ellas con importantes aportes en la investigación y el diagnóstico. Por ejemplo, es posible por técnicas de secuenciación, conocer genomas enteros de bacterias o sectores de él que tengan interés, ya sea porque codifican la producción de alguna estructura, una toxina, etc. Estos sectores de ADN, se pueden separar del ADN total con enzimas de restricción para su posterior análisis o utilización en estudios de biología molecular. Estas técnicas de biología molecular están destinadas a identificar sectores de ADN específico de una bacteria, por ejemplo: las técnicas de hibridización que identifican un trozo de ADN con una sonda genética complementaria de ese sector y marcada con un compuesto revelador; o la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que amplifica miles de veces el sector de interés (Poehlsgaard, J. Douthwaite, S. 2005).

1.2.8.3.

División celular bacteriana

En las bacterias, el aumento en el tamaño de las células (crecimiento) y la reproducción por división celular están íntimamente ligados, como en la mayor parte de los organismos unicelulares. Las bacterias crecen hasta un tamaño fijo y después se reproducen por fisión binaria, una forma de reproducción asexual. En condiciones apropiadas, una bacteria Gram-positiva puede dividirse cada 20 – 30 minutos y una Gram-negativa cada 15 – 20 minutos, y en alrededor de 16 horas su número puede ascender a unos 5.000 millones (Ryan, 2004).

Bajo condiciones

óptimas, algunas bacterias pueden crecer y dividirse

extremadamente rápido, tanto como cada 9,8 minutos. En la división celular se producen dos células hijas idénticas. Algunas bacterias, todavía reproduciéndose asexualmente, forman estructuras reproductivas más complejas que facilitan la dispersión de las células hijas recién formadas. Ejemplos incluyen la formación de cuerpos fructíferos (esporangios) en Myxobacteria, la formación de hifas en 44

Streptomyces. En la gemación una célula forma una protuberancia que a continuación se separa y produce una nueva célula hija (Johnson. M, Lucey J. 2006).

Por otro lado, cabe destacar un tipo de reproducción sexual en bacterias, denominada parasexualidad bacteriana. En este caso, las bacterias son capaces de intercambiar material genético en un proceso conocido como conjugación. Durante el proceso una bacteria donante y una bacteria receptora llevan a cabo un contacto mediante pelos sexuales huecos o pili, a través de los cuales se transfiere una pequeña cantidad de ADN independiente o plásmido conjugativo. El mejor conocido es el plásmido F de E. coli, que además puede integrarse en el cromosoma bacteriano. En este caso recibe el nombre de episoma, y en la transferencia arrastra parte del cromosoma bacteriano. Se requiere que exista síntesis de ADN para que se produzca la conjugación. La replicación se realiza al mismo tiempo que la transferencia (Berg, 2002).

1.2.8.4.

Endospora bacteriana

Ciertas bacterias grampositivas pueden sintetizar un órgano de resistencia que les permite sobrevivir en condiciones más desfavorables, y se transforma de nuevo en una forma vegetativa cuando las condiciones del medio vuelven a ser favorables (Stanchi, 2007).

Esta espora, contiene la información genética de la bacteria la cual está protegida mediante dos cubiertas impermeables. Se caracteriza por su marcado estado de deshidratación y por la considerable reducción de actividades metabólicas, lo que contrasta con su riqueza enzimática. La facultad de esporular está sometida a control genético y ciertos gérmenes pueden perderla. La germinación de las esporas es siempre espontánea. Da lugar al nacimiento de una bacteria idéntica al germen que había esporulado (Stanchi, 2007). 45

1.2.8.5.

Crecimiento bacteriano

El crecimiento bacteriano sigue 4 fases. Cuando una población bacteriana se encuentra en un nuevo ambiente con elevada concentración de nutrientes que le permiten crecer necesita un período de adaptación a dicho ambiente (Stanchi, 2007). •

Esta primera fase se denomina fase de adaptación o fase lag y conlleva un

lento crecimiento, donde las células se preparan para comenzar un rápido crecimiento, y una elevada tasa de biosíntesis de las proteínas necesarias para ello, como ribosomas, proteínas de membrana, etc. (Pumarola, 1995) •

La segunda fase de crecimiento se denomina fase exponencial, ya que se

caracteriza por el crecimiento exponencial de las células. La velocidad de crecimiento durante esta fase se conoce como la tasa de crecimiento k y el tiempo que tarda cada célula en dividirse como el tiempo de generación g. Durante esta fase, los nutrientes son metabolizados a la máxima velocidad posible, hasta que dichos nutrientes se agoten, dando paso a la siguiente fase (Johnson. M, Lucey J. 2006). •

La tercera fase de crecimiento se denomina fase estacionaria y se produce

como consecuencia del agotamiento de los nutrientes en el medio. En esta fase las células reducen drásticamente su actividad metabólica y comienzan a utilizar como fuente energética aquellas proteínas celulares no esenciales. La fase estacionaria es un período de transición desde el rápido crecimiento a un estado de respuesta a estrés, en el cual se activa la expresión de genes involucrados en la reparación del ADN, en el metabolismo antioxidante y en el transporte de nutrientes (Pumarola, 1995).

•

La cuarta fase la población está muriendo se denomina fase de muerte o

declinación en forma geométrica así hay más muertes que aparición de nuevas células. Las muertes son debidas a los factores de la fase estacionaria además de las enzimas líticas que se liberan cuando se lisan las bacterias (Martínez, 2010).

1.2.9. Tinción de GRAM

Es un tipo de tinción empleado en la microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Es un método empírico desarrollado en 1884 por el físico danés Hans Christian Gram para diferenciar las especies de bacterias; pero a la vez clasifica estos microbios en dos grandes grupos basado en las propiedades físicas y químicas de la pared celular (Aulton Michael E, 2004).

La coloración de Gram, descubierta hace más de 100 años, es una tinción diferencial que se emplea para demostrar las propiedades de membrana de todo tipo de bacteria. La tinción de Gram es una técnica muy útil para la diferenciación de las bacterias Gram positivas y las Gram negativas, como primer paso para determinar la identidad de una muestra bacteriana particular. Además permite al clínico clasificar las bacterias según su morfología ( Søgaard, 2007).

No es una herramienta infalible para el diagnóstico, identificación o filogénesis, siendo sustituido por técnicas moleculares, debido a la variabilidad de algunas bacterias (pueden teñirse de violeta o rojo; o no ser susceptibles a la tinción de Gram). Puede ser realizada en fluidos corporales o biopsias cuando se sospecha de infección e incluso a medios de cultivos bacterianos (Stanchi, 2007).

Las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta después de la decoloración y aparecen de color azul intenso. Las bacterias Gram negativas no son capaces de retener el cristal violeta después de la decoloración, y son teñidas de rojo con 47

el colorante de contraste safranina. Las características de la coloración de Gram pueden ser atípicas en cultivos muy jóvenes, viejos, muertos o degenerados (Madigan, 2004).

El cristal violeta (violeta de genciana) sirve como colorante primario, y se une a la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solución débil de yodo, que sirve como mordiente para la unión del colorante. En medio acuoso el cristal +

violeta (CV) se disocia en CV e iones de Cl . Estos iones penetran a través de la pared celular y la membrana citoplasmática a las bacterias tanto Gram positivas +

como negativas. El ión CV interactúa negativamente con las cargas de los componentes de la célula bacteriana tiñéndolas de color violeta. Luego el ión yodo -

(I o I3 añadido en el segundo paso se une al ión CV formando un complejo grande y queda atrapado por las capas celulares ( Søgaard, 2007).

Algunas especies de bacterias, debido a la naturaleza química de sus paredes celulares, tienen la capacidad de retener el cristal violeta incluso luego del tratamiento con un decolorante orgánico, como por ejemplo una mezcla en partes iguales de alcohol etílico al 95% y acetona. Las bacterias que retienen el colorante se ven negroazuladas cuando se observan al microscopio, y se denominan entonces gram positivas (Bergey, 1994).

Algunas bacterias pierden la coloración primaria con cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante, presumiblemente debido al alto contenido de lípidos de su pared celular cuando la solución alcohol-acetona se aplica este diluye parcialmente la capa de lípidos de las Gram negativas, permitiendo que el complejo sea removido. Este paso de descolocación es crítico y su tiempo debe ser medido correctamente; es solo cuestión de segundos para que tanto las Gram positivas y negativas se descoloren. Estas bacterias decoloradas toman el

colorante de contraste, la safranina, y se ven rojas cuando se observan al microscopio, denominadas gram negativas (Madigan, 2004).

La coloración de Gram también pueden ser utilizadas para identificar formas no bacterianas, como las Trichomonas, las larvas estrongiloides, los quistes de Pneumocysti carinii y los trofozoítos de Toxoplasma gondii, si bien no es tan sensitiva como otras tinciones específicas utilizadas para la visualización de estos parásitos (Aulton, 2004).

1.3.

MARCO GEOGRÁFICO

1.3.1. Ubicación y Localización Geográfica

Tunja, capital del Departamento de Boyacá está, aproximadamente a los 5 grados, 32 minutos y 7 segundos de Longitud al Oeste de Greenwich. Con alturas que van desde los 2700 msnm hasta 3150 msnm en la parte más elevada. Como otras zonas de la región Andina de Colombia se encuentra en un área altamente propensa a la actividad sísmica. División política: El Municipio de Tunja tiene una extensión de 121.4 Km2 El área urbana el área rural del municipio, está conformada por diez veredas así: Barón Gallero, Barón Germania, Chorro blanco, El Porvenir, La Esperanza, La Hoya, La Lajita, Pirgua, Runta y Tras del Alto con sus diferentes sectores Sus límites con los pueblos vecinos son los siguientes: Al Norte: con Motavita, Cómbita, Oicatá, Chivatá y Soracá. Por el Sur: con Ventaquemada y Samacá. Por el Occidente: con Samacá, Sora y Cucaita.

La extensión territorial de Tunja es de 118 kilómetros cuadrados, de los cuales el 87% corresponde al área rural y el 13% al área urbana.

Situación Geográfica y Relieve

Está ubicada en el Altiplano de Tunja, que pertenece a la unidad morfológica del Altiplano Cundiboyacense en la Cordillera Oriental de los Andes.

La región montañosa en el Municipio de Tunja tiene los siguientes accidentes orográficos: Las cuchillas de Perico, Cazadero, Peña Negra y las lomas de la Sierra y la Cascada.

En la zona occidental, en la vía hacia Villa de Leyva se localiza el Alto de San Lázaro, que los conquistadores españoles llamaron La Loma de los Ahorcados, porque en esa colina occidental se levantaban muchas horcas, y de los patíbulos pendientes cadáveres de indígenas.

El Zaque Quemuenchatocha castigaba las faltas graves de sus súbditos con la pena de la horca. En el relieve del Municipio de Tunja son importantes también el Alto de Soracá, los Altos de la Cascada, el Alto de Moral, el Alto Cepeda, el Alto de Pirgua y otros (Alcaldía mayor de Tunja, 2010).

1.3.2. Climatología.

El Clima de Tunja es seco y frío de montaña. Cómo está en los trópicos tiene el mismo clima durante casi todo el año, sufriendo pocas variaciones de temperatura, las más significativas entre el día y la noche, dónde puede bajar hasta 8 °C o 9 °C y subir hasta 19 °C o 21 °C.

Cuenta con dos periodos de baja precipitación (diciembre a marzo y julio a septiembre) y dos periodos lluviosos (abril a junio y octubre a noviembre), que varían su intensidad según la influencia de los fenómenos de Humbolt o de la Niña y del Niño, que se presentan cada 2 o 3 años en los países del norte de Sudamérica (Alcaldía mayor de Tunja, 2010).

II.

2.1.

METODOLOGIA

TIPO DE ESTUDIO

Esta investigación es de tipo descriptivo, trasversal, porque busca describir las propiedades del trabajo, en este estudio se mide el porcentaje de las morfologías de las bacterias Gram positivas y Gram negativas encontradas en las muestras que se toman de 106 ovinos sanos, también es en un solo momento, por que las pruebas de heces son extraídas en un tiempo único y de esta forma hacer la evaluación de la morfológica de la flora bacteriana en Tunja, Boyacá.

2.2.

DISEÑO EXPERIMENTAL

2.2.1. Población

En este estudio se emplearon ovinos adultos criollos clínicamente sanos, con peso y medidas similares provenientes de la ciudad de Tunja Boyacá, según EVA 2009 evaluaciones agropecuarias del URPA el total de ovinos con estas características son 360 ver anexo (1, 2, 3). En este trabajo se toman 106 individuos de muestra los cuales son estadísticamente representativos mediante el programa estadístico Win Episcope 2.0, con un nivel de confianza de 92%,y un error aceptado de 8% ver anexo (4).

2.2.2. Animales Experimentales

Se emplearon 106 ovinos adultos criollos clínicamente sanos provenientes de la ciudad de Tunja Boyacá, los cuales son sometidos a un minucioso exámen clínico, demostrando que se encuentran en un excelente estado físico, los animales incluidos al estudio tienen características similares como: se encuentran 52

expuestos a condiciones naturales del medio ambiente, con variedad en el género, alimentados con forraje y desparasitados con 6 meses de anterioridad, además se conto con la autorización correspondiente de los propietarios a los que se les explico con anterioridad, el fin de la investigación y los beneficios que se obtendrán posteriormente.

2.2.3. Lugar de Experimentación

Las muestras de materia fecal de los ovinos clínicamente sanos se obtuvieron de la siguiente manera (Tabla 2). Vereda

N° de ovejas por vereda

N° de muestra

Pirgua

Tras Del Alto

100

La Esperanza

100

Runta

El Porvenir

Total

360

106

Tabla 2: Veredas de Tunja Boyacá y muestra. El procesamiento de las muestras se llevó a cabo en el laboratorio microzoo de la ciudad de Tunja-Boyacá.

2.3.

MATERIALES Y METODOS

2.3.1. Recolección de las muestras

Este estudio se desarrollo de la siguiente forma, se recolectaron 106 muestras de materia fecal de ovinos adultos criollos clínicamente sanos de diferentes veredas de la ciudad de Tunja Boyacá teniendo en cuenta los siguientes parámetros:

•

Se tomaron las medidas de bioseguridad para la toma de muestras como; asepsia, guantes de examen clínico, tapabocas, entre otras.

•

Se procedió a tomar muestra de materia fecal la cual se toma directamente del recto.

•

Se marcaron correctamente las muestras.

•

El embalaje y transporte de las muestras al Laboratorio Clínico Veterinario

Microzoo, se realizo conservando las muestras con gel refrigerante en la cava de icopor evitando que se altere las mismas.

2.3.2. Procedimiento en el Laboratorio

El análisis de las muestras se realizo con la técnica de la Tinción de Gram ya que nos ayuda a distinguir si se trata de una bacteria Gram positiva o Gram negativa.El procedimiento se llevo a cabo en el Laboratorio Clínico Veterinario Microzoo de la ciudad de Tunja Boyacá.

Técnica:

Esta técnica se realizo de la siguiente manera, se marcan las láminas porta objetos para identificar las muestras, después con el mechero se flamea el asa microbiológica para esterilizarla; posteriormente se introduce el asa en la muestra de materia fecal la cual es extendida en la lamina portaobjetos, el frotis que se hace sobre la lamina preferiblemente es delgado y se fija la muestra al calor. Ver anexos (5, 6, 7, 8).

Una vez fijada la muestra en la lamina se agrega azul violeta hasta cubrir la lamina se deja actuar por 1 minuto hasta que todas las células Gram positivas y Gram negativas se tiñan de color azul-purpura.Se enjuaga con agua y se agregará lugol hasta cubrir la lamina, luego se deja actuar durante 1 minuto y se volverá a enjuagar. Ver anexos (9, 10, 11, 12). 54

Después se agrega alcohol acetona suavemente hasta eliminar el color presente en la placa.se deja actuar por 30 segundos para la decoloración de bacterias Gram negativas, por último se realiza una tinción de contraste agregando fucsina básica, el cual visualiza las bacterias Gram negativas de color rosado, se deja actuar durante 30 segundos. Se enjuaga y se deja secar al aire, una vez realizada la tinción se observan las morfologías de las bacterias en el microscopio y se registran los resultados respectivamente. Ver anexos (13, 14, 15, 16).

III.

3.1.

ANALISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

RESULTADOS

Los resultados encontrados en las muestras de materia fecal de los 106 ovinos clínicamente sanos de la ciudad de Tunja, se realizo mediante un análisis descriptivo para determinar los porcentajes normales de las morfologías encontradas en las muestras las cuales fueron: cocos, cocobacilos, diplococos, estreptococos,

estafilococos,

bacilos

cortos,

bacilos

largos,

diplobacilos,

estreptobacilos, espiroquetas; en los dos tipos de bacterias Gram positivas y Gram negativas.

El porcentaje promedio de las morfologías encontradas son diferentes como lo podemos observar en la (figura 6). La sumatoria de los porcentajes encontrados en la (figura 6) es de un total del 100%.

Los porcentajes encontrados en las bacterias Gram positivas fueron: cocos Gram positivos (31,321%), cocobacilos Gram positivos (9,085%), diplococos Gram positivos (4,123%), estreptococos Gram positivos (2,972%), estafilococos Gram positivos (0,019%), bacilos cortos Gram positivos (3,557%), bacilos largos Gram positivos (2,528%),diplobacilos Gram positivos (1,462%) y estreptobacilos Gram positivos (0,019%),mostrando que la población de bacterias más alta pertenece al grupo de las Gram positivas.

Las bacterias Gram negativas se encuentran en menor proporción con valores como: cocos Gram negativos (25,613%), cocobacilos Gram negativos (9,632%), diplococos Gram negativos (3,915%), bacilos cortos Gram negativos (2,934%), bacilos largos Gram negativos (1,896%) y diplobacilos Gram negativos (0,925%).

En total las morfologías bacterianas que se presentaron con más frecuencia fueron, cocos, cocobacilo, diplococos, bacilos largos y bacilos cortos tanto Gram positivos como Gram negativos.

Por

otra

parte

podemos

observar

que

morfologías

bacterianas

como:

estreptococos Gram positivos, estafilococos Gram positivos, diplobacilos Gram positivos y Gram negativos y estreptobacilos Gram positivos se encuentran en mínima proporción en la flora bacteriana normal de los ovinos; también se pude observar que algunas morfologías que no tienen presencia porcentual entre estas tenemos:

estreptococos

Gram

negativos,

estafilococos

Gram

negativos,

estreptobacilos Gram negativos y espiroquetas Gram positivas y negativas.

Figura 6 Porcentaje promedio de las morfologías encontradas en las heces de ovinos clínicamente sanos en Tunja.

Para verificar que los datos porcentuales observados son estadísticamente iguales a los esperados se formula una hipótesis nula (Ho), los porcentajes promedio de las 20 morfologías bacterianas son estadísticamente iguales y para probar si por lo menos un porcentaje promedio observado es estadísticamente diferente al esperado se formula una hipótesis alterna (Ha), los porcentajes de las 20 morfologías bacterianas por lo menos un porcentaje promedio observado es diferente. Por lo tanto se realiza una prueba de bondad de ajuste chi2, (Tabla 3) la cual nos indica si los porcentajes observados se ajustan a los esperados, demostrando que la diferencia entre los observados y los esperados es mínima y con esto podemos asegurar que estos resultados son confiables.

Gram Negativos Cocos Cocobacilos Diplococos Estreptococos Estafilococos Bacilos Cortos Bacilos Largos Diplobacilos Estreptobacilos Espiroquetas Gram. Positivos Cocos Cocobacilos Diplococos Estreptococos Estafilococos Bacilos Cortos Bacilos Largos Diplobacilos Estreptobacilos Espiroquetas

% Promedio 25,613 9,632 3,915 0,000 0,000 2,934 1,896 0,925 0,000 0,000

Esperado 5,3 5,3 5,3 5,3 5,3 5,3 5,3 5,3 5,3 5,3

Chi2 77,8540379 3,540920357 0,361879941 5,3 5,3 1,056251805 2,185976343 3,612217468 5,3 5,3

% Promedio 25,803 9,633 3,916 0,000 0,000 2,935 1,897 0,927 0,000 0,000

31,321 9,085 4,123 2,972 0,019 3,557 2,528 1,462 0,019 0,000

5,3 5,3 5,3 5,3 5,3 5,3 5,3 5,3 5,3 5,3

127,7508823 2,702926577 0,261542078 1,022828241 5,26233132 0,573477434 1,449492534 2,778908764 5,26233132 5,3

31,322 9,086 4,123 2,973 0,019 3,558 2,529 1,463 0,019 0,000

Tabla 3: Prueba de chi2 de bondad de ajuste para morfologías bacterianas.

Bacterias Gram positivas y Gram negativas

Se pueden observar que una misma morfología se encuentra en los dos tipos de bacterias Gram positivas y Gram negativas pero con diferentes valores en los porcentajes promedios. (Tabla 4). Esta tabla nos representa los valores máximos y mínimos encontrados en las muestras de materia fecal de los 106 ovinos criollos cínicamente sanos de la ciudad de Tunja, también podemos observar el promedio de las morfologías encontradas en las mismas muestras y una desviación estándar que nos ayuda ver cuánto se apartan los datos de su mediana, y por lo tanto, se mide en las mismas unidades. Gram Negativos Cocos Cocobacilos Estreptococos Estafilococos Bacilos Cortos Bacilos Largos Diplobacilos Estreptobacilos Espiroquetas Gram Positivos Cocos Cocobacilos Diplococos Estreptococos Estafilococos Bacilos Cortos Bacilos Largos Diplobacilos Estreptobacilos Espiroquetas

Promedio 25,613 9,632 0,000 0,000 2,934 1,896 0,925 0,000 0,000

Desviación Estándar 4,998229696 2,872945963 0 0 2,815835723 1,614984861 0,95317128 0 0

Valor Mínimo 15 3 0 0 0 0 0 0 0

Valor Máximo 38 17 0 0 15 8 6 0 0

31,321 9,085 4,123 2,972 0,019 3,557 2,528 1,462 0,019 0,000

5,007702961 3,077159867 1,77121336 1,641471739 0,136704901 2,461436625 1,663086901 1,295960966 0,136704901 0

15 2 1 0 0 0 0 0 0 0

41 18 10 8 1 15 10 5 1 0

Tabla 4: Análisis de morfologías valores máximos y mínimos También se realizó una prueba de bondad de ajuste chi2, donde se toman los porcentajes promedios de bacterias Gram negativas y Gram positivas. El valor p de cada una de las morfologías bacterianas indica que no hay diferencia 59

significativa entre los porcentajes promedio de bacterias Gram negativas y Gram positivas. (Tabla 5).

Bacteria

Cocos Cocobacilos Diplococos Estreptococos Estafilococos Bacilos Cortos Bacilos Largos Diplobacilos Estreptobacilos Espiroquetas

% GramNegativas 25,613 9,632 3,915 0,000 0,000 2,934 1,896 0,925 0,000 0,000

% GramPositivas 31,321 9,085 4,123 2,972 0,019 3,557 2,528 1,462 0,019 0,000

Valor Esperado N

Valor Esperado P

Valor P

Valor Chi

28,46698113 9,358490566 4,018867925 1,485849057 0,009433962 3,245283019 2,212264151 1,193396226 0,009433962 0

0,449396588 0,899356044 0,941641753 0,084732894 0,890745801 0,806922967 0,76380056 0,727790582 0,890745801 0

0,572173329 0,015995892 0,005359199 2,971698113 0,018867925 0,059730145 0,090296496 0,121149974 0,018867925 0

Tabla 5: Prueba de chi2 de bondad de ajuste para cada morfología bacteriana. La prueba de chi2 de bondad de ajuste para determinar si hay o no diferencias significativas entre los porcentajes promedios de todas las morfologías para probar si los datos observados son estadísticamente iguales a los esperados y para esto se tienen las hipótesis nula (Ho): los porcentajes promedio de las morfologías bacterianas son estadísticamente iguales; hipótesis alterna (Ha): por lo menos el porcentaje promedio de una morfología bacteriana es estadísticamente diferente.

La prueba indica que no hay diferencia significativa en los porcentajes promedios solo en la morfología estreptococos Gram positivos ya que es un valor atípico en esta tabla, pero es normal encontrarlo en la flora bacteriana de los ovinos criollos clínicamente sanos.

De los resultados obtenidos de los porcentajes normales se establecieron unos rangos de cada morfología bacteriana (Tabla 6), para que sirvan de punto de referencia para diagnosticar de una manera más precisa las enfermedades gastrointestinales que afectan la especie ovina, estos rangos se obtuvieron del promedio de cada una de las morfologías bacterianas menos la desviación

estándar para obtener el valor mínimo y el promedio de cada una de las morfologías bacterianas mas la desviación estándar para obtener el valor máximo.

BACTERIA Cocos Cocobacilos Diplococos Estreptococos Estafilococos Bacilos Cortos Bacilos Largos Diplobacilos Estreptobacilos Espiroquetas

% Gam Negativos Rango Rango Inferior Superior 21% 31% 7% 13% 2% 6% 0% 0% 0% 0% 0,1% 6% 0,3% 4% 0% 2% 0% 0% 0% 0%

% Gram Positivos Rango Rango Inferior Superior 26% 36% 6% 12% 2% 6% 1% 5% 0% 0,1% 1% 6% 0,8% 4% 0,1% 3% 0% 0,1% 0% 0%

Tabla 6: Rangos normales de los porcentajes de las morfologias bacteriana en ovinos adultos criollos clinicamente sanos.

3.2.

ANÁLISIS Y DISCUSIÓN

La flora normal está compuesta por muchas bacterias, por esta razón se hace importante efectuar hallazgos que ayuden al médico veterinario a realizar un 61

diagnostico mucho más rápido y de menos costo en todas las patologías digestivas ocasionadas por bacterias patógenas.

Es importante tener en cuenta que el laboratorio clínico veterinario es una herramienta fundamental para el diagnóstico de las posibles causas de los procesos patológicos, por esta razón se procesaron 106 muestras de materia fecal de ovinos clínicamente sanos de la ciudad de Tunja para determinar el porcentaje de la morfología normales de la flora bacteriana.

Para la identificación correcta de las bacterias Gram positivas y Gram negativas se utilizó la técnica de la tinción de Gram la cual es empleada en la microbiología para la visualización de bacterias sobre todo en las muestras clínicas. Es un método empírico desarrollado el 1884 por el físico danés Hans Christian Gram para identificar las especies de bacterias; pero a la vez clasifica estos microbios en dos grandes grupos basado en las propiedades físicas y químicas de la pared celular (Stanchi 2007).

Los resultados encontrados en las 106 muestras tomadas fueron los mostráramos en la (figura 6) los cuales nos muestran las bacterias Gram positivas y Gram negativas, donde se evidencia que la bacterias Gram positivas se encuentran en mayor proporción que las bacterias Gram negativas. Las morfologías más relevantes que se encontraron fueron los cocos, cocobacilos, diplococos, bacilos cortos, bacilos largos, diplobacilos.

También nos muestra que morfologías como estreptococos Gram negativos, estafilococos Gran negativos, estreptobacilos Gram negativos y espiroquetas Gram positivas y Gram negativas no tienen ningún porcentaje es decir no hay presencia. Mientras que los estafilococos Gram positivos y estreptobacilos Gram positivos se encuentran en proporciones mínimas lo que nos indica que un individuo sano pude presentar en mínima proporción estas morfologías. 62

Para identificar que la flora bacteriana de un ovino es normal es necesario tener en cuenta los rangos porcentuales encontrados en este estudio ver (tabla 6) como por ejemplo La presencia mínima de las morfologías bacterianas como estafilococos Gram positivos de 0% a 0.1% y estreptobacilos Gram positivos de 0% a 1% nos indica que la flora bacteriana es normal.

También se pude ver los rangos de los porcentajes de cada morfología bacteriana, encontrados en la (tabla 6), los culés sirven como parámetro para la obtención de un mejor diagnostico de enfermedades gastrointestinales las cuales son las que se presentan con mayor frecuencia en los ovinos criollos de la ciudad de Tunja.

La cantidad de bacterias puede variar por factores ambientales o dietarios, y cuando estos dos parámetros se mantienen, las variaciones derivan de factores específicos de cada animal, tales como: tiempo destinado a la rumia, cantidad de saliva segregada, consumo de agua y capacidad de avance de la digesta.

Es relevante resaltar que la población microbiana en los rumiantes está compuesta en su gran mayoría por bacterias como: bacterias celulíticas, Bacterias hemicelulolíticas y pectinolíticas, Bacterias amilolítica, Bacterias que utilizan azúcares

simples,

Bacterias

que

utilizan

ácidos

intermedios,

Bacterias

proteolíticas, Bacterias productoras de amoníaco, Bacterias lipolíticas, Bacterias productoras de metano. (Church 1993). Donde las morfologías más relevantes son las que se encontraron en el estudio. Por otra parte se realizó una prueba de bondad de ajuste chi2, la cual nos da un nivel de confianza ya que nos determina si hay o no diferencias significativas entre los porcentajes promedios de todas las morfologías para probar si los datos observados son estadísticamente iguales a los esperados mostrando que los datos si se relacionan entre si y certificando que estos resultados son confiables además para que sirvan como punto de referencia parar otros estudios. 63

IV.

IMPACTO

Es de vital importancia reconocer la morfología de los microorganismos habitantes de la flora bacteriana del intestino de los ovinos criollos clínicamente sanos, ya que nos sirve de punto de referencia para diagnosticar enfermedades gastrointestinales, las cuales son las que se presentan con más frecuencia.

Actualmente el clínico veterinario posee herramientas útiles, como lo son las ayudas paraclínicas como el laboratorio clínico, el cual sirve como apoyo para el diagnóstico de varias enfermedades causadas por diversos microorganismos. Sin embargo estas pruebas diagnósticas tienen elevados costos, por lo tanto los pequeños productores no tienen acceso a estas, por esta razón se implemento una técnica a bajo costo y de esta forma sea de fácil acceso al productor, además evitar el uso inapropiado de los antibióticos por que las bacterias están tomando resistencia hacia los mismos.

Es importante resaltar que es poca la información que se encuentra sobre el porcentaje de las morfologías de la flora bacteriana en heces de ovinos clínicamente sanos, por lo tanto es esencial, tener un punto de referencia ya que es un requisito para asegurar el éxito de futuros avances tecnológicos y de esta forma asegurar el bienestar a esta especie y con esto disminuir el costo de tratamientos.

CONCLUSIONES

Las morfologías encontradas con más frecuencia en la flora bacteriana de los ovinos de la ciudad de Tunja son, cocos, cocobacilos, diplococos, bacilos cortos, bacilos largos y diplobacilos de bacterias Gram negativas y Gram positivas.

Las morfologías como estreptococos, estafilococos y estreptobacilos Gram positivos se encuentran en un mínimo porcentaje en condiciones normales en los ovinos adultos criollos clínicamente sanos de la ciudad de Tunja.

La presencia de bacterias Gram positivas es mayor que la presencia de bacterias Gram negativas.

Se implementó un nuevo examen que orienta al clínico veterinario a emitir un mejor diagnóstico en las patologías digestivas ocasionadas por bacterianas que afectan la especie ovina, en base a los datos de referencia de los porcentajes de las morfologías bacterianas encontradas.

Se determinó que los porcentajes más altos están en las morfologías tales como: cocos 31,321%, cocobacilos 9,085%, diplococos 4,123%,de bacterianas Gram positivas y cocos 25,613%, cocobacilos 9,632%,diplococos 3,915% de bacterias Gram negativas encontradas en la flora bacteriana de ovinos adultos criollos clínicamente sanos excretadas en las heces, en la ciudad de Tunja Boyacá.

VI.

RECOMENDACIONES

Utilizar otra técnica como coprocultivo con el fin de afianzar los datos ya obtenidos con la tinción de Gram y de esta forma tener unos rangos porcentuales muchos más seguros.

Dedicar más tiempo a una buena interpretación de las ayudas diagnósticas; ya que los resultados de estas nos muestran el estado en el que se encuentran nuestros pacientes y nos orientan de una manera más precisa al diagnóstico de las enfermedades. Implementar la toma de muestra para obtener resultados exactos y de esta manera evitar que las bacterias tomen resistencia a los antibióticos. Fomentar el uso necesario de las pruebas diagnósticas en los pequeños productores y el beneficio que estas representan para sus animales.

Implementar técnicas para diferenciar bacterias como espirilos ya que por su tamaño con la técnica de la tinción de Gram no se reconocieron.

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ANEXOS

ANEXO 1: PRINCIPALES PROVINCIAS. INVENTARIO OVINO-CAPRINO 2009. Provincia

Inventario explotaciรณn ovinos

Granjas productoras explotaciรณn ovina

Inventario explotaciรณn caprina

Granjas productoras explotaciรณn caprinas

CENTRO

29.970

3.179

3.125

393

TUNDAMA

10.916

755

2.333

226

SUGAMUXI

36.651

4.456

3.343

215

VALDERRAMA

18.800

2.020

6.180

240

NORTE

14.100

150

51.600

940

GUTIร RREZ

15.450

480

6.700

400

TOTAL

125.887

11.040

73.281

2.414

Fuente: consolidado pecuario EVA 2009, URPA ANEXO 2: EVA 0VINOS 2009 Provincias

Municipio

Inventario ovinos

Granjas productoras ovinos

Inventario caprinos

Granjas productoras caprinos

Centro

Chivata

3.100

Centro

Combita

2.300

400

Centro

Cucaita

Centro

520

Motavita

2.400

1.200

325

280

Centro

Oicata

6.200

1.000

200

Centro

Samaca

200

Centro

Sora

Centro

Soraca

Centro

1.500

500

690

650

Sotaquira

2.700

265

890

Centro

Toca

1.000

Centro

Tunja

Centro Centro

360

Tuta

8.000

500

Ventaquema

1.000

100

Fuente: consolidado pecuario EVA 2009, URPA

ANEXO 3: PRINCIPALES VEREDAS DE TUNJA: INVENTARIO OVINO 2009

VEREDAS

N° TOTAL DE OVINOS EN TUNJA

HEMBRAS OVINAS

MACHOS OVINOS

Tras Del Alto

100

La Esperanza

100

Pirgua

Runta

El Porvenir

Fuente: consolidado pecuario EVA 2009, URPA

ANEXO 4: Programa estadístico Win Episcope 2.0

Fuente: Boyaca 2011. 71

ANEXO 5: Marcaje de láminas para la tinción de Gram.

Fuente: López 2011 ANEXO 6: Esterilización del asa microbiológica.

Fuente: López 2011 72

ANEXO 7: Introducir el asa en la muestra.

Fuente: L贸pez 2011 ANEXO 8: Extendido de la muestra en la l谩mina portaobjetos.

Fuente: L贸pez 2011 73

ANEXO 9: Agrega violeta de Gram.

Fuente: L贸pez 2011 ANEXO 10: Se deja actuar el violeta de Gram.

Fuente: L贸pez 2011 74

ANEXO.11: Enjuagar con agua despu茅s de 1 minuto.

Fuente: L贸pez 2011 ANEXO 12: Se agrega lugol y se deja actuar 1 minuto.

Fuente: L贸pez 2011 75

ANEXO 13: Se agrega cetona se deja actuar 30 segundos.

Fuente: L贸pez 2011 ANEXO 14: Se agrega fucsina se deja actuar 30 segundos.

Fuente: L贸pez 2011 76

ANEXO 15: Se deja secar la lámina.

Fuente: López 2011 ANEXO 16: Observación de las morfologías.

Fuente: López 2011. 77